CN102768278B - 用于检测β-受体***的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能识别β-受体***的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞Sal所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201187。本发明还公开了用于检测β-受体***的酶联免疫方法和试剂盒及其在β-受体***检测中的应用。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体能够识别8种β-受体***类药物，识别范围广，本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及提供的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的β-受体***残留。

Description

用于检测β-受体***的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别8种β-受体***的单克隆抗体及酶联免疫方法和试剂盒。

背景技术

β－受体***是一组结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物，能与动物体内大多数组织细胞上的β-肾上腺素能受体结合，并激活β-肾上腺素能受体，从而加速细胞内脂肪的分解和游离脂肪酸的氧化．因此，β－受体***的主要功效是促进动物肌肉组织的增长，减少胴体脂肪的含量，提高瘦肉率．与此同时，可以不同程度的提高生长速度和饲料利用率。欧盟和其他一些国家和地区立法禁止使用β－受体***，我国农业部第235号公告规定禁止在动物性食品中使用。

有效控制β-受体***类药物滥用和残留，检测方法是关键。国内外文献中关于β-受体***残留检测方法，虽然仪器检测的灵敏度和准确度越来越优化和提高，但是有其难以避免的缺陷，有的提取方法繁琐，有的采用的仪器设备一般实验室少有配备（如超临界萃取），并且检测所需时间长，不利于大批量样品的筛选，不能快速的在现场进行检测。酶联免疫分析方法(ELISA)可以克服仪器分析的缺陷，是一种有效的大批量残留筛选方法，在此类药物上的应用有着很大的发展前景。酶联免疫分析法是将抗原抗体反应与现代测试手段结合的超微量分析法，集现代测试方法的高灵敏度和抗原–抗体反应的强特异性于一体（李俊锁等，2002）。相对于仪器分析法，免疫学分析法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点，适用于大批量样品的初筛。

Guy等(1993)将沙丁胺醇与牛血清蛋白结合制备完全抗原，免疫新西兰大白兔后得到对沙丁胺醇等5种β-受体***类药物偶交叉反应的多克隆抗体，其建立的酶免疫方法检测尿液样品中沙丁胺醇含量，最低检测限为0.14ng。Lei等（2008）用沙丁胺醇为半抗原制备的单克隆抗体对沙丁胺醇、克伦特罗、特布他林、肾上腺素有交叉反应，建立的ELISA方法最低检测限可达0.052ng/mL。上述研究中多克隆抗体的灵敏度较高，但不利于标准化；单克隆抗体虽利于标准化生产，但是灵敏度又不够，且检测的药物种类有限。因此，制备一种灵敏度高的能用于检测多种β-受体***的单克隆抗体和酶联免疫试剂盒，并建立相应的ELISA检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种能识别八种β-受体***（克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗、马布特罗、克伦丙罗、马喷特罗、特布他林和妥洛特罗）的单克隆抗体以及酶联免疫方法和试剂盒，本发明还提供所述单克隆抗体在制备检测β-受体***的酶联免疫试剂盒中的应用以及酶联免疫方法和试剂盒在β-受体***检测中的应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能识别β-受体***的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201187的杂交瘤细胞Sal所分泌的。

所述的杂交瘤细胞Sal，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201187。

所述的单克隆抗体在制备检测β-受体***的酶联免疫试剂盒中的应用。

包含所述的单克隆抗体的试剂盒。

所述试剂盒是用于检测β-受体***的酶联免疫试剂盒。

所述的试剂盒在β-受体***检测中的应用。

进一步，本发明提供了一种检测β-受体***的酶联免疫方法，包括以下步骤：

（1）将半抗原琥珀酸酐沙丁胺醇（SAL-SA）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（SAL-SA-BSA）；

（2）将半抗原对氨基苯甲酸沙丁胺醇（SAL-ABA）与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被原（SAL-ABA-OVA）；

（3）利用步骤（1）的免疫原制备得到保藏号为CCTCC NO:C201187的杂交瘤细胞Sal；

（4）利用保藏号为CCTCC NO:C201187的杂交瘤细胞Sal制备单克隆抗体；

（5）用步骤（2）的包被原包被固相载体；

（6）样品前处理：猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物；

（7）对步骤（6）的待测物进行检测。

所述的酶联免疫方法在β-受体***检测中的应用。

本发明的有益效果是：

1．本发明制备的单克隆抗体能够识别8种β-受体***类药物，识别范围广；

2. 本发明制备的单克隆抗体、酶联免疫试剂盒以及建立的酶联免疫方法灵敏度高，能检测更低浓度的β-受体***类残留，同时具有精密度高、灵敏度好的特点。

附图说明

图1为本发明的技术路线图。

图2为本发明的以克伦特罗为标准品的间接竞争ELISA反应标准曲线，X轴为克伦特罗（CL）标准溶液浓度对数值，Y轴为克伦特罗标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值（B/B₀）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1 免疫原和包被原的制备

1.1 沙丁胺醇免疫半抗原（SAL-SA）的合成

沙丁胺醇免疫半抗原（SAL-SA）依如下路线合成：称取沙丁胺醇碱80mg（0.33 mmol）用10mL甲醇溶解，旋转蒸发为黄色油状物，再加16mL无水乙醇溶解，并不断搅拌，然后逐滴加入丁二酸酐36mg（溶于吡啶溶液中，0.36mmol）。出现白色混浊后，用薄层色谱检测琥珀酸酐的结构。在室温条件下反应3h后，停止搅拌，2750r/min离心15min，弃去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀物3次，蒸干溶剂所得白色固体即为半抗原SAL-SA。

1.2 沙丁胺醇免疫原（SAL-SA-BSA）的制备

将SAL-SA 40mg溶于2mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF），1mL 1,4-二氧六环、30μL三正丁胺的混合溶液中，室温下搅拌30min，冰浴中加入氯甲酸异丁脂30μL，4℃搅拌反应5h得到A液。准确称取BSA 86mg，使其充分溶解在25mL硼酸盐缓冲溶液（pH8.5）中为B液。冰浴中，磁力搅拌下将A液缓慢滴加到B液中，4℃下搅拌反应过夜，之后装入透析袋，在pH7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，期间换透析液6次。低压冻干，即得偶联物SAL-SA-BSA，置-20℃保存，作为免疫原用。

1.3 沙丁胺醇包被半抗原（SAL-ABA）的合成

沙丁胺醇包被半抗原（SAL-ABA）依如下路线合成。称取对氨基苯甲酸137mg，溶于3mL 1mol/L的HCl中，冰浴搅拌。称取NaNO₂ 160mg溶于1mL超纯水中，低速搅拌状态下，将NaNO₂溶液每次100μL每隔15s滴加到对氨基苯甲酸溶液中，用TLC监测反应。称取沙丁胺醇240mg，溶于5mL硼酸盐缓冲液（0.05mol/L）中，待上述反应结束，将沙丁胺醇溶液逐滴加入，反应过夜，得到深红色半抗原溶液。

1.4 沙丁胺醇包被原（SAL-ABA-OVA）的合成

取SAL-ABA 3mL，加入40μL三正丁胺，冰浴搅拌15min后，加入40μL氯甲酸异丁酯，活化反应5.5h得到A液。称取OVA 46mg溶于20 mLpH9.6的碳酸盐缓冲溶液中为B液。将A液缓慢加入B液中，冰浴搅拌反应8h，之后装入透析袋，在pH7.4磷酸盐缓冲液中透析72h，期间换透析液6次。低压冻干，既得偶联物SAL-ABA-OVA，置-20℃保存。作为包被原用。

实施例2 单克隆抗体的制备

2.1 小鼠免疫

参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社 2001年版中的方法：以实施例1制备的SAL-SA–BSA偶联物为免疫原，免疫Balb/C雌性小鼠。免疫程序采用一次基础免疫及数次加强免疫。首次免疫时用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下进行基础免疫，以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠（效价高、灵敏度好）停止免疫以备融合。

2.2 细胞融合与筛选

在融合前3天（最好与上次免疫相隔3周以上）给免疫合格的小鼠腹腔注射含100μg免疫原的蛋白溶液（不加佐剂），强化免疫。根据骨髓瘤细胞的计数结果，取3～5×10⁷个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合（比例为1:10～5:10）。1500r/min离心5min，将离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上，控干水滴。轻轻地敲击管底，使管底细胞成糊状，将其放置于37℃水浴中，将吸有0.8mL预温至37℃的50% 聚乙二醇（PEG，购自Amersco）的lmL刻度吸管***到管底，60sec内缓缓加PEG到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，加完后静置90sec，将离心管插到离心管架上。移走水浴杯，用吸管吸取10mL预温至37℃的RPMI–1640基础培养液（购自Hyclone）沿管壁缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻晃动离心管，第1分钟逐滴加入1mL（3sec/滴），第2分钟再加2mL，最后加完剩下的7mL（5min内加完）。加完第一个10mL后，接着沿管壁补加RPMI–1640培养基至50mL，加完后拧紧盖，缓慢颠倒几次，混匀。1500r/min离心5min，弃去上清，用含有饲养细胞的72mL HAT完全培养基轻轻将融合细胞搅拌重悬。将融合细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，2滴/孔。一次融合可接种5块96孔细胞培养板，置于37℃ 5%CO₂培养箱中培养。从融合当天算起为0d，前面3d尽量不要动细胞板，保持培养箱内环境稳定。第3d每孔补加1滴HAT完全培养基（购自Amersco）并观察集落生长情况；第5d每孔吸出l/2培养上清（100μL），再加入1滴HT完全培养基（购自Amersco）；以后每隔3d同上法吸去l/2培养上清，换入HT完全培养基。根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底面积1/4左右即可取细胞培养上清，以发明人制备的SAL-ABA–OVA偶联物为包被原，利用ELISA方法筛选出分泌β-受体***类抗体的阳性细胞孔。对筛选出来的阳性细胞孔利用有限稀释法连续3次克隆化，最终建立一株稳定分泌抗β-受体***类抗体的杂交瘤细胞株， 对该杂交瘤细胞株进行染色体计数平均值为103.3条，高于亲本细胞的染色体数目（SP2/0骨髓瘤细胞的染色体平均数为58条，脾细胞染色体为40条），说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物。申请人将该杂交瘤细胞命名为Sal，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO∶C201187。

2.3 腹水单抗制备与鉴定

在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI–1640基础培养基悬浮细胞并将细胞数调至1×10⁶个/mL，每只小鼠腹腔接种0.5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水，纯化获得单克隆抗体。以鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒确定单克隆抗体为IgG1κ亚型。

实施例3 间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1 试剂配制

碳酸盐缓冲液（pH9.6）：准确称取Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

洗涤液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，加入Tween 20 0.50mL，定容至1000mL。

磷酸盐缓冲液(pH7.4)：准确称取NaCl 8.00g，KH₂PO₄ 0.20g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.90g，KCl 0.20g，少量超纯水溶解，定容至1000mL。

封闭液：准确称取卵清蛋白10.00g，加入磷酸盐缓冲液1000mL，搅拌混匀直至蛋白完全溶解。

底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用。

终止液：准确量取浓硫酸100mL，缓慢滴加到800mL超纯水中。

3.2 方阵滴定法

采用方阵滴定初步选择包被原浓度和抗体稀释度。使用碳酸盐缓冲液将SAL-ABA-OVA包被原倍比稀释成80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL，从第一至第七行依次横向加入96孔酶标板，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭2h；洗涤3次，拍干，单克隆抗体使用磷酸盐缓冲液倍比稀释成1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，从第一至第八列依次纵向加入96孔酶标板加入酶标板，37℃孵育30min；洗涤3次，拍干，各孔加入用磷酸盐缓冲液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体（简称二抗，以下所指二抗均为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞羿生物技术有限公司）100μL，37℃孵育30min；洗涤4次，拍干，各孔加入底物混合液100μL，避光显色15min；加入终止液50μL；用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值（OD值）。方阵滴定结果见表1，初步选择几个OD值接近2.0，且相邻两孔OD值有较大变化的包被浓度及对应的抗体稀释度组合。结果表明，可选择以下包被原浓度和抗体稀释度组合：（5，16000）和（10，32000）。

表1单克隆抗体方阵滴定

3.3 最佳包被浓度的选择

以克伦特罗为竞争物，设置为0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6μg/L浓度梯度，分别以3.2方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组合进行间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0（以无药物抑制时的OD值为B0，相应浓度药物抑制时的OD值为B值）作为纵坐标绘制抑制曲线。结果见表2，以“0”孔OD值和IC₅₀值作为判定指标，确定最佳包被原浓度。由数据可见，最佳包被浓度为10μg/mL，抗体稀释度初步确定为1: 32000。

表2 最佳包被浓度优化

包被原浓度（μg/mL）	抗体系数倍数（1:X）	0孔OD值	IC50值（μg/L）
				5	16000	2.324	0.78
10	32000	1.773	0.49

3.4 最佳抗体稀释度的选择

以最佳包被浓度包被酶标板，将抗体以1: 30000为中心浓度等差设计几个稀释梯度，其0孔与IC₅₀值见表3。随着抗体稀释度的增加，IC₅₀值降低，但是“0”孔值接近2.0，当0孔值过低时其IC₅₀值反而升高，因此选择1: 28000为最佳抗体稀释度。

表3最佳抗体稀释度优化

抗体系数倍数（1:X）	0孔OD值	IC50值（μg/L）
			28000	1.894	0.47
30000	1.654	0.43
			32000	1.488	0.38

3.5 标准曲线的建立

将克伦特罗标准品配制成0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6 μg/L等6个浓度梯度，按照优化后的间接竞争ELISA条件测定，绘制标准曲线（见附图2），重复5次。间接竞争ELISA检测方法的回归方程和相关指数为：y＝－2.2231x＋2.7328，r²＝0.9962，IC₅₀值为0.46±0.075μg/L（n＝5），线性范围为0.05～1.6 μg/L。

3.6 交叉反应实验

分别将各种β-受体***类药物标准品倍比稀释成浓度梯度进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC₅₀值，与克伦特罗标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果见表4。该单克隆抗体对8种β-受体***类有识别能力。

表4 单克隆抗体对β-受体***类药物的交叉反应率

药物	IC50(μg/L)	交叉反应率（%）
			克伦特罗	0.46	100
沙丁胺醇	0.86	53.5
			西马特罗	0.55	83.6
马布特罗	0.46	100
			克伦丙罗	0.64	71.8
马喷特罗	1.04	44.2
			妥洛特罗	7.3	6.3
特布他林	20.0	2.3
			莱克多巴胺	＞10000	＜0.005
多巴胺	＞10000	＜0.005
			异丙肾上腺素	＞100	＜0.46
利托君	＞100	＜0.46
			马波特罗	＞10000	＜0.005
非诺特罗	＞100	＜0.46

实施例4：本发明ELISA检测试剂盒的组装

4.1试剂盒组成：

⑴ 包被有包被原SAL-ABA–OVA的酶标板；

⑵ 克伦特罗标准品溶液6瓶，浓度分别为0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6 μg/L；

⑶杂交瘤细胞Sal单克隆抗体工作液；

⑷ 辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

⑸ 浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

⑹ 浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄ 2.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween-20 5mL，加双蒸水至1000mL

⑺ 底物混合液：准确吸取底物B液（购自武汉市飞远科技有限公司）10mL，加入100μL底物A液（购自武汉市飞远科技有限公司），混匀，现配现用。

⑼ 终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备：

⑴ 包被：用碳酸盐缓冲液将SAL-ABA–OVA稀释成10μg/mL包被原溶液，准确吸取100μL包被原溶液于各酶标孔，水平放置于湿盒，4℃孵育12h。

⑵ 洗板：甩出酶标板内包被原溶液，拍干，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑶ 封闭：准确吸取250μL封闭液于各酶标孔，水平置于湿盒内，37℃培养箱孵育2h。

⑷ 洗板：甩出封闭液，准确吸取250μL洗涤液于各酶标孔，静置30s后，甩出洗涤液，在吸水纸上拍干；重复洗涤3次。

⑸烘干：在吸水纸上拍干后；将酶标板于37℃培养箱中倒置烘干0.5h。

⑹封装：酶标板烘干后和干燥剂一起装入铝箔袋，用真空封装机封装。所述的干燥剂为硅胶或无水氯化钙其中的一种。

实施例5：试剂盒在动物可食性组织中β-受体***残留检测中的应用

5.1试剂配制

0.05mol/L 盐酸：准确量取浓盐酸4.1 mL，加入适量去离子水中混匀，定容至1000mL，即为0.05 mol/L盐酸。

样品提取液：0.05 mol/L 盐酸: 乙腈=6:4。

洗涤液：将试剂盒中提供的浓缩洗涤液液用去离子水10倍稀释，置4℃冰箱保存备用。

样本稀释液：将试剂盒中提供的浓缩样本稀释液用去离子水5倍稀释，置4℃冰箱保存备用。

5.2组织样品处理

猪尿样品 取1mL澄清猪尿（若尿液混浊，4000r/min离心10min后再取样）于10mL离心管中，加乙腈50uL，漩涡1min；4000r/min离心5min，取上清液检测。

猪肉样品 称取均质猪肉2.0±0.01g于50mL塑料离心管中，加入6mL样品提取液，涡旋1min；4000r/min 离心20min，取3mL上层液于10mL塑料离心管中，加入4mL乙酸乙酯于10mL塑料离心管，涡旋30S，4000r/min 离心10min。取乙酸乙酯层于30-50℃氮气吹干。加入1mL 样品稀释液，涡旋30S，再加1mL 正己烷涡旋30S，4000r/min 离心10min，取下层检测。

本方法对猪尿和猪肉样品的稀释倍数为1。

5.3  ELISA测定程序

⑴ 取出试剂盒，平衡至室温，将足够标准品和样品所用数量的孔条***微孔架。

⑵ 加克伦特罗标准品溶液或样品液50μL到各自微孔中；标准品和样品做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置。加抗体液50μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37 ℃孵育60min。

⑶ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤4次。

⑷ 加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育60min。

⑸ 甩净孔中液体，在吸水纸上拍干。准确吸取洗涤液250μL于各孔，静置30秒左右，甩净洗涤液，在吸水纸上拍干。重复洗涤5次。

⑹ 加底物混合液100μL至各孔，充分混合；水平置湿盒内，37℃孵育15min。

⑺ 加终止液50μL至各孔；充分混合；30min内在450nm处测量吸光值。

5.4 结果判定

将标准液或样品液吸光值的平均值除以“0”标准孔的吸光值再乘以100 %，即为抑制率。在0.05~1.6μg/L范围内，以抑制率为纵坐标，标准液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程。按照公式1计算样品的抑制率，将抑制率代入回归方程，计算出测定浓度，乘以稀释系数，即为样品中β-受体***的残留浓度。

 （公式1）

实施例6：本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

以最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。分别取均质空白组织样品（猪尿和猪肉）各20份，样品处理后ELISA测定。将测定的OD值代入标准曲线，计算空白样品的测定浓度、平均值及标准差。根据公式

+ 3SD，得到克伦特罗在各组织样品的最低检测限，沙丁胺醇在各组织的最低检测限可根据交叉反应率算出，结果见表5。本试剂盒对克伦特罗在猪尿和猪肉中的最低检测限分别为0.13μg/kg和0.16μg/kg，沙丁胺醇在在猪尿和猪肉中的最低检测限分别为0.24μg/kg和0.30μg/kg。

表5 试剂盒对各组织的最低检测限

6.2本发明试剂盒的精密度

分别将0、0.05、0.1、0.4、0.8、1.6μg/L克伦特罗标准品浓度对应的OD值代入其标准曲线方程求出ELISA检测的测定值，以标准品浓度测定值计算间接竞争ELISA标准曲线的板内板间变异系数，结果见表6。结果表明，标准曲线的板内及板间变异系数均＜15%，说明本研究建立的间接竞争ELISA方法具有较好的精密度。

表6 标准曲线的板内与板间变异系数

6.3本发明试剂盒的准确度

试剂盒的准确度用添加回收率来表示。将克伦特罗和沙丁胺醇在猪肉和猪尿中分别添加，使其浓度达到0.5 μg/kg和1.0 μg/kg，样品前处理后用本试剂盒进行测定，每批5个重复，重复测定3批，计算回收率和变异性。结果（见表7-表10）显示，本试剂盒在各组织的回收率均在69.8%～118.6%范围内，批内与批间变异系数＜22.3%。

表7 猪肉中克伦特罗添加回收率与变异系数

表8 猪肉中沙丁胺醇添加回收率与变异系数

表9 猪尿中克伦特罗添加回收率与变异系数

表10 猪尿中沙丁胺醇添加回收率与变异系数

Claims (8)

1.一种能识别β-受体***的单克隆抗体，其特征在于：它是由保藏号为CCTCCNO:C201187的杂交瘤细胞Sal所分泌的。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞Sal，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201187。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测β-受体***的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述的单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是用于检测β-受体***的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在β-受体***检测中的应用。

7.一种检测β-受体***的酶联免疫方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将半抗原对氨基苯甲酸沙丁胺醇与卵清蛋白偶联得到包被原；

（2）利用保藏号为CCTCC NO:C201187的杂交瘤细胞Sal制备单克隆抗体；

（3）用步骤（1）的包被原包被固相载体；

（4）样品前处理：猪尿样品加乙腈处理离心后取上清；猪肉样品经酸处理后用乙酸乙酯反萃，再取乙酸乙酯层氮气吹干，残渣复溶后离心取上清，得待测物；

（5）对步骤（4）的待测物进行检测。

8.权利要求7所述的酶联免疫方法在β-受体***检测中的应用。

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