CN103421108B - 合成四环素偶联抗原的方法 - Google Patents
合成四环素偶联抗原的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103421108B CN103421108B CN201310350832.1A CN201310350832A CN103421108B CN 103421108 B CN103421108 B CN 103421108B CN 201310350832 A CN201310350832 A CN 201310350832A CN 103421108 B CN103421108 B CN 103421108B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tsiklomitsin
- coupled antigen
- solution
- dissolve
- add
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种合成四环素偶联抗原的方法。本发明合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：a.四环素的衍生化；b.四环素与蛋白偶联；c.偶联抗原的纯化；d.偶联抗原的鉴定。本发明提供了一种能够高效合成四环素偶联抗原的方法，该合成方法过程简单，易于操作，无污染，合成率高，效价高，从而为检测四环素残留的免疫产品的开发和生产提高了效率，大大节约了成本，降低了免疫产品检测的费用和价格。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种合成四环素偶联抗原的方法。
背景技术
自1948年问世以来，四环素陆续被应用于临床，并已成为应用最多，最广泛的广谱抗菌素了。现在已有大量资料证实，长期反复使用四环素，可影响牙齿的发育和形成，不但使牙齿变黄，还会引起牙釉质发育不良或牙齿畸形。四环素可致肝毒性，通常为脂肪肝变性，妊娠期妇女、原有肾功能损害的患者易发生肝毒性。四环素可引起***反应：多为斑丘疹和红斑，少数患者可出现荨麻疹、血管神经性水肿、过敏性紫癜、心包炎以及***性红斑狼疮皮疹加重。为了控制四环素类药物在动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物最大残留限量为0.1mg/Kg。
目前快速检测动物性食品中四环素的残留多采用灵敏度高，检测时间短的免疫检测技术，这项技术的核心原料之一是四环素偶联抗原，四环素偶联抗原的合成方法报道的很多，但是目前存在合成率低，效价低的现象，必然使检测四环素残留的研发生产和销售***格偏高。
CN1861631公开了《四环素的偶联物及其制备方法与应用》，该方法的步骤是：将四环素与1-1’-羰基二咪唑（CDI）按摩尔比为1：1-1：3的比例溶在无水丙酮中，通入氮气，在氮气的保护下，37℃下避光反应2-4小时，反应生成四环素与1-1’-羰基二咪唑的活性中间体，备用；同时，以四环素与牛血清蛋白的摩尔数比为20：1-35：1的量，称取牛血清蛋白备用；将上述反应后的溶液A中的丙酮旋转蒸干，加入pH=8.5±0.5，浓度为0.5M的硼砂缓冲溶液生成的四环素与1-1’羰基二咪唑的活性中间体，然后再加入上述的牛血清蛋白，使牛血清蛋白的终浓度为10±5mg/ml，在氮气的保护下，20-30 ℃避光反应30-48小时，得溶液B；用pH7.3-7.5，浓度为0.01-0.02M的磷酸缓冲液在0-4℃下，搅拌透析溶液70-80小时，然后改用蒸馏水透析20-30小时，每6小时更换一次透析液；冻干透析后的溶液，得到淡黄色的四环素的偶联物。以上方法的缺点是：合成过程中需要通入氮气保护，增加了合成成本及方法的繁琐性；合成时间长，最短需要122个小时。因此需要针对上述的方法进行改进，探索一种低成本的、能快速合成四环素偶联抗原的方法。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种低成本的、快速的合成四环素偶联抗原的方法。
本发明是通过下述的技术方案来实现的：
合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：
a. 四环素的衍生化
称取四环素，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；
称取N，N-羰基二咪唑，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；
将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于34-39℃下搅拌衍生1-5小时；
b. 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白，加入PBS溶解，得到溶液③，将步骤a中衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于34-39℃搅拌反应3-8小时，然后4℃放置过夜；所述的放置过夜是指放置8-14小时；
c. 偶联抗原的纯化
将步骤b中偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃下放置，用蒸馏水透析1-3天，每隔4-8小时换蒸馏水一次；
d. 偶联抗原的鉴定
采用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释，所述的稀释倍数为1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
优选的，合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：
a. 四环素的衍生化
称取四环素2mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；
称取N，N-羰基二咪唑30mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；
将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时；
b. 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白10mg，加入600μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将步骤a中衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置过夜；所述的放置过夜是指放置8-14小时；
c. 偶联抗原的纯化
将步骤b中偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃放置，用500ml蒸馏水透析3天，每隔6小时换蒸馏水一次；
d. 偶联抗原的鉴定
用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释，所述的稀释倍数为1:2000,1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
本发明的反应原理如下：
本发明与CN1861631公开的《四环素的偶联物及其制备方法与应用》中的方法相比较，上述的文件中披露的方法，合成过程中需要通入氮气保护，增加了氮气保护的合成成本；本发明的方法合成过程中通过改变反应溶剂，不需要通入氮气保护，减少了合成成本；
而且本发明的方法简单，易于操作；合成时间短，最短需要28个小时，最长需要76个小时，而上述的文件中披露的方法较为繁琐；而且其合成时间长，最短需要122个小时，最长需要162个小时。
本发明提供的有益效果在于，合成方法简单，易于操作，无污染，合成率高，效价高，为检测四环素残留的免疫产品的开发和生产提高了效率，大大节约了成本，降低了免疫产品检测的费用和价格。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
（1） 四环素的衍生化
称取四环素2mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；
称取N，N-羰基二咪唑30mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；
将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时，得衍生化的四环素；
（2） 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白10mg，加入600μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置12小时，得偶联的四环素；
（3） 偶联抗原的纯化
将偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃放置，用500ml蒸馏水透析72小时，每隔6小时换蒸馏水一次；
（4）偶联抗原的鉴定
用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释（1:2000,1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000）包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
经测定，偶联抗原的蛋白浓度是8.1mg/mL, 效价是1:32000。
本实施例中，合成的时间为28小时；CN1861631中的合成时间为142小时。
本实施例中，无须加入氮气保护，CN1861631中，加入氮气保护，从而增加了成本；
产品的品质比较：偶联抗原的蛋白浓度是8.1mg/mL, 效价是1:32000，即包被浓度是0.25μg/ml，背景技术中CN1861631中的公开的包被浓度是10μg/ml。
本实施例与CN1861631相比，能够节约包被抗原使用成本40倍。
实施例2
（1） 四环素的衍生化
称取四环素5mg，加入600 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；称取N，N-羰基二咪唑60mg，加入600 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时；
（2） 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白20mg，加入1200μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置12小时；
（3） 偶联抗原的纯化
将偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃放置，用1000ml蒸馏水透析60小时，每隔6小时换蒸馏水一次；
（4）偶联抗原的鉴定
用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释（1:2000,1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000）包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
经测定，偶联抗原的蛋白浓度是7.1mg/mL, 效价是1:32000。
实施例3
（1） 四环素的衍生化
称取四环素1mg，加入150 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；称取N，N-羰基二咪唑15mg，加入150 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时；
（2） 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白(BSA)5mg，加入300μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置13小。
（3） 偶联抗原的纯化
将偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃放置，用500ml蒸馏水透析60小时，每隔6小时换蒸馏水一次。
（4）偶联抗原的鉴定
用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释（1:2000,1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000）包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
经测定，偶联抗原的蛋白浓度是7.6mg/mL, 效价是1:32000。
Claims (2)
1.合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：
a. 四环素的衍生化
称取四环素，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；
称取N，N-羰基二咪唑，加入N，N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；
将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于34-39℃下搅拌衍生1-5小时，得衍生化的四环素；
b. 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白，加入PBS溶解，得到溶液③；
将步骤a中衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于34-39℃搅拌反应3-8小时，然后4℃放置过夜，得偶联的四环素；
c. 偶联抗原的纯化
将步骤b中偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃下放置，用蒸馏水透析1-3天，每隔4-8小时换蒸馏水一次；
d. 偶联抗原的鉴定
采用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释，所述的稀释倍数为1：2000，1：4000，1：8000，1：16000，1：32000，1：64000包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
2.如权利要求1所述的合成四环素偶联抗原的方法，包括下述的步骤：
a. 四环素的衍生化
称取四环素2mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液①；
称取N，N-羰基二咪唑30mg，加入300 μL N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到溶液②；
将溶液①缓慢滴加到溶液②中，于37℃中搅拌衍生3小时；
b. 四环素与蛋白偶联
称取牛血清白蛋白10mg，加入600μL 0.01M PBS溶解，得到溶液③，将衍生化好的四环素缓慢滴加到溶液③中，于37℃搅拌反应5小时，然后4℃放置过夜；
c. 偶联抗原的纯化
将偶联好的四环素全抗原装入透析袋中，4℃放置，用500ml蒸馏水透析3天，每隔6小时换蒸馏水一次；
d. 偶联抗原的鉴定
用间接Elisa方法，将纯化好的四环素偶联抗原用0.01M PBS梯度稀释，所述的稀释倍数为1:2000,1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000包被酶标板，测定偶联抗原的活性及效价。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310350832.1A CN103421108B (zh) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | 合成四环素偶联抗原的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310350832.1A CN103421108B (zh) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | 合成四环素偶联抗原的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103421108A CN103421108A (zh) | 2013-12-04 |
| CN103421108B true CN103421108B (zh) | 2015-01-07 |
Family
ID=49646524
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310350832.1A Expired - Fee Related CN103421108B (zh) | 2013-08-13 | 2013-08-13 | 合成四环素偶联抗原的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103421108B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104725505B (zh) * | 2015-01-08 | 2018-01-19 | 山东绿都生物科技有限公司 | 一种高亲和力抗呕吐毒素单克隆抗体及其制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811454A (zh) * | 2006-01-19 | 2006-08-02 | 镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒 |
| CN1861631A (zh) * | 2006-03-14 | 2006-11-15 | 山东大学 | 四环素的偶联物及其制备方法与应用 |
| CN101429244A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-05-13 | 浙江大学 | 四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途 |
| CN103102300A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 四环素半抗原及其制备方法和应用 |
-
2013
- 2013-08-13 CN CN201310350832.1A patent/CN103421108B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1811454A (zh) * | 2006-01-19 | 2006-08-02 | 镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 | 一种四环素族抗生素酶联免疫检测试剂盒 |
| CN1861631A (zh) * | 2006-03-14 | 2006-11-15 | 山东大学 | 四环素的偶联物及其制备方法与应用 |
| CN101429244A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-05-13 | 浙江大学 | 四环素与载体蛋白偶联产物和四环素类抗生素抗体制备的方法及用途 |
| CN103102300A (zh) * | 2011-11-11 | 2013-05-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 四环素半抗原及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 刘兴泉等.N,N-二甲基甲酰胺的生产与应用.《化工科技》.2002,第10卷(第1期),第46-49页. * |
| 蔡宏道.抗原效价之测定.《使用临床检验学》.上海卫生出版社,1957,第1549页. * |
| 贾万钧等.酶标抗体(单克隆或多克隆)效价参考表.《抗原抗体反应动力学》.军事医学科学出版社,2004,第164-167页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103421108A (zh) | 2013-12-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stewart et al. | Non-peptide entry inhibitors of HIV-1 that target the gp41 coiled coil pocket | |
| CN106237947A (zh) | 高密度羧基修饰的磁性微球及其制备方法 | |
| Cristea et al. | Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes | |
| CN102565405A (zh) | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 | |
| CN103290124B (zh) | 一种卡那霉素a酶联适配体检测方法及应用 | |
| CN103421108B (zh) | 合成四环素偶联抗原的方法 | |
| Zhao et al. | An epitope imprinting method on the surface of magnetic nanoparticles for specific recognition of bovine serum album | |
| CN101865924A (zh) | 基于免疫磁珠联合酶联免疫吸附试验检测伏马毒素的方法 | |
| JP2009284902A5 (zh) | ||
| CN106866568A (zh) | 呋喃唑酮代谢物aoz衍生化半抗原、人工抗原的制备方法及其应用 | |
| CN112641729A (zh) | 一种高水溶性盐酸金霉素可溶性粉及其制备方法 | |
| EP4077285A1 (en) | Process for preparing fluralaner | |
| CN105277423B (zh) | 一种用于呕吐毒素富集净化的免疫磁珠及其制备方法和应用 | |
| CN114632070A (zh) | 一种以苯硼酸化壳聚糖为载体制备葛根素纳米粒的方法 | |
| CN107602666A (zh) | 一种硫酯订书肽及其制备方法与应用 | |
| CN1827642A (zh) | 氧氟沙星的偶联物及其制备方法与应用 | |
| CN106831498A (zh) | 呋喃西林代谢物sem衍生化半抗原、人工抗原的制备方法及其应用 | |
| CN108178777B (zh) | 一种泰乐菌素半抗原、人工抗原与抗体及其制备方法和应用 | |
| CN105273021A (zh) | 红霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和用途 | |
| CN110683965B (zh) | 硝呋地腙半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 | |
| CN112220755A (zh) | 一种盐酸多西环素可溶性粉及其制备方法 | |
| CN109438424B (zh) | 利巴韦林半抗原和人工抗原及其制备方法与应用 | |
| CN114034864B (zh) | 基于金纳米复合材料和多肽构建的核酸适配体荧光传感器对甲胎蛋白的检测方法 | |
| CN103288723B (zh) | 磺胺类药物半抗原及其制备方法和应用 | |
| Yang et al. | Preparation and application of a beta-d-glucan microsphere conjugated protein A/G |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150107 Termination date: 20150813 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |