CN106480070B - 一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 - Google Patents

一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途。具体而言，本发明涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列，且用于***编码目的多肽的核苷酸序列。此外，本发明还涉及包含所述多肽载体和目的多肽的重组蛋白。进一步，本发明还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本发明还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本发明的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。

Description

一种用于展示目的多肽的多肽载体及其用途
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗领域、分子病毒学领域和免疫学领域。此外，本发明还特别涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染治疗领域。具体而言，本发明涉及一种核酸分子，其包含编码多肽载体(peptide carrier)的核苷酸序列，且用于***编码目的多肽的核苷酸序列。特别地，本发明的所述核酸分子在***编码目的多肽的核苷酸序列且表达为重组蛋白后，所述多肽载体能够展示所述目的多肽(例如目的抗原或抗原中的目的表位)，和/或，所述重组蛋白能够形成病毒样颗粒并展示所述目的多肽。此外，本发明还涉及包含所述多肽载体以及目的多肽的重组蛋白。进一步，本发明还涉及，所述核酸分子和所述重组蛋白的用途。此外，本发明还特别涉及，可用于预防、减轻或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的疫苗或药物组合物，其包含含有本发明的多肽载体和来自HBV的表位的重组蛋白。
背景技术
疫苗是应对传染病的有效手段。根据适用人群的不同，疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要应用于预防病毒感染，包括减毒疫苗、灭活疫苗、基因工程疫苗，其主要通过诱导机体产生中和抗体来保护机体不被病毒感染。治疗性疫苗主要应用于治疗持续性病毒感染以及肿瘤等疾病。在这些疾病中，患者对于靶抗原通常表现为免疫耐受的状态，因此，研发人员尝试通过多种形式的疫苗来诱导机体产生针对靶抗原的有效免疫应答。治疗性疫苗主要包括核酸疫苗、病毒载体疫苗、基因工程疫苗等，其中基因工程疫苗具有明显的优势。
已上市的基因工程疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人***瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)疫苗、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)疫苗，它们均为病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的形式。病毒样颗粒是指，由某种病毒的一个或多个结构蛋白构成的空心颗粒，其不包含病毒核酸，不能进行自主复制，但在形态上与真正的病毒粒子相同或相似。病毒样颗粒具有以下优点：免疫原性强、安全性好、不易失活、可展示外源肽段并诱导机体产生针对外源肽段的特异性免疫应答，因此，在疫苗领域具有重要的应用价值。
目前，全球约有20亿人感染过HBV，其中约有3.5亿的慢性HBV感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％。全球每年超过100万人死于乙肝导致的终末期肝病。我国是HBV感染的重灾区，目前约有9300万乙肝携带者。近年来，随着病例报告***不断健全，乙肝相关疾病的发生率，病死率不降反升。
当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为两类，即干扰素类(Interferon)和核苷/核苷酸类似物(NAs)。慢性HBV感染的治疗的最终目标是，阻止重症肝炎(肝衰竭)、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病的发生；其临床最佳治疗终点是，使患者达到乙型肝炎病毒表面抗原的血清学阴转或血清学转换，即完全清除HBV。但现有药物实现该目标的疗效十分有限。因此，针对慢性HBV感染者开发新的、能更有效地清除病毒、尤其是能有效清除HBsAg或大幅降低HBsAg水平的创新型治疗药物和方法是迫切而必要的，并且，研发治疗性疫苗是具有一定潜力的策略。
发明内容
本申请发明人基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，蹄蝠乙型肝炎病毒(roundleaf bat HBV，RBHBV)的核心抗原蛋白(RBHBcAg)；筑帐蝠乙型肝炎病毒(tent-making bat HBV，TBHBV)的核心抗原蛋白(TBHBcAg)；菊头蝠乙型肝炎病毒(horseshoe bat HBV，HBHBV)的核心抗原蛋白(HBHBcAg))，开发了一类新的用于展示目的多肽的多肽载体(peptide carrier)。由此，本发明提供了一种核酸分子，其含有编码多肽载体的核苷酸序列。此类核酸分子能够***编码目的多肽的核苷酸序列，并表达为含有多肽载体和目的多肽(例如目的抗原，或抗原中的目的表位)的重组蛋白。进一步，所产生的重组蛋白能够有效形成VLP，并能够在VLP表面展示***其中的目的多肽，从而所述目的多肽能够有效地被机体的免疫***识别，诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。因此，本发明的多肽载体可用作疫苗载体，用于展示目的多肽，例如来自目的抗原的肽段(例如表位)；并且，包含本发明的多肽载体和目的多肽的重组蛋白可用作疫苗，用于诱发机体产生针对目的多肽的特异性免疫应答。
此外，本申请的发明人还出人意料地发现，RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端均为富含精氨酸的区域，其对于VLP组装不是必须的。因此，本发明的多肽载体可以不包含RBHBcAg蛋白、TBHBcAg蛋白和HBHBcAg蛋白的C端区域。例如，本发明的RBHBcAg载体可以缺失RBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失RBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)；本发明的TBHBcAg载体可以缺失TBHBcAg蛋白的第149-188位氨基酸的部分或全部(例如，缺失TBHBcAg蛋白的第154-188位氨基酸)；本发明的HBHBcAg载体可以缺失HBHBcAg蛋白的第145-189位氨基酸的部分或全部(例如，缺失HBHBcAg蛋白的第150-189位氨基酸)。
此外，本申请的发明人还出人意料地发现，本发明的多肽载体特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)，能够在受试者中诱发特别强的清除HBsAg的特异性免疫应答，其功效显著优于现有的乙肝疫苗(例如，以人HBV的HBcAg为多肽载体构建的、含有相同表位的疫苗)。因此，本发明还提供了一种特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位的多肽载体。
因此，在一个方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列或者其变体，所述变体与所述核苷酸序列具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％)的同一性，或者在严紧条件或者高严紧条件下，能够与所述核苷酸序列杂交，其中，所述多肽载体选自：
(1)RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)的区别在于：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)；
(2)TBHBcAg载体，其与筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的区别在于：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个或5个氨基酸残基；例如，第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、或第80-82位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基)；或
(3)HBHBcAg载体，其与菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg；例如，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的区别在于：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个氨基酸残基；例如，第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、或第78-80位氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体(例如，柔性连接体；例如，如SEQ ID NO:43所示的连接体)；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基(例如，1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基)。
在一个优选的实施方案中，所述变体与所述编码多肽载体的核苷酸序列具有至少90％的同一性，例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的同一性。
在一个优选的实施方案中，所述变体能够在严紧条件下与所述编码多肽载体的核苷酸序列杂交。在一个优选的实施方案中，所述变体能够在高严紧条件下与所述编码多肽载体的核苷酸序列杂交。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白是野生型RBHBcAg。在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白的区别在于，RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白的区别在于：(1)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白是野生型TBHBcAg。在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白的区别在于，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，或5个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-84位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-84位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第83-84位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、第83位氨基酸残基、或第84位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白的区别在于：(1)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，或5个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)TBHBcAg蛋白的C端缺失1-35个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，或30-35个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、或35个氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白是野生型HBHBcAg。在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白的区别在于，HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体。例如，HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基、第78-82位氨基酸残基、第78-81位氨基酸残基、第78-80位氨基酸残基、第78-79位氨基酸残基、第79-83位氨基酸残基、第79-82位氨基酸残基、第79-81位氨基酸残基、第79-80位氨基酸残基、第80-83位氨基酸残基、第80-82位氨基酸残基、第80-81位氨基酸残基、第81-83位氨基酸残基、第81-82位氨基酸残基、第82-83位氨基酸残基、第78位氨基酸残基、第79位氨基酸残基、第80位氨基酸残基、第81位氨基酸残基、第82位氨基酸残基、或第83位氨基酸残基可被缺失或被置换为连接体。在一个优选的实施方案中，所述连接体例如为柔性连接体。此类柔性连接体是本领域技术人员公知的，例如，GGGGGSGGGGTGSEFGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:43)。
在一个优选的实施方案中，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白的区别在于：(1)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个连续氨基酸残基(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个连续氨基酸残基)被缺失或被置换为连接体，如上文所定义的；和(2)HBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-5个，5-10个，10-15个，15-20个，20-25个，25-30个，30-35个，或35-40个氨基酸残基；例如，被缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40个氨基酸残基。
如本领域技术人员已知的，限制性酶切位点的引入是特别有利的。因此，在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中，在编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处引入限制性酶切位点。在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中，在编码所述连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点。在一个优选的实施方案中，在本发明的核酸分子中和/或其一端或两端引入一个或多个限制性酶切位点。各种限制性酶切位点是本领域技术人员已知的，其包括但不限于，EcoR I、BamH I、HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等限制性内切酶识别的酶切位点。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-9。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含选自SEQ ID NO:12-17的核苷酸序列。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子用于***编码目的多肽的核苷酸序列。例如，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述核酸分子还包含，编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:23-40和69-74的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及，含有如上所定义的本发明核酸分子的载体(vector)。
可用于***目的多核苷酸(例如，本发明的核酸分子)的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体可以是真核表达载体或原核表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，或噬菌体等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述核酸分子或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种展示目的多肽的方法，其包括:
(1)将编码所述目的多肽的核苷酸序列***至本发明的核酸分子中(特别是，***至编码多肽载体的核苷酸序列中)，从而获得编码重组蛋白的核酸分子；和
(2)将步骤(1)中的编码重组蛋白的核酸分子表达为重组蛋白。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽相对于所述多肽载体而言是异源的。在一个优选的实施方案中，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。在一个优选的实施方案中，以符合读框的方式将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。在一个优选的实施方案中，利用限制性酶切位点，将编码目的多肽的核苷酸序列***编码多肽载体的核苷酸序列中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述编码重组蛋白的核酸分子包含或者由编码选自SEQID NO:23-40和69-74的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种重组蛋白，其包含多肽载体和目的多肽，其中，所述多肽载体如上文所定义，并且，所述目的多肽被***至所述多肽载体中。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽被***至所述被缺失的一个或多个氨基酸残基的位置处，或者被***至所述连接体中或其一端或两端。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者是抗原或者含有抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是表位肽，例如包含来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HIV、PDL1或HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:20-22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:4-9。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-40和69-74的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种病毒样颗粒，其包含或者由本发明的重组蛋白组成。
在另一个方面，本发明涉及一种药物组合物(例如疫苗)，其包含本发明的重组蛋白或本发明的病毒样颗粒，和任选地，一种或多种药学上可接受的载体(vehicle)或赋形剂(例如佐剂)。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白或本发明的病毒样颗粒以有效量存在于药物组合物中。例如，本发明的药物组合物可包含有效预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的量的重组蛋白或病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40和69-74的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40和69-74的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如，乙型肝炎)，其中所述目的多肽包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg或含有HBsAg的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为TBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。在一个优选的实施方案中，所述多肽载体为HBHBcAg载体，且所述表位肽包含或者是来自HBV(特别是人HBV)的抗原表位(例如，来自人HBV的HBsAg的表位(例如线性表位))。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人HBV的HBsAg蛋白或含有HBsAg蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述HBV选自HBV基因型A、B、C和D。在一个优选的实施方案中，所述HBsAg蛋白的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:35-40和69-74的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗HIV感染或与HIV感染相关的疾病(例如，AIDS)，其中所述目的多肽包含来自HIV的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含来自HIV的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自HIV的GP120蛋白或含有GP120蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是GP120蛋白的第361-375位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及一种预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)的方法，其包括，给有此需要的受试者施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在一个优选的实施方案中，以有效预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)的量施用本发明的重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及上述重组蛋白或病毒样颗粒或药物组合物，其用于预防或治疗癌症(例如，非小细胞肺癌)，其中所述目的多肽包含人PD-L1蛋白的抗原表位。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽是包含人PD-L1蛋白的抗原表位的表位肽。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽包含或者选自人PD-L1蛋白或含有人PD-L1蛋白的表位(例如线性表位)的表位肽。
在一个优选的实施方案中，所述表位肽包含或者是人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸。在一个优选的实施方案中，所述目的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一个优选的实施方案中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:29-34的氨基酸序列组成。
在另一个方面，本发明涉及编码上述重组蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
可用于***目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体可以是真核表达载体或原核表达载体。在一个优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，或噬菌体等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明还涉及制备上述重组蛋白的方法，其包括，在适合表达所述重组蛋白的条件下培养本发明的宿主细胞，和，回收所述重组蛋白。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg)”和“RBHBcAg蛋白”是指，来自蹄蝠乙型肝炎病毒(roundleaf bat HBV，RBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790373.1)。
如本文中所使用的，当提及RBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：1所示的多肽的第78-83位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在RBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的RBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“RBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：1所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述RBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第78-83位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型RBHBcAg”是指，天然存在于蹄蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“RBHBcAg载体”是指，衍生自RBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，RBHBcAg载体与RBHBcAg蛋白存在着如下差异：(a)RBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，RBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“筑帐蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(TBHBcAg)”和“TBHBcAg蛋白”是指，来自筑帐蝠乙型肝炎病毒(tent-making bat HBV，TBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790378.1)。
如本文中所使用的，当提及TBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：2所示的多肽的第80-84位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在TBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的TBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“TBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：2所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述TBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第80-84位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型TBHBcAg”是指，天然存在于筑帐蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“TBHBcAg载体”是指，衍生自TBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，TBHBcAg载体与TBHBcAg蛋白存在着如下差异：(a)TBHBcAg蛋白的N端第80-84位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，TBHBcAg蛋白的C端被缺失1-35个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“菊头蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(HBHBcAg)”和“HBHBcAg蛋白”是指，来自菊头蝠乙型肝炎病毒(horseshoe bat HBV，HBHBV)的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：KC790377.1)。
如本文中所使用的，当提及HBHBcAg蛋白的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。例如，表述“HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”是指，SEQ IDNO：3所示的多肽的第78-83位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBHBcAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBHBcAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBHBcAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：3所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBHBcAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：3的第78-83位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“野生型HBHBcAg”是指，天然存在于菊头蝠乙型肝炎病毒中的核心抗原蛋白。
如本文中所使用的，术语“HBHBcAg载体”是指，衍生自HBHBcAg蛋白的多肽载体。如上文所详细描述的，HBHBcAg载体与HBHBcAg蛋白存在着如下差异：(a)HBHBcAg蛋白的N端第78-83位氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基被缺失或被置换为连接体；以及(b)任选地，HBHBcAg蛋白的C端被缺失1-40个氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“人HBV的HBcAg”和“Hu-HBcAg”是指，人乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AAO63517.1)。如本文中所使用的，当提及人HBV的HBcAg的氨基酸序列时，其使用NCBIGENBANK数据库登录号：AAO63517.1所示的序列来进行描述。
如本文中所使用的，术语“人HBV的HBsAg”和“Hu-HBsAg”是指，人乙型肝炎病毒的表面抗原主蛋白，其是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBI GENBANK数据库登录号：AAF24729.1)。
如本文中所使用的，当提及人HBV的HBsAg的氨基酸序列时，其使用SEQ ID NO：44所示的序列(即，NCBI GENBANK数据库登录号：AAF24729.1)来进行描述。例如，表述“HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：44所示的多肽的第113-135位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，在HBsAg蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于，置换，缺失和/或添加，例如不同基因型或基因亚型的HBsAg蛋白)，而不影响其生物学功能。因此，在本发明中，术语“HBsAg蛋白”应包括所有此类序列，包括例如SEQ ID NO：44所示的序列以及其天然或人工的变体。并且，当描述HBsAg蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：44的序列片段，还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。例如，表述“HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：44的第113-135位氨基酸残基，以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，表述“X蛋白的C端缺失Y个氨基酸残基”是指，X蛋白的C端最后Y个氨基酸残基全部被去除。例如，表述“RBHBcAg蛋白的C端缺失1-40个氨基酸残基”是指，RBHBcAg蛋白的C端最后1-40个氨基酸残基全部被去除。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
如本文中所使用的，术语“杂交”是指，相互间具有互补序列的两个单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)按碱基互补配对原则退火形成双链核酸的过程。核酸杂交可以在DNA-DNA之间，也可在DNA-RNA或RNA-RNA之间进行，只要它们之间存在互补序列，可以进行碱基配对。关于核酸杂交的进一步详细描述，可参见例如，Henegariu O等人，(1999).“Custom fluorescent-nucleotide synthesis as an alternative methodfor nucleic acid labeling”,Nature Biotechnology 18:345-348；Ezaki T等人，1989.Fluorometric Deoxyribonucleic Acid-Deoxyribonucleic Acid Hybridizationin Microdilution Wells as an Alternative to Membrane Filter Hybridization inwhich Radioisotopes Are Used To Determine Genetic Relatedness among BacterialStrains.Int.J.of Systemic Bacteriology 29(3):224-229；和Herrington C等人，1998.PCR 3:PCR in situ hybridization:a practical approach,Volume 3.Oxford:Oxford University Press。
为了保证核酸杂交的特异性，通常使用严紧条件或者高严紧条件。严紧条件和高严紧条件在分子生物学领域中是熟知的。例如，严紧条件可以是指，在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中、于约45℃下进行杂交，随后在0.2×SSC/0.1％SDS中、于约50－65℃下进行一次或多次洗涤。高严紧条件可以是指，在6×SSC中、于约45℃下进行杂交，随后在0.1×SSC/0.2％SDS中、于约68℃下进行一次或多次洗涤。关于本领域技术人员已知的其它严紧条件或高严紧条件，可参见例如Ausubel,F.M.等编,1989,Current Protocols in MolecularBiology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons,Inc.,纽约，第6.3.1-6.3.6和2.10.3页。
如本文中所使用的，术语“连接体”是指，用于连接两个分子(例如蛋白)的短肽。此类连接体是本领域技术人员公知的，包括但不限于柔性连接体，例如(Gly)4，(Gly)4-Ser，((Gly)4-Ser)3等等。
在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义，可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“限制性酶切位点”是指，限制性内切酶识别的酶切位点。此类限制性酶切位点是本领域技术人员已知的，其包括但不限于，EcoR I、BamH I、HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等限制性内切酶识别的酶切位点。
如本文中所使用的，术语“抗原表位”和“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。
如本文中所使用的，术语“HBsAg的表位”是指，存在于HBsAg中的、能够被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。已对人HBV的HBsAg的结构和功能进行了深入的研究。并且，已有许多文献报道了人HBV的HBsAg上的表位。参见例如，WO 97/39029A2；WO 85/04103A1；Xiaoxing Qiu等，The Journal of Immunology，1996，第156卷，第3350-3356页；WO 2013/185558 A1等。
如本文中所使用的，术语“表位肽”是指，抗原上能够形成表位/用作表位的肽段。在一些情况下，单独的表位肽即能够被针对所述表位的抗体特异性识别/结合。在另一些情况下，可能需要将表位肽与多肽载体融合，以便表位肽能够被特异性抗体识别。表位肽所包含的表位可以是线性表位，也可以是构象表位。当表位肽包含线性表位时，其可以包含或者是抗原中构成该表位的连续氨基酸区段(即，肽片段)。当表位肽包含构象表位时，其可以包含或者是抗原中横跨该构象表位所涉及的所有氨基酸残基的连续氨基酸区段(即，肽片段)。在本发明的某些实施方案中，表位肽优选地具有不超过500个氨基酸残基的长度，例如不超过400个氨基酸残基的长度，不超过300个氨基酸残基的长度，不超过200个氨基酸残基的长度，不超过100个氨基酸残基的长度，不超过90个氨基酸残基的长度，不超过80个氨基酸残基的长度，不超过70个氨基酸残基的长度，不超过60个氨基酸残基的长度，不超过50个氨基酸残基的长度，不超过40个氨基酸残基的长度，不超过30个氨基酸残基的长度，或不超过25个氨基酸残基的长度。
如本文中所使用的，术语“多肽载体”是指这样的载体蛋白，其可以充当表位肽的载体，即，其可以在特定位置处(例如蛋白内部，N端或C端)***表位肽，以便该表位肽能够呈现出来，从而该表位肽能够被抗体或免疫***识别。之前的文献已报道了此类载体蛋白，包括例如，HPV L1蛋白(可以将表位肽***在所述蛋白的第130-131位氨基酸之间或在第426-427位氨基酸之间，参见Slupetzky,K.等Chimeric papillomavirus-like particlesexpressing a foreign epitope on capsid surface loops[J].J Gen Virol,2001,82:2799-2804；Varsani,A.等Chimeric human papillomavirus type 16(HPV-16)L1particles presenting the common neutralizing epitope for the L2minor capsidprotein of HPV-6and HPV-16[J].J Virol,2003,77:8386-8393)，CRM197蛋白(可以将表位肽连接至该蛋白或其片段的N末端或C末端)等。如上文所论述的，本发明提供了一类新的多肽载体，其用于展示目的多肽，并且特别适合用于展示含有来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)的表位肽。在本发明的实施方案中，可以在表位肽与多肽载体之间使用连接体(例如柔性或刚性连接体)，以促进二者各自的折叠。
如本文中所使用的，术语“重组蛋白”仅表示，所描述的蛋白不是天然存在的，而不意欲限定该蛋白的产生/获得方式。本发明的重组蛋白可以通过任何已知的方法来产生，包括但不限于，基因工程方法和人工合成方法。
如本文中所使用的，术语“病毒样颗粒”是指，由某种病毒的一个或多个结构蛋白构成的空心颗粒，其不包含病毒核酸，不能进行自主复制，但在形态和结构上与真正的病毒粒子相同或相似。
如本文中所使用的，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“大肠杆菌表达***”是指由大肠杆菌(菌株)与载体(vector)组成的表达***，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698,ER2566,BL21(DE3),B834(DE3),BLR(DE3)。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫***的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种新的多肽载体，其具有广泛的通用性，能够用于高效展示各种目的多肽(例如，抗原表位/抗原肽段)，并诱发宿主免疫***产生针对目的多肽的特异性免疫应答。此类目的多肽(例如，抗原表位/抗原肽段)包括但不限于，来源于HIV的抗原表位/抗原肽段(例如，来源于HIV的GP120蛋白的抗原表位/抗原肽段；例如含有GP120蛋白的第361-375位氨基酸的多肽)，来源于人PD-L1蛋白的抗原表位/抗原肽段(例如，含有人PD-L1蛋白第147-160位氨基酸的多肽)，和来源于人HBV的抗原表位/抗原肽段(例如，来源于人HBV的HBsAg蛋白的抗原表位/抗原肽段；例如含有HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸的多肽)。
(2)本发明的多肽载体特别适合用于展示来自人乙肝病毒的抗原表位(例如来自人HBV的HBsAg中的表位)，能够在受试者中诱发特别强的清除HBsAg的特异性免疫应答，其功效显著优于现有的乙肝疫苗(例如，以人HBV的HBcAg为多肽载体构建的、含有相同表位的疫苗)。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1展示了，将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg载体、TBHBcAg载体和HBHBcAg载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图。
图2展示了，实施例2中所构建的18种重组蛋白的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
图3展示了，用实施例2中构建的18种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗重组蛋白中的目的多肽的抗体滴度随时间的变化情况。纵轴：抗体滴度(log10)；横轴：时间(周)。图3A：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:20，且检测抗GP120抗体的滴度；图3B：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:21，且检测抗PD-L1抗体的滴度；图3C：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:22，且检测抗HBsAg抗体的滴度。
图4展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图 4A)和雌性(图 4B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点。
图5展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。纵轴：HBV DNA的水平(Log10IU/ml)；横轴：时间(周)。箭头指示，给小鼠施用病毒样颗粒的时间点。
图6展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图6A)和雌性(图6B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。纵轴：抗HBsAg抗体的滴度；横轴：时间(周)。
图7显示了，由实施例5中构建的6种重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。
图8展示了，用8种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠3周后，小鼠血清中抗相应靶多肽(SEQ ID NO：60，22，61，62)的抗体滴度；其中，用来自HBV基因型A的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO：60)来检测用RBHBcAg149-SEQ60和TBHBcAg153-SEQ60免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型B的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:SEQ22)来检测用RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型C的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:61)来检测用RBHBcAg149-SEQ61和TBHBcAg153-SEQ61免疫的小鼠血清的抗体滴度；并且，使用来自HBV基因型D的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:62)来检测用RBHBcAg149-SEQ62和TBHBcAg153-SEQ62免疫的小鼠血清的抗体滴度。结果显示，8种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原的抗体。
图9展示了，用4种重组蛋白(SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图9A)和雌性(图9B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况，其中，纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。
序列信息
本发明涉及的部分序列(SEQ ID NO:1-44)的信息提供于下面的表1中。
表1：SEQ ID NO:1-44的序列信息
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具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.编码多肽载体的质粒的构建
在本实施例中，我们构建了编码多肽载体的质粒。
1.1编码多肽载体的核苷酸序列的制备
基于三种蝙蝠来源的乙型肝炎病毒核心抗原蛋白(即，RBHBcAg蛋白，TBHBcAg蛋白，HBHBcAg蛋白)，设计了下述多肽载体：
RBHBcAg189载体，其与RBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:1)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；RBHBcAg189载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；
TBHBcAg188载体，其与TBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:2)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第80-83位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；TBHBcAg188载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
HBHBcAg189载体，其与HBHBcAg蛋白(SEQ ID NO:3)的区别在于，RBHBcAg蛋白的第78-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；HBHBcAg189载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
另外，还基于人HBV的HBcAg蛋白，设计了HBcAg183载体，用作对照。HBcAg183载体与人HBV的HBcAg蛋白的区别在于，人HBV的HBcAg蛋白的第79-81位氨基酸残基被替换为如SEQ ID NO:43所示的连接体；HBcAg183载体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。
上述四种载体的核苷酸序列均委托生工生物工程上海(股份)有限公司进行全基因合成。
1.2编码多肽载体的质粒的制备
以上述合成的核苷酸序列为模板，使用表2中的引物，通过PCR分别扩增上述4种载体的全长基因以及其截短体(即，C端截短的基因片段)。一共获得8种PCR产物，分别是：编码RBHBcAg189载体的基因(SEQ ID NO:12；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4)、编码RBHBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:13；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:5)、编码TBHBcAg188载体的基因(SEQ ID NO:14；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:6)、编码TBHBcAg153载体的基因(SEQ ID NO:15；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:7)、编码HBHBcAg189载体的基因(SEQ ID NO:16；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:8)、编码HBHBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:17；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:9)、编码HBcAg183载体的基因(SEQ ID NO:18；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:10)、和编码HBcAg149载体的基因(SEQ ID NO:19；其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:11)。
用NdeI和HindIII将pTO-T7载体(罗文新,张军,杨海杰,等.一种带增强子的原核高效表达载体的构建及初步应用[J].生物工程学报,2000,16(5):578-581)双酶切，获得线性化载体。利用Gibsonassembly克隆方法(New England Biolabs(UK)Ltd)，将获得的8种PCR产物与线性化载体连接，并转化入DH5a感受态细菌中。将经转化的细菌涂板培养，然后挑取单克隆菌落，提取质粒并进行测序。经测序验证，获得8种含有编码多肽载体的核苷酸序列的质粒。
上述PCR过程涉及的引物示于表2中。
表2：引物序列
实施例2.重组蛋白的制备
在本实施例中，我们将编码目的多肽的核苷酸序列***实施例1构建的质粒中，并获得了含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白。将目的多肽(靶抗原肽段)***本发明的RBHBcAg载体、TBHBcAg载体和HBHBcAg载体以构建重组蛋白的克隆方案的示意图如图1所示。
2.1编码含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白的表达质粒的构建
本实施例利用3种目的多肽来验证本发明的多肽载体用于展示肽段的通用性。这3种目的多肽为：多肽HIV-GP120-aa361-375(即，来源于HIV GP120蛋白的第361-375位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)；多肽hPDL1-aa147-160(即，来源于人PD-L1蛋白的第147-160位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示)；多肽HBsAg-aa113-135(即，来源于人HBV表面抗原主蛋白(HBsAg)的第113-135位氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示)。
直接合成所述3种目的多肽的正义和反义编码序列(如表3所示)，并进行退火，从而获得具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段。
表3：3种目的多肽的正义和反义编码序列
将实施例1中获得的6种质粒(RBHBcAg189、RBHBcAg149、TBHBcAg188、TBHBcAg153、HBHBcAg189和HBHBcAg149)分别用BamHI和EcoRI双酶切，获得6种线性化的载体。然后，将如上制备的3种具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段分别连接入各个线性化载体中，获得编码重组蛋白的表达质粒(一共18种：RBHBcAg189-SEQ20，RBHBcAg149-SEQ20，TBHBcAg188-SEQ20，TBHBcAg153-SEQ20，HBHBcAg189-SEQ20，HBHBcAg149-SEQ20，RBHBcAg189-SEQ21，RBHBcAg149-SEQ21，TBHBcAg188-SEQ21，TBHBcAg153-SEQ21，HBHBcAg189-SEQ21，HBHBcAg149-SEQ21，RBHBcAg189-SEQ22，RBHBcAg149-SEQ22，TBHBcAg188-SEQ22，TBHBcAg153-SEQ22，HBHBcAg189-SEQ22，和HBHBcAg149-SEQ22)。
2.2重组蛋白的表达、纯化和组装
使用前一步骤构建的18种表达质粒，通过相同的方法来表达和纯化所述表达质粒编码的重组蛋白。下面以RBHBcAg149-SEQX(SEQX表示SEQ20、SEQ21或SEQ22)为例，阐述这些重组蛋白的表达和纯化过程。
(2.2.1)用于表达重组蛋白的菌株的制备：将2.1中获得的表达质粒RBHBcAg149-SEQX转化入大肠杆菌ER2566菌株，从而获得表达菌株。
(2.2.2)重组蛋白RBHBcAg149-SEQX的表达：将表达菌株接种至500mL三角瓶中，于37℃定温摇床培养至OD＝1.0左右；随后加入异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，并于25℃继续表达6小时。
(2.2.3)重组蛋白RBHBcAg149-SEQX的纯化：
(2.2.3.1)菌体超声破碎：离心收取2.2.2中的菌体，并进行超声破碎。超声缓冲液为：20mM磷酸盐缓冲液(PH6.0)+300mM NaCl。
(2.2.3.2)重组蛋白的初步纯化：将超声破碎后的混合物于65℃水浴中温育30分钟，随后离心收取上清；按1:1的体积比向上清中加入饱和硫酸铵，离心收取沉淀；加入适当体积的缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)+150mM NaCl)将沉淀重悬，从而获得初步纯化的重组蛋白RBHBcAg149-SEQX。
(2.2.3.3)重组蛋白的层析纯化：按照制造商的说明书，利用Sepharose 4FF(GE)分子筛柱层析进一步纯化2.2.3.2中获得的蛋白，从而获得经纯化的重组蛋白。对经纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE检测，并用透射电镜观察由重组蛋白形成的VLP的状态。
图2显示了，所构建的18种重组蛋白的SDS-PAGE结果，以及由所述重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的18种重组蛋白的纯度均大于85％，并且均能够组装成直径约30nm病毒样颗粒。这些结果表明，本发明所构建的多肽载体具有广泛的通用性，能够用于展示各种目的多肽，并且能够形成VLP。
实施例3.病毒样颗粒的免疫原性的评估
在本实施例中，我们验证了由本发明的重组蛋白形成的病毒样颗粒的免疫原性。此类病毒样颗粒均能够诱导机体产生特异性结合靶抗原的抗体。
3.1小鼠免疫
用实施例2制备的18种病毒样颗粒分别免疫BALB/C小鼠。免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为3ug/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，初次免疫+2周后的加强免疫，共免疫2次。
3.2血清中特异性结合靶抗原的抗体的滴度的检测
3.2.1反应板的制备
反应板的包被抗原是，分别与上述3种目的多肽对应的靶抗原，即：HIV-1的gp120蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司，目录号11233-V08H)，人PD-L1蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，CHO细胞重组表达的人乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，购自北京万泰生物药业股份有限公司)。
将3种重组蛋白分别用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，终浓度为2μg/mL，以获得包被液。在96孔酶标板的各个孔中加入100μL的包被液，并在2-8℃包被16-24小时，然后在37℃继续包被2小时。然后，用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤孔1次；随后每孔加入200μL的封闭液(含20％小牛血清及1％酪蛋白的20mMNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液，pH值为7.4)，并在37℃封闭2小时。弃去封闭液。然后，将酶标板干燥，并装入铝箔袋，于2-8℃保存备用。
3.2.2血清中Anti-HBsAg抗体滴度的ELISA检测
血清样品的收集：在0、2、4周采集小鼠眼眶血，分离血清并冻存于-20℃，直至检测。
样品稀释：用含20％新生牛血清的PBS溶液将小鼠血清稀释成1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500、1:1562500共7个稀释梯度。
ELISA检测：向经包被的酶标板的各孔中加入100μL已稀释的血清样品，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入100μL GAM-HRP反应液，于37℃孵育30分钟。然后，用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)将酶标板洗涤5遍。洗涤后，向酶标板的各孔中加入50μL TMB显色剂(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，于37℃孵育15分钟。孵育完成后，向酶标板的各孔中加入50μL终止液(由北京万泰生物药业股份有限公司提供)，并在酶标仪上读取各孔的OD450/630值。
抗体滴度的计算：取读值在0.2-2.0之间的样品孔进行分析，对样品的稀释倍数与读值作回归曲线，计算出读值等于2倍本底值时的样品稀释倍数，并将该样品稀释倍数作为血清中的特异性抗体的滴度。
图3展示了，用18种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠后，小鼠血清中抗靶抗原的抗体滴度随时间的变化情况。图3A：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:20，且检测抗GP120抗体的滴度；图3B：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:21，且检测抗PD-L1抗体的滴度；图3C：所使用的目的多肽为SEQ ID NO:22，且检测抗HBsAg抗体的滴度。结果显示，18种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶抗原的抗体。
实施例4.展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果的评估
在本实施例中，我们评估了基于不同多肽载体构建的、展示相同表位肽(SEQ IDNO:22)的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。
4.1小鼠免疫
按照实施例1-2描述的方案，制备了基于人HBV的HBcAg构建的、展示HBsAg表位(SEQ ID NO:22)的2种重组蛋白(即，HBcAg183-SEQ22，其氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示；和HBcAg149-SEQ22，其氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示)，并制备了由这2种重组蛋白形成的病毒样颗粒。
随后，利用HBV转基因小鼠模型来评价实施例2中制备的5种展示HBsAg表位(SEQID NO:22)的病毒样颗粒以及本实施例制备的2种病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。
免疫方案如下：免疫佐剂为氢氧化铝佐剂；免疫剂量为12μg/dose；免疫方式为后肢大腿外侧肌肉注射；免疫程序为，0、2、3、4、5、6周各免疫一次，共免疫6次。
4.2血清抗体滴度与病毒学指标的检测
按实施例3.2中描述的方法进行血清中Anti-HBsAg抗体滴度的检测，并检测小鼠血清中的病毒学指标，即，HBV DNA和HBsAg的水平。
4.3重组蛋白的治疗效果分析
检测结果示于图4-6中。图4展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图4A)和雌性(图4B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况。图5展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性小鼠后，小鼠血清中HBV DNA的水平随时间的变化情况。图6展示了，用展示相同表位肽(SEQ ID NO:22)的不同病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图6A)和雌性(图6B)小鼠后，小鼠血清中抗HBsAg抗体的滴度随时间的变化情况。
结果显示，在用VLP进行免疫治疗的组中，在免疫后，小鼠血清中均可检出Anti-HBsAg抗体，并且小鼠血清中的HBV DNA和HBsAg的水平均出现了不同程度的下降。相比之下，对照组小鼠(未用VLP进行免疫)的血清中均没有产生Anti-HBsAg抗体，并且血清中的HBVDNA和HBsAg的水平均未出现下降。
这些结果显示，基于蝙蝠乙型肝炎病毒核心蛋白所构建的6种多肽载体均可以用于高效展示来自人HBV的HBsAg的表位肽(例如，HBsAg-aa113-135)，其能够形成VLP，并在宿主体内诱导机体产生高滴度的anti-HBsAg抗体，并由此抑制小鼠体内的HBV DNA和HBsAg的水平(即，HBV DNA和HBsAg显著下降)。此外，图4-6的实验数据还显示，基于本发明的多肽载体(例如RBHBcAg149和TBHBcAg153)的病毒样颗粒具有特别显著的抗HBV治疗效果，其优于基于人HBV的HBcAg构建的病毒样颗粒。
因此，本实施例的实验结果表明：(1)本发明的多肽载体能够形成VLP，适合于展示各种目的多肽，并能够诱导机体产生高滴度的针对目的多肽的抗体；(2)本发明的多肽载体特别适合于展示人HBV的表位(例如，人HBV的HBsAg的表位)，其能够诱导机体产生高滴度的针对HBsAg的抗体，清除或抑制体内的HBV DNA和HBsAg的水平，并且其效果优于基于人HBV的HBcAg构建的多肽载体。因此，本发明的展示人HBV的表位的重组蛋白具有治疗HBV感染的潜力，特别适合用于诱发有效的、特异的、治疗性的抗HBV免疫。
实施例5.展示来自不同基因型的HBV的HBsAg表位的病毒样颗粒的制备和评估
实施例2-4中所使用的HBsAg表位(SEQ ID NO:22)来自HBV基因型B。为了证实本发明的多肽载体对各种基因型的HBV的广泛适应性，我们还以RBHBcAg149和TBHBcAg153为示例性多肽载体，构建了展示来自不同基因型(基因型A、C和D)的HBV的HBsAg表位的重组蛋白，并评估了所构建的重组蛋白组装成病毒样颗粒的能力，以及所产生的病毒样颗粒的免疫原性和抗HBV感染的治疗效果。
5.1编码含有目的多肽和多肽载体的重组蛋白的表达质粒的构建
在本实施例中，除了实施例2-4中所使用的HBsAg表位(来自HBV基因型B，SEQ IDNO:22)之外，目的多肽还包括来自HBV基因型A、C和D的HBsAg蛋白表位(第113-135位氨基酸)，其分别被命名为：HBsAg-aa113-135-A，HBsAg-aa113-135-C和HBsAg-aa113-135-D，并且其序列(SEQ ID NO:60-62)示于表4中。
表4：来自HBV基因型A、C和D的HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸的序列
SEQ ID NO 名称 序列信息
60 HBsAg-aa113-135-A STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
61 HBsAg-aa113-135-C TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
62 HBsAg-aa113-135-D SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
直接合成所述3种目的多肽的正义和反义编码序列(如表5所示)，并进行退火，从而获得具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段。
表5：3种目的多肽的正义和反义编码序列
如实施例2中所述，将如上制备的3种具有粘性末端的、编码目的多肽的基因片段分别连接入线性化载体RBHBcAg149和TBHBcAg153中，从而获得编码重组蛋白的表达质粒(共6种：RBHBcAg149-SEQ60，RBHBcAg149-SEQ61，RBHBcAg149-SEQ62，TBHBcAg153-SEQ60，TBHBcAg153-SEQ61，TBHBcAg153-SEQ62)。这些表达质粒所编码的重组蛋白的氨基酸序列如表6所示。
表6：6种重组蛋白的氨基酸序列
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5.2重组蛋白的表达、纯化和组装
如实施例2中所述，使用前一步骤构建的6种表达质粒，表达和纯化了所述表达质粒编码的重组蛋白。随后，使用透射电镜观察由这些重组蛋白形成的VLP的状态。
图7显示了，由所构建的6种重组蛋白形成的病毒样颗粒的透射电镜观察结果。结果显示，所获得的6种重组蛋白均能够组装成直径约30nm病毒样颗粒。这些结果表明，本发明所构建的多肽载体具有广泛的通用性，能够用于展示来自各种基因型的HBV的表位肽(例如HBsAg蛋白的aa113-135)，并且能够形成良好的VLP。
5.3病毒样颗粒的免疫原性的评估
使用实施例3中描述的方法，评估了如上构建的6个重组蛋白以及实施例2中的重组蛋白RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22形成的病毒样颗粒的免疫原性。实验结果示于图8中。
图8展示了，用8种重组蛋白形成的病毒样颗粒免疫BALB/C小鼠3周后，小鼠血清中抗相应靶多肽(SEQ ID NO：60，22，61，62)的抗体滴度；其中，用来自HBV基因型A的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO：60)来检测用RBHBcAg149-SEQ60和TBHBcAg153-SEQ60免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型B的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:SEQ22)来检测用RBHBcAg149-SEQ22和TBHBcAg153-SEQ22免疫的小鼠血清的抗体滴度；用来自HBV基因型C的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:61)来检测用RBHBcAg149-SEQ61和TBHBcAg153-SEQ61免疫的小鼠血清的抗体滴度；并且，使用来自HBV基因型D的HBsAg蛋白的表位肽(SEQ ID NO:62)来检测用RBHBcAg149-SEQ62和TBHBcAg153-SEQ62免疫的小鼠血清的抗体滴度。结果显示，8种重组蛋白形成的病毒样颗粒均具有良好的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度的特异性结合靶表位的抗体。
5.4病毒样颗粒的抗HBV治疗效果的评估
使用实施例4中描述的方法，评估了4种重组蛋白(SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒的抗HBV治疗效果。实验结果示于图9中。
图9展示了，用如上构建的4种重组蛋白(RBHBcAg149-SEQ22，RBHBcAg149-SEQ60，RBHBcAg149-SEQ61，RBHBcAg149-SEQ62；其序列分别SEQ ID NO：36，69，70，71)形成的病毒样颗粒治疗HBV转基因雄性(图9A)和雌性(图9B)小鼠后，小鼠血清中HBsAg的水平随时间的变化情况，其中，纵轴：HBsAg的水平(IU/ml)；横轴：时间(周)。结果显示，在用VLP进行免疫治疗的小鼠中，在免疫后，小鼠血清中的HBsAg的水平均出现了显著的下降。
这些实验结果显示，本发明的多肽载体(例如RBHBcAg149和TBHBcAg153)可用于高效展示来自不同基因型(例如基因型A、B、C和D)的人HBV的HBsAg的表位肽(例如，HBsAg-aa113-135)。基于本发明的多肽载体和HBsAg的表位肽所构建的重组蛋白能够形成VLP，并且能够在宿主体内诱导机体产生高滴度的anti-HBsAg抗体，并由此抑制小鼠体内的HBsAg的水平(即，HBsAg的水平显著下降)。这表明，含有本发明的多肽载体和HBsAg的表位肽的重组蛋白能够用于预防和治疗各种基因型的HBV的感染，从而可用于开发新的抗HBV疫苗和药物。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (47)

1.一种核酸分子，其包含编码多肽载体的核苷酸序列，其中，所述多肽载体为RBHBcAg载体，其与蹄蝠乙型肝炎病毒的核心抗原蛋白(RBHBcAg蛋白)的区别在于：(a)RBHBcAg蛋白的N端与SEQ ID NO:1第78-81位相应位置的氨基酸残基被缺失或被置换为柔性连接体；以及(b)RBHBcAg蛋白的C端缺失40个氨基酸残基；
其中，所述核酸分子还包含编码目的多肽的核苷酸序列，其中，所述目的多肽是包含来自人HBV的HBsAg的表位的表位肽，并且所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述柔性连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。
2.权利要求1的核酸分子，其中，所述人HBV为HBV基因型A。
3.权利要求1的核酸分子，其中，所述人HBV为HBV基因型B。
4.权利要求1的核酸分子，其中，所述人HBV为HBV基因型C。
5.权利要求1的核酸分子，其中，所述人HBV为HBV基因型D。
6.权利要求1的核酸分子，其中，所述RBHBcAg蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
7.权利要求1的核酸分子，其中，所述柔性连接体为如SEQ ID NO:43所示的连接体。
8.权利要求1的核酸分子，其中，在编码所述被缺失的氨基酸残基的位置处引入限制性酶切位点。
9.权利要求1的核酸分子，其中，在编码所述柔性连接体的核苷酸序列中和/或其一端或两端引入限制性酶切位点。
10.权利要求1的核酸分子，其中，所述多肽载体的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
11.权利要求1的核酸分子，其中，所述编码多肽载体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。
12.权利要求1的核酸分子，其中，所述HBsAg的表位为线性表位。
13.权利要求1的核酸分子，其中，所述HBsAg的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
14.权利要求1的核酸分子，其中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。
15.权利要求1的核酸分子，其中，所述核酸分子包含或者由编码选自SEQ ID NO:36和69-71的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
16.一种载体，其包含权利要求1-15任一项的核酸分子。
17.权利要求16的载体，其为克隆载体或表达载体。
18.一种宿主细胞，其包含权利要求1-15任一项的核酸分子或权利要求16或17的载体。
19.一种展示目的多肽的方法，其中，所述目的多肽是包含来自人HBV的HBsAg的表位的表位肽，所述方法包括:
(1)将编码所述目的多肽的核苷酸序列***至权利要求1-11任一项所定义的编码多肽载体的核苷酸序列中，从而获得编码重组蛋白的核酸分子；其中，所述编码目的多肽的核苷酸序列被***至编码所述被缺失的氨基酸残基的位置处，或者被***至编码所述柔性连接体的核苷酸序列中或其一端或两端；和
(2)将步骤(1)中的编码重组蛋白的核酸分子表达为重组蛋白。
20.权利要求19的方法，其中，通过限制性酶切位点，将所述编码目的多肽的核苷酸序列***至编码所述被缺失的氨基酸残基的位置处，或者***至编码所述柔性连接体的核苷酸序列中或其一端或两端。
21.权利要求19的方法，其中，所述人HBV选自HBV基因型A、B、C或D。
22.权利要求19的方法，其中，所述HBsAg的表位为线性表位。
23.权利要求19的方法，其中，所述HBsAg的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
24.权利要求19的方法，其中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。
25.权利要求19的方法，其中，所述编码重组蛋白的核酸分子包含或者由编码选自SEQID NO:36和69-71的氨基酸序列的核苷酸序列组成。
26.一种重组蛋白，其包含多肽载体和目的多肽，其中，所述多肽载体如权利要求1-11任一项所定义，所述目的多肽是包含来自人HBV的HBsAg的表位的表位肽，并且，所述目的多肽被***至所述被缺失的氨基酸残基的位置处，或者被***至所述柔性连接体中或其一端或两端。
27.权利要求26的重组蛋白，其中，所述多肽载体的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5。
28.权利要求26的重组蛋白，其中，所述人HBV选自HBV基因型A、B、C或D。
29.权利要求26的重组蛋白，其中，所述HBsAg的表位为线性表位。
30.权利要求26的重组蛋白，其中，所述HBsAg的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
31.权利要求26的重组蛋白，其中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。
32.权利要求26的重组蛋白，其中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:36和69-71的氨基酸序列组成。
33.一种病毒样颗粒，其包含或者由权利要求26-32任一项的重组蛋白组成。
34.一种药物组合物，其包含权利要求26-32任一项的重组蛋白或权利要求33的病毒样颗粒，和任选地，一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
35.权利要求34的药物组合物，其为疫苗。
36.权利要求34的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体或赋形剂为佐剂。
37.权利要求26-32任一项的重组蛋白或权利要求33的病毒样颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于预防或治疗人HBV感染或与人HBV感染相关的疾病，其中所述目的多肽是包含来自人HBV的HBsAg的表位的表位肽。
38.权利要求37的用途，其中，所述与人HBV感染相关的疾病为乙型肝炎。
39.权利要求37的用途，其中，所述人HBV选自HBV基因型A、B、C或D。
40.权利要求37的用途，其中，所述HBsAg的表位为线性表位。
41.权利要求37的用途，其中，所述HBsAg的表位为HBsAg蛋白的第113-135位氨基酸。
42.权利要求37的用途，其中，所述目的多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:22和60-62。
43.权利要求37的用途，其中，所述重组蛋白包含或者由选自SEQ ID NO:36和69-71的氨基酸序列组成。
44.一种多核苷酸，其编码权利要求26-32任一项的重组蛋白。
45.一种载体，其包含权利要求44的多核苷酸。
46.一种宿主细胞，其包含权利要求44的多核苷酸或权利要求45的载体。
47.制备权利要求26-32任一项的重组蛋白的方法，其包括，在适合表达所述重组蛋白的条件下培养权利要求46的宿主细胞，和，回收所述重组蛋白。
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