CN1153908A - 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1含量的检测。本发明配制试剂盒,并采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法检测AFB1,利用抗原免疫家兔,获得含有抗体的血清。经过生化提纯分离出家兔免疫球蛋白将抗体吸附于酶标板孔中,温育后洗涤,加入样品提取液及酶标抗原,使两者进行反应,洗涤,加酶底物反应显色。本发明灵敏度高,特异性好,操作简便,结果易判读,价格低廉,尤其适用于粮食,食品,饲料中黄曲霉毒素B1的检测。
Description
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法,用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的检测。
由于黄曲霉毒素具有毒性大,致癌力强,含量低(通常0-200μg/Kg,即0-200PPb)和结构相似等特点,这就要求检测方法灵敏度高,特异性强,集分离与检测为一体,目前黄曲霉毒素的测定方法有多种,概括起来有化学分析法,仪器分析法,生物鉴定法及免疫分析法等。上述这些分析方法也是紧密相联的,它们之间没有绝然的分界线。免疫分析法中的酶联免疫吸附法(ELISA)是70年代出现的新的免疫测定技术。正如1994年《粮食与饲料工业》杂志中已报道,酶联免疫吸附法其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应,最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。这一技术应用于黄曲霉毒素的测定大体为二类:一是用双抗体夹心法检测样本中的黄曲霉毒素,如Sashidha将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白涂覆于酶标板孔穴中,经初步培养后,加兔的AFB1抗体和游离AFB1,用磷酸4-硝基苯酯作基质,以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合:二是用竞争法检测样本中的黄曲霉毒素,如在涂抗体的孔穴中,用乙烷萃取黄曲霉毒素B1,并与结合辣根过氧化物酶的黄曲霉素B1交联物混合,37℃下培养10分钟后,用水洗除去未结合的黄曲霉毒素B1交联物,再加底物,在波长405nm进行检测。为得到特异性更强的ELISA法,发展了AFB1单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法,Kawamura用间接和直接竞争ELISA法分析AFB1检出限小于1ng。上述所讲的黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(酶标抗原)的中间体是用Adsorbosil-柱层析法来提纯,部分材料需进口,操作要求较严格,费用也较高。如采用薄层层析制备来提纯,其中的硅胶吸附能力较强,在层析分离产物AFB1-Oxime和原料AFB1时,洗脱比较困难,其产率低,而且洗脱时间较长。
本发明的目的在于提供一种结构简单,使用方便,廉价,携带方便的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。
本发明的另一个目的是克服上述不足之处,从而提供一种样品前处理简单,提取后就可直接测定,不需要净化过程;一次可测定大量样本,而且简便,快速、灵敏、准确、廉价的检测黄曲霉毒素B1的方法。
本发明试剂盒主要由盒体(1),酶标板(2),A试剂瓶(稀释液)(3),B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4),C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5),D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6),E试剂瓶(含吐温20的PBS缓冲液)(7),F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂)(8)、G试剂瓶(H2O2溶液)(9),H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10),I试剂瓶(硫酸溶液)(11)、海棉托架(12)所组成,海棉托架(12)上制有孔及凹槽,上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶安装在海棉托架(12)的孔和凹槽内,海棉托架(12)酶标板(2)安装在盒体(1)内。
本发明主要采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法来检测AFB1。采用ELISA竞争法的技术主要有两个方面。特异性抗体(多克隆或单克隆)的制备,利用抗原免疫家免,获得含有抗体的血清,经过生化提纯分离免疫球蛋白;第二,抗原-酶交联物(即酶标抗原)的制备。由于AFB1(黄曲霉毒素B1)不脂直接与酶结合,必须先将AFB1修饰,引入一个-COOH修饰基团,然后和酶的氨基反应,使其具有酶的活性,即能催化底物的显色反应。
首先将多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上,酶标板(2)放在4℃左右冰箱过夜。再进行试剂及酶底物混合液的配制,在B试剂(标准AFB1中)加20-30mlA试剂混匀,在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(无酶标抗原稀释液),溶解、混匀,在2-8℃下保存,E试剂(含吐温20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液,用E洗涤液洗酶标板2-4次,洗液不得溢出,每次间隔0.5-1.5分钟,放在吸水纸上拍干,在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应,在37-38℃放置28-35分钟,再用洗涤液洗板4-6次,每次间隔1-2分钟,拍干,再加入酶底物混合液,混匀,在37-38℃放置13-18分钟,显色,最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应,测定。
黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备:
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(B1-Oxime)的制备:(中间体)
(1)合成:
取20-30mg黄曲霉毒素B1,30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底瓶中,加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂,回流2-4小时,再室温搅拌15-20小时,减压挥干溶剂,得固体。
(2)、提纯:
在上述固体中加入5-10ml蒸馏水,采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性,转移至分液漏斗中,2-5ml氯仿萃取,静置分层,得水相层,再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性,用4-8ml氯仿萃取,得氯仿层,用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层,弃去水层,减压蒸馏,挥干溶剂,得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备:
(1)、合成:取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中,混匀,依次加入150-200mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶,慢速搅拌15-30分钟,再加150-200mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐,在2-8℃搅拌15-18小时,并在5000-10000转/分钟,离心5-10分钟,取上清液。
(2)、提纯:
将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱,并用该缓冲液洗脱,部分收集器收集,洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值,绘制洗脱曲线,收集双峰并存的洗脱液,在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天,得含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液,小瓶分装冷冻干燥,得粉状固体。
实施例1:
本发明主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测黄曲霉毒素B1的含量。具体操作步骤如下:
一、多克隆抗黄曲霉毒素B1抗体的制备
1、免疫用抗原:首次免疫用5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml完全福氏佐剂混合后作为免疫抗原,加强免疫时取5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml不完全福氏佐剂混合作为免疫抗原。
2、免疫程序:先将购买的新西兰大白免饲养数周后,在背部脊柱两侧脱毛区取5-10个接种点,每点内接种完全佐剂抗原0.2-0.3ml,然后每隔4周四肢肌肉加强接种不完全佐剂抗原1ml,共加强免疫2次。
3、采血:
首先免疫前可取耳缘静脉采血,以后每次加强免疫前各采血1次,第二次加强免疫后第四周再采血一次,测定血清抗体效价后颈动脉放血。
4、分离血清:
分别以30%和60%的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白与抗体免疫球蛋白,离心后得含有抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的溶液。
二、单克隆抗黄曲霉毒素B1的制备:
1、抗原制备:
通过黄曲霉毒素B1的肟化反应和交联反应制备免疫用人工抗原黄曲霉毒素B1-羧甲基肟-牛血清白蛋白人工抗原(AFB1-Oxime-BSA)。
2、免疫动物:
采用BALB/C小白鼠作为免疫动物,免疫抗原剂量为10-100ng,经腹腔注射,在4-6周后静脉加强免疫2-4次,取脾细胞。
3、细胞融合:
取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞在聚乙二醇(4000)的溶剂中进行细胞融合,在HAT培养液中作选择培养。
4、杂交瘤细胞克隆化:
采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞,直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
6、单克隆抗体的保存:
在液氮-20℃下保存,37℃水浴快速解冻,使细胞存活率保持80%以上。
7、单克隆抗体大量生长及提纯:在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞,采集腹水,经HPLC提纯后小瓶分装待用。
三、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备:(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备
(1):合成:
称取20mg黄曲霉毒素B1(AFB1)和30mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)放在30-50ml圆底蒸馏瓶中,再加入10ml吡啶∶甲醇(1∶3-1∶6)的反应溶剂,回流2小时,再室温搅拌15小时。当黄曲霉毒素B1(AFB1)已大部分转化为其衍生物羧甲基黄曲霉毒素肟时,停止反应,减压挥干反应溶剂,得黄色固体。
(2)、提纯:
在含上述黄色固体的圆底蒸馏瓶中,加入5ml蒸馏水,用0.1N碳酸氢纳(NaHCO3)调PH至碱性,使固体全部溶解,然后转移至分液漏斗中,用2ml氯份(CHCl3)萃取,静置分层,弃氯仿(CHCl3)层,得水相层,再用0.1N盐酸(HCl)调水相层至酸性,出现沉淀,用4ml氯仿(CHCl3)萃取,沉淀溶解在氯仿(CHCl3)层中,得氯仿(CHCl3)层,用0.5ml蒸馏水洗氯仿层,弃去水层,减压蒸馏挥干溶剂得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)(酶标抗原)的制备。
(1)、合成:
称取上述0.5mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)固体溶于10ml的乙醇溶液中,混匀,依次加入150mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和5.0mg的辣根过氧化物酶(HRP)混匀,慢速搅拌15分钟,再加入150ml乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl),在2℃温度下搅拌15小时,在转速为5000-10000转/分下离心5分钟,取上清液。
(2)、提纯:
将上清液通过pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的Sephadex层析柱,再用该缓冲液洗脱,采用BS-100A自动部分收集器收集。洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值,绘制洗脱曲线,见图3所示。收集双峰并存的洗脱液,在pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透折3天,得含AFB1-HRP的溶液,小瓶分装冷冻干燥得粉状固体,为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)。
图4为酶标抗原合成原理反应式:
可以看出,其反应分两步进行,即AFB1-Oxime的肟化反应和AFB1-O-HRP交联反应。
具体检测步骤如下:
将多克隆(或单克降)抗黄曲霉毒素B1抗体包装在酶标板上,然后进行样品的处理。
1、先将样品粉碎至20目,称取5g样品于磨口的50ml试管中,加入提取液25ml(甲醇∶水为7∶3),加塞振荡5-10min,过滤。滤液按下表用A试剂适当稀释。
样品 滤液量(ml) A试剂量(ml) 稀释倍数豆类发酵食品,其它粮食 0.1 0 0大米食用油、肉鸡、生长 0.1 0.1 1∶1鸡饲料玉米(食品用)、混合、 0.05 0.15 1∶3配合饲料玉米(饲料用)、花生饼、粕 0.02 0.18 1∶9
2、试剂的配制:
(1)标准黄曲霉毒素B1(AFB1):B试剂中加入稀释液A试剂20ml混匀;(2)酶标抗原(AFB1-HRP):C试剂中加入10ml酶标抗原稀释液D试剂,溶解,混匀,在2-8℃下保存;(3)在含0.05%吐温-20(Tween-20)的磷酸盐(PBS)的E试剂中加入200ml蒸馏水配制洗涤液;(4)底物混合液配制:根据每次测定所需底物混合液用量,用醋酸钠-柠檬酸缓冲液H试剂:四甲基联苯胺F试剂按H∶F=7-9.5∶3-0.5的比例稀释F试剂,再按每毫升此稀释液需加入14μl的双氧水G试剂配成底物混合液(临用前半小时内配制)。
3、将试剂盒平衡至室温
4、用E洗涤液洗酶板2次,洗液不得溢出,每次间隙0.5分钟,放在吸水纸上拍干。
5、反应物组成:按下表所列,依次加入配制好的试剂及待测样品稀释液。1-3号孔为标准对照孔。4-12号孔为样品孔。
次序 | 加入量 | 孔号 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 | ||
1 | 25μl | A、B、A …… 稀释后样品液 ……… |
2 | 摇匀 | |
3 | 25μl | C C D C C C C C C C C C |
4 | 摇匀 |
6、反应:按上表所列加入各试剂在38℃放置28分钟。
7、洗涤显色:用E洗涤液洗酶标板4次,加入50μl底物混合液,混匀,在38℃放置13分钟。
8、中止:加底物液I试剂50μl中止反应。
9、测定:先比较1-3号孔颜色,若1号最深,2号孔次之,3号孔按近无色,说明标准准确。
(1)、目视法:比较样品孔与2号孔颜色,若浅者,则为阳性,反之为阴性,若颜色接近,则用仪器法或国标法验证。
(2)、仪器法:用酶标仪(通用)测定吸光度值,通过标准曲线确定样品中黄曲霉毒素B1的含量(定量)。
10、结果判读:若样品经目视法为阳性
则AFB1含量如下表:
稀释倍数 AFB1含量(PPb)
0 >5
1∶1 >10
1∶3 >20
1∶9 >50
本发明试剂盒体(1)内装有海棉托架(12),酶标板(2),有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成,海棉托架(12)上制有孔及凹槽,孔及凹槽内放有A试剂瓶(稀释液)(3),B试剂瓶(标准AFB,试剂)(4),C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5),D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6),E试剂瓶(含吐温20的PBS固体)(7),F试剂瓶(四甲基联苯胺)(8),G试剂瓶(H2O2溶液)(9),H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10),I试剂瓶(硫酸溶液)(11)。试剂盒放在2-8℃贮存,忌0℃下冻存,有效期12个月。详见:图1、图2
实施例2:
1、多克隆(或单克隆)抗黄曲霉毒素B1抗体的制备与实施例1相同,略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备:(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备:
(1)、合成:
称取25mg黄曲霉毒素B1(AFB1),35mg羧甲基羟胺半盐酸醇盐(CMO)回流3小时,室温搅拌18小时,其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯:
蒸馏水取7.5ml,0.3N碳酸氢钠(NaHCO3),3ml氯仿(CHCl3)萃取,0.3N盐酸(HCl)
再取6ml氯仿(CHCL3)萃取,用1.2ml蒸馏水洗氯仿层,其它工艺流程条件操作步骤相同于实施例1。
2,黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。
(1)、合成:
取0.75mg上述固体,乙醇溶液15ml
175mg乙二醇3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)7.5mg辣根过氧化物酶(HRP),搅拌25分钟再加入175mg(EDC·HCL)乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸胺,4℃搅拌16.5小时,离心7.5分钟,其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯:
pH7.5透析4天,其它工艺条件、操作步骤同实施例1。
检测步骤:
样品处理同实施例1。
试剂配制:B试剂中加入A试剂25ml
C试剂中加入15mlD试剂,洗涤液洗酶板3次,每次间隔1分钟,在37.5℃下放置30分钟,第二次洗酶板5次,每次间隔1.5分钟,在37.5℃下放置15分钟,其它工艺条件操作步骤同于实施例1。
实施例3
一、多克隆(或单支隆)抗黄曲霉毒素B抗体的制备同实施例1,略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(试剂盒中C试剂瓶)
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备:
(1)、合成
称取30mg黄曲霉毒素B1(AFB1),40mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO),回流4小时,室温搅拌20小时,其它工艺条件操作步骤相同实施例1
(2)、提纯:
蒸馏水取10ml,0.5N碳酸氢钠(NaHCO3),5ml氯仿(CHCl3)萃取,0.5N盐酸(HCl),再取6ml氯仿(CHCl3)萃取,用2ml蒸馏水洗氯仿层,其它工艺条件制作步骤相同于实施例1。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备:
1、合成:
取1.0mg上述固体,乙醇溶液20ml,200mg乙二醇3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC· HCl)、10mg辣根过氧化物酶(HRP),搅拌30分钟,再加入200mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl),8℃搅拌18小时,离心10分钟,其它操作步骤同于实施例1。
(2)、提纯
pH8.0透析5天,其它工艺条件制作步骤相同于实施例1
检测步骤
样品处理同于实施例1
试剂配制:B试剂中加入A试剂30ml,C试剂中加入20mlD试剂,洗涤液洗板4次,每次间隔1.5分钟,在37℃下放置35分钟,第二次洗酶板6次,每次间隔2分钟,在37℃下放置18分钟,其它操作步骤同于实施例1。
本发明与已有技术相比具以下优点:1、试剂盒结构简单,携带使用配制方便,2、灵敏度高,特异性好,操作简单、方便,3、检测结果易判读,4、试剂来源方便,价格低廉,尤其适用于粮食、食品、饲料中黄曲霉毒素B1的检测。
Claims (6)
1. 一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒由盒体(1),酶标板(2)、A试剂瓶(稀释液)(3),B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4),C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5),D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6),E试剂瓶(含吐温-20的PBS固体)(7),F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂(8),G试剂瓶(H2O2溶液)(9)、H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10),I试剂瓶(硫酸溶液)(11),海棉托架(12)所组成,海棉托架(12)内装有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶,海棉托架(12)及酶标板(2)均安装在盒体(1)内。
2、根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒,其特征在于所述的海棉托架(12)上制有孔和凹槽。
3、根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒,其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成。
4、一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及用该试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法,先进行样品处理,将样品粉碎至20目,取样品。放在50ml试管中,加入提取液(甲醇∶水为7∶3)。加塞振荡5-10分钟,过滤,滤液采用A试剂液适当稀释,其特征为:首先采用多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上,酶标板(2)放在4℃冰箱过夜,然后进行试剂及酶底物混合液的配制:在B试剂(标准AFB1)中加20-30mlA试剂混匀,在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(酶标抗原稀释液),溶解混匀,在2-8℃下保存,E试剂(含吐温-20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液,用E洗涤液洗酶板2-4次,洗液不得溢出,每次间隔0.5-1.5分钟,放在吸水纸上拍干,在酶板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应,在37-38℃放置28-35分钟,再用洗涤液洗板4-6次,每次间隔1-2分钟,拍干,再加入酶底物混合液,混匀,在37-38℃放置13-18分钟显色,最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应,测定。
5、根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征是C试剂为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原,(酶标抗原)分二步进行制备:
①黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)(中间体)的制备:
(1)、合成:
取20-30mg黄曲霉毒素B1、30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底蒸馏瓶中,加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂,回流2-4小时,再室温搅拌15-20小时,减压挥干溶剂,得固体。
(2),提纯:
在上述固体中加入5-10ml蒸馏水,采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性,转移至分液漏斗中,2-5ml氯仿萃取,静置分层,得水相层,再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性,再用4-8ml氯仿萃取,得氯仿层,用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层,弃去水层,减压蒸馏,挥干溶剂得淡桔黄色固体
②黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。
(1)、合成:
取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中,混匀,依次加入150-200mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶,混匀,慢速搅拌15-30分钟,再加入150-200mg乙二胺3,3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐,在2-8℃搅拌15-18小时,并在5000-10000转/分钟,离心5-10分钟,取上清液。
(2)、提纯:
将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱,再用该缓冲液洗脱,部分收集器收集,洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值,绘制洗脱曲线,收集双峰并存的洗脱液,在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天,将含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液,小瓶分装冷冻干燥得粉状固体。
6、根据权利要求4所述的的检测黄曲霉毒素B1的方法,其特征在于所述的底物混合液,采用H试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)和F试剂(四甲基联苯胺)按H∶F=7-9.5∶3-0.5和每毫升此稀释液加14μlG试剂(H2O2)混合配制而成。(临用前半小时内配制)。
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