CN1786183A - 一种高效酶解玉米蛋白制备生物活性短肽的技术 - Google Patents

Abstract

玉米淀粉加工的副产物－玉米蛋白，因其水溶性差，组成复杂，口感粗糙，赖氨酸和色氨酸含量较低，则玉米蛋白是一种非全营养蛋白，从而严重影响了该蛋白资源的应用。本发明是采用多酶体系对玉米蛋白水解制造具生物活性短肽的技术。筛选了二组生物法制造生物活性短肽的多酶体系；建立了一套有效地玉米蛋白原料的处理方法；设计建立了以玉米蛋白二次酶解为特点的生物反应器的加工***；形成了一套完整的利用多酶体系生产和分离制备玉米活性短肽的技术工艺路线，生产生物活性短肽混合物的得率达到36％以上。本发明的技术特点是建立了一条优化的技术路线，有效地提高了生物法生产玉米生物活性短肽的水解度和得率；同时又具有简易有效的分离制备的工艺、操作简单、无污染、成本低廉等特点。

Description

一种高效酶解玉米蛋白制备生物活性短肽的技术

一、背景介绍

生物活性肽(Bioactive peptides)是蛋白质经过特征酶或生物降解后产生的具有显著的生物学活性，且由数个至数十个氨基酸组成的肽类混合物，即蛋白水解产物(Protein Hydrolysates)。研究表明，酶切蛋白质释放生物活性短肽，是由被降解的蛋白质的结构基础决定的，其依据在于：从生物进化的角度看，营养和贮存蛋白应该是从功能蛋白进化而来，因为开始的生物是不可能合成大量的此类蛋白的。当生物进化到需要为后代发育提供营养时，其不可能凭空制造出一种营养蛋白，最好的方法就是通过许多功能区(结构域)DNA组装出营养或贮存蛋白的基因，所以在贮存和营养蛋白中可广泛存在着不同的功能区，选择适当的蛋白酶就可以将其释放出来，还原其功能特性；从免疫的角度看，尽管不同的生物都具有功能上非常相似的蛋白质，但是由于非功能区已存在着较大的氨基酸差异，所以不能互相使用，因为生物正是通过免疫***识别自身蛋白和外来蛋白的这些非功能区的差异来清除异己和保持自身的稳定性的。如果把注意力放在这些具有不同功能区的生物活性多肽上，则可能有效的避免生物免疫排斥反应的困扰。另外，20世纪50年代，人们研究发现蛋白质的多肽片段要比氨基酸更易为人体所吸收，它们可以直接通过小肠壁进入血液。这使得人们对蛋白质来源的多肽特别是其对生物体产生的生理功能产生了极大的兴趣，并引发了世界范围内的研究热潮。截止到现在，人们已发现和分离出一百多种存在于人体的具有重要生理活性的多肽，使学术界和企业界对于肽的研究和利用产生了极大的关注，特别是关系人类健康的保健品其研发的前景将会产生不可估量的未来。

近年来，国外已经有大量的生物活性肽通过蛋白酶水解营养或贮藏蛋白释放和辨别出来。我国水解蛋白制备生物活性多肽的研究相对滞后，直至90年代才有一些研究报道。据初步调查，国内虽然有多家单位进行了不同蛋白来源(如酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白等)的生物活性肽的研究，但成功生产的蛋白水解物或生物活性肽产品很少，而研究开发出具特征功能以及有良好功能配伍性的产品更是寥寥无几，最显著的问题是还没有形成一套完整适合于产业化的生产活性肽的生产技术体系。总之，对动植物蛋白的有效利用，开发生物活性短肽具有巨大的产业化价值和市场潜力，必将会产生显著的社会效益和经济效益。

玉米蛋白(Corn Gluten Meal)水溶性差，组成复杂，口感粗糙，严重影响了其在食品中的应用。不仅如此，玉米蛋白就氨基酸组成而言，赖氨酸和色氨酸含量较低，为其限制性氨基酸，根据衡量氨基酸组成的木桶平衡理论，玉米蛋白是一种非全营养蛋白。因此作为人类的营养成分，玉米蛋白的利用受到限制；又加之玉米蛋白原料丰富，价格低廉，玉米淀粉的副产物很多未经利用即自然排放，这不仅是对可利用粮食资源的极大浪费，而且对环境造成一定程度的污染。据有关统计，我国每年随废液排走的玉米蛋白高达8万吨以上，其余主要用作蛋白饲料，也就是说玉米蛋白质的利用率极低。但是随着人类对蛋白资源的重视和对生物活性短肽的科学研究的不断深入，掌握了酶解天然蛋白资源制备生物活性短肽的基本理论和技术方法，对玉米蛋白可实现有限的酶解过程，能生产出高营养且易于吸收的、高附加值的具生物学功能特性的生物制品。从酶解玉米蛋白制备生物活性多肽的研究结果统计可知，可释放出具生物活性的多肽主要有：(1)玉米降压肽：降血压肽通过抑制人体中血管紧张素转换酶(AgiotensinI-converting Enzyme，EC.3.4.15.1，缩写为ACE)活性而达到降血压的作用。ACE的抑制肽最早发现于蛇毒中。人们于90年代发现许多天然蛋白水解可以得到具有ACE抑制活性的多肽，这些寡肽的共同特征是C-末端为pro或芳香族氨基酸，而N-末端往往是疏水性氨基酸。玉米蛋白含有高比例的Val、Ile、Leu、Pro和Gln等，很少含有Lys等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组成使玉米醇溶蛋白的水溶性差，营养价值不高，而这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白成为多种生理活性肽，特别是降血压肽的来源。α-玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白的酶解产物就具有较为显著的抗高血压的作用。降解α-玉米醇溶蛋白时所得到的血管紧张素抑制剂大多数为三肽，其C-末端一般具有四种不同的氨基酸：Pro、Tyr、Ala、Glu。(2)高F值寡肽：早在1970年，Fisher等人发现肝病病人血液中的氨基酸组成失常：对于正常人而言，血液中支链氨基酸与芳香族氨基酸之比约为3-3.5，而肝病病人只有1.0或更低。他们将支链氨基酸对芳香族氨基酸的摩尔比称之为F值(Fisher ratio)。就氨基酸而言，赖氨酸和色氨酸较低，为其限制性氨基酸，但支链氨基酸和中性氨基酸的含量相当高，是植物中颇为少见的特色组成，早期特别是营养学家以此使玉米蛋白的利用受限制，但近年来却是玉米蛋白深层次加工的依据。谷文英等人对酶解玉米蛋白制备高F值肝性脑病防治肽进行了较为深入的研究，确立了制得F值＞20的高F值功能性低聚肽混合物的技术路线。而且，经动物实验证实了其效果相当于市售的氨基酸配置品，如肝醒灵、六合氨基酸静脉输液等。(3)谷氨酰胺活性肽：长期以来Gln被认为是非必需氨基酸，而且Gln单位不稳定，这是传统氨基酸营养液或输液中不含Gln的主要原因。自从认识到应激状态下Gln的必需作用后，才开始重视Gln代用品的研究开发。玉米蛋白中Gln含量丰富，为开发Gln活性肽提供了物质条件。任国普等人采用复合酶、胃蛋白酶对酶解玉米蛋白制备Gln活性肽的技术路线进行了探索，确定了Gln活性肽的制备工艺和最佳工艺条件，最终产品中Gln组成百分比大约为18.16％。(4)抗氧化肽：抗氧化肽是指生物体内源性的或由生物体内蛋白质降解后的寡肽。李相鲁以玉米蛋白粉为原料，制备了具有较高纯度的抗氧化肽(Leu-Asp-Tyr-Gln)。发现该抗氧化肽对自由基造成的各种线粒体损伤、流动性下降、ATPase酶活性降低、线粒体膨胀等均有不同程度的抑制作用。(5)醒酒肽：武汉天天好生物工程公司从玉米蛋白中成功的提取了醒酒肽，实验证明可缩短醉酒时间。利用玉米蛋白粉制备含有丰富支链氨基酸(Leu、Ile、Val)的短肽，口服后通过提高血液中的丙氨酸和亮氨酸浓度产生稳定的脱氢辅酶NAD+，增强乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的活性，促进体内乙醇的分解和代谢，从而降低血液中乙醇的浓度，达到醒酒的作用。从目前玉米蛋白的利用现状可知将酶解玉米蛋白粉所得的生物活性肽混合物制成功能性食品，目前已显现出可观的市场前景。

本发明是采用多酶体系对玉米蛋白水解制造具生物活性短肽的技术。该技术***地筛选了二组生物法制造生物活性短肽的多酶体系；建立了一套有效地以玉米蛋白为原料的处理方法，经适度变性的玉米蛋白提高了酶解效率；同时设计建立了酶解玉米蛋白的生物反应器，实现了玉米蛋白的高效二次酶解；最终研究建立了一套完整的利用多酶体系生产和分离制备玉米活性短肽的技术工艺路线，玉米蛋白生物活性短肽混合物的得率达到36％以上。本发明的技术特点是建立了一条优化的技术路线，提高了生物法生产玉米生物活性短肽的水解度和得率。

二、生产玉米短肽的技术路线

本发明生产玉米生物活性短肽的工艺路线见附图。[注：附图为“生产玉米短肽的技术路线图”]。

三、具体实施方式

1、将玉米蛋白粉与水按1∶5～1∶15配制成粗分散***。

2、20℃～80℃恒温条件下，添加促进使底物适度变性的复合添加剂(变性剂A)，调制pH＝7.0～10.0，处理过程维持10～20min左右。

3、添加0.1％～2％(V/V)的Alcalase AF 2.4L或碱性蛋白酶(酶活力为10万以上)对处理的玉米蛋白进行专一性酶解，酶解反应过程采用pH-stat自动***监控，酶解1h～1.5h。【注：酶活力单位定义：每毫升酶制剂在37℃，pH＝7.5条件下每分钟水解酪蛋白产生1ug酪氨酸的所需酶量为酶的一个活力单位】。

4、利用10,000～50,000Da的超滤膜对上述酶解液进行超滤，收集的滤液，对未反应的蛋白和酶循环泵入生物反应器1，使酶解蛋白的水解度达到一定的水解度，获得第一次酶解滤液。

【注：在该酶解过程中注意监测酶活，目的是控制保持酶解反应的酶量及酶活水平】。

5、将第一次酶解的超滤液泵入生物反应器，调节超滤液温度维持在20℃～55℃，pH＝7～10。

6、添加0.1％～3.0％(W/V)的复合风味蛋白酶(包括：风味酶，氨肽酶、中性蛋白酶等)(酶活力为5万)。反应采用pH-stat自动滴定***控制酶解反应条件，酶解1h左右终止反应，获得第二次酶解液。

7、滤液选用300Da～5,000Da的超滤膜进行超滤处理。收集分子量在6000Da左右的水解产物的滤液；大于6000Da的产物和酶循环泵入酶解生物反应器2。合并收集全部符合产品质量要求的酶解液，适度浓缩(蛋白含量维持在30％～35％以上)，进行真空喷雾干燥，获得最终产品-玉米生物活性短肽。其得率达到36％以上。

【注：在该酶解过程中注意监测酶活，目的是控制保持酶解反应的酶量及酶活水平】。

Claims (7)

1、一种高效酶解玉米蛋白制备生物活性短肽的技术，其特征在于筛选了二组生物法制造生物活性短肽的多酶体系；建立了一套有效地玉米蛋白原料的处理方法；设计建立了以玉米蛋白二次酶解为特点的生物反应器的加工***；形成了一套完整的利用多酶体系生产和分离制备玉米活性短肽的技术工艺路线。

2、根据权利要求1所述，本发明制造生物活性短肽所选用的多酶体系，包括酶制剂有：Alcalase AF 2.4L，2709碱性蛋白酶，胰蛋白酶，中性蛋白酶、Flavourzyme、胃蛋白酶。

3、根据权利要求1所述，有效地玉米蛋白原料的处理方法，主要包括物理的方法和化学方法相结合，使用的物理学方法是热处理和超声波处理；化学法是碱、亚硫酸氢钠等，添加量为0.1％～5％。

4、根据权力1所述，高效二次酶解玉米蛋白的生产工艺路线的特征在于采用pH-stat反应控制体系与优化的超滤***组合方式。

5、根据权力1和4所述，本工艺优化的超滤***为二次超滤。一次超滤截留的分子量为10,000Da～50,000Da。二次超滤截留的分子量为300Da～5,000Da。

6、根据权力1和4所述，本工艺优化的超滤***，其酶解产物大于6000Da的物质，采用再循环酶解的方式，达到理想的酶解效率。

7、根据权利1、2和4所述，玉米蛋白二次酶解的条件分别是：一次酶解体系温度为20℃～55℃，pH为7.0～9.0，搅拌速度为100r/min～500r/min。二次酶解体系温度为10℃～60℃，pH为6.5～9.0，搅拌速度为100r/min～500r/min。