CN107011451A - 银耳异聚多糖及其提取物、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银耳异聚多糖及其提取物、制备方法和应用。本发明中的银耳异聚多糖提取物的制备方法包括以下步骤：将酸性絮凝剂与经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液混合，絮凝，固液分离得沉淀复合物，即可；其中，所述的酸性絮凝剂为絮凝剂的酸水溶液，所述的絮凝剂为壳聚糖。利用本发明的制备方法可制得高纯度的不同分子量范围的银耳异聚多糖，收率可以达到20％以上，纯度可以达到93％以上；采用本申请的制备方法制得的10～20万道尔顿的银耳异聚多糖表现出了良好的促成纤维细胞增殖效果和促进成纤维细胞分泌透明质酸的能力，同时还表现出了优异的皮肤渗透性。

Description

银耳异聚多糖及其提取物、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种银耳异聚多糖及其提取物、制备方法和应用。

背景技术

银耳异聚多糖作为一种功能性多糖，可应用于药品、保健品、食品和化妆品中，具有多种功效。专利CN100402555C公开了水溶液高温条件下提取得到的一种分子量在85～160万道尔顿的银耳杂多糖，并公开了其具有保湿润滑皮肤和粘膜、增强润滑感、抗氧化衰老、抗过敏、增稠稳定等功效。专利CN102161710A中公开了利用酸解法制备低分子量银耳异聚多糖的方法，并公开了分子量为500～10000道尔顿银耳异聚多糖在制备治疗慢性萎缩性胃炎的药物和制备肿瘤治疗辅助药物中的应用。专利CN1778824A中公开了碱溶液和水溶液提取的均一体银耳异聚多糖，其分子量在5万～7万道尔顿，分别具有抑制淋巴瘤、抗辐射、增强免疫力、抗病毒、抗氧化等功效。

由以上现有专利技术可以看出(1)不同分子量的银耳异聚多糖的功效是不同的；(2)由于多糖往往以较大的分子状态存在于动植物体内，因此制备低分子量的多糖时必定需要一定的方法对糖苷键进行水解断裂。目前常见的水解糖苷键的方法有酸解、碱解和酶解。

酸解是采用一定浓度的盐酸等酸性物质进行水解，属于非专一性水解，可以很方便的将大分子多糖的糖苷键进行断裂，但酸解往往也会造成多糖的过度水解，一方面无法实现分子量的精准控制，另一方面也会造成多糖收率的下降，影响其技术应用价值。另外，该方法由于酸的存在，对生产设备有特定的要求，不利于产品的生产转化。

碱解和酸解一样属于非专一性水解，但其水解作用温和，可以通过不同工艺条件的设置获得特定分子量的多糖。另外，其对生产设备要求不高，工艺应用不需要特定的设备。但是碱解也存在一些问题，碱解工艺容易导致产品颜色加深，还可以将植物原料组织中的纤维素水解，得到碱纤维素钠及其裂解产物，这些物质作为杂质最终会和目标多糖一起被乙醇沉淀，作为杂质进入最终产品，严重影响产品的纯度和功效。因此，在进行碱液提取不同分子量多糖时，必须要考虑去除因为纤维素水解而产生的相关杂质，另外还要解决产品颜色深的问题。

另外，采用酶解方法时酶种类的选择比较难，因为不同的多糖其糖苷键链接方式差异较大，且同一种多糖中也往往存在多种糖苷键，但是酶的专一性又比较强，一种酶只能水解一种糖苷键，所以对于酶的筛选存在较大难度，目前多采用酵母菌等不同微生物发酵方法以获得某种特定的酶进行多糖的酶解，开发周期长，费用高；银耳异聚多糖大分子结构主要以α-1,3糖苷键的链接方式存在，而目前尚无专一性的酶可应用于银耳异聚多糖大分子结构的酶解。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中碱解糖苷键获取银耳异聚多糖的方法纯度较低、颜色深的问题，而提供了一种银耳异聚多糖及其提取物、制备方法和应用。利用本发明的制备方法可制得不同分子量范围的高纯度的银耳异聚多糖，收率可以达到20％以上，纯度可以达到93％以上；采用本申请的制备方法制得的10～20万道尔顿的银耳异聚多糖表现出了良好的促成纤维细胞增殖效果和促进成纤维细胞分泌透明质酸的能力，同时还表现出了优异的皮肤渗透性。

本发明提供了一种银耳异聚多糖提取物的制备方法，其包括以下步骤：将酸性絮凝剂与经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液混合，絮凝，固液分离得沉淀复合物，即可；其中，所述的酸性絮凝剂为絮凝剂的酸水溶液，所述的絮凝剂为壳聚糖。

本发明所述的酸性絮凝剂一般通过将所述的壳聚糖溶解于酸水中得到。其中，所述的酸水一般为本领域常规的可以将壳聚糖溶解的酸水，本发明优选盐酸水溶液；所述的盐酸水溶液的质量浓度优选0.25％～1.0％。所述的壳聚糖可以参照本领域常规进行选择，本发明优选壳聚糖的规格为：脱乙酰基≥85％；且20℃下，浓度为10克/升时的粘度≥200mpa.s。所述的酸性絮凝剂中，所述的絮凝剂的浓度优选0.005～0.02g/mL，更优选0.01g/mL。

本发明所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法中，所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中酸的种类可为本领域该类操作中常规使用的酸的种类，本发明优选稀盐酸；所述的稀盐酸的质量浓度优选0.5％～6.0％，更优选1％～6.0％；所述的弱酸性一般指4≤PH＜7，优选6≤PH＜7；所述的中性一般指PH＝7。所述的银耳一般指银耳子实体原料；所述的银耳子实体原料可为将银耳子实体原料利用纯水浸泡清洗得到的银耳子实体原料。

本发明所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法中，本发明所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”制备方法可以参照本领域常规进行选择，一般为：将银耳进行碱解得到银耳碱提液后，用酸调节所述的银耳碱提液至弱酸性或中性，过滤得到的滤液即为所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”。其中，所述的银耳可以直接进行碱解得到“所述的银耳碱提液”，也可以将所述的银耳匀浆后再进行碱解得到所述的银耳碱提液。所述的过滤优选减压精过滤。所述的碱解的条件可以根据不同分子量范围的银耳异聚多糖进行选择，不同的碱解条件(包括碱的种类、浓度与用量，碱解的时间和温度等)可以得到不同分子量范围的银耳异聚多糖，本发明中的碱解条件优选如下：碱优选氢氧化钠；所述的碱可以以碱水溶液的形式参与反应，所述的碱水溶液的质量浓度优选1～15％(例如3％、5％、6％、8％或10％)；所述的碱水溶液与所述的银耳的体积质量比优选10～30mL/g(例如15mL/g、20mL/g或25mL/g)；所述的碱解的时间优选2～10h(例如3h、4h、6h或8h)；所述的碱解温度优选90～98℃。

本发明所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法中，所述的酸性絮凝剂的用量一般为可以将所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中的银耳异聚多糖絮凝完全，即可；本发明中，每100mL所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”优选添加5～10mL所述的酸性絮凝剂；更优选添加5～8mL所述的酸性絮凝剂。所述的絮凝的温度优选10～35℃；所述的絮凝优选在搅拌下进行。所述的固液分离可以参照本领域的常规进行选择，本发明优选过滤。

本发明所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法中，所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”与所述的“酸性絮凝剂”的混合方式没有特殊限定，一般为将所述的酸性絮凝剂加入到所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中。

本发明所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法，在得到所述的沉淀复合物后还可进一步包括以下步骤：将所述的沉淀复合物在碱性条件下解离，固液分离，得滤液A，即可。

所述的滤液A的制备中，所述的解离为将所述的酸性絮凝剂与银耳异聚多糖分开的过程，本发明中优选包括以下步骤：将所述的沉淀复合物与水混合后，用碱调至PH为8.0～10.0(例如9.0)，50～60℃下进行解离，即可。其中，所述的水优选纯水，本领域中的纯水一般为去离子水；所述的水的用量可以参照本领域的常规进行选择，所述水与所述的沉淀复合物的体积质量比优选10～20mL/g，更优选12～15mL/g。所述的碱可使所述的沉淀复合物解离即可，本申请优选氢氧化钠；所述的氢氧化钠可以以氢氧化钠水溶液的形式进行反应，所述的氢氧化钠水溶液优选质量浓度为4％～10％的氢氧化钠水溶液，更优选质量浓度为5％的氢氧化钠水溶液。

本发明还提供了一种银耳异聚多糖的制备方法，其包括以下步骤：将上述的滤液A脱色，用酸调至中性，浓缩，醇沉，收集沉淀，即可。

所述的银耳异聚多糖的制备方法中，所述的脱色可以参照本领域的常规进行选择，本发明优选采用过氧化氢进行脱色；其中，所述的过氧化氢优选质量分数为30％的过氧化氢水溶液。所述的过氧化氢的用量一般为将所述的滤液A脱色即可，例如，所述的质量分数为30％的过氧化氢水溶液的体积优选为所述的滤液A体积的0.5％～2.0％，更优选1.0％。所述的银耳异聚多糖的制备方法中，所述的酸可以参照本领域该类反应的常规进行选择，本发明优选稀盐酸，所述的稀盐酸的质量浓度优选4％～8％，更优选6％。所述的银耳异聚多糖的制备方法中，所述的浓缩条件可以参照本领域的常规选择，本发明优选减压浓缩；所述的浓缩优选至浓缩液与银耳的体积质量比为2～3mL/g，所述的银耳为所述的滤液A的制备过程中使用的银耳原料。所述的醇沉的步骤可参照本领域的常规进行选择，一般为将醇与到所述的浓缩液混合，沉淀，即可；其中，所述的醇的种类可以参照本领域的常规进行选择，本发明优选乙醇；所述的乙醇一般以其水溶液的形式进行所述的沉淀，所述的乙醇水溶液的体积百分比浓度优选90％～95％；所述的醇沉的终点可以参照本领域常规进行选择，本发明优选至最终乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％，即可。

本发明所述的银耳异聚多糖的制备方法还可包括干燥所述的沉淀的步骤。所述的干燥优选真空减压干燥。

本发明所述的银耳异聚多糖的制备方法中，当制备得到分子量小于10万道尔顿(例如5.6万、8.7万或9.6万道尔顿)银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳子碱提液的碱提条件优选为：碱为质量浓度为9％～11％的氢氧化钠水溶液(例如10％的氢氧化钠水溶液)；所述的碱与所述的银耳的体积质量比为15～25mL/g(例如20mL/g)；碱解的温度为90～98℃；碱解的时间为9～11h(例如10h)，制备得到了所述的分子量小于10万道尔顿银耳异聚多糖。

本发明所述的银耳异聚多糖的制备方法中，当制备得到分子量大于20万小于等于100万道尔顿(例如22.4万、67.5万或97.1万道尔顿)银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳子碱提液的碱提条件优选为：碱为质量浓度为0.5％～4.5％的氢氧化钠水溶液(例如3％的氢氧化钠水溶液)；所述的碱与所述的银耳的体积质量比为5～15mL/g(例如10mL/g)；碱解的温度为90～98℃；碱解的时间为3～6h(优选4h)，制备得到所述的分子量大于20万小于等于100万道尔顿银耳异聚多糖。

本发明所述的银耳异聚多糖的制备方法中，当制备得到分子量10～20万道尔顿(例如16.7万、18.5万和12.8万道尔顿)银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳碱提液的碱提条件优选为：碱为质量浓度为5％～8％的氢氧化钠水溶液(例如6％氢氧化钠水溶液)；所述的碱与所述的银耳的体积质量比为15～25mL/g(例如20mL/g)；所述的碱解的温度为90～98℃；所述的碱解的时间为3～6h(例如4h)，制备得到了所述的分子量10～20万道尔顿银耳异聚多糖。

本发明还提供了一种由上述的制备方法制备得到的分子量为10～20万道尔顿的银耳异聚多糖。所述的分子量为10～20万道尔顿的银耳异聚多糖中的中性糖的摩尔比优选为，岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.40～0.45(例如0.42):0.34～0.36(例如0.35):1:0.17～0.25(例如0.20)；所述的分子量为10～20万道尔顿的银耳异聚多糖中葡萄糖醛酸的质量含量优选17％～20％(例如18％)。

本发明还提供了一种分子量10～20万道尔顿的银耳异聚多糖在制备护肤品中的应用。所述的护肤品的功效可包括深层补水和/或抗衰老。所述的护肤品的种类没有特殊限定，可为化妆品或个人护理用品等。另外，本发明所述的分子量10～20万道尔顿的银耳异聚多糖还可用于日化用品、保健食品和药品等领域。

本发明中的盐酸的浓度，如无特殊说明，指盐酸水溶液的质量分数；如1％的盐酸指质量分数为1％的盐酸水溶液。

本发明中的氢氧化钠的浓度，如无特殊说明，指氢氧化钠水溶液的质量分数；如10％的氢氧化钠指质量分数为10％的氢氧化钠水溶液。

本发明所述的室温一般指10～35℃。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

①本发明中银耳异聚多糖的制备方法中，针对碱解过程中存在的一些问题，根据银耳异聚多糖的结构特点，创新性的使用了酸性絮凝剂，通过絮凝剂和银耳异聚多糖的络合沉淀，可使银耳异聚多糖与其他杂质(如纤维素碱解的产物等)进行分离，最终可制得高纯度的低分子量银耳异聚多糖，采用本发明的制备方法制备银耳异聚多糖的收率可以达到20％以上，纯度可以达到93％以上。

②本申请采用上述银耳异聚多糖的制备方法实现了不同分子量范围的银耳异聚多糖的制备，例如10～20万道尔顿的银耳异聚多糖。

③本申请中的10～20万道尔顿的银耳异聚多糖表现出了良好的促成纤维细胞增殖效果和促进成纤维细胞分泌透明质酸的能力，同时还表现出了优异的皮肤渗透性，可以增加肌肤真皮层储水能力的效果，具有深层补水和/或抗衰老的功效。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

具体实施例中室温一般为10～35℃。

具体实施例中的酸性絮凝剂溶液是指将壳聚糖溶解于1％(v/v)的盐酸水溶液中制备得到；例如，1％的酸性絮凝剂溶液是指将1g壳聚糖溶解于100mL 1％(v/v)的盐酸水溶液中制备得到。(其中，壳聚糖规格：脱乙酰基≥85％；粘度(10克/升，20℃)≥200mpa.s)

具体实施例中的多糖含量测定的方法和分子量测定的方法均为本领域常规的方法，其中，多糖含量测定参考：《糖复合物生化研究技术》，张惟杰.浙江大学出版社，1999年，第11页的第二章2.1节糖的定量测定中苯酚-硫酸法；分子量测定参考：HPLC法测定真菌多糖平均分子量方法的研究，孔祥辉等，黑龙江省科协2006学术年会暨太阳岛科技论坛，2006。

实施例1

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)20倍体积的浓度为6％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取4h；碱解结束后，用6％浓度的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规减压精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入8ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的20倍体积的纯水溶液(mL)中，并用5％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入滤液总体积的1.0％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：27.2％；银耳异聚多糖含量为：95％；经HPLC方法测定分子量为16.7万道尔顿。

实施例2：

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)25倍体积的浓度为5％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取3h，碱解结束后，用质量浓度6％的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入5ml浓度为2％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)15倍体积的纯水溶液中(mL)，并用5％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性8.0～9.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入滤液总体积的0.5％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：29.1％；银耳异聚多糖含量为：94.7％；经HPLC方法测定分子量为18.5万道尔顿。

实施例3：

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的15倍体积的浓度为8％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取6h；碱解结束后，用6％浓度的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规精过滤，收集滤液；每100mL滤液中加入10mL浓度为0.5％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的10倍体积的纯水溶液(mL)中，并用5％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性8.0～9.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入滤液总体积的2.0％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：24.8％；银耳异聚多糖含量为：93.6％，经HPLC方法测定分子量为12.8万道尔顿。

实施例4

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍体积的浓度为10％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取10h，碱解结束后，用质量浓度6％的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入10ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的20倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的2.0％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：26.8％；银耳异聚多糖含量为：96.4％；经HPLC方法测定分子量为8.7万道尔顿。

实施例5

(1)取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍体积的浓度为9％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取9h，碱解结束后，用质量浓度6％的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入10ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的20倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的2.0％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：24.2％；银耳异聚多糖含量为：95.8％；经HPLC方法测定分子量为9.6万道尔顿。

实施例6

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的20倍体积的浓度为11％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取11h，碱解结束后，用质量浓度6％的稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；进行常规精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入10ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的20倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的2.0％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：28.3％；银耳异聚多糖含量为：94.6％；经HPLC方法测定分子量为5.6万道尔顿。

实施例7：

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍体积的浓度为3％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取4h；碱解结束后，用稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入8ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的12倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的0.5％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：20.6％；银耳异聚多糖含量为：97.1％；经HPLC方法测定分子量为67.5万道尔顿。

实施例8

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍体积的浓度为0.5％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取3h；碱解结束后，用稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入8ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的12倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的0.5％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：22.7％；银耳异聚多糖含量为：99.2％；经HPLC方法测定分子量为97.1万道尔顿。

实施例9

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍体积的浓度为4.5％的氢氧化钠水溶液(mL)，在90℃～98℃条件下碱解提取6h；碱解结束后，用稀盐酸调节料液PH值至6.0～7.0；精过滤，收集滤液；每100ml滤液中加入8ml浓度为1％的酸性絮凝剂溶液，常温条件下搅拌使其充分絮凝，形成一种沉淀复合物；过滤，收集沉淀复合物；滤液进行无害化处理后、弃去。将上述沉淀复合物分散在原料重量(g)的12倍体积的纯水溶液(mL)中，并用10％的氢氧化钠溶液调整料液PH值至碱性9.0～10.0，在50℃～60℃条件下加热解离。将上述料液过滤，收集滤液；沉淀物进行无害化处理后、弃去。向上述滤液中加入料液总体积的0.5％(V/V)的30％过氧化氢进行脱色处理；脱色后料液再次用质量浓度为6％的稀盐酸调节PH值为中性；上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，收率为：25.6％；银耳异聚多糖含量为：98.5％；经HPLC方法测定分子量为22.4万道尔顿。

对比实施例1：采用纯水高温煮提的方法制备得到保留天然银耳异聚多糖结构的高分子量银耳异聚多糖，通过HPLC方法测定分子量为480万道尔顿。具体步骤如下：

取银耳子实体原料，纯水浸泡清洗；清洗后原料，加入原料重量(g)的10倍体积的纯水(mL)，在90℃～98℃条件下煮提8h，过滤，收集滤液。上述料液减压浓缩至原料重量(g)的2倍～3倍体积(mL)；浓缩后料液采用90％～95％的高浓度乙醇进行沉淀，使最终料液中乙醇的沉淀浓度达到60％～70％，收集沉淀，真空减压干燥，即得到高纯度银耳异聚多糖，经测定分子量为480万道尔顿。

对比实施例2：不采用酸性絮凝剂，其余条件和步骤按照本发明的实施1进行，制备得到银耳异聚多糖。

对比实施例3：不进行本发明的脱色处理，其余条件和步骤按照本发明的实施1进行，制备得到银耳异聚多糖。

效果实施例1银耳异聚多糖中单糖组成分析测试结果

测试样品：

实施例1～3和对比实施例1～2制得的银耳异聚多糖。

测试方法：

(1)取样品20mg，加2mol/L TFA 6ml，在100℃下封管水解6h，蒸干后加入吡啶、盐酸羟胺、乙酸酐制成糖腈乙酸酯，进GC-MS分析，得到银耳异聚多糖中中性单糖的摩尔组成比例。

(2)采用硫酸咔唑法对各样品中的酸性糖(葡萄糖醛酸)的质量含量进行测试。

对比实施例1的银耳异聚多糖是保留天然银耳异聚多糖结构的高分子量银耳异聚多糖，即可以理解为未被酸或碱破坏的原始状态的银耳多糖，其分子量测定为480万道尔顿。若经过碱解得到的低分子量银耳异聚多糖中中性糖的比例与对比实施例1基本一致，说明该低分子银耳多糖的单糖组成和原始状态基本一致，即在经碱解得到的低分子量银耳异聚多糖中基本没有引入由于纤维素水解所得的杂质葡萄糖。具体测试结果：见表1。

表1：不同银耳异聚多糖单糖组成比例分析

样品	中性糖的摩尔比	葡萄糖醛酸含量，％
			对比实施例1	岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.42:0.34:1:0.18	19
对比实施例2	岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.25:0.26:1:0.67	15
			实施例1	岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.40:0.35:1:0.20	17
实施例2	岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.45:0.34:1:0.17	20
			实施例3	岩藻糖:木糖:甘露糖:葡萄糖＝0.42:0.36:1:0.25	18

由表1看出：实施例1～3制备所得样品的中性单糖组成比例基本与样品对比实施例1的样品一致，而对比实施例2中的葡萄糖含量明显增多，说明本发明所采用的酸性絮凝方法可有效的去除在碱解提取时引入的杂质葡萄糖(该杂质葡萄糖可能由纤维素水解得到)。

效果实施例2：产品颜色对比。

测试样品：对比实施例3样品和实施例1～3样品。

测试方法：

透光率测定方法：样品采用纯水溶解成0.5％质量浓度的水溶液，采用紫外分光光度计在400nm处测定其透光率，颜色深的样品透光率低。结果表2。

表2样品的透光率

样品	透光率，％
		对比实施例3	70.6
实施例1	90.7
		实施例2	88.5
实施例3	92.1

表2，可见采用本发明实施例1～3制得的银耳异聚多糖的透光率远高于对比实施例3，因此采用本发明的制备方法能有效解决产品银耳异聚多糖颜色深的问题。

效果实施例3：银耳异聚多糖对成纤维细胞的活化及促进成纤维细胞分泌透明质酸含量功效测试

选择上述实施例1的样品进行功效测试。

用含小牛血清的DMEM培养基培养人成纤维细胞，传代2次，确认细胞生长情况稳定，取生长融合率为80％左右的细胞待用。

在无菌操作台中将培养皿中生长至80％左右的细胞回收至离心管中，通过细胞计数仪计数，接种至6孔细胞培养板中进行培养，在培养基中添加实施例1的提取物，使其在培养基中的浓度(w/v)为0.1％(即0.1g/100mL)和0.01％，同时设立不添加本发明的提取物的一组为空白对照组。

培养3天后，用细胞计数仪测定每孔细胞数量，并进行统计分析。

透明质酸含量检测：收集各组分72h后的培养液进行透明质酸(HA)的ELISA检测(即酶联免疫吸附实验检测)，绘制标准品绘制标准曲，按说明书加入试剂，避光室温孵育5min的反应终止溶液终止反应15min内观察吸光率测出HA的浓度。

检测结果：

(1)成纤维细胞增殖效果：样品经过72h的培养后，含有样品浓度0.5％、0.25％、0.125％作用组的细胞存活率为107.03％、106.31％、105.70％，表现出对成纤维细胞具有良好的增殖效果。

(2)成纤维细胞分泌透明质酸效果：样品经过72h的培养后，含有样品浓度0.5％、0.25％、0.125％作用组的透明质酸分泌量为108.57％、106.83％、100.76％，因此，0.5％、0.25％浓度的银耳异聚多糖可显著促进成纤维细胞分泌透明质酸。

由以上检测结果可以看出，实施例1制备得到的银耳异聚多糖可促进成纤维细胞增殖，同时可通过促进成纤维细胞分泌透明质酸，从而达到增加肌肤真皮层储水能力，达到深层补水、抗衰老的效果。

效果实施例4：银耳异聚多糖皮肤渗透性对比

1、测试仪器及试剂：

渗透仪(RYJ-6B型药物透皮扩散试验仪)

人造皮肤(上海轩仪仪器)

2、测试样品：对比实施例1和实施例1～3样品

3、测试方法

透皮扩散试验仪接受池体积为15mL，接受液为PH 6.0的PBS缓冲液，将扩散池置于恒温水浴循环箱中保持37℃，以400r/min不断搅拌。将接受液加进接受池中并与人造皮肤密切接触，并注意从取样口排尽气泡。开动渗透扩散试验仪30min稳定后，将3ml样品溶液加入样品池，以400r/min不断搅拌，连续渗透8h，渗透结束，取接收池溶液采用苯酚硫酸法测定银耳多糖的含量。以8h的累积透过率作为样品渗透性的评价条件。

8h累积透过率计算：接收池银耳多糖的量(mg)/样品池初始银耳多糖的量(mg)

其中,多糖含量测定参考：《糖复合物生化研究技术》，张惟杰.浙江大学出版社，1999年。

4、测试结果见表3：

表3银耳异聚多糖皮肤透过率

样品	8h累积透过率，％
		对比实施例1	5.9
实施例1	36.7
		实施例2	32.4
实施例3	38.1

表3可表明，本申请实施例1～3中分子量为10～20万的银耳异聚多糖表现出了良好的皮肤渗透性，远优于对比实施例1中的高分子量银耳异聚多糖。良好的皮肤渗透性可使本申请中的10～20万的银耳异聚多糖更好地透过皮肤，且通过促进成纤维细胞增殖、促进成纤维细胞分泌透明质酸，从而增加肌肤真皮层储水能力，达到深层补水、抗衰老的效果。

Claims (10)

1.一种银耳异聚多糖提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将酸性絮凝剂与经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液混合，絮凝，固液分离得沉淀复合物，即可；其中，所述的酸性絮凝剂为絮凝剂的酸水溶液，所述的絮凝剂为壳聚糖。

2.如权利要求1所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法，其特征在于，

所述的酸性絮凝剂中，所述的絮凝剂浓度为0.005～0.02g/mL，优选0.01g/mL；

和/或，所述的壳聚糖的规格为：脱乙酰基≥85％；且20℃下，浓度为10克/升时的粘度≥200mpa.s；

和/或，所述的酸性絮凝剂中，所述的酸水为盐酸水溶液，所述的盐酸水溶液的质量浓度优选为0.25％～1.0％；

和/或，所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”的制备方法为：将银耳进行碱解得到银耳碱提液后，用酸调节所述的银耳碱提液至弱酸性或中性，过滤得到的滤液，即为所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”；

和/或，所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中的酸为稀盐酸；所述的稀盐酸的质量浓度优选0.5％～6.0％，更优选1％～6.0％；

和/或，所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”与所述的“酸性絮凝剂”的混合方式为将所述的酸性絮凝剂加入到所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中；

和/或，所述的酸性絮凝剂的用量为：每100mL所述的“经酸调至弱酸性或中性的银耳碱提液”中添加5～10mL所述的酸性絮凝剂；优选添加5～8mL所述的酸性絮凝剂；

和/或，所述的絮凝的温度为10～35℃；

和/或，所述的银耳为银耳子实体原料。

3.如权利要求1或2所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法，其特征在于，在得到所述的沉淀复合物后还进一步包括以下步骤：将所述的沉淀复合物在碱性条件下解离，固液分离，得滤液A，即可。

4.如权利要求3所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法，其特征在于，所述的解离包括以下步骤：将所述的沉淀复合物与水混合后，用碱调至PH为8.0～10.0，50～60℃下进行解离，即可。

5.如权利要求4所述的银耳异聚多糖提取物的制备方法，其特征在于，

所述的滤液A的制备中，所述水与所述的沉淀复合物的体积质量比为10～20mL/g，优选12～15mL/g；

和/或，所述的滤液A的制备中，所述的碱为氢氧化钠；所述的氢氧化钠优选为质量浓度优选为4％～10％的氢氧化钠水溶液，更优选质量浓度为5％的氢氧化钠水溶液；

和/或，所述的滤液A的制备中，所述的“调至PH为8.0～10.0”为调至PH为8.0～9.0。

6.一种银耳异聚多糖的制备方法，其包括以下步骤：将权利要求3～5任一项所述的滤液A脱色，用酸调至中性，浓缩，醇沉，收集沉淀，即可。

7.如权利要求6所述的银耳异聚多糖的制备方法，其特征在于，所述的脱色为采用过氧化氢进行脱色；所述的过氧化氢优选为质量分数为30％的过氧化氢水溶液；所述的质量分数为30％的过氧化氢的体积优选为所述的滤液A体积的0.5％～2.0％，更优选1.0％；

和/或，所述的银耳异聚多糖的制备方法中，所述的酸为稀盐酸；所述的稀盐酸的质量浓度优选为4％～8％，更优选6％；

和/或，所述的银耳异聚多糖的制备方法中，所述的浓缩为减压浓缩；所述的浓缩为至浓缩液与银耳的体积质量比为2～3mL/g，所述的银耳为所述的滤液A的制备过程中使用的银耳原料；

和/或，所述的醇沉淀为采用乙醇进行沉淀，所述的乙醇优选为体积百分比浓度为90％～95％的乙醇水溶液；所述的醇沉的终点优选至最终乙醇的体积百分比浓度达到60％～70％；

和/或，所述的银耳异聚多糖的制备方法中，还包括干燥所述的沉淀的步骤；所述的干燥优选真空减压干燥。

8.如权利要求6或7所述的银耳异聚多糖的制备方法，其特征在于，

当制备得到分子量小于10万道尔顿银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳碱提液的碱提条件为：碱为质量浓度为9％～11％的氢氧化钠水溶液，优选10％的氢氧化钠水溶液；所述的碱与所述的银耳的体积质量比为15～25mL/g，优选20mL/g；碱解的温度为90～98℃；碱解的时间为9～11h，优选10h；制备得到了所述的分子量小于10万道尔顿银耳异聚多糖；

或当制备得到分子量大于20万且小于等于100万道尔顿银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳碱提液的碱提条件优选为：碱为质量浓度为0.5％～4.5％的氢氧化钠水溶液，优选3％的氢氧化钠水溶液；所述的碱与所述的银耳的体积质量比为5～15mL/g，优选10mL/g；碱解的温度为90～98℃；碱解的时间为3～6h，优选4h；制备得到所述的分子量大于20万且小于等于100万道尔顿银耳异聚多糖；

或当制备得到分子量10～20万道尔顿银耳异聚多糖时，所述的滤液A的制备过程中制备银耳碱提液的碱提条件为：碱为质量浓度为5％～8％的氢氧化钠水溶液，优选6％氢氧化钠水溶液；所述的碱水与所述的银耳的体积质量比为15～25mL/g，优选20mL/g；碱解的温度为90～98℃；碱解的时间为3～6h，优选4h；制备得到分子量10～20万道尔顿银耳异聚多糖。

9.一种如权利要求8所述的银耳异聚多糖的制备方法制备得到的分子量为10～20万道尔顿的银耳异聚多糖。

10.一种如权利要求9所述的分子量为10～20万道尔顿的银耳异聚多糖在护肤品中的应用，所述的护肤品的功效优选包括深层补水和/或抗衰老。