CN1778824A - 几种均一体银耳多糖及其提取方法和以该化合物为活性成分的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了几种均一体银耳多糖及其提取方法和以该化合物为活性成分的药物组合物。将银耳孢子发酵物经水煮、醇沉或不同浓度的NaOH水溶液梯度提取，经柱层析分离、纯化得到含量在90％以上碱提银耳多糖ATF－A、ATF－B、ATF－C、ATF－D，水提银耳多糖WTF－A、WTF－B。取治疗有效量的均一体银耳多糖与药用辅料混合制成各种不同的制剂。该制剂具有增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗衰老、抗病毒等作用。

Description

几种均一体银耳多糖及其提取方法 和以该化合物为活性成分的药物组合物

技术领域

本发明涉及几种中药多糖物质，更具体地说，是从中药银耳中经提取、分离得到的几种均一体银耳多糖。同时也公开了其提取方法，和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及该组合物在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗衰老、抗爱滋病等药物中的应用。

背景技术

银耳(Tremella fuciformis Berk缩写为TF)又称白木耳，是一种高等真菌，属于有隔担子菌亚纲银耳科。银耳是世界公认的珍贵食用菌和重要药材，具有多方面的生物活性，包括抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗辐射、免疫调节、促进蛋白质、核酸生物合成等。

目前，市场上已有银耳孢糖胶囊及各种银耳保健品，这些均由银耳粗提物制成，有效成分含量低，杂质多，水溶性不好，特别是在胃肠吸收率较低，制成的胶囊、片剂口服效果较差，起不到较好的治疗效果。另外，由于目前银耳多糖只做到粗提物，因此尚不能做成注射剂，影响了疗效的正常发挥。现有专利及各种杂志上对多糖的研究大多局限于水溶性组份上，而对于水难溶性组分的研究比较少，已发表的有碱提山茱萸多糖、碱提鬼毛针多糖、碱提箬叶多糖等。

本发明从银耳孢子发酵粉中水溶性部分提取得到了两种均一体多糖(WTF-A、WTF-B)；从银耳孢子发酵物中水不溶性部分，用碱液提取得到4种均一体多糖(ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D)，均为杂多糖，特别是碱液提取银耳孢子发酵物，目前尚未见任何文献报道。

发明内容

鉴于上述原因，本发明人对银耳孢子发酵物的水溶性组份、水难溶性组份进行了大量的实验研究，确定了水提、碱液梯度提取、分离、纯化银耳多糖和结构分析等一系列方法，从而完成了几种均一体银耳多糖的发明。

本发明的第一个目的在于，提供了几种均一体银耳多糖，简称ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D、WTF-A、WTF-B。

本发明的另一个目的在于，提供了几种均一体银耳多糖的提取方法。

本发明的再一个目的在于，提供了以几种均一体银耳多糖为活性成分的药物组合物。

本发明的还一个目的在于，提供了以几种均一体银耳多糖为活性成分的药物组合物在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗衰老、抗爱滋病等药物中的应用。

本发明所述的几种均一体银耳多糖，它是由银耳孢子发酵物经水煮、醇沉、除蛋白或用不同浓度的NaOH水溶液梯度提取后，经柱层析分离、纯化得到含量在90％以上的几种均一体银耳多糖；主要含有以下成分：碱提银耳多糖ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D，水提银耳多糖WTF-A、WTF-B；经高效凝胶柱色谱法分析，它们的重均分子量分别为62830、63710、58962、51454、73000和68000；其中，

ATF-A主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成；

ATF-B主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成；

ATF-C主要由D-葡萄糖、L-鼠李糖组成；

ATF-D主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖组成；

WTF-A主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖及D-葡萄糖组成；

WTF-B主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖组成。

所述的几种均一体银耳多糖的提取方法，包括如下步骤：

A.水溶性均一体银耳多糖的提取：

(1)银耳孢子发酵粉加水煮提，冷却后离心，上清液浓缩后加乙醇沉淀。过滤取沉淀，真空干燥得粗多糖。

(2)粗多糖加水煮提，冷却后离心，上清液用sevage法除蛋白，除蛋白后的溶液用乙醇沉淀。过滤取沉淀，真空干燥得精制多糖。

(3)取精制多糖经凝胶柱层析分离，用氯化钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩加乙醇沉淀，真空干燥，制得水提均一体银耳多糖WTF-A、WTF-B。

B.水难溶性均一体银耳多糖的提取：

在用热水提取出水溶性组份后，对其余的水难溶性组份采用不同浓度的氢氧化钠碱液梯度提取，经过酸中和、乙醇沉淀、用Sevage法除去蛋白质后，纤维素柱层次进行分离和纯化，得到四个多糖组份，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D均为杂多糖.经鉴定为本发明的均一体多糖，具体操作如下：

(1)在用热水提取出水溶性组份后，对其余的水难溶性组份以0.1mol/L-10mol/LNaOH水溶液梯度提取，盐酸中和至中性，浓缩至小体积，用流动水透析，70-90％乙醇沉析，制得碱提粗多糖；

(2)碱提粗多糖经sevage法除蛋白，用流动水透析，70-90％乙醇沉析，得精制多糖；

(3)将精制多糖上纤维素柱层析分离，用不同浓度的氯化钠水溶液洗脱，收集不同洗脱液，浓缩后醇沉，真空干燥，制得碱提均一体银耳多糖，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D。

所述的凝胶层析柱包括DEAE-Sephadex gel A-25和Sephadex G-200、Sephadex G-100、Sephadex G-150。所述的纤维素柱层析包括DEAE-52-cellulose、DEAE-32-cellulose。

所述的sevage法除蛋白是指氯仿∶正丁醇＝4∶1的方法。

本发明所述的以均一体银耳多糖为活性成分的药物组合物，是指该组合物含有治疗有效量的均一体银耳多糖，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。

其中，所述的均一体银耳多糖的治疗有效量一般为0.1～500mg；较好为1～200mg；最佳5～100mg。

所述的组合物包括口服制剂、液体制剂或外用制剂。其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液等注射给药制剂；外用制剂为霜剂或膏剂。

所述的大、小输液是指均一体银耳多糖氯化钠或葡萄糖注射剂。

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，抗氧剂(如焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠)，防腐剂(苯甲醇)；稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与均一体银耳多糖混合，当均一体银耳多糖用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。

各种药物制剂的制备具体操作如下：

(1)、按配置总量计称取含10-70％均一体银耳多糖，加入30-90％的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂等，充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时压制成片，使每片含均一体银耳多糖40-240mg；或将制成的湿颗粒直接在60-70℃干燥2-4小时，然后充填入空胶壳中，使每粒胶囊含均一体银耳多糖30-280mg。

(2)、注射液和大、小输液的制备：是取0.01-70％的均一体银耳多糖与蒸馏水配液，或加入稳定剂，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得。

所述的冻干剂是由0.08-50％均一体银耳多糖与药用辅料(乳糖、甘露醇、甘氨酸、山梨醇、葡萄糖的一种或几种的组合)混合，较好的药用辅料是甘露醇，分装灭菌，制得。

(3)、按配置总量计称取含10％-60％均一体银耳多糖，加入40％-90％的填充剂、崩解剂、矫味剂等，充分搅拌混合用12-14目筛制成颗粒。在60-70℃干燥2-4小时，使每克颗粒剂含均一体银耳多糖100-300mg。

(4)、按配置总量计称取含10-60％均一体银耳多糖，加入40％-90％的填充剂、抗氧剂等，加热熔融温度(40-90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成丸，使每粒滴丸含均一体银耳多糖4-30mg。

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量为一般为0.1～300mg/kg；较好为0.1～100mg/kg；最佳.0.1～60mg/kg。可根据临床的病理体症适当加以改变。

本发明的均一体银耳多糖(ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D、WTF-A、WTF-B)具有如下的理化特性：

一、光谱分析：

1.红外光谱；

将六种多糖纯品进行傅立叶转换红外光谱测定。结果显示，3400cm^-1的宽峰为O-H和N-H的伸缩振动，2930cm^-1为C-H的吸收峰，这两组峰是糖类的特征吸收峰；另外6个多糖在1022cm^-1和1150cm^-1附近处都有吸收，说明它们都是吡喃糖；样品在850cm^-1附近处都有吸收，说明多糖结构中存在着α型糖苷键(即α端基差向异构体)，六个多糖皆为α-吡喃糖。

2.紫外扫描：

Shimadzu UV-3000紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)。将六种多糖溶于水，配成10mg/50ml的溶液，进行紫外扫描，波长为200nm-800nm。扫描结果样品在260nm和280nm处都没有吸收，说明这六个多糖中均不含有核酸和蛋白质。

二、纯度测定：

凝胶柱色谱：取六种多糖各15g溶于最小体积的0.9％Nacl中，加入Sephadex G-200(2.5×33cm)柱顶。用0.9％Nacl洗脱，流速1.5ml/小时，1ml/管分部收集，苯酚硫酸法测定各管多糖含量，用752分光光度计测定吸光度。一直洗脱到多糖的反应呈阴性，合并相同组分，绘制洗脱管数与吸光度的关系曲线，结果表明，碱提银耳多糖ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D，水提银耳多糖WTF-A、WTF-B的Sephadex G-200凝胶柱层析洗脱曲线均为单一对称峰，说明该样品为均一体多糖。

三、平均分子量测定：

液相色谱条件：

色谱柱为TSK G 4000PWXL(6×300mm)；检测器为Shodex；柱温为35℃；进样量为20μl；流动相为0.7％Na₂SO₄，流速为0.5ml/min。

六种多糖的分子量分别为ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D、WTF-A、WTF-B它们的重均分子量分别为62830、63710、58962、51454、73000和68000。

四、均一体多糖组成测定：

1、水溶性均一体多糖纸层析：

(1)层析纸：Whattman No1层析滤纸。

(2)展开剂：正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)；醋酸乙酯-吡啶-水(10∶4∶3)

(3)显色剂：苯胺-邻苯二甲酸(0.93g苯胺，1.66g邻苯二甲酸溶于100ml水饱和的正丁醇中)。

(4)方法：取样品WTF-(A-B)各8mg，分别用2N H₂SO₄ 1mL封管，100℃水解6hr，碳酸钡中和至中性。抽滤，取滤液，浓缩点样。用正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)和醋酸乙酯-吡啶-水(10∶4∶3)为展开剂展开，相应的标准品做对照，展开完毕后，挥干展开剂，喷显色剂。

2、水难溶性均一体多糖纸层析

(1)层析纸：Whatman No.1层析滤纸

(2)展开剂：乙酸乙酯-吡啶-水-冰醋酸(5∶5∶3∶1)

(3)显色剂：苯胺-邻苯二甲酸(0.93g苯胺和1.66g邻苯二甲酸溶于100ml水饱和的正丁醇)

(4)方法：分别取ATF-(A-D)各个多糖纯品10mg溶于2m12mol/L三氟乙酸中，封管，沸水浴中水解6小时。冷却后点样，用上述展开剂饱和、展开后喷显色剂，用相应的单糖标准品做对照。

3、气相色谱分析：

A.将水解物加入10mg盐酸羟胺及1ml无水吡啶，温热溶解后置于90℃水浴中加热30min，冷至室温后，加入1ml无水乙酸酐，继续在此水浴上加热30min，乙酰化完成，样品直接检测。并用此方法将相应的单糖标准品乙酰化后一并送样。

B.气相色谱条件：

色谱柱为石英毛细管柱，固定液为SE-52，柱长30米；柱温在180℃维持5min后每分钟升高3度，在250℃维持10min；检测器为FID；进样室温度为270℃；载气为N₂，流速为50ml/h。

C.气相色谱结果：

ATF-A主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成。

ATF-B主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成。

ATF-C主要由D-葡萄糖、L-鼠李糖组成。

ATF-D主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖组成。

WTF-A主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖及D-葡萄糖组成。

WTF-B主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖组成。

本发明还公开了均一体银耳多糖在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗衰老等药物中的应用。

下述的药理实验证实了均一体银耳多糖具有增强免疫，抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒等药理作用。

一、抗肿瘤作用：银耳多糖抑制淋巴瘤实验

1材料

1.1动物选择：

中国医学科学院放射医学研究所繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用。

1.2瘤种：

中国医学科学院放射医学研究所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。

1.3药物配制：

取多糖WTF-B，配制成浓度为6mg/kg、12mg/kg，溶剂为蒸馏水。

2方法：

2.1接种：

选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁尔灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。

疗效评价：停药后24小时处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。

肿瘤抑制率：C-T/C×100％

式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重

实验结果：

组别			体重(g)X±(S·D)		瘤重(g)X±(S·D)	抑瘤率(％)	P值
								开始	最终	开始	最终
		♂♀/2
对照					10	10	30.2±2.5	34.3±4.4	1.24±0.66
	6mg/kg	20	20	29.8±2.7								33.8±5.4	1.23±0.57	0.81％
12mg/kg					20	20	30.5±3.4	32.8±1.6	0.48±0.49	61.3％	P＜0.01

结果表明，银耳多糖在12mg/kg时，对淋巴瘤的抑制率为61.3％。

二.抑制淋巴瘤放射增效作用：

1材料

1.1动物选择：

中国医学科学院放射医学研究所自繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用。

1.2瘤种：

中国医学科学院放射医学研究所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。

1.3药物配制：

取多糖WTF-A，配制成浓度为6mg/kg，溶剂为蒸馏水。

2方法：

2.1接种：

选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁尔灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。

2.2分组给药

接种后次日将动物随机分组，设对照组及r射线组、药物和r射线合用组，每天给药一次，腹腔注射，每次0.5ml，对照组给予蒸馏水0.5ml，连续给药10天。r射线组，每天用1Gy的r射线照射1分钟，连续照射8天。

2.3疗效评价：停药后24小时处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。

肿瘤抑制率：C-T/C×100％

式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重

多糖(6mg/kg)和1Gy r射线合用抑制淋巴瘤实验

组别	动物数(只)		体重(g)X±(S·D)		瘤重(g)X±(S·D)	抑瘤率％	P值
								开始	最终	开始	最终
	对照	10	10	30.2±2.5								33.4±4.4	1.24±0.66
r射线					10	10	30.3±3.8	31.9±4.6	0.7±0.25	43.5	P＜0.05
	药+r射线	10	10	30.5±3.8								31.5±2.8	0.34±0.32	72.6	P＜0.001

结果表明，多糖在浓度6mg/kg时和1Gy的r射线照射合用，对IRM-2小鼠的淋巴瘤抑制率为72.6％(P＜0.001)，与对照组相比差异显著。

三.抗辐射作用：

1.实验材料

1.1动物：纯种C57小鼠，体重22-24g。

1.2实验方法：

1.2.1分组与给药：动物随机分为四组(15只/组，雌雄各半)：对照组、药物(ATF-B)6mg/kg、12mg/kg、24mg/kg三个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。

1.1.2致伤条件：¹³⁷Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为：7.005Gy和7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。

1.1.3观察指标：(1)股骨有核细胞数BMC(The number of nucleated cellsin bone marrow)，照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，生理盐水冲洗骨髓。电子显微镜下记数细胞数。

(2)脾脏结节数CFU(Colong forming unit of spleen)和脾指数，取出脾脏，称重，计算脾指数。将脾脏放入Bouin氏液内，24小时后，肉眼记数突出脾脏表面的结节数(CFU-S)。

实验结果：

小鼠照后第9天股骨有核细胞数、脾结节数和脾脏指数

组别	BMC×106股骨/根	脾指数脾重(mg)/体重(g)	CFU-S个/脾	照射剂量Gy
					对照组6mg/kg12mg/kg24mg/kg	1.31±0.181.53±0.33*2.01±0.38***1.73±0.49**	0.993±0.2061.115±0.196*1.084±0.1881.134±0.186	1.29±1.142.80±3.2***1.07±0.961.38±1.02	7.005
对照组6mg/kg12mg/kg24mg/kg	1.795±0.282.27±0.44**3.26±0.52***3.34±0.75***	1.03999±0.33411.1353±0.1451.062±0.161.174±0.335	1.64±1.490.93±0.701.08±0.922.2±1.6	7.5

注：*P＜0.05    **P＜0.01    ***P＜0.001

银耳多糖在6mg/kg、12mg/kg、24mg/kg三个剂量时BMC经统计学处理与对照组相比有显著性差异。

造血器官是射线的敏感器官，受照后造血组织的损伤是其最重要的病理变化，造血功能的恢复是预后的关键因素。CFU-S系代表一类多向性的造血干细胞群，它们具有自我更新和向骨髓红系、粒系和巨核细胞分化的能力，CFU-S是促进造血恢复的主要成分。BMC是骨髓中的有核细胞成分。CFU-S和BMC的变化代表机体造血组织恢复的能力。从本实验中可以看出，银耳多糖可以保护辐照小鼠的造血功能，具有抗辐射作用。

四.升白作用：

1.实验材料：

1.1动物：纯种C57小鼠，体重22-24g.

1.2实验方法：

1.2.1分组与给药：动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)：对照组、药物(ATF-D)6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。

1.2.2致伤条件：¹³⁷Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为：7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。

观察指标：(1)白细胞数：照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，眼眶取血，白细胞稀释液稀释，电子显微镜下记数细胞数。

(2)DNA含量，照射后第9天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，生理盐水冲洗骨髓。加入反应液，紫外分光光度计上测定吸光度。

(3)CFU-S(Colong forming unit of spleen)将脾脏放入Bouin氏液内，24小时后，肉眼记数突出脾脏表面的结节数(CFU-S)

实验结果：

                银耳多糖对辐射损伤小鼠升高白细胞实验

组别	DNA(OD/根)	WBC×109/L	CFU-S
				对照6mg/Kg15mg/Kg30mg/Kg60mg/Kg	0.111±0.0260.115±0.0240.098±0.0210.119±0.0210.166±0.08	0.185±0.0850.258±0.1460.267±0.1330.308±0.0860.475±0.157	0.1±0.3160.33±0.5160.33±0.520.167±0.40.83±0.754

经统计学处理，60mg/Kg组，DNA(OD/根)，WBC×10⁹/L，CFU-S各项指标，

与对照组相比差异显著。

五、增强免疫力实验

1.实验材料：

1.1动物：纯种C57小鼠，体重22-24g.

1.2实验方法：

1.2.1分组与给药：动物随机分为五组(15只/组，雌雄各半)：对照组、药物6mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg四个剂量组。照射前第3、2、1天连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只，对照组给与生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。

1.2.3致伤条件：¹³⁷Cs-γ射线一次全身照射，剂量分别为：7.5Gy，剂量率为89.1404伦/分。

观察指标：(1)脾指数：取出脾脏，称重，计算脾指数

          (2)胸腺指数：取出胸腺，称重，计算脾指数

银耳多糖对辐射损伤小鼠提高免疫力实验

组别对照6mg/Kg15mg/Kg30mg/Kg60mg/Kg

脾指数0.77±0.3760.89±0.2650.98±0.2440.91±0.1861.05±0.06

胸腺指数1.13±0.2941.07±0.3091.27±0.2461.29±0.2021.72±0.375

经统计学处理，60mg/Kg组，脾指数，胸腺指数两项指标与对照组相比有显著性差异。

六、抗病毒作用：

1.材料

1.1细胞及病毒

胎牛肺细胞(Fetal Bovine Lung，FBL)，牛免疫缺陷病毒R29毒株(BovineImmunodeficiency Virus R29 strain，BIVR29)

1.2试剂与药品

DMEM培养基、青霉素/链霉素(P/S)、Trypsin、Tris、EDTA、胎牛血清(美国GIBCO/BRL公司)。AZT购自Sigma公司。

1.3药品

(1)阳性对照药物AZT溶于二甲基亚砜(DMSO)中，浓度0.1mM(0.026mg/ml)，过滤除菌，储于-20℃。

(2)银耳多糖(WTF-B)用PBS稀释到0.1mg/ml、0.15mg/ml 0.2mg/ml三个浓度，过滤除菌，储于-20℃。

2.方法

2.1细胞培养

以DEME培养基(1％P/S 10％胎牛血清)在37℃，5％CO₂培养箱中培养FBL细胞，细胞传代所用消化液含0.02％EDTA 0.25％胰酶。

2.2病毒培养

将BIV(R29)感染的FBL细胞(BIV-R29/FBL)与正常的FBL细胞1∶1混合培养，使BIV大量扩增。

2.3药物对细胞毒实验(FBL)

以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后细胞密度增至50000/孔，加入0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml的药物，以正常细胞为阴性对照，AZT为阳性对照。正常细胞长满之后(约72小时)，计数每孔细胞数，确定药物50％致死浓度(IC₅₀)

2.4药物对BIV感染引起合胞体形成抑制实验

以40000/孔的密度将FBL细胞铺于24孔板，24小时后以2000/孔的密度加入BIV-R29/FBL(MOI＝1∶25)，同时加入待测药物(浓度＜IC₅₀)，以AZT为阳性对照，等体积PBs为阴性对照，72小时后计数合胞体形成数量。

             银耳多糖对胎牛肺细胞的细胞毒实验

样品	浓度(mg/ml)	存活细胞数
					孔1	孔2	孔3
		培养基AZT正常细胞银耳多糖	/0.0026/0.20.10.05	05.86.55.66.85.8				05.96.05.56.35.9	05.35.64.95.16.2

细胞毒结果：银耳多糖IC₅₀＞0.2mg/ml

表3  银耳多糖对BIV感染引起的合胞体形成的抑制作用

样品	浓度(mg/ml)	合胞体数量
					孔1	孔2	孔3
		培养基AZTBIV-R29	/0.0026/	--++++				-+++++	--++++

正常细胞银耳多糖

/0.20.20.15

-++++++++++

-+++++++

-+++++++++

合胞体数与对照孔相近++++    合胞体数比对照孔少75％    +++

合胞体数比对照孔少50％++    合胞体数比对照孔少25％    +

基本无合胞体出现

上述药理实验表明：

(1)毒性实验表明，银耳多糖毒性较低，其IC₅₀均大于0.2mg/ml。

(2)由牛免疫缺陷病毒引起的合胞体抑制实验说明，银耳多糖在0.2mg/ml的浓度时有一定的抑制合胞体形成的作用。

七、抗氧化作用：

在H₂O₂引起的红细胞溶血试验中，以蒸馏水溶血率为100％、抑制率为0％计算，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D抑制率分别为78.6％、68.8％、71.5％、74.4％；

在多糖对超氧阴离子自由基(O^2-.)的清除作用实验中，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D最高抑制率分别为21.4％、28.4％、36.6％、53.0％；

在清除羟基自由基实验中，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D的EC₅₀分别为233.6mg/L、603mg/L、191mg/L、195mg/L。

本发明的均一体银耳多糖及其提取方法和现有技术相比具有如下的优点：

1.本发明的均一体银耳多糖具有含量高，稳定性好，有效成分确切，质量易于控制的特点。

2.利用银耳孢子发酵粉，提取银耳多糖不受场地、时间限制，可以降低成本，易于大规模的工业化生产。

3.本发明的均一体多糖分子量较小，水溶性好，纯度高，既可制成口服制剂又易于制成液体制剂，从而使有效成分更好的发挥疗效，以满足不同患者的需求。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明做进一步的说明，但并非是对本发明的限制：

实施例1

(1)取150g银耳孢子发酵粉，用3000ml水煮，约5个小时。冷却室温后，将提取液离心，提取后的残渣再用水煮，冷却后离心，合并两次上清液，用旋转蒸发仪浓缩至微粘稠。加三倍量乙醇，静置后抽滤取沉淀。沉淀用少许***洗，真空干燥，得产品80g，即为粗多糖。

(2)取10克粗多糖，加500ml蒸溜水，加热溶解，冷却后，倾出上清液，不溶物再加100ml水加热溶解。冷却后，离心，取上清液，和上一次上清液合并，总计得上清液600ml，加125ml氯仿和25ml正丁醇，机械搅拌20分钟，产生乳白色沉淀。离心，取上清液再加入氯仿和正丁醇，再搅拌，离心，如此反复至无蛋白质反应为止。将上清液浓缩至适量，用蒸溜水透析三天，透析袋内溶液加三倍量乙醇沉淀。抽滤，用无水乙醇、丙酮、***洗沉淀。置真空干燥器中干燥，得精制银耳多糖5.18g。

(3)取500mg的精制银耳多糖，用6ml 0.1M NaCl溶解，加上清液在柱顶，用DEAE-SephadexA-25进行柱层析。进样后，用0.1M NaCl洗脱，分部收集，用752分光光度计测定吸光度。一直洗脱到多糖的反应呈阴性。得到二种均一体银耳多糖。命名为WTF-A和WTF-B。

实施例2

(1)水提取：取300g银耳孢子发酵物，加入40倍量的水，煮提约4个小时，煮沸过程中保持水量的一致性。水煮后放至室温，将提取液离心，提取后的残渣加入约40倍的水，以相同的方法煮提两次并离心分离，收集沉淀。所得沉淀置于50℃烘箱中烘干，称重，重量为188.8g。沉淀即为粗多糖。

(2)碱液提取：取140g粗多糖，加入0.5mol/LNaOH 1000ml，提取6小时，离心。沉淀以相同的方法再提取两次，合并三次所得的上清液，沉淀另置。将上清液减压浓缩至约原体积的三分之一，以1mol/L的HCl中和至PH＝7，将中和液减压浓缩至小体积。将浓缩后的中和液用流动水透析三天。将透析后的溶液用三倍体积85％乙醇沉析，离心后收集沉淀，即为0.5mol/LNaOH提取得到的碱提多糖。

(3)精制多糖：将0.5mol/LNaOH提取物加入约700ml水搅拌溶解，加入175mlSevag试剂(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，机械搅拌0.5小时后，离心对所得上清液反复用此法除蛋白，直至用茚三酮试剂检测无蛋白质反应为止。将所得上清液减压浓缩至小体积用对流动水透析三天，透析袋内溶液用三倍体积85％乙醇沉析。抽滤，沉淀用无水乙醇、丙酮、***洗涤，置于真空干燥器中干燥，得0.5mol/LNaOH提取所得精制多糖，称重为4.470g。

(4)均一体银耳多糖：取600mg 0.5mol/LNaOH提取所得精制多糖上DEAE-32-cellulose层析柱，用0.1mol/LNaCl溶液洗脱，分部收集，得到112mg均一体银耳多糖，命名为“ATF-A”。

实施例3

在无菌条件下取均一体银耳多糖18g，置于容器中，加注射用水1000ml，加入甘露醇50g、乳糖20g，按注射剂的要求进行高压消毒灭菌，加入1.5g活性碳，采用微孔滤膜过滤，滤液按每只0.6ml进行分装，采用冷冻干燥法，制得黄色疏松块状物，封口即得。

实施例4

无菌条件下取均一体银耳多糖100g，加入到注射用水24000ml中，加入60g硫代硫酸钠搅拌30分钟，加入30g活性炭，搅拌吸附30分钟，除炭、精滤、灌封、灭菌，即得注射液。

或无菌条件下取均一体银耳多糖100g，加入注射用水24000ml中，经G4漏斗过滤后，分装灭菌，制得注射液。

实施例5：

均一体银耳多糖1000g，药用淀粉600g，糊精600g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60-70℃干燥2-4小时，制成1000片，使每片含均一体银耳多糖0.3g。

实施例6：

均一体银耳多糖1000g，药用淀粉1000g，50％乙醇适量，制粒，整粒，烘干，装1#胶囊，每粒0.2g

实施例7：

均一体银耳多糖20g，聚乙二醇-4000 10g，聚乙二醇-6000 30g，焦亚硫酸钠适量，加热熔融温度(40-90℃)，使原料和辅料充分混溶，滴制成1000粒滴丸，使每粒滴丸含均一体银耳多糖20mg。

尽管本发明结合它的专门的实施例已做了详细的描述，但是很明显对本技术领域的熟练人来说仍能做出各种各样的变化和改进，都不会偏离本发明的精神实质和保护范围。

Claims (9)

1、几种均一体银耳多糖，它是由银耳孢子发酵物经水煮、醇沉、除蛋白或用不同浓度的NaOH水溶液梯度提取后，经柱层析分离、纯化得到含量在90％以上的均一体银耳多糖；主要含有以下成分：

碱提银耳多糖ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D；

水提银耳多糖WTF-A、WTF-B；

高效液相色谱法测定它们的重均分子量分别为62830、63710、58962、51454、73000和68000；其中，

ATF-A主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成；

ATF-B主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖组成；

ATF-C主要由D-葡萄糖、L-鼠李糖组成；

ATF-D主要由D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖组成；WTF-A主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖及D-葡萄糖组成；WTF-B主要由L-岩藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖组成。

2、权利要求1所述几种均一体银耳多糖的提取方法，包括如下步骤：

A、水溶性均一体银耳多糖的提取：

(1)将银耳孢子发酵粉水煮提，冷却、离心，上清液浓缩醇沉，过滤，干燥得粗多糖；

(2)粗多糖经sevage法除蛋白，用流动水透析，70-90％乙醇沉析，得精制多糖；

(3)精制多糖经柱层析分离，用0.1-5mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集不同洗脱液，浓缩后醇沉干燥，制得水提均一体银耳多糖，WTF-A、WTF-B；

B、水难溶性均一体银耳多糖的提取：

(1)在用热水提取出水溶性组份后，对其余的水难溶性组份以0.1mol/L-10mol/LNaOH水溶液梯度提取，盐酸中和至中性，浓缩至小体积，用流动水透析，70-90％乙醇沉析，制得碱提多糖；

(2)碱提粗多糖经sevage法除蛋白，用流动水透析，70-90％乙醇沉析，得精制多糖；

(3)精制多糖经柱层析分离，用0.1mol/L-5mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集不同洗脱液，浓缩后醇沉，真空干燥，制得碱提均一体银耳多糖，ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D。

3、如权利要求2所述均一体银耳多糖的提取方法，其中的层析柱包括DEAE-32-cellulose、DEAE-52-cellulose、DEAE-Sephadex gel A-25和Sephadex G-200、Sephadex G-100、Sephadex G-150。

4、一种以均一体银耳多糖为活性成分的药物组合物，该组合物含有治疗有效量的均一体银耳多糖，及一种或一种以上的药学上可接受的载体。

5、如权利要求4所述的药物组合物，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为0.1-500mg。

6、如权利要求4所述的药物组合物，其中，均一体银耳多糖的治疗有效量为1-200mg。

7、如权利要求4-6所述的药物组合物，其中，该组合物可以口服制剂、液体制剂或外用制剂的形式存在。

8、如权利要求7所述的药物组合物，其中，口服制剂为片剂、胶囊、缓释片、滴丸、颗粒剂或口服液；液体制剂为冻干粉针、注射液、大、小输液或静脉滴注液；外用制剂为霜剂或膏剂。

9、均一体银耳多糖在用于制备增强免疫、抗肿瘤、抗放射、升高白细胞、抗病毒、抗衰老药物中的应用。