CN1589330A - 胰岛干细胞及其在治疗糖尿病中的用途 - Google Patents

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Abstract

治疗I型胰岛素依赖型糖尿病及其他疾病的方法及组合物，它使用新发现的能够分化为不同的胰岛细胞，包括产生胰岛素的β细胞以及肝细胞的干细胞。巢素和ABCG2被鉴别为胰腺干细胞的一个分子标记，而细胞角蛋白19作为胰导管细胞的一个明确标记。本发明同样也描述了巢素和/或ABCG2阳性干细胞可分离自胰岛且培养以获得干细胞或假胰岛类似结构的方法。同样也描述了胰腺干细胞的体外分化的方法。描述了分离、扩增及移植胰腺干细胞进入患者以同种异体移植、同种移植或者异种异体移植以取代丢失或损坏胰岛素分泌细胞或其它细胞的方法。

Description

胰岛干细胞及其在治疗糖尿病中的用途
本发明要求下列优先权：2001年9月26日提交的美国专利申请09/963,875，2002年4月11日提交的美国专利申请10/120,687，2002年5月2日提交的美国专利申请10/136,891。
技术领域
本发明涉及到干细胞及其分化领域，尤其是涉及到胰腺胰岛β细胞及巢素(nestin)阳性肝干细胞及其从干细胞及祖细胞的分化，以及胰腺干细胞，祖细胞，及已分化的β细胞或巢素(nestin)阳性肝干细胞或祖细胞在器官移植中的用途。
背景技术
本发明是在得到至少部分美国政府基金的资助下完成的，其得到国立卫生研究所DK30457、DK30834、DK55365、DK60125的支持，因此，美国政府享有本发明的一定权利。
胰岛细胞的起源，包括其在胚胎发育还是在成熟哺乳动物细胞阶段，尽管已作了许多研究，但依然不确定。  一些导管上皮细胞能够分化或者反分化以形成在成熟胰岛中的β细胞及其他类型的细胞(Bouwens，1998)。来自分离胰岛的导管细胞可以在培养物中增殖且如果移植进入动物体内，可以分化成功能性β细胞(Cornelius et al.，1997)。
已经可以证明exendin-4，一个长期作用的GLP-1拮抗剂，当给予鼠类时激发了来自导管祖细胞的(新生)的β细胞的分化及β细胞的增殖。在一个2型糖尿病鼠模型的部分胰切手术中胰切后10天每天给予exendin-4可以减缓糖尿病的发展。已经可以证明exendin-4刺激了胰腺的再生及新生的β细胞群体的扩增及β细胞的增殖(Xu et al.，1999，Diabetes，48：2270-2276)。
Ramiya等，已经证明分离自成人前驱糖尿病非肥胖糖尿病(NOD)鼠的胰腺导管的多能性干细胞的体外产生的胰岛分化形成葡萄糖响应性胰岛其可以在不管是以囊装是否进入糖尿病NOD鼠类(Ramiya et al.，2000，Nature Med.，6：278-282)移植后反转胰岛素依赖型糖尿病。
促胰岛激素，肠生高血糖素相似性多肽(GLP)-1可以提高有助于胰腺发育的同源区转录因子IDX-1的胰腺表达及胰岛素基因的转录调控。与此同时，GLP-1被给予糖尿病小鼠刺激胰岛素的分泌且可以有效地降低其血糖水平。GLP-1同样可以提高β细胞的再生及胰岛的大小(Stoffers et al.，2000，Diabetes，49：741-748)。
Ferber等，已经证明了腺病毒介导的体外PDX-1(同样也为IDX-1)转移基因转移进入小鼠肝细胞结果使得肝细胞数量向β细胞显型反转。其表明使用PDX-1腺病毒载体静脉内输入小鼠后有超过60％的肝细胞合成PDX-1。处理小鼠的血清及肝中免疫反应性胰岛素浓度大量增加。使用PDX-1处理的小鼠存活于链脲霉素诱导的糖尿病且可以调节血糖过高症(Ferber et al.，2000，Nature Med.，6：568-572)。
获自分离胰岛的导管细胞培养物明显含有可以提高胰岛素分泌的细胞量，其还不清楚是否这些细胞是真正的干细胞或仅仅是导管上皮细胞所经历的反分化状态。即使这些物质中含有真正的干细胞，尚不清楚哪一部分代表干细胞及可以被描述的细胞类型。因此需要从胰腺组织中分离出特定的细胞类型，使用分子标记证明哪一部分是干细胞的细胞类型且证明其是多能性的且可以长期增殖。
在大脑中已发现能够分化成为神经元及神经胶质组织的多能性干细胞。神经干细胞特定表达巢素(nestin)，一个中间丝状体蛋白(Lendahl et al.，1990；Dahlstrand etal.，1992)。在第E11天巢素表达于发育小鼠胚胎神经管中，其在第E16天在大脑皮层达到表达量的最高水平，然后在成人大脑皮层降低，局限于室管膜细胞群体(Lendahl et al.，1990)。发育中的神经***及胰腺胰岛细胞显示出其与普通细胞特征相似的表型。
本发明涉及到胰腺胰岛干细胞/祖细胞(IPCs)群体其与神经元及肝干细胞相似且分化成胰岛α-细胞(高血糖素)及β细胞(胰岛素)。本发明同样涉及巢素阳性肝细胞。按照本发明的IPCs是免疫耐受性型还是免疫优势型通过其自身作为移植受体来证实。按照本发明的IPCs可以被用于同种异基因或经过异源基因载体移植。
本领域需要通过同种异基因或经过异源基因载体的方法移植干细胞。
本领域同样需要治疗I型糖尿病的方法其中胰岛，巢素阳性胰腺干细胞或者巢素阳性肝干细胞通过同种异基因或异种基因的载体方法被转移进入受体细胞且并未发生移植排斥反应。
本领域同样需要移植进入一个哺乳动物细胞的方法其中胰岛，巢素阳性胰腺干细胞或者巢素阳性肝干细胞通过同种异基因或异种基因的载体方法被转移进入受体细胞且并未发生移植排斥反应。
发明内容
本发明的目的是提供一个哺乳动物胰腺或肝干细胞用于治疗糖尿病及其他病症。提供鉴别，定位及分离胰腺干细胞的方法也是本发明的目的，同样为本发明目的的还有提供一个分化胰腺干细胞以获得可产生胰岛素及其他激素的细胞的方法。本发明的另外一个目的是提供可使用哺乳动物胰腺或肝干细胞移植进入哺乳动物的方法。这些及其他的本发明的目的可通过下述一个或多个具体的实施例来体现。
该发明的实施例之一提供一种治疗糖尿病病人的方法。一种巢素阳性胰腺干细胞从供体的胰岛中被分离出来。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞，被从供体的胰岛中分离出来。在另一个实施例中，一种对SST-R2、SST-R3和/或SST-R4阳性的胰腺干细胞被从供体的胰岛中分离出来。干细胞被移植到病人身上，并在病人体内分化成能分泌胰岛素的细胞。
另一个实施例提供另一种治疗糖尿病病人的方法。一种巢素阳性胰岛干细胞从供体的胰岛中被分离出来，并在体外增殖，以生成一种始祖细胞(progenitor cell)。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞，被从供体的胰岛中分离出来，并在体外增殖，以生成一种始祖细胞。始祖细胞被移植入病人体内，在那里分化成能分泌胰岛素的细胞。另一个实施例仍还提供另一种治疗糖尿病病人的方法。一种巢素阳性胰腺干细胞从供体的胰岛中被分离出来，并在体外增殖，以生成一种始祖细胞。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞，被从供体的胰岛中分离出来，并生长成一种始祖细胞。始祖细胞在培养基中分化，形成假胰岛样的、被移植入病人体内的聚集体。
另一个实施例提供另一种治疗糖尿病病人的方法。一种巢素阳性胰岛干细胞被从供体的胰岛中分离出来，并在体外培养，以生成一种始祖细胞。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞，被从供体的胰岛中分离出来，并在体外培养，以生成一种始祖细胞。始祖细胞被移植到病人身上，并在病人体内分化成能分泌胰岛素的β细胞。
在这些实施例中，病人也可作为胰岛组织的供体，提供一种细胞的或分化组织的同基因移植物(isograff)。
在另一个优选的实施例中，干细胞在移植步骤前，在体外用一种从以下及其组合物组成的组中选择的试剂处理：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
在另一个优选的实施例中，移植通过内窥镜逆注射实现，或通过注射入胰动脉中。
在另一个优选的实施例中，治疗糖尿病病人的方法还附加包括免疫抑制剂治疗步骤。
在另一个优选的实施例中，免疫抑制剂从由FK-506、环孢子菌素和GAD65抗体组成的组中选择。
另一个实施例提供一种从胰岛分离干细胞的方法。一个胰岛从供体身上被取下，从之培养细胞。从培养物中选择一种巢素阳性干细胞克隆。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞的克隆，从培养物中选择出来。作为一项可选择性的步骤，可通过在以伴刀豆球蛋白A(concanavalin A)涂层的培养皿中培养，首先洗净该胰岛的非胰岛细胞。伴刀豆球蛋白A能与非胰岛细胞结合。
在一个优选的实施例中，分离干细胞的方法更进一步包括通过应用一种试剂处理扩增克隆的附加步骤，这种试剂是从由EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素、TGF-β及其组合物组成的组中选择的。
另一个实施例提供一种诱导巢素阳性胰腺干细胞分化成胰始祖细胞的方法。另一个实施例提供诱导一种胰腺干细胞分化的方法，这种胰腺干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或对CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一不表达或其全部不表达。正如这儿所使用到的，“分化”指那种过程，细胞赖其经历变化，变成某一特别的细胞类型，例如变成一种专门的细胞类型。该干细胞用一种由EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素、TGF-β及其组合物组成的组中选择的试剂处理。该干细胞随后分化成一种胰始祖细胞。
在一个优选实施例中，胰始祖细胞随后形成假胰岛样的聚集体。
然而，另一个实施例提供一种分离的巢素阳性人体胰或肝的干细胞。另一个实施例也还提供一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的分离胰腺干细胞。在这个实施例的各种形式中，该干细胞或者分化成β细胞、或者α细胞、或者假胰岛样聚集体或肝细胞。在这个实施例的各种形式中，该干细胞受免疫豁免待遇。在这个实施例的多种形式中，该干细胞不表达MHCII型抗原。在这个实施例的多种形式中，该干细胞不表达MHCI型或II型抗原。
另一个实施例还提供一种鉴别一种胰腺细胞为干细胞的方法。一种细胞与一种标记巢素特异抗体接触，如果该细胞因为抗体而变成标记，那么该细胞就被鉴别为是一种干细胞。在另一个实施例中，胰腺干细胞通过与一种对任何ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、SST-R3、SST-R4、SUR-1或Kir6.2特异的抗体接触，就可鉴别为干细胞——以一种细胞因为一种抗体而变为标记就被鉴别为干细胞的方式。可选择的附加步骤包括，将该细胞与细胞角蛋白19(cytokeratin 19)抗体和胶原IV抗体接触；如果该细胞不因变细胞角蛋白19或胶原IV抗体变为标记，那么该细胞就被鉴别为一种干细胞。
在另一个实施例中，通过将胰腺干细胞与一种对任何CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型特异的抗体接触而将其鉴别。在此情种情况，如果细胞不因以上任何抗体而变为标记就可将其鉴别为干细胞。
另一个实施例提供一种诱导巢素阳性胰腺干细胞分化成肝细胞的方法。巢素阳性胰腺干细胞用一种有效剂量的、能诱导干细胞分化成肝细胞或肝细胞始祖细胞的试剂处理。在一个优选的实施例中，该试剂为环杷明(cyclopamine)。另一个实施例通过应用一种有效剂量的、能诱导干细胞分化成肝细胞或能分化成肝细胞的始祖细胞的试剂处理，提供诱导一种胰腺干细胞分化成肝细胞的方法，这种胰腺干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达。
然而，另一个实施例提供一种治疗治疗肝病病人的方法。一种巢素阳性胰腺干细胞从供体的胰岛中分离出来，并移植入病人的体内，在病人体内该干细胞分化成肝细胞。在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的胰腺干细胞，被从供体的胰岛中分离出来，并移植入病人的体内，在病人体内干细胞分化成肝细胞。
在一相关实施例中，干细胞在体外生长成始祖细胞，而后始祖细胞被移植入病人体内并在病人体内进一步分化成肝细胞。
在另一相关实施例中，干细胞在体外分化成始祖细胞，而后将始祖细胞移植入病人体内并进一步分化成肝细胞。在另一相关实施例中，干细胞在体外分化成随后植入病人体内的肝细胞。
在这些实施例中，该病人也可作为胰岛组织的供体，提供细胞或分化组织的同基因移植物。
然而，另一个实施例提供一种分离的、巢素阳性人体肝干细胞。在这个实施例的各种形式中，干细胞是免疫特异的。在这个实施例的多种形式中，干细胞不表达MHCI型抗原。在这个实施例的多种形式中，该干细胞不表达MHCII型抗原。在这个实施例的多种形式中，该干细胞不表达MHCI型或MHCII型抗原。
然而，另一个实施例提供一种分离的、非神经***的巢素阳性人体干细胞，可被移植入动物而不引起宿主对移植物的排斥。在这个实施例的多种形式中，该干细胞不是主要组织相容性复合体I型或有限I型。然而，另一实施例提供一种分离的，至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的非神经***人体干细胞，能被移植入动物而不引起宿主对移植物的排斥。
这儿所使用的“干细胞”意指未分化细胞其可以在体内外无限制性地繁殖并能够分化成为其他细胞类型。其可以是某种分化细胞，定向型细胞，不成熟细胞，祖细胞或成熟细胞类型，例如红血球及淋巴细胞其来源于相同的祖细胞，甚至是组织发育各阶段的细胞类型其完全不同于干细胞时的组织。例如，血液干细胞可以变为脑细胞或肝细胞，神经细胞可以变为肝细胞，如此干细胞是多功能性的，假如从周围环境中获得一定的信号，其可以分化成为机体的任何组织。
在一个实施例中，本发明所述的“干细胞”是免疫盲或免疫豁免的。正如这儿所使用的“免疫盲或免疫豁免”指的是细胞并不诱发免疫反应。正如这儿所使用的，“免疫反应”指的是由免疫***针对外源物质所发生的反应。正如这儿所使用的，包括但并不限于移植排斥，抗体产生，感染及抗原特异性淋巴细胞针对抗原的反应。按照本领域的已知技术如果移植物志被成功移植或排斥都可以检测到免疫反应，正如在移植排斥反应分析的部分进行定义那样。在一个实施例中，按照本发明一个″免疫盲的干细胞″或者一个″免疫豁免的干细胞″可以被同种异体移植或者异种移植而不发生移植排斥反应在移植受体或宿主中可以被识别为自身。
如果宿主对移植物质不是免疫耐受性的或者并未使用免疫抑制试剂以防排斥，移植物质可能要遭受到移植受体或者宿主的排斥。
正如这儿所使用的，按照本发明，一个宿主如果是免疫耐受性的，正如这儿所定义的那样，其不会马上发生免疫反应。在一个实施例中，免疫耐受性宿主并不排斥或破坏移植物质。在一个实施例中，免疫耐受性性宿主对抗原并不发生通过产生抗体结合在抗原上的反应。
正如这儿所使用的，″排斥″指的是由宿主免疫***排斥抑制物质。在一个实施例中，″排斥意指针对宿主免疫反应的结果移植物有超过90％的细胞或组织坏死现象发生″。在另一个实施例中 ″排斥″意指生存能力的降低而且移植物针对宿主免疫反应的结果其生存能力与移植前相比降低90％甚至更多。生存能力的降低可由本领域的普通技术来确定其包括但并不限于trypan蓝色排斥染色。在另一个实施例中，″排斥″意指移植物不能增殖。增殖可以通过本领域的已知技术其包括但并不限于苏木精/曙红染色来测量。移植排斥的发生和/或移植后排斥发生的速度将依赖于各种因素，其包括但并不限于移植物质(也就是说，细胞类型，细胞数量)或宿主(也就是说，不管宿主是否免疫耐受性的和/或已经使用免疫抑制剂处理过)。正如这儿所使用到的，″移植物对宿主的排斥″或″移植物对宿主的反应″指的是移植物与宿主抗原发生的T细胞介导的反应。
正如这儿所使用到的，″宿主对移植排斥″或″宿主对移植物反应″指的是宿主免疫***抵抗外来移植物的细胞介导的免疫反应。
在另一个实施例中，特异性抗体的产生发生免疫反应(例如特异性连接在移植物抗原上的抗体或特异性连接在外源物质或外源物质产品上的抗体)通过本领域已知的免疫方法检测，包括但并不限于ELISA，免疫染色，免疫沉降反应及蛋白质印迹分析。
干细胞在细胞表面表达形态发生或生长因子受体，且可以感觉到，例如，受伤相关因子然后定位于组织受伤位点，或感受到其周围的微环境及分化成为合适的细胞类型。
″基本无限制性增殖″可以被确定，例如，通过分离干细胞在细胞培养***中通过至少50，最好是100，甚至200或者更多的细胞分化进行增殖的能力。干细胞可以是″全能的″意指其可以成为所有的有机体细胞例如细菌细胞。干细胞也可以是″多能性的″意指其可以成为不同类型的细胞但并不是所有的有机体细胞，当一个干细胞分化时，其一般成为一个更加成熟的细胞类型，其可以成为部分分化的细胞例如祖细胞，一个分化的细胞或者一个终止分化的细胞。干细胞可以是高度活动性的。
″巢素″指的是中间纤维蛋白，其序列已在Genbank上登记，号为X65964(图7)。
“ABCG2”指ATP结合盒多药抵抗(或耐药)转运体G2，它带有XM-032424号基因库编号揭示的序列(图18)。编码ABCG2的DNA序列可能有变化，但编码氨基酸序列保持不变，此种情况该技术将能辨认有同类物的存在。
“Oct3/4”指一种POU/同源结构域(Homeodomain)转录因子，带有基因库编号NM013633号显示的序列。
“GLP-1R”指由图21显示的核酸序列(基因库编号U01156号)编码的高血糖素样肽-1受体，并带有图17显示的氨基酸序列(基因库编号U01156号)。编码GLP-1R的DNA序列可能有变化，但编码氨基酸序列保持不变，此种情况该技术将能辨认有同类物的存在。
“Latrophilin(2型)”指一种G蛋白偶联受体，其带有基因库编号AJ131481号显示的序列。
“Hes-1”指一种bHLH转录因子，其带有基因库编号NM-005524号显示的序列。
整合素是整合(组合)的细胞表面蛋白质，由一条α链链和一条β链组成。一条指定的链可以跟多种配对结合组成不同的整合素。例如，α6可以跟β4结合形成被称为TSP180的整合素，与β1形成VLA-6整合素。
整合素亚单元“α6”指带有基因库编号NM-000210号显示序列的人体α6 cDNA。
整合素亚单元“β1”指带有基因库编号X07979号显示序列的人体β1 cDNA。
“c-Kit”指一种细胞表面受体酪氨酸激酶，带有基因库编号X06182号显示的一个序列。
“MDR-1”指那种带有基因库编号NM-000927号显示的一个序列的多药抵抗转运体1。
“SST-R2”、“SST-R3”和“SST-R4”指带有基因库编号XM-085745号(SST-R2)、NM-001051号(SST-R3)或XM-009594号(SST-R4)显示序列的生长激素抑制素受体。
“SUR-1”指一种带有基因库编号XM-042740号显示的一个序列的人磺酰脲类受体。
“Kir 6.2”指一种人体内向整流钾通道，带有基因库编号AF021139号显示的一个序列。
“CD34”指一种跨膜糖蛋白，带有基因库编号NM-001773号显示的一个序列。
“CD45”指那种带有基因库编号Y00638号显示的一个序列的白细胞共同抗原。
“CD133”指一种五膜造血干细胞抗原，带有基因库编号NM-006017号显示的一个序列。
一个”胰腺干细胞”意指一个已从胰组织分离出来的干细胞和/或一个具备所有以下特点的细胞：巢素阳性染色、巢素基因表达、细胞角蛋白-19阴性染色、长期在培养基中增殖并具备在培养基中能分化成假岛(胰岛)的能力。
一个”胰腺干细胞”也指一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或其全部不表达的干细胞。
在一个实施例中，一个”胰腺干细胞”还指一种对SST-R2、SST-R3和/或SST-R4显阳性的干细胞。
一个″肝″干细胞指的是分离自肝组织的干细胞和或巢素阳性染色特征的细胞，巢素基因表达，及其在培养物中的长期增殖。
一个″祖细胞″指的是一个通过分化获自干细胞的细胞其能够进一步分化成为更加成熟的细胞类型。
正如这儿所使用的，词组″产生胰岛素的β细胞″指的是能够产生分泌与人类胰脏胰岛细胞β细胞分泌的相同数量的胰岛素的所有细胞。优选的，产生胰岛素的β细胞胰岛素的分泌同样以人类β细胞原位胰岛素的分泌调控相似的方式进行调控；例如，胰岛素的分泌同样可为在产生胰岛素的β细胞周围葡萄糖浓度的提高而刺激。
″假胰岛相似性″聚集体是一个胰岛素分泌细胞的人工聚集体其在形态与功能上与胰岛细胞相似。假胰岛相似性聚集体在细胞培养条件下体外产生。其直径大约为50-150μm(与胰岛平均直径100μm相比较)且形状为球形体。
″分离″一个干细胞指的是从组织样品中移出干细胞且与另外的非组织干细胞分开。一个分离的干细胞可以从其他类型的细胞中自由分出且具有增殖能力而分化成为组织中的成熟细胞。然而，当处理干细胞的收集时，例如干细胞的培养，已经得知其有部分可能性获得100％纯度的干细胞。因此，一个分离的干细胞可以存在于其他类型的细胞仅有一部分时且并不与干细胞的分析或生产其它分化种类的细胞类型使用相冲突时，分离的干细胞一般至少为30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，或99％纯度。最好是，按照本发明分离干细胞至少有98％或99％的纯度。
一个干细胞是″扩增的″当其在培养物中增值时且通过细胞分化变为其他类型的干细胞和/或祖细胞。干细胞的扩增可以在干细胞的增殖的同时进行其也可能需要某种特定的生长环境，例如最小的细胞浓度，容器表面的细胞汇集度或者加入化学因子例如生长因子，分化因子或信号因子。
一个干细胞，祖细胞或分化细胞被移植或者引入一个哺乳动物细胞，当其从一个培养器中转移至一个患者时。这儿所使用到的移植可以包括按照本发明所述的干细胞分离步骤及将干细胞转移进入哺乳动物或患者体内。移植可能涉及到通过注射细胞悬液进入哺乳动物或者患者，外科手术将细胞移植进入哺乳动物或患者体内的组织或器官，使用细胞悬浮灌注组织或器官等将干细胞转移进入哺乳动物或患者体内。转移干细胞或移植的路径将通过细胞在特定组织或器官中的定位的需要及细胞为靶定组织或器官所发现或获得的能力来确定。在一个案例中移植细胞定位于特定的位点，其可以被外科转移进入组织或器官或者简单地注射进入血流如果该细胞在靶定细胞中有移植的能力。
正如这儿所使用的，移植可以包括按照本发明分离干细胞，培养和转移干细胞进入哺乳动物或者患者体内去的步骤。正如这儿所使用的，移植可以包括按照本发明分离干细胞，分化干细胞，转移干细胞进入哺乳动物或者患者体内去的步骤。正如这儿所使用的，移植可以包括按照本发明分离干细胞，分化和扩增干细胞，转移干细胞进入哺乳动物或者患者体内去的步骤。
通过给予患者人以试剂其可以预防延缓如移植细胞组织器官的排斥等免疫反应的发生或已发生免疫反应强度的降低的免疫抑制剂。
正如这儿所使用到的，″免疫抑制反应″指的是防止免疫反应(例如如这儿所定义的给予免疫抑制剂)以至于免疫反应并不能检测到。正如这儿所使用到的，免疫反应的预防指的是免疫反应检测不到。一个免疫反应(例如移植排斥或抗体产生)按照本领域已知技术检测到。
按照本发明″免疫抑制″同样意指与任一并未受到免疫抑制试剂的移植受体或者不是“免疫盲的”或“免疫豁免”的如这儿所定义的那样的移植物质移植的受体相比较免疫反应发生的延缓。免疫反应的延缓发生可以是短期延缓，例如1小时至10天例如1小时，2，5或10天。免疫反应发生的延缓也可以是长期延缓例如10天至10年(例如30天，60天，90天，180天，1，2，5，10年)。
按照本发明″免疫抑制反应″同样意指免疫反应强度的减少，按照本发明免疫反应强度可以减少例如5-100％，最好是25-100％及最好是75-100％任一并未受到免疫抑制试剂的移植受体或者不是“免疫盲的”或“免疫豁免”的如这儿所定义的那样的移植物质移植的受体的免疫反应强度。免疫反应强度的减少通过确定移植物质被排斥的时间点来测量。例如一个含有移植物质在在移植后1天被排斥的免疫反应比较在移植后30天被排斥的免疫反应强度要大。免疫反应的强度同样可以通过定量可特异性结合至移植物质上的抗体的数量来测量其中所产生抗体的水平与免疫强度正相关。此外，免疫反应强度可以通过确定检测到的特异性抗体可特异性结合至移植物质上的时间点来确定。
不同的方法和试剂可被用于免疫抑制。例如淋巴细胞的增殖和活化一般可通过使用这样的试剂例如FK-506，环孢霉素或其他免疫抑制剂进行抑制。另外的可能的方法是给予抗体例如抗GAD65单抗或其他的化合物其可以掩盖移植细胞表面上的抗原并因此使得部分细胞为宿主免疫***所看不到。
一个″免疫抑制试剂″是这样的一个试剂其可以预防延缓宿主中外源细胞尤其是移植细胞的免疫反应强度。最好是这样的免疫抑制试剂其可以抑制细胞介导为其免疫***鉴别为非自身的免疫反应，免疫抑制试剂例如包括但并不限于环孢霉素，环磷酰胺，强的松，***，甲氨喋呤，咪唑硫嘌呤，mycophenolate，镇静剂，FK506，***类固醇，及其他的大范围内的抗体，受体拮抗剂，及其他本领域已知的试剂。
一个″促有丝***剂″可以是任一试剂其可以刺激细胞的有丝***及增殖。
一个″分化因子″指的是可以导致干细胞或祖细胞分化为另外细胞类型的试剂。分化一般通过改变干细胞或祖细胞一个或多个基因的表达来实现其结果在于细胞改变了结构及功能。
正如这儿所使用到的一个″信号因子″为一个细胞所分泌的试剂其可以作用于相同或不同的细胞。例如一个信号因子其可以抑制或诱导生长，增殖或其本身的分化，机体中的相邻细胞或距离较远的细胞。信号因子可以例如在组织中传递位置信息，调控结构形成，或影响各种解刨学构造的大小，形状及功能。
正如这儿所使用到的，哺乳动物指的是任一哺乳动物包括但并不限于人类，鼠，羊，猴，山羊，兔子，硕鼠，马，牛或猪。
一个″非人哺乳动物″，正如这儿所使用到的，意指非人的任一哺乳动物。
正如这儿所使用到的，″同种异源基因″指的是同种遗传性不同的成员。
正如这儿所使用到的，″同基因″指的是同样的遗传构造。
正如这儿所使用到的，″异基因″指的是不同种的成员。
正如这儿所使用到的，″培养″指的是增殖或营养一个细胞，细胞聚集体，组织或器官的收集通过在一定环境下培养一段时间并在此条件下支持细胞的增殖或存活。培养包括一个或多个扩增或增殖细胞，按照本发明收集细胞组织或器官的步骤。
正如这儿所使用到的，“前诱导或诱导一种免疫耐受状态”指应用来自移植供体的干细胞对移植可能接受者(受体)进行治疗，以便从供体移植器官、组织或细胞时，接受者的免疫***能认同供体的组织，因此不启动“宿主对移植物”的反应。在一个优选的实施例中，该干细胞为巢素阳性干细胞。
正如这儿所使用到的，“耐受”指免疫***的一种状态，在该状态下，某些外来抗原被免疫***细胞作为自我认同。
正如这儿所使用到的，“接受者”指从供体接受器官、组织或细胞的哺乳动物。
正如这儿所使用到的，“供体”指从其身上取下器官、组织或细胞向接受者移植的哺乳动物。
本发明还提供了一个药物组合物其包括本发明的分离干细胞以及药理学上合适的载体。
附图说明
图1A及1B显示了鼠胰岛在胚胎16天双重荧光免疫细胞化学染色(图1A)及在出生后60天(图1B)。巢素的抗体免疫染色以白色显示(一开始是红色，使用Cy3作为萤光团)且抗胰岛素抗体是以灰色显示(一开始是绿色，使用Cy2作为萤光团)。
图2显示了使用获自50个鼠胰岛mRNA进行的RT-PCR结果，前后引物都已被标明。834bp的单链被测序且被标明为巢素序列。
图3显示了巢素阳性细胞其已从培养的鼠胰岛中增殖。
图4显示了鼠胰岛类似物在培养物中的发育。
图5显示了培养物中产生的胰岛类似结构的RT-PCR的分析结果。NCAM及cytokeratin-19(CK19)的表达都被检测到。
图6显示了高葡萄糖刺激巢素mRNA的表达。APRT作为对照进行鉴定。
图7是巢素的氨基酸及核苷酸序列。
图8描述了在胰岛中独特的细胞群体的神经干细胞特异性标记巢素的表达如免疫细胞化学或RT-PCR所确定的那样。
图9描述的是通过免疫细胞化学或RT-PCR从胰腺中分离的干细胞巢素。
图10描述的是获自巢素阳性胰岛祖细胞(NIPs)的人类胰岛类似性聚集体中的同族区域蛋白IDX-1及proglucagon的表达。
图11证明了巢素阳性细胞在鼠胰腺管区域定位。
图12描述其为胰岛内分泌细胞祖先的胰管细胞的起源的替代模型。
图13A及B描述了巢素阳性肝干细胞的免疫荧光染色。
图14描述了在鼠内分泌胰腺发育期间转录因子的序列。
图15描述了在含有干细胞的人类NIP培养物中神经内分泌，外分泌胰腺及肝标记。
图16描述由逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和胰岛素分泌确定的高血糖素原和胰岛素mRNA的表达。
图17描述NIP标记物。
图18描述人ABCG2的核酸(a)和氨基酸(b)序列。
图19a描述由逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和DNA印迹杂交的ATP结合盒转运体ABCG2的表达。
图19b显示，由Hoechst 33342染色证明，巢素阳性胰岛衍生的祖细胞(NIPs)包括较多数量的SP细胞。
图19c证明从SP细胞染料外流在异搏定存在情况下被抑制。在B中，SP门细胞占总被分析细胞数量的2.1％，而在C中为0.1％。
图20显示由FACS分离的SP细胞共同表达高水平的ABCG2、MDR1和巢素。图20A描述SP细胞和非SP对照细胞在Hoechst 33342染色后被FACS分离(分别为R1和R2)。图20B显示该些细胞由逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对表达ABCG2、MDR1、巢素和GAPDH RNA进行分析。对ABCG2和MDR1的PCR反应产物的身份被由DNA印迹杂交证实。
图21显示人GLP-1R的核酸(21A)和氨基酸(21B)序列。
图22显示GLP-1R在胰岛衍生的干细胞/祖细胞上表达。A块显示GLP-1R(Cy-3)的免疫细胞化学鉴定(immunocytochemical detection)，以及被DAPI染色的细胞核。B块显示对RNA的RT-PCR，RNA从NIPS制备，且带有对GLP-1R特异的引物。
图23显示GLP-1(7-36)酰胺和甲苯磺丁脲在巢素阳性NIPs中刺激Ca离子内流。
图24显示证明GLP-1诱导分化的NIPs免疫组织化学染色。A块显示免疫组织化学鉴别巢素和胰岛素。B块显示细胞用GLP-1激发后，巢素和胰岛素的免疫组织化学染色。
图25显示从受GLP-1激发的NIP培养物中的胰岛素分泌水平。
图26显示在受人Idx-1转染的NIP培养物中胰岛素表达的免疫组织化学分析。
具体实施方式
当前的发明人已从哺乳动物胰腺的郎格罕氏岛鉴别并分离出了一种特别的亚组导管细胞，这种细胞具有干细胞的功能性和分子性特点。此外特别是，这种新发现的胰腺干细胞还被以下一种或多种(更好的是所有)方法所鉴别：巢素阳性染色、巢素基因表达、GLP-1R阳性染色、GLP-1R基因表达、ABCG2阳性染色、ABCG2基因表达、Oct3/4阳性染色、Oct3/4基因表达、latrophilin(2型)阳性染色、latrophilin(2型)基因表达、Hes-1阳性染色、Hes-1基因表达、整合素亚单元α6和β1阳性染色、基因表达、整合素亚单元α6和β1、C-kit阳性染色、C-kit基因表达、MDR-1阳性染色、MDR-1基因表达、SST-R2、3、4阳性染色、SST-R2、3、4基因表达、SUR-1阳性染色、SUR-1基因表达、Kir6.2阳性染色、Kir6.2基因表达、CD34阴性染色、CD45阴性染色、CD133阴性染色、MHCI型阴性染色、MHCII型阴性染色、细胞角蛋白-19阴性染色、在培养基中长期增殖，以及具有在培养基中分化成假胰岛的能力。当前的发明人也已经鉴别了显现巢素阳性染色的肝细胞。
在一个实施例中，该发明提供的干细胞可供各种应用，包括但不只限于用于1型胰岛素依赖糖尿病和各种形式的糖尿病的细胞替代疗法，以及用于各种糖尿病、激素异常、基因疾病或缺陷——如多态性与独特的生理或病理状态的关系——的发生和发展研究的研究工具的开发。在同基因移植物、异基因移植物和异种移植物移植中，该发明的干细胞还可用于进行内分泌胰腺或其他组织的基因治疗。再者，本处描述的干细胞可用于在培养基中生产重组细胞、人造组织和替代器官。它们还可用于在体外生产胰岛素及其他激素。发明人发现的胰腺干细胞分子特性，如巢素阳性、GLP-1R阳性、ABCG2阳性染色、Oct3/4阳性、latrophilin(2型)阳性、Hes-1阳性、整合素亚单元α6和β1阳性、C-kit阳性、MDR-1阳性、SST-R2、3、4阳性、SUR-1阳性、Kir6.2阳性、细胞角蛋白阳性、CD34阴性、CD45阴性、CD133阴性、MHCI型和II型阴性染色，或肝干细胞特性如巢素阳性染色，可用于各种各样的诊断、病理或研究方法，用于鉴别、定位和定量来自病人或实验动物组织中的干细胞。
胰岛干细胞的鉴别
以前的研究都聚焦于胰岛管上皮细胞或者外分泌组织作为干细胞可能的来源以用于胰岛外分泌细胞的再生。巢素是一个中间纤维蛋白其通过从一个E15鼠胚胎使用一个单克隆抗体R.401(Hockfield & McKay，1985；Lendahl et al.，1990)筛选一个cDNA文库进行克隆。巢素最初发现于神经上皮干细胞且其在发育中的中枢神经***中表达。在鼠胚胎E16中达到最高水平后，巢素表达量在成人大脑皮层降低至几乎不可检测的水平，其正好与早期巢素表达祖细胞的终止分化相一致(Lendahl et al.，1990)。巢素起初仅发现于胚胎发育的脑及骨骼肌中的干细胞中(Lendahl et al.，1990)。最近的研究表明在成人哺乳动物前脑中室管膜下层巢素阳性神经干细胞(Morshead et al.，1994)。巢素阳性干细胞已被证明其是一个多能性的甚至当其分离出成熟小鼠大脑中。例如，巢素阳性干细胞可以产生所有三种主要类型神经细胞：神经元，星形胶质细胞及少突细胞(Reynolds & Weiss，1996)。巢素阳性神经干细胞反应脊髓的损伤是通过可以分化成为星形胶质细胞的迁移细胞的增殖及降解，其也参与疤的形成(Johansson et al.，1999)且在输入照射鼠后储存骨髓造血细胞(Bjornsonet al.，1999)。
干细胞的特征
依据该发明，干细胞可通过它们表达巢素和/或GLP-1R、ABCG2、Oct3/4、latrophilin(2型)、Hes-1、整合素亚单元α6和β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、3、4、SUR-1和Kir6.2鉴别，通过如FACS、免疫细胞化学染色、RT-PCR、DNA RNA和免疫印迹分析以及其他技术人员熟知的细胞鉴别技术鉴别。
免疫细胞化学染色，例如，按照下述方法进行：准备自胰腺或肝的Cryosections(6pM)以及细胞在磷酸溶液的4％的多聚甲醛中固定。细胞首先使用3％正常的驴血清室温下凝固30分钟且与最初的抗相关蛋白的抗血清在4C下过夜培养培养。抗血清使用PBS洗涤且在合适的荧光标记的第二抗体下室温下培养1小时。然后使用PBS再次洗涤斜面且使用荧光封固剂涂附斜面(Kirkegaard and Perry Labs，Gaithersburg，MD)。使用装有界面上有一个PowerMac 7100装有IP实验光谱分析软件(SignalAnalytics Corp，Vienna，VA)的光学TEC-470 CCD照相机(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence显微镜获取荧光图片。
依据该发明，可用的抗血清包括以下：对细胞角蛋白19的鼠单克隆抗体(克隆K4.62，Sigma，圣路易斯，密苏里州)、对鼠巢素和IDX-1的兔多克隆抗血清(分别用纯化GST巢素融合蛋白质或鼠IDX-1的最后12个氨基酸免疫兔子制备)(McManus等，1999年，J.Neurosci.，19：9004-9015)、对GLP-1R的兔多克隆抗血清(Heller等，1997年，Diabetes 46：7851)、ABCG2抗血清(MAB4146，Chemicon公司(Temecula，加州))、整合素αG抗血清(SC-6597，圣克鲁斯)、整合素β1抗血清(SC-6622，圣克鲁斯)、HES1抗血清(AB5702，Chemicon公司)、CD45抗血清(31252X，BD Pharmigen(圣地亚哥，加州))、CD34抗血清(MS-363-PO，NeoMarkers(Freemont，加州))、MHCI抗血清(MS-557-PO，NeoMarkers)、MHCII抗血清(MS-162-PO，NeoMarkers)、MDR-1抗血清(p170)(MS-660-PO，NeoMarkers)、Oct3/4抗血清(SC-5279，圣克鲁斯，加州)、SUR-1抗血清(SC-5789，圣克鲁斯)、KIR6.2抗血清(SC-11227，圣克鲁斯)、ABCG2抗血清(SC-18841，圣克鲁斯)、c-kit抗血清(SC-1493，圣克鲁斯)、SSTR2抗血清(SC-11606，圣克鲁斯)、SSTR3抗血清(SC-11610，圣克鲁斯)、SSTR4抗血清(SC-11619，圣克鲁斯)、豚鼠抗胰岛素和抗胰多肽抗血清(购自Linco公司，圣查尔斯，密苏里)、鼠抗高血糖素抗血清和兔抗生长激素抑制素抗血清(分别购自Sigma公司(圣路易斯，密苏里州)和DAKO公司(Carpinteria，加州))、鼠抗人甘丙肽(galanin)(半岛实验室公司，Belmont，加州)、胶原质IV抗血清(Caltag实验室公司，旧金山，加州)、鼠抗鼠MHCI型血清(Seroteck)和抗鼠MHCII型血清。发明人相信，其他直接针对这些标记物的抗血清现可获得或将被开发。这样的其他抗血清被认为是在该发明的范围之内。
RT-PCR及DNA印迹法按照下述方法进行。获自鼠或人胰岛的总的细胞RNA被反转录且通过PCR扩增按照扩增的预期程度大约35个循环，正如前所述(Daniel，et al.，1998，Endocrinology，139：3721-3729)。用作PCR引物或扩增引物以及RNA印迹杂交的探针的寡聚核苷酸可以为：
鼠巢素：正向，  5′gcggggcggtgcgtgactac3′；
        反向，  5′aggcaagggggaagagaaggatgt3′；
        杂交，  5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19：正向，  5′acagccagtacttcaagacc3′；
          反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；
          杂交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
Rat NCAM：正向，5′cagcgttggagagtccaaat3′；
          反向，5′ttaaactcctgtggggttgg3′；
          杂交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
Rat IDX-1 正向，5′atcactggagcagggaagt3′
          反向，5′gctactacgtttcttatct3′
          杂交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′
人类  巢素：正向，5′agaggggaattcctggag3′；
            反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；
            杂交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人类角蛋白：正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；
            反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；
            杂交  5′aaccatgaggaggaaatcagtacgctgagg3′。
人类高血糖素：正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；
              反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；
              杂交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′；
人E-Cadherin 正向，5′agaacagcacgtacacagcc 3′
             反向，5′cctccgaagaaacagcaaga 3′
             杂交，5′tctcccttcacagcagaactaacacacggg 3′
人transthyretin 正向，5′gcagtcctgccatcaatgtg 3′
                反向，5′gttggctgtgaataccacct 3′
                杂交，5′ctggagagctgcatgggctcacaactgagg 3′
人胰淀粉酶 正向，5′gactttccagcagtcccata 3′
           反向，5′gtttacttcctgcagggaac 3′
           杂交，5′ttgcactggagaaggattacgtggcgttcta 3′
人羧肽酶原 正向，5′tgaaggcgagaaggtgttcc 3′
           反向，5′ttcgagatacaggcagatat 3′
           杂交，5′agttagacttttatgtcctgcctgtgctca 3′
人Synaptophysin 正向，5′cttcaggctgcaccaagtgt 3′
                反向，5′gttgaccatagtcaggctgg 3′
         杂交，5′gtcagatgtgaagatggccacagacccaga 3′
人类肝细胞生长因子(HGF)
         正向，5′gcatcaaatgtcagccctgg 3′
         反向，5′caacgctgacatggaattcc 3′
         杂交，5′tcgaggtctcatggatcatacagaatcagg 3′
人cMET(HGF-receptor)正向，5′caatgtgagatgtctccagc 3′
                    反向，5′ccttgtagattgcaggcaga 3′
                    杂交，5′ggactcccatccagtgtctccagaagtgat 3′
人XBP-1  正向，5′gagtagcagctcagactgcc 3′
         反向，5′gtagacctctgggagctcct 3′
         杂交，5′cgcagcactcagactacgtgcacctctgca 3′
人Glut-2 正向，5′gcagctgctcaactaatcac 3′
         反向，5′tcagcagcacaagtcccact 3′
         杂交，5′acgggcattcttattagtcagattattggt 3′
人胰岛素 正向，5′aggcttcttctacaca3′
         反向，5′caggctgcctgcacca 3′
         杂交，5′aggcagaggacctgca 3′
其他这样的序列是可能的，且这样的序列被认为是在该技术的范围之内。该发明包括低聚核苷酸，用作PCR引物或扩增引物，以及用作从以下组成的组中选择的任何标记物的DNA(Southern)分析探针：ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6和β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、3、4、SUR-1、Kir6.2、CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型。作为一种普通导子(guide)，引物从两种不同的外显子中选择，且至少包括一个内含子序列。此外，一种RT减控制在大多数样品中运行。PCR在94℃一分钟下完成扩大，然后94℃10秒，58/56℃10秒，72℃一分钟，35个周期，以及72℃二分钟。对鼠巢素退火(annealing)温度是58℃，而对其余引物对为56℃。
对于分离自非鼠或人的哺乳动物的mRNA的RT-PCR，特异于来自要准备分析的哺乳动物种的扩增核酸的寡聚核苷酸。这些引物的选择及使用为本领域技术人员所共知。
对于DNA杂交寡聚核苷酸探针使用合适的放射性核来进行标记，例如γ32P ATP，其使用传统的技术。放射性标记探针在37℃下杂交于转移进入尼龙膜的PCR产品一小时，然后在1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗涤10-20分钟或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下对于人类的PCR产品。
巢素作为胰腺干细胞的标记
发明家已经出乎意料地发现成人哺乳动物包括人类的胰脏含有表达巢素的细胞。重要的是，巢素阳性细胞在胰脏中的分布并不相应于产生激素的细胞。例如特异性反应与胰岛素或高血糖素的荧光标记抗体分别标记有胰岛的β及α细胞，其中发明者已经发现在老鼠及人类中荧光标记的巢素抗体仅位于管上皮的某些细胞中且并不是α，β，δ，及产生于胰岛的胰脏多肽(图1)。发明者同样发现特异于胶原质IV的抗体，动脉管内皮细胞galanin，神经末梢的一个标记及细胞角蛋白19，管细胞的一个标记，其并不共位于巢素抗体。此外，发明家已经发现巢素阳性胰岛细胞并不与抗胰岛素，高血糖素，生长激素抑制素或者胰多肽共标记(图1)。这表明这些巢素包含细胞并非内分泌细胞，管细胞，神经细胞或者动脉内皮细胞，但是其却代表一个先前并未描述的胰岛中的真正独特的细胞类型。发明者已经发现胰岛中的巢素阳性细胞正如胰脏导管中的其他区域一样且位于外分泌胰脏的centroacinar区域。
巢素mRNA在胰岛中的表达通过使用RT-PCR使用分离自鼠胰岛的RNA(图2)进行检测。巢素阳性胰脏细胞的功能性特点使用通过从胰岛中分离出巢素阳性细胞且细胞培养技术进行检测，这些下面进一步描述。
发明家同样发现了鼠肝含有可以表达巢素的细胞(图13)。
ATP结合盒(ABC)多药抗性转运体(ABCG2(Brcp1)和MDR-)作为胰腺干细胞的标记物
人胰岛衍生的NIPs含有大量的一种亚族SP细胞，共同表达ABCG2、MDR1和巢素：依赖排除Hoechst 33342染料，ABCG2表达定义骨髓多能干细胞的边族(sidepopulation，SP)表型。MDR-1提供SP细胞复制的能力。SP细胞(CD34低/阴性)不能增殖，因此在试管内不能增殖。在CD34低/阴性SP细胞中MDR-1的强迫表达引起它们增殖(Bunting等，2000年，Blood 96：902)。NIPs也是CD34低/阴性。因此，由于它们表达ABCG2，NIPs现在被定义为SP细胞；且不像骨髓衍生的SP细胞，NIPs表达MDR-1，因此可以增殖，使旨在移植的体外扩增NIP SP细胞成为可能。
Oct3/4作为一种胰腺干细胞的标记物
NIPs表达Oct3/4。Oct3/4是一种属于Pou同源结构域(homeodomain)蛋白家族的转录因子(Niwa等，2002，Mol.Cell.Biol.，22：1526；Niwa等，2000年，Nat.Genet.，24：328；Niwa等，2001年，Cell Struct.Funct.，26：137；Shimazaki等，1993年，EMBO，12：4489；Wang等，1996年，Biochem.Cell.Biol.，74：579；Nichols等，1998年，Cell 95：379；)。这是一项重要的发现，因为Oct3/4的表达严格限制于干/祖细胞(Niwa等，2002年，supra；Niwa等，2000年，supra；Niwa等，2001年，supra)。NIPs强烈表达Oct3/4，因此自我定义是干/祖细胞。那就是，如果Oct3/4表达绝对限制于干/祖细胞，且Oct3/4在NIPs中表达，那么NIPs是干/祖细胞。
整合素亚单元α6和β1作为一种胰腺干细胞标记物
NIPs表达整合素亚单元α6和β1。α6/β1整合素是层粘蛋白(laminin)受体(Giancotti和Ruoslahti，1999年，Science 285：1028)。最近证明ES细胞能在层粘蛋白包衣的培养皿中增值，且其生长无需依赖喂养细胞层(Xu等，NatureBiotechnology，2001年10月，19：971)。细胞表面的表达整合素为维持细胞生长和发育所必需(参见Giancotti等，supra)。α6/β1受体对层粘蛋白特异认知。层粘蛋白是一种在胚泡中表达的必需蛋白质。因此α6/β1是ES细胞的一个标记物(干/祖细胞)。NIPs表达整合素亚单元α6和β1。因此，在此方面，NIPs与ES细胞相似。
Hes-1作为一种胰腺干细胞的标记物
侧抑制(lateral inhibition)的δ/凹口信息通路对胚胎发育至关重要。关于凹口信息传递的重要性已有很多文章表述。在NIPs中，凹口信息传递也很重要。凹口信息传递为胰腺发育所绝对需要(Apelquist等，199年，Nature 400：6747；Lammert等，2000年，Mech Dev.94：；Jensen等，2000年，Nat.Genet.，24：36；Jansen等，Diabetes2000，49：163)。Ngn-3是bHLH转录因子的关键的决定因子，为内分泌胰腺家系(lineage)的发育所需。Hes-1是Ngn-3表达的一个强大的抑制剂。NIPs强烈表达Hes-1。因此，NIPs是阻止分化成内分泌细胞的祖细胞。因此，阻止Hes-1在NIPs表达的方法将使它们分化成内分泌细胞(β细胞)。这种阻止Hes-1表达的方法可能是应用转染反义RNA，要么通过应用小段干预RNA寡核苷酸，要么通过应用一种表达反义Hes-1RNA的表达质粒。
GLP-1R作为胰腺干细胞的一种标记物
发明人进一步发现，成年哺乳动物包括人类的胰腺，包含表达高血糖素样的肽-1受体(GLP-1R)的细胞。GLP-1R阳性细胞可以跟巢素阳性细胞共存于同一位置，这个发现为该发明进一步提供了基础。该发明也基于相反的发现，即巢素阳性胰腺干细胞可以跟GLP-1R阳性细胞共存于同一的位置。高血糖素基因编码一种多功能的高血糖素原，高血糖素和胰高血糖样肽(GLP)是通过依赖胰腺和肠道中的前激素转化酶的分化过程产生。GLP-1已被证明与一种在胰β细胞中发现的G-蛋白偶联受体特异结合，通过一种cAMP依赖通路刺激胰岛素的分泌(Kiefer和Habener，1999年，Endocri.Rev.20：876；Drucker，1998年，Diabetes，47：159)。当前的发现部分基于这个发现，即如上所述，在胰岛和胰管中发现的巢素阳性干细胞，也是GLP-1R阳性。
巢素阳性胰岛祖细胞(NIPs)从人体胰岛组织中分离，遵循以上概述的普通免疫细胞化学过程，与兔的GLP-1R多克隆抗血清反应(Heller等，supra)。在超过60％的受检NIPs中发现有受体免疫活性(图22A)。为进一步在NIPs中证实GLP-1R的免疫细胞化学检测，对从NIP细胞中制备的mRNA进行RT-PCR检查。NIP mRNA以及随之的5’gtgtggcggccaattactac 3’(正向)、5’gtgtggcggccaattactac 3’(反向)引物的扩增，产生期望的346bp产品(图22B)，提示除表达GLP-1R蛋白质外，NIPs还有合成GLP-1R的生物合成能力。因此，除巢素外，GLP-1R作为胰腺干细胞的一个标记物，在本发明中有其应用。
细胞角蛋白-19作为导管上皮细胞一明显族群的一个标记物
细胞角蛋白-19(CK-19)是另一种中间纤维蛋白质。CK-19以及相关的角蛋白最初发现在胰导管细胞中表达(Bouwens等，1994年)。然而，本发明者发现，尽管CK-19表达确实被限制在导管内，但对CK-19特异的荧光抗体从那些被巢素特异抗体标记的细胞中标记出分离的导管细胞。这就提示，胰岛中的巢素阳性细胞可能是一种明显区别于CK-19阳性细胞的细胞类型。
NIPs是CD34低/阴性：
NIPs的SP部分(图19B的左下口)表达低至零水平的CD34。这个发现很重要，因为与CD34阳性SP细胞相反，骨髓衍生的CD34低阴性SP细胞极具多能(参见Goodell，1999年，Blood，94：12545)。骨髓衍生的CD34低/阴性SP细胞具备有限的增殖能力——如果有的话(Goodell等，1996年，J.Exp.Med.，183：1797；Goodell等，1997年Nat Med，3：1337)。CD34低/阴性NIPs确能在试管内增殖，因为它们表达Mdr-1。
胰腺干细胞的其他标记物
该发明也为胰腺干细胞提供至少对从由latrophilin(2型)(Sudhof，2001年，Annu.Rev.Neurosci 24：933)、C-kit(CD117)(Gibson等，2002年，Adv.Anat.Pathol.9：65)，SSTR-2、3、4(生长激素抑制素受体)(Schulz等，2000年J Physiol Paris 94：259)，SUR-1(sulonylurea受体)(Winarto等，2001年，Arch.Histol.Cytol.64：59；Landgraf，2000年，Drugs Ageing，17：411)和Kir6.2(带有SUR-1的内流调节钾离子通道亚单位)(Winarto等，supra；Landgraf，supra)组成的组中选择出来的标记物之一显阳性。
该发明还为胰腺干细胞提供至少对CD45(Sasaki等，2001年，Int.J.Biochem.CellBiol.33：1041)、CD133(Kobari等，2001年，J Hematother Stem Cell Res.10：273)、MHCI型和MHCII型之一显阴性。
从胰岛中分离干细胞及其应用
于细胞可从胰腺组织标本中分离出来，例如，从糖尿病病人活组织检查样本中获得的胰岛。之后，干细胞在体外增长，结果得到的细胞作为同基因移植物移植回供体体内。在供体体内，它们可分化，以提供胰岛素分泌细胞，如提供β细胞以替代因自动免疫攻击——引起糖尿病的原因——而损失的β细胞。这种方法能克服移植组织——譬如来自另一个供体人的胰岛所产生的免疫排斥问题。在该发明的一个实施例中，同基因移植干细胞的应用使能进行另一项旨在避免免疫排斥的技术，那就是移植细胞的基因疗法使它们能抵抗免疫攻击，如出现在1型糖尿病患者身上的自动免疫。应用干细胞比全胰岛更进一步的优势是，移植的细胞可以在原处分化，且更能适应宿主的环境，例如，提供适宜的微循环以及一种响应宿主生理需要的、不同的辅助胰岛细胞类型。该发明的另一项实施例考虑应用部分分化的干细胞在体外(比如)形成祖细胞，然后将其移植入宿主，让其进一步的分化在宿主体内随机发生。虽然推荐使用一种干细胞、祖细胞或假胰岛的同基因移植物，但另一项实施例则考虑应用取自另一个人或另一种哺乳动物的干细胞、祖细胞或假胰岛的同种异体移植物。
然而，在该发明的另一项实施例中，干细胞为免疫盲的或免疫豁免的。在该发明这方面的一个实施例中，免疫豁免干细胞没有表达足够数量的I型和/或II型主要组织相容性抗原(a.k.a.HLA或人体白细胞抗原)以诱导宿主的免疫反应。例如，这些从同种异基因或异种来源的干细胞，在有正常免疫能力的移植接受者中不会引起宿主对移植物的反应。
在该发明这方面的另一个实施例中，免疫豁免干细胞不表达MHCI型抗原和/或MHCII型抗原。这些从同种异基因或异种异基因来源的干细胞，在有正常免疫能力的移植接受者中不会引起宿主对移植物的反应。
在该发明的另一个实施例中，由干细胞组成的人组织移植物表达人特异MHCI型和MHCII型抗原，但被有正常免疫活性的鼠认作是自身的产物，因此没有发生宿主对移植物的排斥。这些从同种异基因或异种来源的干细胞，在有正常免疫能力的移植接受者中不会引起宿主对移植物的反应。
该发明还提供从异种供体中分离干细胞，并将结果细胞作为异种移植物移植入另一种类的哺乳动物(比如，鼠干细胞被移植入一位人如一位糖尿病患者中)的方法。
该发明提供进行同基因、同种异基因或异种移植巢素阳性干细胞的方法，在这里那些干细胞在移植前已培养了一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天。该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植一种干细胞的方法，那种干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6和β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达，在这里那些干细胞在移植前已培养了一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天。
该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植巢素阳性干细胞的方法，在此种情况下，为分化生成其他干细胞或祖细胞，干细胞在移植前已生长了一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天。
该发明还提供进行同种基因、同种异基因或异种移植一种干细胞的方法，那种干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达，在这里那些干细胞在移植前已培养了一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天。
该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植干细胞的方法，在此种情况，巢素阳性干细胞在移植前被用一种制剂处理一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天，以诱导分化生成一种祖细胞，这种处理制剂从以下组成的组中选择：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β及其组合物。
假如是胰腺干细胞，该干细胞随后分化成一种胰祖细胞。
该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植一种干细胞的方法，那种干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、SST-R3、SST-R4、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达；在该种情境况，该干细胞在移植前被用一种制剂处理一段时间，比如2-4小时、4-5小时、5-10小时或1-3天，以诱导分化生成一种祖细胞，这种处理制剂从以下组成的组中选择：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β及其组合物。假如是胰腺干细胞的情况，该干细胞随后分化成一种胰祖细胞。
该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植的方法，在此种情况下，巢素阳性干细胞在移植前没有培养，也不增长或分化，或巢素阳性细胞在移植前已培养和/或增长和/或分化。
该发明还提供进行同基因、同种异基因或异种移植一种干细胞的方法，这种干细胞至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、SST-R3、SST-R4、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达，且在移植前既不培养，也不增长或分化；或至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、SST-R3、SST-R4、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达，且在移植前已培养和/或增长和/或分化。
巢素阳性细胞可在分离胰岛的培养基中增值，然后将其分离，以形成一种基本上具有无限增殖能力的干细胞家族。
在另一个实施例中，一种至少对ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SST-R2、SST-R3、SST-R4、SUR-1、Kir6.2之一显阳性，和/或不表达CD34、CD45、CD133、MHCI型和MHCII型之一或对其全部不表达的干细胞，可在分离胰岛的培养基中增值，然后将其分离，以形成一种基本上具有无限增殖能力的干细胞家族。
发明人发现，巢素表达的细胞从培养胰岛中长出来，并早在四天就可观察到在培养基的胰岛周围生长。这些细胞具有一种神经元样的形态和结构(图3)，显示巢素阳性染色，并表达mRNA。通过将胰岛混悬液与伴刀豆球蛋白A接触，包含巢素阳性细胞的胰岛可从其他细胞——如在培养胰岛中增值的成纤维细胞分离出来。例如，包含巢素阳性干细胞的胰岛将不粘附在伴刀豆球蛋白A覆盖的培养皿上，让这些胰岛简单地被倾泻出来，而其他细胞类型继续在皿上黏附。然后，将这些胰岛覆盖在它们能黏附的、不含伴刀豆球蛋白A衣层的井内。以下例1详细描述了鼠细胞的培养基组成和分离方法。在人细胞也已获得了类似的结果。
培养物中假胰岛和导管结构的形成
该发明的一个实施例通过使于细胞或祖细胞形成能移植入病人体内的假岛样聚集体，提供一种移植干细胞或祖细胞的替代方法，它补充病人胰岛细胞团的不足，以维持生理调节而无需激素疗法。胰岛衍生的干细胞可从以上所述的培养胰岛中制备，或从祖干细胞家族中获取。干细胞然后通过与各种的生长因子接触，被诱导分化。这个过程在例2和例3中表述。
干细胞或祖细胞向胰岛细胞的分化
诱导胰腺干细胞分化的生长因子包括但不限于EGF-2、碱性FGF、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4、β细胞素(betacellulin)、苯丙酸诺龙A和TGF-β以及它们的组合物。GLP-1指高血糖素样的肽-1。高糖指一种比通常用于培养干细胞浓度较高的葡萄糖浓度。例如，干细胞通常能在大约5.6mM葡萄糖中培养和增殖，高糖指高于5.6mM的浓度。在优选的实施例中，一种16.7mM的浓度被认为是可能的。例2中，描述了一种使用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的可能的生长因子处理。
除了将生长因子加入细胞培养基外，当干细胞被移植入动物或人体中时，进一步应用生长因子可促进分化。在此种情况下，内分泌细胞可分泌许多已知或未知的生长因子，并在原位与干细胞接触。移植的干细胞可被任何内源性与外源应用的生长因子组合诱导分化；外源应用的生长因子与期望的结果相一致，即与最后分化的细胞类型和形成的解剖结构(即组织或器官)相一致。
一个实施例提供一种刺激分化的方法，那就是应用生长因子的顺流效应因子，或用一种编码这些效应因子的核酸分子转染干细胞或祖细胞。IDX-1就是一个例子，它是一种由GLP-1或exendin-4诱导的转录因子。引入像IDX-1那样的效应因子可启动分化，形成内分泌胰岛细胞。
移植排斥分析
本发明提供了一个体内评估移植物质存活的方法。按照本发明通过移植一个干细胞或一个假胰岛类似性聚集体入一个免疫抑制的或非免疫抑制的哺乳动物分析实验性移植排斥反应。
例如，非免疫抑制的C57BL/6小鼠按照本发明被使用人类干细胞移植(例如在肾囊中)，通过牺牲移植受体且对存活移植物染色或在移植物上(例如移植物上的一个器官或组织)在移植后合适的时间点进行免疫细胞化学染色对移植排斥进行分析。在该时间点对移植物的染色(例如苏木精/曙红或免疫染色)可以变化，例如按照移植哺乳动物平均的存活时间或预期的存活时间。通过染色分析移植位点，移植后1天至10年(例如，1，5，10，30，100或更多天，1，2，5，或10年)，最好是10天至1年且更好是10-100天。例如，如果移植物质在鼠肾囊中被引入，检查移植鼠的肾。如果移植物质被检测到和/或移植物质在组织中进行增殖的话说明移植物被成功移植(也就是说没有被排斥)。
移植物的增殖及检测例如通过准备自移植位点的冷冻部分(例如肾)的苏木精/曙红染色及并不起源于移植受体的新生长(例如不是宿主肾获得的)的检测进。在异种移植的情况下，使用特异于获自移植物起源的种的抗原的抗血清进行的特异性的免疫染色的话移植物被成功移植，按照本领域已知的且这儿所描述的免疫细胞化学染色方法鉴别阳性细胞。此外，在一个实施例中进行的异种移植，如果获自移植种的(从其中移植物质所获得的种)分子(例如蛋白或抗原)在移植受体的血液中检测到的话移植物被成功移植。
正如这儿所使用到的，″排斥″指的是宿主免疫***对移植物的排斥。在一个实施例中，“排斥”意指移植物中有超或90％的细胞或组织因为宿主免疫反应坏死的发生。在另一个实施例中，“排斥”意指生存能力的降低也就是说因为宿主的免疫反应移植物中有90％甚至更多与移植前相比较生存能力降低。生存能力的降低可通过本领域已知的技术检测到，包括但并不限于trypan蓝专一染色。在另一个实施例中，“排斥”意指移植物增殖的失败。增殖可通过本领域已知的技术包括但并不限于苏木精/曙红染色检测到。移植排斥的发生和/或移植后排斥发生的速度将因各种因素而变化，包括但并不限于移植物质(例如细胞类型或细胞数量)或宿主(也就是说不管宿主是免疫耐受性的和/或使用免疫抑制剂处理过的)。
移植方法
本发明提供了移植进入哺乳动物的方法。一个干细胞，祖细胞或分化细胞被“移植”或“引入”进入一个哺乳动物细胞当期从培养器皿中进入患者时。
按照本发明，移植包括按照本发明所述分离干细胞的步骤且转移干细胞进入哺乳动物或患者的步骤。按照本发明，移植还涉及到转移干细胞进入哺乳动物或患者通过注射细胞悬液进入哺乳动物或患者的途径，外科输入哺乳动物或患者的组织或器官的细胞，或使用细胞悬液注入组织或器官。转移干细胞或移植的路径，将按照细胞在特定组织或器官中的位置需要及细胞发现且滞留在预期目标组织或器官位置的能力确定。当移植细胞停留在特定的位置时，其可以通过外科手术方法进入组织或器官或简单地注入到血浆中去如果细胞具有移动至目标靶器官的能力的话。按照本发明所述的移植包括分离干细胞的步骤以及培养且转移干细胞进入哺乳动物或患者体内去的步骤。在另一个实施例中，这儿所使用的移植还包括分离干细胞，分化干细胞，转移干细胞进入哺乳动物或患者体内去的方法。这儿所使用的移植还包括按照本发明分离干细胞，分化及扩增干细胞且转移干细胞进入哺乳动物或患者体内去的方法。
使用胰脏干细胞治疗胰岛素依赖型糖尿病患者的方法
干细胞对于取代I型糖尿病患者的丧失的β细胞或提高II型糖尿病患者的β细胞的总的数量是非常有用的。糖尿病患者更适宜作为用于产生干细胞，祖细胞或假胰岛类似物聚集体的供体。干细胞存在成人胰岛或胰脏导管。对糖尿病患者进行活组织检查后，从活组织中分离出胰岛且体外准备24小时，干细胞然后使用上述方法在2-3周内分离且增殖。分离后或经过一段时间生长因子诱导的分化干细胞可被直接移回患者。胰岛可通过如实施例2所述的亚培养产生。胰脏外科手术活组织分析的整个过程在大约30天内进行。
在本发明的一个实施例中可用到多功能干细胞。这些细胞是免疫盲的或免疫豁免的例如在异源或异种移植物中，其可以被受体作为自身识别而不是限制于I型或II型抗原的MHC。在本发明该实施例的一方面，这些细胞并不表达MHC型和/或II型抗原。
在本发明另一个实施例中，移植物受体可以证明宿主对其它移植细胞的移植排斥其可以通过给予抗体激起反应，例如一个自身抗原如GAD65，通过给予一个或多个这里所述的免疫抑制剂或使用本领域已知的技术以预防或减缓自身免疫排斥反应。
此外，按照本发明分离自非人哺乳动物的干细胞移植进入人糖尿病患者。在移植步骤之前，干细胞可被培养和/或扩增和/或分化。
使用胰脏干细胞治疗肝病患者的方法
胰脏干细胞或祖细胞分化形成肝细胞的能力是众所周知的(Bisgaard &Thorgeirsson，1991)。本发明的胰脏干细胞可以用于提供肝细胞以治疗肝病患者所遭受的肝病例如cirrosis，肝炎，或肝癌其中功能性肝组织已经被减少。本发明所述的干细胞同样可被经过基因治疗处理遗传缺陷并引入患者恢复肝功能。巢素阳性干细胞可以在培养物中被分化也可在体内使用一个或多个生长因子或其它的处理例如使用核酸分子转染其结果是干细胞分化形成肝细胞。在一个实施例中，发明设计了使用cyclopamine以抑制例如sonic hedgehog，结果使得肝细胞形成。在本发明另一个实施例中，干细胞可不经过任何体外处理移植且在患者体内使用合适的生长因子。在另一个实施例中，干细胞使用生长因子或其它试剂体外处理结果以部分分化或结果分化的状态移植进入患者。在发明的另一个方面，包括转染干细胞或祖细胞的方法，注射的剂量及途径，药物组合物，供体一同系移植物的方法及免疫抑制方法可用与反分化为肝细胞就像分化为胰脏组织一样。
本发明专门设计了移植进入患者的同基因移植，异基因移植或异种异基因移植干细胞或其组合。
干细胞转染的方法
有不同的方法基因转移进入胰脏干细胞。磷酸钙沉降DNA法已被使用但转化效率很低，尤其是对非粘附性细胞来讲。此外，磷酸钙沉降DNA法经常导致多种反复子的***，增加了内外源DNA功能的损害的可能性(Boggs，1990)。阳离子脂类例如以脂质体的形态，同样是包装DNA以转染真核细胞的有效方法且几种商业阳离子脂类试剂也是可获得的。电穿孔法相比较磷酸钙沉降法提高了转化效率，其具有在基因组单一位点提供单一拷贝***子的优势。DNA直接微注射进入细胞核是另外一种基因转移的方法，其已经显示可提供对于短期转染来讲将近100％的效率且对于稳定的DNA整合有20％的效率。微注射有时避免了外源DNA通过细胞质的细胞运输的问题。该方法要求转移物体积要小，其还要考虑到在每细胞中引入已知量的DNA。获取事实上较纯的干细胞的能力将提高微注射途径用于靶定胰脏干细胞基因修饰的可行性。尽管如此，微注射也是一项沉闷的，高度专一的技术。该技术的这一特征限制了在一定时间内注射进入细胞的数量，因此其在大范围内的使用是很受限制的。是用逆转录病毒的方法将基因***胰脏干细胞是较为理想的方法。逆转录病毒提供了一个任意的，单拷贝的单位点***子且转染效率很高。其它的一些转染方法对于本领域技术人员来讲是已知的且被认为是在本发明的保护范围之内。
胰脏干细胞的逆转录病毒转化
胰脏细胞基因转化涉及到逆转录病毒也作“辅助病毒”(也就是说，膜缺陷型病毒基因组其携有相关外源基因但是不能形成完整的病毒颗粒)。例外的载体例如DNA介导的转移，腺病毒，SV40，腺病毒相关病毒，及单纯疱疹病毒载体也可被用到。当选择不同的载体用于转染时要考虑到各种因素，有时最好使用一个病毒长末端重复子或者一个强的内源引物以表达外源基因而不是简单依靠拼接的亚基因簇RNA。
干细胞转化的两种最基本的方法是共培养或上清感染。上清感染涉及到将干细胞重复暴露于病毒上清液中。共培养涉及到干细胞及一感染的“组装细胞系”(参见下面)混合24-48小时，共培养一般要较上清感染对于干细胞转化来讲更为有效。共培养后，感染的干细胞进一步被培养以建立一个长期培养物(LTC)。
含有辅助病毒的细胞系指的是包装细胞系，不同的包装细胞系也是可获得的。包装细胞系的一个重要的特点是其并不能产生复制完整的辅助病毒。
在本发明的一个实施例中从中获得干细胞的动物或患者在抽取干细胞前使用5-fluorouracil(5-FU)对其进行处理，相比较未处理的细胞来讲，5-FU处理的干细胞更易于逆转录病毒的转染。然而，5-FU干细胞很大程度地减少了克隆基因起源的数量。
在另一个实施例中，收获的干细胞暴露于不同的生长因子条件下，例如那些用于提高胰脏干细胞增殖及分化的生长因子。生长因子在转染之前，其中或之后被引入培养物以提高细胞的复制及转导。研究表明生长因子的使用提高了转化效率从30到80％不等。
典型的逆转录病毒转化方案
哺乳动物胰脏干细胞的体外转导及随后移植进入未被切除的受体以充分获得可能的移植及基因表达在含有已显示于小鼠的后裔细胞的不同组织中。靶细胞在输入受体之前在含有相关基因的合适载体的存在下培养2-4天。
更确切地讲，骨髓干细胞获自雄性供体(4-8周年龄时)BALB/c AnNCr小鼠(National Cancer Institute，Division of Cancer Treatment Animal Program，Frederick，MD)。这些细胞被培养在一个密度为1-2×107cells/10cm的平皿上且在含有10％热失活的牛胎血清，谷氨酸盐，Pen/Strep，100U/ml的白细胞介素-6(IL-6)及以激活细胞生长的干细胞因子(SCF；Immunex，Seattle，WA)(Schiffmann，et。al.，1995)的DMEM培养基上培养48小时，
与此同时，培养一个病毒包装细胞系24小时，该包装细胞系为Schiffmann，等所使用。其为GP+E86且病毒载体为基于逆转录病毒载体LN序列的LG逆转录病毒载体。
经过一段合适的培养时间，1-2×107干细胞被培养在一个10cm的含有病毒包装细胞的平皿上然后在8g/ml polybrene的存在下共培养48小时然后在相同的生长因子刺激的环境下其作为供体干细胞。收获该干细胞，洗涤生长培养基注入受体鼠以2×107细胞/注射的剂量并进行多次注射(总共5次以每天或每周计)。
干细胞的转导及移植的成功可通过例如PCR分析，免疫细胞化学染色，DNA印迹法或蛋白质印迹法或其它本领域已知技术来进行。
哺乳动物
本发明所述的哺乳动物可以是任意哺乳动物(例如，人，小鼠，鼠，绵羊，兔子，山羊，猴子，马，东欧鼠，猪或牛)。本发明所述非人哺乳动物可以是任意非人哺乳动物包括但并不限于小鼠，鼠，绵羊，兔子，山羊，猴子，马，东欧鼠，猪或牛。
给予的剂量及模式
作为一个例子，这儿所述的需要胰脏干细胞的患者可以如下进行处理，本发明的细胞可被给予患者，最好以生物学上适宜的溶液形式或药物学上可接受的输入载体，通过摄取，注射，吸入或其它的一些方法。一个可行的方法是内向倒退注射。另外的方法是注射或取代细胞或假胰岛类似性聚集体进入肾囊中。给予的试剂量可因患者而不同，一个“治疗有效性剂量”可被确定，例如但不限于通过功能性增强的水平(例如，胰岛素产量或血浆葡萄糖水平)。干细胞引入水平的监控，由该转移影响的某些基因的表达水平，和/或编码产品的存在及表达，同样也使得本领域技术人员选择及调整给予的剂量。一般来讲一个含有干细胞的药物组合物以105-108，最好是106-107个细胞每公斤体重的范围以单一剂量给予患者。这些剂量可以以每天，每周，每月，每年计或者由治疗医师确定合适的剂量。本发明提供了同样可被移出患者体内的细胞群体或者通过体外扩增，使用含有预期治疗基因的质粒转染，然后再重新输入患者体内。
药物组合物
本发明提供了包含如本发明所述干细胞混合有生理学上可接受载体的药物组合物。正如这儿所使用的，″生理学上适宜的载体″指的是生理学上可接受的稀释剂例如水，磷酸缓冲盐或盐及进一步包括佐剂，佐剂例如有不完整的傅氏佐剂，正磷酸铝，氢氧化铝，以及明矾等本领域已知的物质。
本发明同样也提供了药物组合物。除了活性成分以外，这些药物组合物还包括合适的药学载体其可以被药理学上使用。
用于口服的药物组合物可使用本领域已知的适于口服的药物载体一起包装。这些载体使得药物组合物以片剂，药丸，糖衣，胶囊，液体，凝胶体，糖浆，浆液，悬浮液及其类似的形式为患者所摄取。
用于口服的试剂可通过结合活性成分与固体赋形剂，加入合适的辅助剂后，例如为了获得片剂或糖衣核心混合后选择性碾磨，处理混合细粒。相应的赋形剂可为糖类或蛋白类例如糖包括乳糖，蔗糖，甘露糖或山梨糖糖，玉米淀粉，小麦，大米，马铃薯及其他植物；维生素例如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或者羧甲基纤维素钠；以及橡胶包括***胶及黄芪胶；以及蛋白例如凝胶及胶原质。如果需要，加入溶解剂或分解剂例如交联的乙烯聚合物pyrrolidone，琼脂，褐藻酸，或其盐例如藻酸钠。
所提供的糖衣核心具有合适的糖衣例如浓缩的糖溶液，其也含有***树胶，云母，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，carbopol凝胶，聚乙二醇，和/或二氧化钛漆溶液，及合适有机溶液及溶液混合物。染料或色料加入到片剂中或糖衣上用于产品识别或表明活性成分的数量例如剂量。
可被用于口服的药物制剂包括由凝胶制成的推入契合胶囊以及软的由凝胶制成的封闭胶囊一样以及衣被甘油或山梨糖醇。推入契合胶囊包括混有诸如乳糖或淀粉的添充剂，诸如云母或硬脂酸镁的润滑剂以及可选择性的稳定剂的活性成分。在软的胶囊中，活性化合物可被溶解或悬浮在合适的液体中例如油脂，液体石蜡或液体聚乙二醇有或无稳定剂。
肠胃外投药的试剂包括活性成分的液体溶液。对于注射，本发明的药物组合物可以溶液形式，最好在生理学上适宜的缓冲剂例如Hank′s溶液，Ringer′溶液，或生理缓冲盐的存在下制成。液体注射悬浮液可以包括可提高悬浮液粘度的物质例如羧甲基钠纤维素，山梨糖，或右旋糖酐。此外，活性溶剂或载体的悬浮液包括油脂例如香油，或合成的脂肪酸酯例如乙基油酸盐或甘油三酸酯，或脂质体。可选择地，该悬浮液也包括适宜的稳定剂或可以提高化合物溶解度以形成高浓度溶液的化合物。
对于鼻给药形式，适于特定屏障的渗透剂在制药时考虑使用，该渗透剂对于本领域技术人员来说均为已知。
本发明的药物组合物可以本领域已知技术生产例如通过传统的混合，溶解，粒化，糖衣制备，悬浮，乳化，形成胶囊，包载及冻干途径。
药物组合物可以盐的形式提供也可以许多酸的形式形成，包括但不限于盐酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸等等。适宜在液体情况下更易溶解的盐及其他的质子溶剂其也具有相应自由的碱基。在另外的情况下，首选的试剂也可以是一冻干的干粉其在1mM-50mM组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇在PH值4.5至5.5其在使用前使用缓冲液混合。
在含有本发明化合物的药物组合物以一合适载体形成完成时，其可放置于合适的容器标签上给药的条件包括数量，频率及途径。
上述基本描述了本发明，其通过下述实施例可以更好地完整理解，其在这里仅仅是证明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1  从鼠胰脏中分离巢素阳性干细胞
鼠胰岛分离自2-3个月的老的Sprague-Dawley鼠使用如Lacy及Kostianovsky所述的胶原酶溶解的方法。人体胰岛由糖尿病研究所，迈阿密，FL提供使用胶原酶溶解法获得。胰岛在37℃下在12孔平板培养96小时(Falcon 3043plates，Becton Dickinson，Lincoln Park，NJ)在该平板上涂覆有伴刀豆球蛋白A。培养基为RPMI 1640补充有10％牛胎血清，1mM丙酮酸钠，10mM HEPES缓冲液，100μg/ml链霉素，100units/ml青霉素，0.25μg/ml两性霉素B(GIBCO BRL，Life Science Technology，Gaithersburg，MD)，及71.5mMβ巯基乙醇(Sigma，St。Louis，MO)。
96小时后，纤维原细胞及其他非胰岛细胞粘附在伴刀豆球蛋白A涂覆的培养孔表面上而胰岛在漂浮(并未附在表面)。这时，含有胰岛的培养基被移走，离心分离，将纯化的胰岛重新种植在没有伴刀豆球蛋白A涂覆的12孔平板上。胰岛然后在上述RPMI 1640培养基补充有20ng/ml碱性纤维原细胞生长因子-2及20ng/ml上皮生长因子下培养。
粘附在平板表面的胰岛及长出且离开胰岛的细胞在一个单层。这些形成单层的细胞使用麻州普通医院的Dr。Mario Vallejo所创立的兔抗鼠巢素抗血清免疫染色为巢素阳性。另外的巢素抗体也可能被用到，例如这儿所述的R.401抗体，或MAB533抗体。特异于鼠胚胎脊髓巢素的单抗，MAB353，ATCC No.1023889；描述于神经***科学杂志1996；16：1901-100；其同样可获自Chemicon International，SingleOak Dr.，Temecula，CA 92590 USA。培养后两周，几个(3-5)巢素阳性单层细胞通过毛细管采摘移出(cylinder cloning)且在12孔平板上重新种植(其上不再涂覆有伴刀豆球蛋白A)且培养在RPMI 1640培养基进一步补充有bFGF-2及EGF。细胞以很快的速度进行增殖且培养后六天覆盖平板。培养后12天细胞单层形成波动其中其开始以co-linear型式叠加。培养第15天，细胞波开始浓缩，移入球形体后在第17天形成含有球形体的孔表面(ca.直径为100μm)，中空，一部分保留有单层细胞，重新挑选几个这样的单层细胞且重新克隆，然后上述途径在相同的时间段再次进行。
实施例2  胰腺干细胞分化形成胰岛
鼠胰岛首先在含有10％的牛胎血清的RPMI培养基上在伴刀豆球蛋白A包覆的12孔平板上培养，胰岛在除了牛胎血清外未加入培养因子的情况下培养三天。经过这个期间，其中胰岛并未粘附，胰岛被转移至不含伴刀豆球蛋白A的新的平板。
干细胞然后通过暴露其于bFGF-2(20ng/ml)及EGF(20ng/ml)24天被刺激从干细胞中增殖形成单层。24天以后，单层达到丰度其中围绕着胰岛的是一群细胞，这些细胞被挑选然后被亚克隆进入新的12孔平板并再次在含有bFGF及EGF的培养基中培养。
亚克隆快速以无性繁殖的形式增殖进入单层，并从中心向外延扩增。细胞在第6天达到丰度并在第12天重叠细胞波。在第17天细胞几乎被全部移植进入球形结构体及关系型结构体等胰岛类似结构(假胰岛类似聚集体)及管状类似结构(假导管)(图4)。RT-PCR分析表明假胰岛类似聚集体表达NCAM(内分泌细胞的一个标记，参见图5)，细胞角蛋白19(导管细胞的一个标记，参见图5)，以及转录因子brain-4(一个贝塔细胞标记)。使用生长因子处理以实现其最终分化成为成熟胰岛细胞的目的。
实施例3  人或鼠胰岛的分离及培养
分离及培养人类胰岛，人类胰岛组织获自细胞移植中心，糖尿病研究所，迈阿密大学医学院哈佛医学院，Boston，MA的用于胰岛移植的青少年糖尿病基金的胰岛分配程序，手工挑选彻底洗涤的胰岛，在修饰的RPMI 1640培养基(11.1mM葡萄糖)补充有10％牛胎血清，10mM HEPES缓冲液的，1mM丙酮酸钠，100U每mL青霉素G钠盐，100μg/mL链霉素硫酸盐，0.25ng/mL两性霉素B，及71.5uMβ巯基乙醇，及加入鹰3043且包覆有伴刀豆球蛋白A(ConA)的12孔组织培养平板。胰岛在37℃下在有5％空气及5％CO2下培养96小时。在这种条件下，更多的胰岛依然保留在悬浮液中(漂浮)，而纤维原细胞及其他的非胰岛细胞黏附在培养基上，培养后96小时，含有悬浮胰岛的培养基被小心移出，手工挑选胰岛然后在修饰的RPMI1640补充有20ng/mL碱性纤维原细胞生长因子(bFGF)及上皮生长因子(EGF)中重悬浮。胰岛悬浮液(包含有20-30个胰岛的平板)被加入到12孔并不附有ConA的组织培养平板上，胰岛快速黏附在平板表面。
在几天内，发现细胞单层从胰岛中长出。在有些情况下，人源细胞被培养在含有2.5mM葡萄糖及几种包括activin-A(2nM)，肝细胞生长因子(100pM)，或betacellulin(500pM)的生长因子的组合的修饰的RPMI培养基中培养。这些实验中细胞使用10mM烟碱处理，培养基不含有血清及生长因子。
实施例4  葡萄糖及GLP-1对胰腺干细胞分化的影响。
可使胰岛尺寸增加的血浆葡萄糖浓度的评估。培养基中葡萄糖的浓度使用含有巢素阳性干细胞的分离的胰岛来调查。鼠胰岛被培养在含有高葡萄糖浓度(16.7mM)的培养基或正常的(5.6mM)葡萄糖浓度中。四天后，使用RT-PCR确定巢素mRNA的水平。结果表明与正常葡萄糖浓度培养的胰岛相比高浓度葡萄糖浓度培养下的胰岛巢素mRNA的水平提高了3倍(图6)。
类似的，注入glucagon类似的多肽-1(GLP-1)进入小鼠发现48小时后胰岛数提高了2倍。具有编码GLP-1受体的***的基因的晕的小鼠再次检查其胰岛巢素的表达。
糖尿病动物模型
给予结果是其症状的减少的糖尿病类型的治疗在一个其可展示糖尿病症状的动物中进行测试。所设计的进行试剂或方法测试的动物有益于人体的糖尿病的治疗。糖尿病的潜在治疗首先在动物模型中测试并观察其效果并比较其与未处理的对照组的区别。
非肥胖的糖尿病(NOD)小鼠对于I型糖尿病或胰岛素依赖的糖尿病来说是重要的(参见Kikutano and Makino，1992，Adv.Immunol.52：285 and references cited therein，herein incorporated by reference)。在NOD小鼠中I型糖尿病的发展不需要外界的任何刺激可以自然发生也可突然发生，当NOD小鼠发展糖尿病时，其遭到β细胞的程序性破坏其由慢性自身免疫性疾病所致。在NOD小鼠中胰岛素依赖型的糖尿病的发展可以被大概分为两个阶段：自身免疫刺激的诱发(胰岛中淋巴细胞感染)及胰岛破坏的加速并爆发糖尿病。糖尿病NOD小鼠以euglycemia开始其生命，或正常的血液葡萄糖水平，但是在大约过了15至16周时NOD小鼠开始变成hyperglycemic，表明其大部分胰腺β细胞的破坏且胰腺丧失产生足够量的胰岛素的能力。除了胰岛素缺乏及多糖症外，糖尿病NOD小鼠也要遭受严重的糖尿，polydypsia，及多尿症，伴随有体重的快速减少。这样，该疾病的发生及进程非常相似于遭受胰岛素依赖型的糖尿病的人体患者。自然康复很少发生于NOD小鼠上，且这些糖尿病动物在糖尿病发生后1-2个月如果不接受胰岛素治疗的话均死去。
NOD小鼠被用作动物模型以测试按照本发明给予干细胞治疗糖尿病的不同方法的有效性。同样地，通过给予干细胞治疗在NOD小鼠中也进行测试以验证其对I型糖尿病的有效性。
干细胞被给予一个NOD小鼠，一般是通过腹腔进行，按照下述的剂量。NOD小鼠被给予大约每个小鼠1×101至1×104个细胞每小鼠。在NOD小鼠中在大约4周给予小鼠，然后从8至10周，每周3次。用于检测糖尿病的小鼠在大约13周时开始，按照下述方法一周两次。治疗效果可比较处理及未处理的NOD小鼠得出。
在NOD的小鼠中对糖尿病的治疗效果可通过分析NOD小鼠中糖尿病进行其使用本领域已知技术，例如，检查NOD小鼠是否多渴，多尿，糖尿，多糖症及胰岛素缺乏症或者体重减少。例如，葡萄糖尿的水平(糖尿)可通过Testape(Eli Lilly，Indianapolis，IN.)进行检测且血浆葡萄糖水平使用如Burkly，1999，U.S.Patent 5,888,507，这儿被引用作为参考等所述的Glucometer 3血糖仪(Miles，Inc.，Elkhart，IN.)。通过这些方法检测尿糖及血糖水平，NOD小鼠被认为是糖尿病患者在经过两个连续的尿阳性测试使用Testape值+1或更高或血浆葡萄糖水平＞250mg/dL(Burkly，1999，supra)。在NOD小鼠中另外的检测糖尿病的方法在NOD小鼠中检测胰岛素水平，例如胰岛素水平可由免疫测定且在处理及对照组比较后确定(Yoon，U.S.Patent 5,470,873，herein incorporated by reference)。在这种情况下，从鼠胰脏中抽取的胰岛素及其浓度可由免疫活性例如放射性免疫测定来进行确定，使用鼠胰岛素作为一个标准。
除了一般使用NOD小鼠检测糖尿病外，治疗方法效果如果干细胞被使用外源基因转化或转染通过基因特异性或基因产品特异性来进行检测，因此，考虑到在外源基因表达及其对糖尿病的效果之间有一定的关联。例如，外源基因产品的存在可以通过产生基因产品及胰岛素的NOD小鼠胰脏β细胞的胰岛的免疫组织化学而确定。通过检测RNA转录补丁或平滑受体在NOD小鼠中进一步测定补丁及平滑基因的表达。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增是通过已知技术扩增一个鼠补丁或平滑cDNA片段来进行的，且按照标准技术进行琼脂糖凝胶电泳。扩增cDNA片段的鉴别通过杂交扩增片段与用于补丁或者平滑基因的荧光标记的内寡聚核苷酸探针，或者通过本领域已知的其它技术进行。
实施例5  巢素阳性的人或鼠胰腺干细胞的免疫细胞化学鉴别
通过分析巢素的表达来分析胰岛。胰岛及干细胞如上进行分离。巢素的表达通过在胚胎第16天(E16)鼠胰腺中(图8A)及在成人胰腺胰岛中(出生后60天)(图8B)发育的胰岛群中明显的免疫细胞化学染色来观察。免疫细胞化学染色如下进行。
取自胚胎第16天及成人(60天)的鼠胰腺Cryosections(6M)与细胞一样使用4％多聚甲醛磷酸溶液固定。
细胞首先使用3％正常的猴血清在室温下处理30分钟且在4℃下使用第一抗体过夜培养。抗血清使用PBS洗涤且分别使用Cy-3及Cy-2标记的第二抗体在室温下培养一小时。再使用PBS洗涤斜面PBS且使用荧光封固剂(Kirkegaard and Perry Labs，Gaithersburg，MD)重新覆盖斜面。组织部分在4℃下使用第一抗体过夜培养。第一抗血清使用PBS洗涤，且斜面使用3％正常猴血清在室温下培养10分分钟在其使用猴抗Cy3(indocarbocyanine)及抗豚鼠猪(胰岛素)，抗鼠(高血糖素)，或抗绵羊(生长激素抑制素)sera DTAF(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA)在室温下培养30分钟。斜面然后再使用PBS洗涤并使用荧光封固剂(Kirkegaard andPerry Laboratories，Gaithersburg，MD)重新覆盖。使用装有界面上有一个PowerMac7100装有IP实验光谱分析软件(Signal Analytics Corp，Vienna，VA)的光学TEC-470 CCD照相机(Optronics Engineering，Goleta，CA)的Zeiss Epifluorescence显微镜获取荧光图片。
巢素阳性细胞区别于β-，α-，δ-，及PP细胞因为其并不与抗荷尔蒙胰岛素，高血糖素，生长激素抑制素，或者胰腺多肽的抗血清共染色-(图8A & B)。巢素阳性细胞同样也并不与抗胶原质IV，动脉内皮细胞标记(图8C)的抗血清共染色，也不与抗galanin，神经细胞的一个标记或者细胞角蛋白19也即导管细胞的一个单抗(图8)的一个单抗共染色。巢素阳性染色与核共染色所清楚观察到的胰岛的截然不同细胞相关(图4D)。
实施例6  通过RT-PCR鉴别巢素阳性人及鼠干细胞
为了证实胰岛中巢素表达的免疫细胞化学鉴别，我们使用准备自新的分离鼠胰岛及人类胰岛组织的总的RNA进行的巢素mRNA的RT-PCR。按照下述方法进行RT-PCR：
取自鼠及人胰岛的总的细胞RNA被反转录且通过PCR扩增35个循环如前所述(Daniel等.，1998，Endocrinology，139：3721-3729)。用作PCR的引物或扩增引物以及随后DNA印迹杂交的探针的寡聚核苷酸如下：
鼠巢素：正向，5′gcggggcggtgcgtgactac3′；
        反向，5′aggcaagggggaagagaaggatgy3′；
        杂交，5′aagctgaagccgaatttccttgggataccagagga3′。
鼠角蛋白19：正向，5′acagccagtacttcaagacc3′；
            反向，5′ctgtgtcagcacgcacgtta3′；
           杂交，5′tggattccacaccaggcattgaccatgcca3′。
鼠NCAM：正向  5′cagcgttggagagtccaaat3′；
        反向  5′ttaaactcctgtggggttgg3′；
        杂交，5′aaaccagcagcggatctcagtggtgtggaacgatgat3′。
鼠IDX-1正向，5′atcactggagcagggaagt3′
       反向，5′gctactacgtttcttatct3′
       杂交，5′gcgtggaaaagccagtggg3′
人类 巢素：正向，5′agaggggaattcctggag3′；
           反向，5′ctgaggaccaggactctcta3′；
           杂交，5′tatgaacgggctggagcagtctgaggaaagt3′。
人类角蛋白 正向，5′cttttcgcgcgcccagcatt3′；
           反向，5′gatcttcctgtccctcgagc3′；
           杂交，5′aaccatgaggaggaaacagtacgctgagg3′。
人类高血糖素：正向，5′atctggactccaggcgtgcc3′；
              反向，5′agcaatgaattccttggcag3′；
              杂交，5′cacgatgaatttgagagacatgctgaaggg3′。
选自两个不同外显子的引物包含至少一个内含子序列。此外，一个RT负的对照也有很多例子。PCR循环在94℃下1分钟然后再在94℃下10秒，58/56℃下10秒，72℃下1分钟，35个循环且在72℃下2分钟。退火温度为58℃对于鼠巢素来讲且在56℃下对其它的引物碱基。
对于DNA杂交寡聚核苷酸探针使用荧光标记的T4多聚核苷酸激酶及y32PATP。荧光标记探针杂交于PCR产品其转移到尼龙膜上在37℃下1小时，然后使用1×SSC+0.5％SDS在55℃下洗涤10-20分钟或在0.5×SCC+0.5％SDS在42℃下洗涤对于人类PCR产品来讲。
合适预期尺寸的RT-PCR产生的产品(图8E，上面板)且通过DNA印迹法证实(图8E，较低面板)且通过产品的DNA测序。这些数据证明表达巢素的且可能代表胰岛多功能性干细胞其相似于中枢神经***的巢素阳性干细胞的胰岛中新的细胞类型的鉴别。
实施例7  ATP依赖转运体ABCG2在胰岛衍生的巢素阳性细胞中被表达
人胰岛衍生的NIPs含有大量的SP亚族细胞，它们共同表达ABCG2、MDR1和巢素。巢素是第一个被证明的神经和肌肉干/祖细胞的标记物(Lendahl等，1990年，Cell 60：585；Zimmerman等，1994年，Neuron 12：11)。神经干细胞特别显示一种高度可塑性，可生成神经细胞和不同类型的神经胶质细胞。神经干细胞/祖细胞也分化成造血细胞，这使它们成为真正的多能干细胞(Shih等，2001年，Blood 98：2412)。到目前为止，多能成年干细胞的最好例子是那些从骨髓衍生的细胞，即所谓的边族(SP)细胞(Goodell等，1996年，J.Exp.Med.183：1797)。SP细胞能有效地排除荧光活体染料Hoechst33342且包含大多的骨髓族群补充细胞，SP因此特点而被鉴别。SP细胞占成年人和鼠的整个骨髓的0.05％，除了生成所有的造血细胞家族外，它们也可以生成骨骼和心肌以及内皮细胞(Gussoni等，1999年，Nature 401：390；Jackson等，2001年，J Clin Invest，107：1395)。ATP-\结合盒转运体ABCG2(BCRP1)已被证明为SP表型的主要组分，因此提供了一种特异鉴别SP细胞的分子方法(Kim等，2002年，Clin.Cancer Res.8：22；Schareberg等，Blood 99：507；Zhou等，2001，Nat Med 7：1028)。特别要注意的是，骨髓衍生的SP细胞具有有限的——如果有的话——体外增殖能力(Bunting等，2000年Blood 96：902；Storms等，2000年，Blood96：2125)；但骨髓细胞内强迫性的P-糖蛋白泵(MDR-1)作用导致体外SP干细胞的扩充和体内细胞的重增殖(Bunting等，2002年，Stem Cell 20：11)。
NIPs因表达巢素而与神经细胞干细胞相关，由于它们在相当多的NIPs亚族群中表达ABCG2——通过Hoechst33342排除检验鉴别，因此，NIPs也显示骨髓SP干细胞的特点。NIPs的这个边族也表达MDR-1，促进其在试管内不断的扩充。因此，NIPs可能是成年多能干/祖细胞的一个潜在来源，可用于供移植入糖尿病患者体内的胰岛组织的生产。
人体胰岛取自迈阿密大学医学院糖尿病研究所细胞移植中心(迈阿密，佛罗里达州)和哈佛医学院胰岛移植青少年糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病)研究基金中心(波士顿，马塞诸塞州)的“胰岛分配计划”。NIPs按前所述方法分离(Zulewski等，2001年，Diabetes 50：521)。简单来说，精选人体胰岛，在37℃、5％CO2下，在含伴刀豆球蛋白A(ConA)覆盖的培养皿内培养；培养皿内含RPMI1640改良培养基，并附加有10％牛胎儿血清、10mmol/lHEPES缓冲剂、1mmol/l丙酮酸钠、71.5μmol/lβ-巯基乙醇和抗细菌-抗真菌药(Gibco生命技术公司，盖瑟斯堡，马里兰州)。96个小时后，悬浮的胰岛转移至新鲜的培养基中，新的培养基进一步附加有20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和20ng/ml表皮生长因子(EGF)(均来自Sigma公司，圣路易斯，密苏里州)，且装在一个新的无伴刀豆球蛋白A包衣的塑料培养皿中。岛黏附在无包衣的塑料表面，数天之内可见单层细胞生长出来并离开小岛。取自单层周边的细胞——巢素阳性胰岛衍生祖细胞(NIPs)，转移至一个新的培养皿中，在以上相同条件下生长至融合。进一步把细胞分至两个培养皿，进行含或不含异搏定——Hoechst33342转运抑制剂——的Hoechst33342染料排除试验(Goodell等，1996年，supra)。
RT-PCR证明ABCG2的表达(图19A)。对RT-PCR产生的DNA物质进行测序显示，与人ABCG2的完全一致(586bps)(基因库编号XM-132424号，图18)(没有显示数据)。与一种克隆ABCG2探针的DNA印迹杂交证实正确的cDNA放大(图19A)。
使用Trizol(Gibco)，依照生产厂商的规定方法，将RNA从培养的NIPs以及精选SP细胞和非SP对照品(分别为5000和10,000个细胞)中分离出来。单股cDNA使用(Invitrogen公司，卡尔斯巴德美，加州)“上标首股***”(SuperscriptFirst-Strand System)制备。cDNAs应用多酶链反应(PCR)扩大。无逆转录酶(-RT对照品)对照品进行所有的PCR反应。PCR产品用琼脂糖凝胶电泳分析，产品的真实身份通过测序证实。使模板浓度正常化，以适合于GAPDH(31循环)。ABCG2、MDR1和巢素分别以34、38和36循环扩大。引物是：GAPDH为5’tgaaggtcggagtcaacggatttggt 3’和5’catgtgggccatgaggtccaccac 3’，
巢素为5’agaggggaattcctggag 3’和5’ctgaggaccaggactctcta 3’，
MDRR1为5’tcctggagcggttctacgac 3’和5’gggcttcttggacaaccttttca 3’，
ABCG2为5’gctggggttctcttcttcctgacg 3’和5’ctaccccagccagtgtcaac 3’。ABCG2的PCR产品被转移至尼龙膜中(Hybond N+；Amersham Pharmacia，littleChalfont，英国)。印迹使用快速杂交缓冲剂(Rapid Hyb Buffer)(Amersham)，依据生产厂商规定方法，与放射标记、克隆ABCG2或MDR1探针杂交。人ABCG2全开放读取框的引物是5’tattaagctgaaaagataaaaactctcc  3’和5’atgtgaggataaatcatactgaat3’(基因库序列XM-032424碱基对174-202和2184-2207)。
实施例8   在Hoechst33342染料排除试验中，1.5到2％的培养细胞有一种边族表 型
NIPs因表达巢素而与神经细胞干细胞相关，由于它们在相当多的NIPs亚族群中表达ABCG2——通过Hoechst33342排除检验鉴别，因此，NIPs也显示骨髓SP干细胞的特点。NIPs的这个边族也表达MDR-1，促使其在试管内的不断扩充。
为研究是否ABCG2的表达导致一些培养的NIPs产生边族(SP)表型，依照已公开发表的方法(Goodell等，1996年，supra)，稍加改进后，进行Hoechst33342染料排除检验。Hoechst33342染料的排除确定造血干细胞的多能边族(SP)，它由ATP结合盒转运体ABCG2介导。维拉帕米(异搏定)被用作的H33342转运的一种特异抑制剂(Goodell等，1996年，supra)。
Hoechst染料排除试验依照Goodell等1996年supra上发表的方法稍加改进，即当细胞仍黏附在培养皿上时就着色。这种变化使细胞的活性比最初的方法——细胞在悬浮液时着色，明显较高。将Hoeschst33342(Sigma)加到生长介质中，使其最后浓度为5μg/ml，细胞在37℃下培养90分钟。在试验开始前15分钟，只要显示需要，就加入维拉帕米(Sigma)，直至其最后浓度为50μmol/l。为分析，细胞被胰蛋白酶化，用40μm细胞滤器滤过，将其悬浮在含碘化丙啶(Sigma)最后浓度为2/ml(用于分辨死亡细胞)的冰冻Hanks平衡盐溶液中。使用紫外激光激活Hoechst33342和碘化丙啶，在Vantage仪和一台Moflow细胞分类器上进行流式细胞计数。在家族模式(linearmode)分析中使用450/20BP(蓝)和630/20(红)过滤器。
荧光激活细胞分类(FACS)显示一种清晰可见的边族(图19B；2.1％门控细胞)，而在抑制剂维拉帕米存在时消失(图19C；0.1％门控细胞)。在两个独立衍生的NIP培养物分析中，SP阳性细胞的百分比率分别为百分之1.5和2(数据没有显示)。我们还从NIPs扩大了ABCG2的全展开阅读框。克隆入表达载体和转染入INS-1胰岛瘤细胞导致在转染细胞中Hoechest33342的有效排除(数据未显示)。
实施例9  SP表型与ABCG2、MDRl和巢素的表达相关
SP细胞和非SP对照细胞通过FACS被从培养NIPs中分离(图20A；分别为门R1和R2)。ABCG2的表达与SP表型紧密相关，如通过RT-PCR(图20B)以及与一个克隆ABCG2探针的DNA印迹杂交显示的一样。RT-PCR和DNA印迹杂交显示MDR1的表达(P-糖蛋白)，另一个出现在培养NIPs的SP部分造血干细胞中的ATP-结合盒转运体(Chaudhary等，1991年，Cell 66：85)。SP部分也以比非SP对照显著较高的水平表达巢素(图20B)。
从人胰岛衍生的巢素阳性细胞含有1.5到2％的SP细胞，与非SP对照细胞相比，这些细胞以较高的水平表达ABCG2和巢素。ABCG2表达和SP表型的关系证实了这个发现，即ABCG2的活性是SP染料泵出(dye efflux)的主要原因(Kim等，supra；Scharenberg等，supra；Zhou等，supra)。巢素和ABCG2的共同表达指明，巢素作为一种干/祖细胞通用标记物的更广阔的作用。
在不同的哺乳动物种类包括人类的骨髓的SP细胞部分，包含极大多数的多能造血干细胞(HSCs)(Goodell等，1997年，supra)。骨髓衍生SP细胞的分化并不仅限于血液家族；在动物模型中，SP细胞也分化成骨骼、心肌以及内皮细胞(Gussoni等，Nature，401：390；Jackson等2001年，J Clin Invest，107：1375)。此外，骨髓衍生的干细胞分化成功能性脑和肝细胞(Brazelton等，2000年，Science 290：1775；Lagasse等，2000年，Nat Med 6：1229)。
NIP培养物中的SP细胞组分(1.5至2％)至少比骨髓中(0.05％)发现的多20倍(Goodell等，1996年，supra)。然而，相当百分比率的SP细胞在肌肉卫星细胞中被发现，而肌肉卫星细胞一般认为是生肌祖(Jackson等，1999年，Pro Natl Acad Sci，96：14482)。除产生分化肌纤维外，SP细胞已证明能重建致死辐射小鼠的骨髓，显示了一种未曾预料的可塑程度(Gussoni等，1999年，supra)。一些证据表明，这些SP细胞在肌肉定居前也来自骨髓(Kawada等，2001年，Blood 98：2008)。一种SP族在鼠胚胎干细胞也被证实(Zhou等，2001年，supra)。在ABCG2神经干细胞上的表达已证明，比在更加分化的神经细胞显著较高(Geschwind等，2001年，Neuron 29：325)。
MDR1(P-糖蛋白，ABCG1)是另一个在造血干细胞(包括其他数个细胞类型)上表达的ATP结合盒转运体(Zhou等2001年，supra；Chaudhary等，1991年，supra)。MDR1在骨髓细胞的过度表达导致SP组群的扩大以及在培养基中延长生存和移植入小鼠体内后较高的族群重建活性(Bunting等，2000年，supra)。在一些移植动物中，它最终导致一种骨髓增生综合征，类似于慢性骨髓性白血病(Bunting等，1998年，Blood 92：2269)。因此，MDR-1表达与造血干细胞的扩充紧密相关，并被认为是增殖干细胞的一种特点，与只表达ABCG2的休眠细胞(quiescent cells)形成对照(Bunting等，2002年，supra)。MDR1被在衍生NIPs的胰岛的SP组分中表达。
实施例10 GLP-1R阳性人胰岛干细胞的免疫化学鉴别
对巢素阳性胰岛干细胞进行GLP-1R表达分析。人胰岛组织从哈佛医学院“胰岛移植青少年糖尿病研究中心”获取。NIPs如前述描述方法分离(Zulewski等，2001年，Diabetes 50：521)。简单来说，胰岛在包含血清、11.1mM葡萄糖、抗生素、丙酮酸钠、β-巯基乙醇和生长因子的RPMI1640培养基中清洗和培养。几天内，巢素阳性细胞(按以上描述方法免疫化学鉴别)从胰岛中生长出来。然后这些细胞在含20ng/ml碱性成纤维生长因子和表皮生长因子或1000单位重组人白血病抑制因子的培养基中被克隆和增殖。进行在不含血清情况下的与GLP-1共同培养，且在不使培养基改变的情况下，每48小时加入新鲜肽。
如下所示，使用兔多克隆抗血清进行GLP-1R的免疫化学检测(Heller等，supra)。在Lab-Tek室载玻片(chamber slides)(Nunc Naperville公司，伊利诺斯州)或格栅盖玻片上培养的细胞，在PBS中用4％的多聚甲醛室温下固定10分钟。在PBS中清洗数次后，细胞用正常驴血清阻滞30分钟，然后在4℃下与第一个抗血清或免疫前血清培养。第二天，细胞用PBS清洗，并在室温下与标签为Cy-3或Cy-2的第二个抗血清(驴抗兔和驴抗豚鼠血清)培养一小时。几次清洗后，含细胞的盖玻片在含DAPI(可将细胞核染色)封固剂(Vector实验室公司，伯明翰，加州)中被装载在载玻片上。应用装有一台与Powermac7100互相配合的Optronics TEC-470 CCD照相机(Optronics工程公司，戈拉塔，加州)的Zeiss周围荧光显微镜获取荧光成像。使用实验室IP光谱软件(Signal分析公司，维也纳，佛吉尼亚州)获取和分析成像。
在大多数被检的NIPs(至少60％)中检测到GLP-1R免疫活性(图22A)
实施例11  用RT-PCR鉴别GLP-R1阳性人干细胞
为证实在胰岛(NIPs)中GLP-1R表达的免疫细胞化学特征，使用从NIPs制备的全RNA进行RT-PCR。RT-PCR按上述实施例6描述的方法进行，为了鉴别巢素mRNA的区别，以下特别的引物被应用：5’gtgtggcggccaattactac3’(顺)；5’cttggcaagtctgcatttga3’(逆)。NIP mRNA的扩增产生期望的346bp产物(图22B)表明，除表达GLP-1R蛋白质外，NIPs具有生成GLP-1R的生物合成能力。因此，除巢素外，GLP-1R在当前发明中是一个有用的胰腺干细胞标记物。
实施例12  巢素阳性干细胞在试管中的增殖
巢素阳性干细胞在试管中的增殖能力被确定。
取自于60日龄鼠或健康成年人的胰岛，首先铺放在伴刀豆球蛋白A包衣的培养皿中，在含10％牛胎儿血清的改良的RPMI1640培养基中培养四天，以清除黏附在ConA盘上的胰岛样本中的成纤维细胞和其它非胰岛细胞。在此培养条件下不粘附在盘上的胰岛被收集，并转移至12井盘(12-well plates)(无ConA包衣)中，井盘包含同样的改良RPMI1640培养基，但此外还加有bFGF和EGF(每样20ng/mL)。之所以选择一同加入生长因子bFGF和EGF，是因为它们能刺激来自脑室管膜的神经干细胞的增殖(Reynolds和Weiss，1996年，Dev.Bio.，175：1-13)。胰岛粘附在盘上，且细胞慢慢地从岛中以单层的形式生长出来(对人体细胞，估计增殖一倍的时间为40-45小时)。生长出来的细胞单层在表型上同源(图9A，板1)并表达巢素(图9A，板2)。鼠细胞从这些单层细胞中挑选(每批至少20-30个细胞)，亚克隆至12井盘中，在含bFGF和EGF的改良RPMI1640培养基(11.1mM葡萄糖)中培养。亚克隆细胞以细胞倍增时间估计为12-15个小时(图9A，板3)的速度快速生长，六天内融合，到12天形成波状的结构。15-17天培养后，细胞形成岛样的簇(ILCs)(图9A，板4)。相似的细胞从人体胰岛中克隆(图9B)。在接近融合时(图9B，板1)，人细胞移植在盘中形成大的空泡性结构(图9B，板2和板3)。然后大空泡衬里细胞改变形态，变圆、集结形成三维ILCs(图9B，板4-6)。
形成ILCs的这些巢素阳性胰岛祖细胞(NIPs)的分化指示物，被RT-PCR和DNA印迹所鉴别，并由此发现它们表达内分泌标记物NCAM(神经细胞黏附分子)(Cirulli等，1994年，J.Cell Sci.107：1429-36)(图9C，右板)和导管细胞标记物CK19(细胞角蛋白19)(Bouwens等，1998年，J.Pathol.，184：234-9；Bouwens等，1995年，J.Histochem.Cytochem.43：245-53；Bouwens等，1994年，Diabetes，43：1279-93)(图C，左板)。在这个研究阶段可得出的结论是，当NIPs变成融合和集结形成胰岛样的细胞簇时，它们开始表达胰腺基因(NCAM和CK19)；但胰岛基因表达有限，因为缺乏分化成内分泌细胞的必需生长因子。而且还发现，一种祖细胞组族的分化一般首先需要一种增殖阶段，而后是在分化特异成形素生长因子存在下的增殖休眠。因此，在一些情况下，通过用含较少诱导增殖的低葡萄糖(2.5mM)以及含HGF/分布因子或betacellulin和苯丙酸诺龙A的培养基，代替含诱导细胞增殖的11.1mM葡萄糖以及含bFGF和EGF的培养基，改进培养基的条件。葡萄糖是一种已知的胰岛β细胞增殖因子(Swenne，1992年，Diabetologia，35：193-201；Bonner-Weir，1989年，Diabetes，38：49-53)，HGF/分布因子和苯丙酸诺龙A已被证明将胰腺导管细胞家族AR42J分化成一种分泌胰岛素、高血糖素和其他胰内分泌细胞蛋白质的内分泌表型(Mashima等，1996年，Endocrinology，137：3969-76；Mashima等，1996年，J.Clni.Invest，97：1647-54)。
含ILCs的培养物通过免疫细胞化学(图10A，上板)、RT-PCR和DNA印迹(图10B)，以及通过免疫印迹(图10C)表达胰腺特异同源结构区蛋白质IDX-1。ILCs也表达mRNA编码的高血糖素原如通过RT-PCR发现的一样(图10D)，且合成免疫活性高血糖素、高血糖素样肽-1和胰岛素。放射免疫测定法培养物——在数个井中对岛样簇培养72-96小时后获取，得到的数值是40-80pg/mlGLP-1、30-70pg/ml高血糖素、29-44pg/ml胰岛素。放射免疫测定法按以下方法测量。
胰岛素和高血糖素在培养基中的浓度由紫外敏感放射免疫测定法工具包确定，工具包分别采自林肯研究公司和DPC公司。用在各自工具包中的抗血清分别是豚鼠抗人胰岛素和兔抗人高血糖素。GLP-1分泌用抗人GLP-1(7-36)酰胺兔多克隆抗血清(用一种合成肽CFIAWLVKGR酰胺共轭透孔螺血蓝蛋白免疫接种兔获取)测量。这种抗血清对检测GLP-1(7-36)酰胺高度特异，而对检测高血糖原不太敏感。这些检测的敏感水平分别是6pg/ml、13pg/ml和10.2pg/ml。
如Ramiya等描述的那样(Rmiya等，200年，Nat Med，6：278-282)，ILCs在10mM尼克酰胺中培养7天，胰岛素分泌增加2到3倍。
数个另外的胰腺标记物在分化的NIPs中表达，如葡萄糖转运体-2(Wang等，1998年)、兔抗人突触素(synaptophysin)和HGF(Menke等，1999年)，如图15所示。为确定是否分化的NIPs具有胰外分泌组织，我们使用RT-PCR，并检测淀粉酶和羧肽酶原的表达。
一些包含NIPs的干细胞培养物也表达mRNA编码高血糖原和胰岛素，如通过RT-PCR所发现(图16A和B)。
IDX-1的表达非常重要，因为已发现它是胰腺发育的一种主要调控子，特别是分泌胰岛素的胰岛β细胞成熟和发挥功能所必需(Stoffers等，1997年，TrendsEndocrinol.Metab.，8：145-151)。
因为新胰岛的再生也已知可通过胰导管细胞的分化而发生，特别是新生期间(大鼠和小鼠)，但在某种程度上是整个成年期(Bonner-weir等，1993年，Diabetes，42：1715-1720；Rosenberg，1995年，Cell Transplant，4：371-383；Bouwens等，1996年，Virchows Arch..，427：553-560)，所以，巢素表达在成年鼠的胰导管中分析。通过应用巢素抗血清和细胞角蛋白抗血清——导管表皮细胞的一种标记物——的双荧光免疫细胞化学，巢素在大小导管的局部地区以及外分泌腺泡组织内的一些小叶中心导管强烈表达(图11A和11B)。尤其显著的是，导管中巢素表达的局部区域大多数不被抗CK19抗血清染色。再者，导管中的巢素阳性细胞显示一种形态，显著相异于表皮细胞。表皮细胞由一种同源的方形、圆形细胞族组成，而巢素阳性细胞有核、扁爬形，似乎只位于表皮细胞的间隙或周围(图11C)。
因此，CK19不在大多数表达巢素的导管细胞表达提示，这些位于胰导管的巢素表达细胞是一种与导管表皮细胞明显有别的细胞信使族群，是尚未分化成导管或内分泌表型的干细胞。在成年鼠胰腺的胰导管和胰岛内，巢素表达细胞局部集聚生长，这个发现进一步支持了这个观点，即鼠胰导管包含的细胞是胰岛细胞(新生)的祖，但这些祖细胞本身不是导管表皮细胞的一个亚族。
实施例13  以在糖尿病患者中表达IDX-1的基因工程胰腺干细胞的移植
胰岛从猪或人供体胰腺中分离，或从最终人移植受体的胰腺活组织检查中获取，然后体外在刺激干细胞生长的条件下培养。然后将干细胞从胰岛(克隆的)中分离，试管内在含bFGF-2、EGF和11.1mM葡萄糖的增殖培养基下增殖，用含DNA编码转录因子IDX-1的表达载体转染/注射，最后移植入糖尿病受体。此外，在移植以启动基因工程干细胞分化成β细胞的程序前，IDX-1转染干细胞也用GLP-1或其他分化成形素或生长因子处理1-3天。在一个实施例中，干细胞在注入受体前既不增殖也不分化。在一个实施例中，移植期间和移植后数天内应用GLP-1，以刺激干细胞的分化和促进嫁接成功。依据这种方法，进行异种移植物(猪胰岛)或同种异体移植物(来自非受体人供体的人胰岛)以及同基因移植物(来自受体的胰岛)移植。人们推测，当移植入宿主受体时，干细胞的所有基因集合重新编程，以便宿主把这些干细胞认作是自体物，因此不发生免疫不耐受、移植物排斥和自动免疫破坏(1型糖尿病)。
实施例14  培育以刺激在糖尿病患者内表达IDX-1的胰腺干细胞的移植
如以上描述方法分离的胰岛，在首先刺激胰岛内干细胞扩大(增殖)、然后刺激转录因子IDX-1表达的条件下，体外培养数天。通过在含bFGF和11.1mM葡萄糖的培养基中培养胰岛，获得增殖的干细胞。通过在GLP-1和2mM葡萄糖存在情况下培养，诱导IDX-1的表达。如此方法预处理后的胰岛被移植入宿主受体中。此外，宿主受体在移植期间和移植后数天内可应用GLP-1，以进一步增殖和分化干细胞，使之形成胰岛素分泌细胞，促使嫁接成功。
依据这种方法，进行异种移植物(猪胰岛)、同种异体移植物(来自非受体人供体的人胰岛)以及同基因移植物(来自受体自身的胰岛)移植。
实施例15  胰腺干细胞异种移植入肾脏
人巢素阳性胰岛祖细胞(NIPs)如所述方法分离，然后移植入八只不被免疫抑制的C57B16小鼠肾囊中。移植的人体细胞不被鼠受体排斥。目前的认识是，异种移植物如人组织，将在5-10天内被鼠所排斥。与目前的认识相反，我们发现，在所有八只不受免疫抑制的鼠中，到目前为止所有的移植都成功的嫁接，且在移植入105～106个细胞后一个月内(30-38天)，增殖成大群的组织遍及肾脏两端。
杀死一只C57B16鼠，确认在移植部位有大面值新的生长。包含新组织的肾脏切片分成两块：一块冷冻以进行冷冻切片组织学检查；另一块在多聚甲醛中固定，以便进行石蜡切片组织学检查。冷冻部分用苏木精、曙红(H&E)以及对各种胰岛细胞抗原的抗血清处理和染色。
对H&E染色肾脏切片的检查证明不是肾脏组成部分的新生长的存在，显示一种由间叶细胞和上皮细胞混合组织、包括肝、神经、导管、脂肪和造血成分组成的多形性形态。对肾脏切片的纤维照相证明，新的生长似乎正在侵入肾实质和肾小球。使用人特异(而不是鼠)抗血清的特异免疫染色揭示，免疫阳性细胞索对人特异角蛋白、vimentin以及对人造血淋巴细胞特异的CD45白细胞抗原染色。第二只C57B16鼠的肾脏在NIP移植部位也有相似的新生长。
检查一只C57B16鼠(第一只杀死的鼠)NIP嫁接肾脏的石蜡切片。检查的组织块来自肾的上端，显示外来组织在肾囊下被很好的包容，没有“侵入”肾实质的迹象。特别值得注意的是，在多形外表的移植组织之间是类似肾实质的区域。对这种与理论的不符，一种假说是：该移植物由试图分化的干细胞组成，且这些干细胞不是“侵入”，而只是简单地迁移和增殖，并寻找小生境，也就是间叶细胞的指令。它们可能接受来自肾脏的信号，并可能尝试分化入肾脏。这些移植细胞可能不是恶性的，但可能只是尝试发挥其功能的干细胞。
实施例16  移植入胰腺的胰腺干细胞异种基因移植
人巢素阳性胰岛祖细胞(NIPs)如上所述分离，并移植入未被免疫抑制的鼠的胰腺，且这种鼠(1)被链脲霉素(产生链脲霉素诱导糖尿病)处理而损伤，或是(2)胰岛正在发炎的NOD鼠。
检查移植动物的胰腺，确定是否NIPs寻找到了它们正确的小生境、接受来自胰岛区域的指令并分化成胰岛(β细胞)细胞。
实施例17  通过胰腺干细胞异种基因移植治疗糖尿病
人胰岛如上所述分离，然后在试管内培育数天以扩增干细胞数量。人HIPs通过门静脉移植入肝(据移植入肝技术中广为所知的惯常方法)。
作为可选用的一种情况，人NIPs族群(如所述方法分离)被引入血液循坏。在某些实施例中，人NIPs通过胰动脉直接导入糖尿病者的胰腺。
为了解糖尿病症状的改善情况(如血糖水平、胰岛素水平和胰β细胞数目)，分析对照组(非移植动物)和移植动物。
实施例18  肝巢素阳性干细胞的鉴别
依据熟知的技术及此处描述的方法，鼠肝被分离并制成冷结切片。
用兔多克隆抗巢素血清进行鼠肝冷结切片(6μM)的免疫染色。免疫荧光信号通过以荧光团、Cy3(黄澄色)为标示的抗驴IgG血清的反应。图13A描述的是围绕一尽可能较大胆管的巢素阳性细胞，图13B描述的是围绕数条小胆管的巢素阳性细胞簇。
实施例19  NIPs旨在肝细胞表型的分化
由于胰腺中肝干细胞(椭圆形细胞)、肝星形细胞和祖细胞之间被报告有明显的族群外观，且观察到，一些损伤以后再生的胰腺进行肝转化(Slack 1995年；Reddy等，1991年；Bisgaard等，1991年；Rao等，1996年)，我们进行了RT-PCR，以检测干细胞中的肝表达基因。为肝细胞发育所需的转录因子XBP-1(Reimold等，2000年)和转甲状腺蛋白(transthyretin，一种肝急性期蛋白)获取PCR产物。数个其它肝标记物也被表达，如α-胎蛋白(Dabeva等，2000年)、E-钙黏附素(E-Cadherin)(Stamatoglou等，1992年)、c-MET(Ikeda等，1998年)、HGF(Skrtic等1999年)和突触素(synaptophysin)(Wang等，1998年)。胰腺和肝共同蛋白质的表达，如HGF和突触素等，可能反应它们来自前肠内胚层的共同来源，并代表向胰腺或肝表现型的分化。
实施例20  GLP-1R在NIPs中的信号传递
对单个、分离的NIPs应用GLP-1R酰胺提升胞内Ca离子浓度([Ca2+]i)。将细胞铺在隔栅盖玻片上，随后进行免疫组织化学染色以测试巢素的表达。获取所有细胞的[Ca2+]i读数，所有细胞都显示表达巢素。与成年β细胞相反，在碱性葡萄糖(5.6mM)中GLP-1刺激[Ca2+]i水平，但在高葡萄糖(20mM)存在时没有效果(图23，板A)。这种效果可通过毛喉素重现(图23，板B)，提示，GLP-1的效果通过Gs的激活和cAMP的生产介导，即与正常β细胞应用的信号通路相同。应用GLP-1的特异拮抗剂肽Extendin(9-39)对单个分离的NIPs预处理，阻止GLP-1介导的[Ca2+]i的升高(图23，板C和D)。GLP-1拮抗剂Extendin的效果提示，相同的GLP-1R对碘氧基苯甲醚在NIPs中表达，就如在β细胞中一样。GLP-1介导的[Ca2+]i升高被胞外的La3+所抑制，提示GLP-1刺激[Ca2+]i内流，与它已知的β细胞去极化作用一致(图23，板E)。我们进一步证明，甲苯磺丁脲(100μM)在NIPs中刺激[Ca2+]i升高，表明它们表达ATP敏感性K+通道(图23，板F)。这些数据与GLP-1诱导膜去极化和在NIPs中激活电位依赖性Ca+通道的作用相一致，与它在β细胞中的作用机理相一致。
实施例21  GLP-1诱导NIPs分化成泌胰岛素的细胞
早前的研究已经证明了GLP-1的促胰岛素作用及其在部分胰切除鼠中刺激β细胞再生的能力(Xu等，1999年，Diabetes 48：2270)。NIPs从胰岛培养物中挑取，在包含bFGF加EGF(传代通路01)的培养基中增殖3-10天(Zulewski等，2001年，Diabetes 50：521)。在某些情况中，增殖3-5天的NIPOs被固定，并接受对巢素(Cy-3)和胰岛素(Cy-2)的免疫细胞化学检测，如图24A所示。在此阶段发现，它们为巢素阳性，胰岛素阴性。当NIP培养增殖7-10天，然后用GLP-1或其稳定同类物extendin-4处理，一种细胞亚族变为胰岛素阳性(Cy-2；图24B，板3、5和6)、Idx-1阳性(Cy-3；图24B，板7)和巢素阴性(Cy-3；图23B，板4)。当培养基应用GLP-1处理时，整个巢素表达下降(图24B，板2对板4)。据此，应用extendin-4处理诱导胰岛素分泌增加2至3倍(图25)。然而，在一些培养井，融合本身就足够引起少量的胰岛素分泌。
同源结构域蛋白质Idx-1对胰腺发育至关重要，且胰岛素基因转录调节中起一种主要的作用。Idx-1的表达导致一种早期发生的2型糖尿病形式(MODY4)，且Idx-1的遗传氨基酸改变与2型糖尿病的晚期发生相关。Idx-1在分化的NIP细胞族群中表达。
重复传代的人NIPs丧失其响应GLP-1分泌胰岛素的能力。然而，用一种编码人Idx-1 cDNA的表达载体转染这些细胞，将使它们对GLP-1响应，诱导胰岛素在NIPs亚族的合成(图26，板1)。有意思的是，在不使用GLP-1的情况下，用Idx-1转染NIPs(传代通路9)不能诱导胰岛素的生物合成(图26，下B板)，但确实能刺激Idx-1的表达水平(图26，上B板)。总的来水，这些结果提示，GLP-1刺激Idx-1在NIP细胞的表达水平，要使NIPs转为胰岛素分泌细胞需要一关键的Idx-1阈浓度；因此提示GLP-1R在胰岛细胞分化中的一种作用。
实施例22应用NIPs在准备接受组织/器官移植的宿主受体中预先诱导一种免疫 耐受状态的一种方法
NIPs被用于预先诱导一种对可能器官供体的耐受状态。最近发表的报告指出，从供体移植干细胞到一位移植受者可诱导对来自供体的移植耐受，而不需要任何免疫抑制药(参加Fandrich等提供的例子，Nat Med 2002年2月，8：171；Quaini等，N.Engl.J.Med.，2002年1月3号，346：5；Korbling等，N.Engl.J.Med.，2002年5月7号，346：738)。本处描述的方法证实了这些观察，并示范了在将供体的器官移植到受体之前，NIPs在预先诱导受体对器官供体的一种免疫耐受状态中的一种新颖应用。
依据这种方法，从一位预期供体的胰腺或肝中取下一块活组织检查切片。如上所述，分离人巢素阳性细胞(NIPs)并在试管内增殖，以便产生NIPs或NIP相对应的干/祖细胞。然后通过皮下或者通过静脉注射，将这些NIPs注射入一位免疫力正常的受者体中。4-8小时后，通过针吸或钻孔活检(穿刺活检)获取组织样本。基因组PCR检查和使用供体特异探针的原位杂交表明，移植的人NIPs在受体的多种器官定位繁殖，并创造一种微观/混和嵌合状态，这种状态诱导一种免疫耐受环境。一位受体对人组织移植物的接受被认为起自于移植的干/祖细胞向含抗原的树枝状细胞的分化，因此诱导人免疫***将移植的组织辨认为是自己组织。受体对供体组织免疫耐受的成功诱导通过以下方式证实：从供体身上提取皮肤活检，移植到受体的皮肤上，受体不显示对供体皮肤移植物的排斥。对供体的一种免疫耐受状态被证实后，NIP移植物外科除下。然后，来自供体的器官(肾、心、肝、胰)被移植入受体中，此时不会引起对移植器官的排斥。这种器官前移植方法强令受体的免疫***把移植器官辨认为自身组织，因而避免了对强效但毒性较大的免疫抑制药的需求。
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<400>1
Met Glu Gly Cys Met Gly Glu Glu Ser Phe Gln Met Trp Glu Leu Asn
1               5                   10                  15
Arg Arg Leu Glu Ala Tyr Leu Gly Arg Val Lys Ala Leu Glu Glu Gln
            20                  25                  30
Asn Glu Leu Leu Ser Ala Gly Leu Gly Gly Leu Arg Arg Gln Ser Ala
        35                  40                  45
Asp Thr Ser Trp Arg Ala His Ala Asp Asp Glu Leu Ala Ala Leu Arg
    50                  55                  60
Ala Leu Val Asp Gln Arg Trp Arg Glu Lys His Ala Ala Glu Val Ala
65                  70                  75                  80
Arg Asp Asn Leu Ala Glu Glu Leu Glu Gly Val Ala Gly Arg Cys Glu
                85                  90                  95
Gln Leu Arg Leu Ala Arg Glu Arg Thr Thr Glu Glu Val Ala Arg Asn
            100                 105                 110
Arg Arg Ala Val Glu Ala Glu Lys Cys Ala Arg Ala Trp Leu Ser Ser
        115                 120                 125
Gln Gly Ala Glu Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Ala His
    130                 135                 140
Glu Glu Glu Arg Val Gly Leu Asn Ala Gln Ala Ala Cys Ala Pro Arg
145                 150                 155                 160
Leu Pro Ala Pro Pro Arg Pro Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val Glu Glu
                165                 170                 175
Leu Ala Arg Arg Leu Gly Glu Ala Trp Arg Gly Ala Val Arg Gly Tyr
            180                 185                 190
Gln Glu Arg Val Ala His Met Glu Thr Ser Leu Asp Gln Thr Arg Glu
        195                 200                 205
Arg Leu Ala Arg Ala Val Gln Gly Ala Arg Glu Val Arg Leu Glu Leu
    210                 215                 220
Gln Gln Leu Gln Ala Glu Arg Gly Gly Leu Leu Glu Arg Arg Ala Ala
225                 230                 235                 240
Leu Glu Gln Arg Leu Glu Gly Arg Trp Gln Glu Arg Leu Arg Ala Thr
                245                 250                 255
Glu Lys Phe Gln Leu Ala Val Glu Ala Leu Glu Gln Glu Lys Gln Gly
            260                 265                 270
Leu Gln Ser Gln Ile Ala Gln Val Leu Glu Gly Arg Gln Gln Leu Ala
        275                 280                 285
His Leu Lys Met Ser Leu Ser Leu Glu Val Ala Thr Tyr Arg Thr Leu
    290                 295                 300
Leu Glu Ala Glu Asn Ser Arg Leu Gln Thr Pro Gly Gly Gly Ser Lys
305                 310                 315                 320
Thr Ser Leu Ser Phe Gln Asp Pro Lys Leu Glu Leu Gln Phe Pro Arg
                325                 330                 335
Thr Pro Glu Gly Arg Arg Leu Gly Ser Leu Leu Pro Val Leu Ser Pro
            340                 345                 350
Thr Ser Leu Pro Ser Pro Leu Pro Ala Thr Leu Glu Thr Pro Val Pro
        355                 360                 365
Ala Phe Leu Lys Asn Gln Glu Phe Leu Gln Ala Arg Thr Pro Thr Leu
    370                 375                 380
Ala Ser Thr Pro Ile Pro Pro Thr Pro Gln Ala Pro Ser Pro Ala Val
385                 390                 395                 400
Asp Ala Glu Ile Arg Ala Gln Asp Ala Pro Leu Ser Leu Leu Gln Thr
                405                 410                 415
Gln Gly Gly Arg Lys Gln Ala Pro Glu Pro Leu Arg Ala Glu Ala Arg
            420                 425                 430
Val Ala Ile Pro Ala Ser Val Leu Pro Gly Pro Glu Glu Pro Gly Gly
        435                 440                 445
Gln Arg Gln Glu Ala Ser Thr Gly Gln Ser Pro Glu Asp His Ala Ser
    450                 455                 460
Leu Ala Pro Pro Leu Ser Pro Asp His Ser Ser Leu Glu Ala Lys Asp
465                 470                 475                 480
Gly Glu Ser Gly Gly Ser Arg Val Phe Ser Ile Cys Arg Gly Glu Gly
                485                 490                 495
Glu Gly Gln Ile Trp Gly Leu Val Glu Lys Glu Thr Ala Ile Glu Gly
            500                 505                 510
Lys Val Val Ser Ser Leu Gln Gln Glu Ile Trp Glu Glu Glu Asp Leu
        515                 520                 525
Asn Arg Lys Glu Ile Gln Asp Ser Gln Val Pro Leu Glu Lys Glu Thr
    530                 535                 540
Leu Lys Ser Leu Gly Glu Glu Ile Gln Glu Ser Leu Lys Thr Leu Glu
545                 550                 555                 560
Asn Gln Ser His Glu Thr Leu Glu Arg Glu Asn Gln Glu Cys Pro Arg
                565                 570                 575
Ser Leu Glu Glu Asp Leu Glu Thr Leu Lys Ser Leu Glu Lys Glu Asn
            580                 585                 590
Lys Arg Ala Ile Lys Gly Cys Gly Gly Ser Glu Thr Ser Arg Lys Arg
        595                 600                 605
Gly Cys Arg Gln Leu Lys Pro Thr Gly Lys Glu Asp Thr Gln Thr Leu
    610                 615                 620
Gln Ser Leu Gln Lys Glu Asn Gln Glu Leu Met Lys Ser Leu Glu Gly
625                 630                 635                 640
Asn Leu Glu Thr Phe Leu Phe Pro Gly Thr Glu Asn Gln Glu Leu Val
                645                 650                 655
Ser Ser Leu Gln Glu Asn Leu Glu Ser Leu Thr Ala Leu Glu Lys Glu
            660                 665                 670
Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Pro Glu Val Gly Asp Glu Glu Ala Leu
        675                 680                 685
Arg Pro Leu Thr Lys Glu Asn Gln Glu Pro Leu Arg Ser Leu Glu Asp
    690                 695                 700
Glu Asn Lys Glu Ala Phe Arg Ser Leu Glu Lys Glu Asn Gln Glu Pro
705                 710                 715                 720
Leu Lys Thr Leu Glu Glu Glu Asp Gln Ser Ile Val Arg Pro Leu Glu
                725                 730                 735
Thr Glu Asn His Lys Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Gln Asp Gln Glu
            740                 745                 750
Thr Leu Arg Thr Leu Glu Lys Glu Thr Gln Gln Arg Arg Arg Ser Leu
        755                 760                 765
Gly Glu Gln Asp Gln Met Thr Leu Arg Pro Pro Glu Lys Val Asp Leu
    770                 775                 780
Glu Pro Leu Lys Ser Leu Asp Gln Glu Ile Ala Arg Pro Leu Glu Asn
785                 790                 795                 800
Glu Asn Gln Glu Phe Leu Lys Ser Leu Lys Glu Glu Ser Val Glu Ala
                805                 810                 815
Val Lys Ser Leu Glu Thr Glu Ile Leu Glu Ser Leu Lys Ser Ala Gly
            820                 825                 830
Gln Glu Asn Leu Glu Thr Leu Lys Ser Pro Glu Thr Gln Ala Pro Leu
        835                 840                 845
Trp Thr Pro Glu Glu Ile Asn Lys Ser Gly Gly Asn Glu Ser Ser Arg
    850                 855                 860
Lys Gly Asn Ser Arg Thr Thr Gly Val Cys Gly Ser Glu Pro Arg Asp
865                 870                 875                 880
Ile Gln Thr Pro Gly Arg Gly Glu Ser Gly Ile Ile Glu Ile Ser Gly
                885                 890                 895
Ser Met Glu Pro Gly Glu Phe Glu Ile Ser Arg Gly Val Asp Lys Glu
            900                 905                 910
Ser Gln Arg Asn Leu Glu Glu Glu Glu Asn Leu Gly Lys Gly Glu Tyr
        915                 920                 925
Gln Glu Ser Leu Arg Ser Leu Glu Glu Glu Gly Gln Glu Leu Pro Gln
    930                 935                 940
Ser Ala Asp Val Gln Arg Trp Glu Asp Thr Val Glu Lys Asp Gln Glu
945                 950                 955                 960
Leu Ala Gln Glu Ser Pro Pro Gly Met Ala Gly Val Glu Asn Lys Asp
                965                 970                 975
Glu Ala Glu Leu Asn Leu Arg Glu Gln Asp Gly Phe Thr Gly Lys Glu
            980                 985                 990
Glu Val Val Glu Gln Gly Glu Leu Asn Ala Thr Glu Glu Val Trp Phe
        995                 1000                1005
Pro Gly Glu Gly His Pro Glu Asn Pro Glu Pro Lys Glu Gln Arg
    1010                1015                1020
Gly Leu Val Glu Gly Ala Ser Val Lys Gly Gly Ala Glu Gly Leu
    1025                1030                1035
Gln Asp Pro Glu Gly Gln Ser Gln Gln Val Gly Thr Pro Gly Leu
    1040                1045                1050
Gln Ala Pro Gln Gly Leu Pro Glu Ala Ile Glu Pro Leu val Glu
    1055                1060                1065
Asp Asp Val Ala Pro Gly Gly Asp Gln Ala Ser Pro Glu Val Met
    1070                1075                1080
Leu Gly Ser Glu Pro Ala Met Gly Glu Ser Ala Ala Gly Ala Glu
    1085                1090                1095
Pro Gly Leu Gly Gln Gly Val Gly Gly Leu Gly Asp Pro Gly His
    1100                1105                1110
Leu Thr Arg Glu Glu Val Met Glu Pro Pro Leu Glu Glu Glu Ser
    1115                1120                1125
Leu Glu Ala Lys Arg Val Gln Gly Leu Glu Gly Pro Arg Lys Asp
    1130                1135                1140
Leu Glu Glu Ala Gly Gly Leu Gly Thr Glu Phe Ser Glu Leu Pro
    1145                1150                1155
Gly Lys Ser Arg Asp Pro Trp Glu Pro Pro Arg Glu Gly Arg Glu
    1160                1165                1170
Glu Ser Glu Ala Glu Ala Pro Arg Gly Ala Glu Glu Ala Phe Pro
    1175                1180                1185
Ala Glu Thr Leu Gly His Thr Gly Ser Asp Ala Pro Ser Pro Trp
    1190                1195                1200
Pro Leu Gly Ser Glu Glu Ala Glu Glu Asp Val Pro Pro Val Leu
    1205                1210                1215
Val Ser Pro Ser Pro Thr Tyr Thr Pro Ile Leu Glu Asp Ala Pro
    1220                1225                1230
Gly Leu Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Gln Glu Ala Ser Trp Gly
    1235                1240                1245
Val Gln Gly Arg Ala Glu Ala Gly Lys Val Glu Ser Glu Gln Glu
    1250                1255                1260
Glu Leu Gly Ser Gly Glu Ile Pro Glu Gly Leu Gln Glu Glu Gly
    1265                1270                1275
Glu Glu Ser Arg Glu Glu Ser Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Thr
    1280                1285                1290
Leu Pro Asp Ser Thr Pro Leu Gly Phe Tyr Leu Arg Ser Pro Thr
    1295                1300                1305
Ser Pro Arg Trp Thr Pro Leu Glu Ser Arg Gly His Pro Leu Lys
    1310                1315                1320
Glu Thr Gly Lys Glu Gly Trp Asp Pro Ala Val Leu Ala Ser Glu
    1325                1330                1335
Gly Leu Glu Glu Pro Ser Glu Lys Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu
    1340                1345                1350
Glu Glu Cys Gly Arg Asp Ser Asp Leu Ser Glu Glu Phe Glu Asp
    1355                1360                1365
Leu Gly Thr Glu Ala Pro Phe Leu Pro Gly Val Pro Gly Glu Val
    1370                1375                1380
Ala Glu Pro Leu Gly Gln Val Pro Gln Leu Leu Leu Asp Pro Ala
    1385                1390                1395
Ala Trp Asp Arg Asp Gly Glu Ser Asp Gly Phe Ala Asp Glu Glu
    1400                1405                1410
Glu Ser Gly Glu Glu Gly Glu Glu Asp Gln Glu Glu Gly Arg Glu
    1415                1420                1425
Pro Gly Ala Gly Arg Trp Gly Pro Gly Ser Ser Val Gly Ser Leu
    1430                1435                1440
Gln Ala Leu Ser Ser Ser Gln Arg Gly Glu Phe Leu Glu Ser Asp
    1445                1450                1455
Ser Val Ser Val Ser Val Pro Trp Asp Asp Ser Leu Arg Gly Ala
    1460                1465                1470
Val Ala Gly Ala Pro Lys Thr Ala Leu Glu Thr Glu Ser Gln Asp
    1475                1480                1485
Ser Ala Glu Pro Ser Gly Ser Glu Glu Glu Ser Asp Pro Val Ser
    1490                1495                1500
Leu Glu Arg Glu Asp Lys Val Pro Gly Pro Leu Glu Ile Pro Ser
    1505                1510                1515
Gly Met Glu Asp Ala Gly Pro Gly Ala Asp Ile Ile Gly Val Asn
    1520                1525                1530
Gly Gln Gly Pro Asn Leu Glu Gly Lys Ser Gln His Val Asn Gly
    1535                1540                1545
Gly Val Met Asn Gly Leu Glu Gln Ser Glu Glu Ser Gly Ala Arg
    1550                1555                1560
Asn Ala Leu Val Ser Glu Gly Asp Arg Gly Ser Pro Phe Gln Glu
    1565                1570                1575
Glu Glu Gly Ser Ala Leu Lys Arg Ser Ser Ala Gly Ala Pro Val
    1580                1585                1590
His Leu Gly Gln Gly Gln Phe Leu Lys Phe Thr Gln Arg Glu Gly
    1595                1600                1605
Asp Arg Glu Ser Trp Ser Ser Gly Glu Asp
    1610                1615
<210>2
<211>4854
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>2
atggagggct gcatggggga ggagtcgttt cagatgtggg agctcaatcg gcgcctggag    60
gcctacctgg gccgggtcaa ggcgctggag gagcagaatg agctgctcag cgccggactc    120
ggggggctcc ggcgacaatc cgcggacacc tcctggcggg cgcatgccga cgacgagctg    180
gcggccctgc gtgcgctcgt tgaccaacgc tggcgggaga agcacgcggc cgaggtggcg    240
cgcgacaacc tggctgaaga gctggagggc gtggcaggcc gatgcgagca gctgcggctg    300
gcccgggagc ggacgacgga ggaggtagcc cgcaaccggc gcgccgtcga ggcagagaaa    360
tgcgcccggg cctggctgag tagccagggg gcagagctgg agcgcgagct agaggctcta    420
cgcgtggcgc acgaggagga gcgcgtcggt ctgaacgcgc aggctgcctg tgccccccgc    480
ctgcccgcgc cgccccggcc tcccgcgccg gccccggagg tagaggagct ggcaaggcga    540
ctgggcgagg cgtggcgcgg ggcagtgcgc ggctaccagg agcgcgtggc acacatggag    600
acgtcgctgg accagacccg cgagcgcctg gcccgggcgg tgcagggtgc ccgcgaggtc    660
cgcctggagc tgcagcagct ccaggctgag cgcggaggcc tcctggagcg cagggcagcg    720
ttggaacaga ggttggaggg ccgctggcag gagcggctgc gggctactga aaagttccag    780
ctggctgtgg aggccctgga gcaggagaaa cagggcctac agagccagat cgctcaggtc    840
ctggaaggtc ggcagcagct ggcgcacctc aagatgtccc tcagcctgga ggtggccacg    900
tacaggaccc tcctggaggc tgagaactcc cggctgcaaa cacctggcgg tggctccaag    960
acttccctca gctttcagga ccccaagctg gagctgcaat tccctaggac cccagagggc    1020
cggcgtcttg gatctttgct cccagtcctg agcccaactt ccctcccctc acccttgcct    1080
gctacccttg agacacctgt gccagccttt cttaagaacc aagaattcct ccaggcccgt    1140
acccctacct tggccagcac ccccatcccc cccacacctc aggcaccctc tcctgctgta    1200
gatgcagaga tcagagccca ggatgctcct ctcrctctgc tccagacaca gggtgggagg    1260
aaacaggctc cagagcccct gcgggctgaa gccagggtgg ccattcctgc cagcgtcctg    1320
cctggaccag aggagcctgg gggccagcgg caagaggcca gtacaggcca gtccccagag    1380
gaccatgcct ccttggcacc acccctcagc cctgaccact ccagtttaga ggctaaggat    1440
ggagaatccg gtgggtctag agtgttcagc atatgccgag gggaaggtga agggcaaatc    1500
tgggggttgg tagagaaaga aacagccata gagggcaaag tggtaagcag cttgcagcag    1560
gaaatatggg aagaagagga tctaaacagg aaggaaatcc aggactccca ggttcctttg    1620
gaaaaagaaa ccctgaagtc tctgggagag gagattcaag agtcactgaa gactctggaa    1680
aaccagagcc atgagacact agaaagggag aatcaagaat gtccgaggtc tttagaagaa    1740
gacttagaaa cactaaaaag tctagaaaag gaaaataaaa gagctattaa aggatgtgga    1800
ggtagtgaga cctctagaaa aagaggctgt aggcaactta agcctacagg aaaagaggac    1860
acacagacat tgcaatccct gcaaaaggag aatcaagaac taatgaaatc tcttgaaggt    1920
aatctagaga catttttatt tccaggaacg gaaaatcaag aattagtaag ttctctgcaa    1980
gagaacttag agtcattgac agctctggaa aaggagaatc aagagccact gagatctcca    2040
gaagtagggg atgaggaggc actgagacct ctgacaaagg agaatcagga acccctgagg    2100
tctcttgaag atgagaacaa agaggccttt agatctctag aaaaagagaa ccaggagcca    2160
ctgaagactc tagaagaaga ggaccagagt attgtgagac ctctagaaac agagaatcac    2220
aaatcactga ggtctttaga agaacaggac caagagacat tgagaactct tgaaaaagag    2280
actcaacagc gacggaggtc tctaggggaa caggatcaga tgacattaag acccccagaa    2340
aaagtggatc tagaaccact gaagtctctt gaccaggaga tagctagacc tcttgaaaat    2400
gagaatcaag agttcttaaa gtcactcaaa gaagagagcg tagaggcagt aaaatcttta    2460
gaaacagaga tcctagaatc actgaagtct gcgggacaag agaacctgga aacactgaaa    2520
tctccagaaa ctcaagcacc actgtggact ccagaagaaa taaataaatc agggggcaat    2580
gaatcctcta gaaaaggaaa ttcaagaacc actggagtct gtggaagtga accaagagac    2640
attcagactc ctggaagagg agaatcagga atcattgaga tctctgggag catggaacct    2700
ggagaatttg agatctccag aggagtagac aaggaaagtc aaaggaatct ggaagaggaa    2760
gagaacctgg gaaagggaga gtaccaagag tcactgaggt ctctggagga ggagggacag    2820
gagctgccgc agtctgcaga tgtgcagagg tgggaagata cggtggagaa ggaccaagaa    2880
ctggctcagg aaagccctcc tgggatggct ggagtggaaa ataaggatga ggcagagctg    2940
aatctaaggg agcaggatgg cttcactggg aaggaggagg tggtagagca gggagagctg    3000
aatgccacag aggaggtctg gttcccaggc gaggggcacc cagagaaccc tgagcccaaa    3060
gagcagagag gcctggttga gggagccagt gtgaagggag gggctgaggg cctccaggac    3120
cctgaagggc aatcacaaca ggtggggacc ccaggcctcc aggctcccca ggggctgcca    3180
gaggcgatag agcccctggt ggaagatgat gtggccccag ggggtgacca agcctcccca    3240
gaggtcatgt tggggtcaga gcctgccatg ggtgagtctg ctgcgggagc tgagccaggc    3300
ctggggcagg gggtgggagg gctgggggac ccaggccatc tgaccaggga agaggtgatg    3360
gaaccacccc tggaagagga gagtttggag gcaaagaggg ttcagggctt ggaagggcct    3420
agaaaggacc tagaggaggc aggtggtctg gggacagagt tctccgagct gcctgggaag    3480
agcagagacc cttgggagcc tcccagggag ggtagggagg agtcagaggc tgaggccccc    3540
aggggagcag aggaggcgtt ccctgctgag accctgggcc acactggaag tgatgcccct    3600
tcaccttggc ctctggggtc agaggaagct gaggaggatg taccaccagt gctggtctcc    3660
cccagcccaa cgtacacccc gatcctggaa gatgcccctg ggctccagcc tcaggctgaa    3720
gggagtcagg aggctagctg gggggtgcag gggagggctg aagctgggaa agtagagagc    3780
gagcaggagg agttgggttc tggggagatc cccgagggcc tccaggagga aggggaggag    3840
agcagagaag agagcgagga ggatgagctc ggggagaccc ttccagactc cactcccctg    3900
ggcttctacc tcaggtcccc cacctccccc aggtggaccc cactggagag cagaggccac    3960
cccctcaagg agactggaaa ggagggctgg gatcctgctg tcctggcttc cgagggcctt    4020
gaggaaccct cagaaaagga ggagggggag gagggagaag aggagtgtgg ccgtgactct    4080
gacctgtcag aagaatttga ggacctgggg actgaggcac cttttcttcc tggggtccct    4140
ggggaggtgg cagaacctct gggccaggtg ccccagctgc tactggatcc tgcagcctgg    4200
gatcgagatg gggagtctga tgggtttgca gatgaggaag aaagtgggga ggagggagag    4260
gaggatcagg aggaggggag ggagccaggg gctgggcggt gggggccagg gtcttctgtt    4320
ggcagcctcc aggccctgag tagctcccag agaggggaat tcctggagtc tgattctgta    4380
agtgtcagcg tcccctggga tgacagcttg aggggtgcag tggctggtgc ccccaagact    4440
gccctggaaa cggagtccca ggacagtgct gagccttctg gctcagagga agagtctgac    4500
cctgtttcct tggagaggga ggacaaagtc cctggccctc tagagatccc cagtgggatg    4560
gaggatgcag gcccaggggc agacatcatt ggtgttaatg gccagggtcc caacttggag    4620
gggaagtcac agcatgtaaa tgggggagta atgaacgggc tggagcagtc tgaggaaagt    4680
ggggcaagga atgcgctagt ctctgaggga gaccgaggga gcccctttca ggaggaggag    4740
gggagtgctc tgaagaggtc ttcggcaggg gctcctgttc acctgggcca gggtcagttc    4800
ctgaagttca ctcagaggga aggagataga gagtcctggt cctcagggga ggac          4854
<210>3
<211>2431
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
atggccggcg cccccggccc gctgcgcctt gcgctgctgc tgctcgggat ggtgggcagg    60
gccggccccc gcccccaggg tgccactgtg tccctctggg agacggtgca gaaatggcga    120
gaataccgac gccagtgcca gcgctccctg actgaggatc cacctcctgc cacagacttg    180
ttctgcaacc ggaccttcga tgaatacgcc tgctggccag atggggagcc aggctcgttc    240
gtgaatgtca gctgcccctg gtacctgccc tgggccagca gtgtgccgca gggccacgtg    300
taccggttct gcacagctga aggcctctgg ctgcagaagg acaactccag cctgccctgg    360
agggacttgt cggagtgcga ggagtccaag cgaggggaga gaagctcccc ggaggagcag    420
ctcctgttcc tctacatcat ctacacggtg ggctacgcac tctccttctc tgctctggtt    480
atcgcctctg cgatcctcct cggcttcaga cacctgcact gcaccaggaa ctacatccac    540
ctgaacctgt ttgcatcctt catcctgcga gcattgtccg tcttcatcaa ggacgcagcc    600
ctgaagtgga tgtatagcac agccgcccag cagcaccagt gggatgggct cctctcctac    660
caggactctc tgagctgccg cctggtgttt ctgctcatgc agtactgtgt ggcggccaat    720
tactactggc tcttggtgga gggcgtgtac ctgtacacac tgctggcctt ctcggtcttc    780
tctgagcaat ggatcttcag gctctacgtg agcataggct ggggtgttcc cctgctgttt    840
gttgtcccct ggggcattgt caagtacctc tatgaggacg agggctgctg gaccaggaac    900
tccaacatga actactggct cattatccgg ctgcccattc tctttggcat tggggtgaac    960
ttcctcatct ttgttcgggt catctgcatc gtggtatcca aactgaaggc caatctcatg    1020
tgcaagacag acatcaaatg cagacttgcc aagtccacgc tgacactcat ccccctgctg    1080
gggactcatg aggtcatctt tgcctttgtg atggacgagc acgcccgggg gaccctgcgc    1140
ttcatcaagc tgtttacaga gctctccttc acctccttcc aggggctgat ggtggccatc    1200
ttatactgct ttgtcaacaa tgaggtccag ctggaatttc ggaagagctg ggagcgctgg    1260
cggcttgagc acttgcacat ccagagggac agcagcatga agcccctcaa gtgtcccacc    1320
agcagcctga gcagtggagc cacggcgggc agcagcatgt acacagccac ttgccaggcc    1380
tcctgcagct gagactccag cgcctgccct ccctggggtc cttgctgcag gccgggtggc    1440
caatccagga gaagcagcct cctaatttga tcacagtggc gagaggagag gaaaaacgat    1500
cgctgtgaaa atgaggagga ttgcttcttg tgaaaccaca ggcccttggg gttcccccag    1560
acagagccgc aaatcaaccc cagactcaaa ctcaaggtca acggcttatt agtgaaactg    1620
gggcttgcaa gaggaggtgg ttctgaaagt ggctcttcta acctcagcca aacacagagc    1680
gggagtgacg ggagcctcct ctgcttgcat cacttggggt caccaccctc ccctgtcttc    1740
tctcaaaggg aagctgtttg tgtgtctggg ttgcttattt ccctcatctt gccccctcat    1800
ctcactgccc agtttctttt tgaggggctt tgtttgggcc actgccagca gctgtttctg    1860
gaaatggctg taggtggtgt tgagaaagaa tgagcattga gacggtgctc gcttctcctc    1920
caggtatttg agttgttttg gtgcctgcct ctgccatgcc cagagaatca gggcaggctt    1980
gccaccgggg aacccagccc tggggtatga gctgccaagt ctattttaaa gacgctcaag    2040
aatcctctgg ggttcatcta gggacacgtt aggaatgtcc agactgtggg tgtagattac    2100
ctgccacttc caggagccca gagggccaag agagacattg cctccacctc tccttggaaa    2160
tactttatct gtgaccacac gctgtctctt gagaatttgg atacactctc tagctttagg    2220
ggaccatgaa gagactctct tagggaaacc aatagtcccc atcagcacca tggaggcagg    2280
ctccccctgc ctttgaaatt cccccacttg ggagcttgta tatacttcac tcacttttct    2340
ttattgctgt gaatagtctg tgtgcacaat gggcaattct gacttctccc atctagtgga    2400
aatgagcgaa atcatggttg tagtgatgtt g                                   2431
<210>4
<211>463
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Met Ala Gly Ala Pro Gly Pro Leu Arg Leu Ala Leu Leu Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Met Val Gly Arg Ala Gly Pro Arg Pro Gln Gly Ala Thr Val Ser Leu
            20                  25                  30
Trp Glu Thr Val Gln Lys Trp Arg Glu Tyr Arg Arg Gln Cys Gln Arg
        35                  40                  45
Ser Leu Thr Glu Asp Pro Pro Pro Ala Thr Asp Leu Phe Cys Asn Arg
    50                  55                  60
Thr Phe Asp Glu Tyr Ala Cys Trp Pro Asp Gly Glu Pro Gly Ser Phe
65                  70                  75                  80
Val Asn Val Ser Cys Pro Trp Tyr Leu Pro Trp Ala Ser Ser Val Pro
                85                  90                  95
Gln Gly His Val Tyr Arg Phe Cys Thr Ala Glu Gly Leu Trp Leu Gln
            100                 105                 110
Lys Asp Asn Ser Ser Leu Pro Trp Arg Asp Leu Ser Glu Cys Glu Glu
        115                 120                 125
Ser Lys Arg Gly Glu Arg Ser Ser Pro Glu Glu Gln Leu Leu Phe Leu
    130                 135                 140
Tyr Ile Ile Tyr Thr Val Gly Tyr Ala Leu Ser Phe Ser Ala Leu Val
145                 150                 155                 160
Ile Ala Ser Ala Ile Leu Leu Gly Phe Arg His Leu His Cys Thr Arg
                165                 170                 175
Asn Tyr Ile His Leu Asn Leu Phe Ala Ser Phe Ile Leu Arg Ala Leu
            180                 185                 190
Ser Val Phe Ile Lys Asp Ala Ala Leu Lys Trp Met Tyr Ser Thr Ala
        195                 200                 205
Ala Gln Gln His Gln Trp Asp Gly Leu Leu Ser Tyr Gln Asp Ser Leu
    210                 215                 220
Ser Cys Arg Leu Val Phe Leu Leu Met Gln Tyr Cys Val Ala Ala Asn
225                 230                 235                 240
Tyr Tyr Trp Leu Leu Val Glu Gly Val Tyr Leu Tyr Thr Leu Leu Ala
                245                 250                 255
Phe Ser Val Phe Ser Glu Gln Trp Ile Phe Arg Leu Tyr Val Ser Ile
            260                 265                 270
Gly Trp Gly Val Pro Leu Leu Phe Val val Pro Trp Gly Ile val Lys
        275                 280                 285
Tyr Leu Tyr Glu Asp Glu Gly Cys Trp Thr Arg Asn Ser Asn Met Asn
    290                 295                 300
Tyr Trp Leu Ile Ile Arg Leu Pro Ile Leu Phe Gly Ile Gly Val Asn
305                 310                 315                 320
Phe Leu Ile Phe Val Arg Val Ile Cys Ile Val Val Ser Lys Leu Lys
                325                 330                 335
Ala Asn Leu Met Cys Lys Thr Asp Ile Lys Cys Arg Leu Ala Lys Ser
            340                 345                 350
Thr Leu Thr Leu Ile Pro Leu Leu Gly Thr His Glu Val Ile Phe Ala
        355                 360                 365
Phe Val Met Asp Glu His Ala Arg Gly Thr Leu Arg Phe Ile Lys Leu
    370                 375                 380
Phe Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ser Phe Gln Gly Leu Met val Ala Ile
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Cys Phe Val Asn Asn Glu Val Gln Leu Glu Phe Arg Lys Ser
                405                 410                 415
Trp Glu Arg Trp Arg Leu Glu His Leu His Ile Gln Arg Asp Ser Ser
            420                 425                 430
Met Lys Pro Leu Lys Cys Pro Thr Ser Ser Leu Ser Ser Gly Ala Thr
        435                 440                 445
Ala Gly Ser Ser Met Tyr Thr Ala Thr Cys Gln Ala Ser Cys Ser
    450                 455                 460
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>5
gcggggcggt gcgtgactac                                              20
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>合成引物
<400>6
aggcaagggg gaagagaagg atgt                                           24
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(35)
<223>合成引物
<400>7
aagctgaagc cgaatttcct tgggatacca gagga                               35
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>8
acagccagta cttcaagacc                                               20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>9
ctgtgtcagc acgcacgtta                                               20
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>10
tggattccac accaggcatt gaccatgcca                                      30
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>11
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<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>12
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<210>13
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<212>DNA
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(37)
<223>合成引物
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
<223>合成引物
<400>14
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
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<210>16
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<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(19)
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<213>人工序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(18)
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<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
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<211>20
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
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<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<212>DNA
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
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<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
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<221>misc feature
<222>(1)..(20)
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<220>
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<221>misc feature
<222>(1)..(30)
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<220>
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<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
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<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(31)
<223>合成引物
<400>34
ttgcactgga gaaggattac gtggcgttct a                                  31
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
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<212>DNA
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<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
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ttcgagatac aggcagatat                                               20
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>37
agttagactt ttatgtcctg cctgtgctca                                      30
<210>38
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>38
cttcaggctg caccaagtgt                                                 20
<210>39
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>39
gttgaccata gtcaggctgg                                                20
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>40
gtcagatgtg aagatggcca cagacccaga                                     30
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>41
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<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>42
caacgctgac atggaattcc                                                 20
<210>43
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>43
tcgaggtctc atggatcata cagaatcagg                                     30
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>44
caatgtgaga tgtctccagc                                                20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>45
ccttgtagat tgcaggcaga                                                20
<210>46
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>46
ggactcccat ccagtgtctc cagaagtgat                                     30
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>47
gagtagcagc tcagactgcc                                               20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>48
gtagacctct gggagctcct                                               20
<210>49
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>49
cgcagcactc agactacgtg cacctctgca                                    30
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>50
gcagctgctc aactaatcac                                               20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>51
tcagcagcac aagtcccact                                               20
<210>52
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>52
acgggcattc ttattagtca gattattggt                                     30
<210>53
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(16)
<223>合成引物
<400>53
aggcttcttc tacaca                                                    16
<210>54
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(16)
<223>合成引物
<400>54
caggctgcct gcacca                                                   16
<210>55
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(16)
<223>合成引物
<400> 55
aggcagagga cctgca                                                   16
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>56
gtgtggcggc caattactac                                               20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>合成引物
<400>57
cttggcaagt ctgcatttga                                               20
<210>58
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>合成引物
<400>58
ggatcttcag gctctacgtg agcataggct                                     30
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>合成引物
<400>59
gggtggtgag ggttgaggtt tgtg                                           24
<210>60
<211>2718
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>60
tttaggaacg caccgtgcac atgcttggtg gtcttgttaa gtggaaactg ctgctttaga    60
gtttgtttgg aaggtccggg tgactcatcc caacatttac atccttaatt gttaaagcgc    120
tgcctccgag cgcacgcatc ctgagatcct gagcctttgg ttaagaccga gctctattaa    180
gctgaaaaga taaaaactct ccagatgtct tccagtaatg tcgaagtttt tatcccagtg    240
tcacaaggaa acaccaatgg cttccccgcg acagcttcca atgacctgaa ggcatttact    300
gaaggagctg tgttaagttt tcataacatc tgctatcgag taaaactgaa gagtggcttt    360
ctaccttgtc gaaaaccagt tgagaaagaa atattatcga atatcaatgg gatcatgaaa    420
cctggtctca acgccatcct gggacccaca ggtggaggca aatcttcgtt attagatgtc    480
ttagctgcaa ggaaagatcc aagtggatta tctggagatg ttctgataaa tggagcaccg    540
cgacctgcca atttcaaatg taattcaggt tacgtggtac aagatgatgt tgtgatgggc    600
actctgacgg tgagagaaaa cttacagttc tcagcagctc ttcggcttgc aacaactatg    660
acgaatcatg aaaaaaacga acggattaac agggtcattc aagagttagg tctggataaa    720
gtggcagact ccaaggttgg aactcagttt atccgtggtg tgtctggagg agaaagaaaa    780
aggactagta taggaatgga gcttatcact gatccttcca tcttgttctt ggatgagcct    840
acaactggct tagactcaag cacagcaaat gctgtccttt tgctcctgaa aaggatgtct    900
aagcagggac gaacaatcat cttctccatt catcagcctc gatattccat cttcaagttg    960
tttgatagcc tcaccttatt ggcctcagga agacttatgt tccacgggcc tgctcaggag    1020
gccttgggat actttgaatc agctggttat cactgtgagg cctataataa ccctgcagac    1080
ttcttcttgg acatcattaa tggagattcc actgctgtgg cattaaacag agaagaagac    1140
tttaaagcca cagagatcat agagccttcc aagcaggata agccactcat agaaaaatta    1200
gcggagattt atgtcaactc ctccttctac aaagagacaa aagctgaatt acatcaactt    1260
tccgggggtg agaagaagaa gaagatcaca gtcttcaagg agatcagcta caccacctcc    1320
ttctgtcatc aactcagatg ggtttccaag cgttcattca aaaacttgct gggtaatccc    1380
caggcctcta tagctcagat cattgtcaca gtcgtactgg gactggttat aggtgccatt    1440
tactttgggc taaaaaatga ttctactgga atccagaaca gagctggggt tctcttcttc    1500
ctgacgacca accagtgttt cagcagtgtt tcagccgtgg aactctttgt ggtagagaag    1560
aagctcttca tacatgaata catcagcgga tactacagag tgtcatctta tttccttgga    1620
aaactgttat ctgatttatt acccatgagg atgttaccaa gtattatatt tacctgtata    1680
gtgtacttca tgttaggatt gaagccaaag gcagatgcct tcttcgttat gatgtttacc    1740
cttatgatgg tggcttattc agccagttcc atggcactgg ccatagcagc aggtcagagt    1800
gtggtttctg tagcaacact tctcatgacc atctgttttg tgtttatgat gattttttca    1860
ggtctgttgg tcaatctcac aaccattgca tcttggctgt catggcttca gtacttcagc    1920
attccacgat atggatttac ggctttgcag cataatgaat ttttgggaca aaacttctgc    1980
ccaggactca atgcaacagg aaacaatcct tgtaactatg caacatgtac tggcgaagaa    2040
tatttggtaa agcagggcat cgatctctca ccctggggct tgtggaagaa tcacgtggcc    2100
ttggcttgta tgattgttat tttcctcaca attgcctacc tgaaattgtt atttcttaaa    2160
aaatattctt aaatttcccc ttaattcagt atgatttatc ctcacataaa aaagaagcac    2220
tttgattgaa gtattcaatc aagttttttt gttgttttct gttcccttgc catcacactg    2280
ttgcacagca gcaattgttt taaagagata catttttaga aatcacaaca aactgaatta    2340
aacatgaaag aacccaagac atcatgtatc gcatattagt taatctcctc agacagtaac    2400
catggggaag aaatctggtc taatttatta atctaaaaaa ggagaattga attctggaaa    2460
ctcctgacaa gttattactg tctctggcat ttgtttcctc atctttaaaa tgaataggta    2520
ggttagtagc ccttcagtct taatacttta tgatgctatg gtttgccatt atttaataaa    2580
tgacaaatgt attaatgcta tactggaaat gtaaaattga aaatatgttg gaaaaaagat    2640
tctgtcttat agggtaaaaa aagccaccgt gatagaaaaa aaatcttttt gataagcaca    2700
ttaaagttaa tagaactt                                                  2718
<210>61
<211>655
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>61
Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn
1               5                   10                  15
Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Ala Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr
            20                  25                  30
Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu
        35                  40                  45
Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu
    50                  55                  60
Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg
                85                  90                  95
Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro
            100                 105                 110
Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp
        115                 120                 125
Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala
    130                 135                 140
Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg
145                 150                 155                 160
Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Iys Val Ala Asp Ser
                165                 170                 175
Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys
            180                 185                 190
Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe
        195                 200                 205
Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val
    210                 215                 220
Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe
225                 230                 235                 240
Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu
                245                 250                 255
Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu
            260                 265                 270
Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn
        275                 280                 285
Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala
    290                 295                 300
Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu
305                 310                 315                 320
Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr
                325                 330                 335
Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu
            340                 345                 350
Ser Gly Gly Glu Lys Lys Lys Lys Ile Thr Val Phe Lys Glu Ile Ser
        355                 360                 365
Tyr Thr Thr Ser Phe Cys His Gln Leu Arg Trp Val Ser Lys Arg Ser
    370                 375                 380
Phe Lys Asn Leu Leu Gly Asn Pro Gln Ala Ser Ile Ala Gln Ile Ile
385                 390                 395                 400
Val Thr Val Val Leu Gly Leu Val Ile Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Leu
                405                 410                 415
Lys Asn Asp Ser Thr Gly Ile Gln Asn Arg Ala Gly Val Leu Phe Phe
            420                 425                 430
Leu Thr Thr Asn Gln Cys Phe Ser Ser Val Ser Ala Val Glu Leu Phe
        435                 440                 445
Val Val Glu Lys Lys Leu Phe Ile His Glu Tyr Ile Ser Gly Tyr Tyr
    450                 455                 460
Arg Val Ser Ser Tyr Phe Leu Gly Lys Leu Leu Ser Asp Leu Leu Pro
465                 470                 475                 480
Met Arg Met Leu Pro Ser Ile Ile Phe Thr Cys Ile Val Tyr Phe Met
                485                 490                 495
Leu Gly Leu Lys Pro Lys Ala Asp Ala Phe Phe Val Met Met Phe Thr
            500                 505                 510
Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala
        515                 520                 525
Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys
    530                 535                 540
Phe Val Phe Met Met Ile Phe Ser Gly Leu Leu Val Asn Leu Thr Thr
545                 550                 555                 560
Ile Ala Ser Trp Leu Ser Trp Leu Gln Tyr Phe Ser Ile Pro Arg Tyr
                565                 570                 575
Gly Phe Thr Ala Leu Gln His Asn Glu Phe Leu Gly Gln Asn Phe Cys
            580                 585                 590
Pro Gly Leu Asn Ala Thr Gly Asn Asn Pro Cys Asn Tyr Ala Thr Cys
        595                 600                 605
Thr Gly Glu Glu Tyr Leu Val Lys Gln Gly Ile Asp Leu Ser Pro Trp
    610                 615                 620
Gly Leu Trp Lys Asn His Val Ala Leu Ala Cys Met Ile Val Ile Phe
625                 630                 635                 640
Leu Thr Ile Ala Tyr Leu Lys Leu Leu Phe Leu Lys Lys Tyr Ser
                645                 650                 655
1
34

Claims (90)

1.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；和
(b)将该干细胞转移进患者中，其中所述的干细胞分化形成产生胰岛素的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
5.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；和
(b)将该干细胞转移进患者中，其中所述的干细胞分化形成产生胰岛素的细胞。
6.如权利要求1或5所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述的干细胞的供体。
7.如权利要求1或5所述的方法，其中在转移步骤之前，在体外用一种下述试剂或其组合物处理干细胞：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
8.如权利要求1或5所述的方法，其中所述的转移步骤是通过内窥镜逆注射实现。
9.如权利要求1或5所述的方法，还含有下述步骤：
(c)免疫抑制剂治疗患者的步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述的免疫抑制剂从由FK-506、环孢子菌素和GAD65抗体组成的组中选择。
11.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；和
(c)将该祖细胞转移进患者中，其中祖细胞分化形成产生胰岛素的β细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophlin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
15.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；和
(c)将该祖细胞转移进患者中，其中祖细胞分化形成产生胰岛素的细胞。
16.如权利要求11或15所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述的干细胞的供体。
17.如权利要求11或15所述的方法，其中所述的扩增是在存在下述的一种试剂或其组合物的条件下实现的：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
18.如权利要求11或15所述的方法，其中所述的转移步骤是通过内窥镜逆注射实现。
19.如权利要求11或15所述的方法，还含有下述步骤：
(d)免疫抑制剂治疗患者的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述的免疫抑制剂从由FK-506、环孢子菌素和GAD65抗体组成的组中选择。
21.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；
(c)在培养基中分化该干细胞，形成假胰岛样的聚集体；和
(d)将该假胰岛样的聚集体转移进患者中。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
25.一种治疗糖尿病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；
(c)在培养基中分化该干细胞，形成假胰岛样的聚集体；和
(d)将该假胰岛样的聚集体转移进患者中。
26.如权利要求21或25所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述的干细胞的供体。
27.如权利要求21或25所述的方法，其中所述的扩增是在存在下述的一种试剂或其组合物的条件下实现的：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
28.如权利要求21或25所述的方法，其中所述的转移步骤是通过内窥镜逆注射实现。
29.如权利要求21或25所述的方法，还含有下述步骤：
(e)免疫抑制剂治疗患者的步骤。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述的免疫抑制剂从由FK-506、环孢子菌素和GAD65抗体组成的组中选择。
31.一种从胰岛分离干细胞的方法，包括以下步骤：
(a)从供体分离出胰岛；
(b)培养胰岛细胞；和
(c)在培养物中选择巢素阳性克隆。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述的巢素阳性克隆也是ABCG2阳性的。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述的巢素阳性克隆还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述的巢素阳性克隆不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
35.一种从胰岛分离干细胞的方法，包括以下步骤：
(a)从供体分离出胰岛；
(b)培养胰岛细胞；和
(c)在培养物中选择ABCG2阳性克隆。
36.如权利要求31或35所述的方法，其中所述培养首先在以伴刀豆球蛋白A涂层的培养皿中进行，然后在没有伴刀豆球蛋白A涂层的培养皿中进行。
37.如权利要求31所述的方法，还包括下述步骤：
(d)扩增巢素阳性克隆是在以下述的一种试剂或其组合物处理的条件下实现的：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
38.如权利要求35所述的方法，还包括下述步骤：
(d)扩增ABCG2阳性克隆是在以下述的一种试剂或其组合物处理的条件下实现的：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、betacellulin、活化素和TGF-β。
39.一种诱导巢素阳性胰腺干细胞分化成胰腺祖细胞的方法，它包括下述步骤：
以下述的一种试剂或其组合物处理巢素阳性胰腺干细胞：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、betacellulin、活化素和TGF-β，该巢素阳性胰腺干细胞由此分化成胰腺祖细胞。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
43.一种诱导ABCG2阳性胰腺干细胞分化成胰腺祖细胞的方法，它包括下述步骤：
以下述的一种试剂或其组合物处理ABCG2阳性胰腺干细胞：EGF、bFGF-2、高糖、KGF、HGF/SF、IDX-1、一种编码IDX-1的核酸分子、GLP-1、exendin-4(肠促胰岛素类似物)、betacellulin、活化素和TGF-β，该ABCG2阳性胰腺干细胞由此分化成胰腺祖细胞。
44.如权利要求39或43所述的方法，其中所述的胰腺祖细胞又形成假胰岛样的聚集体。
45.一种分离的巢素阳性人胰腺或肝的干细胞，它不是神经干细胞。
46.如权利要求45所述的干细胞，其中所述的干细胞也是ABCG2阳性的。
47.如权利要求45所述的干细胞，其中所述的干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
48.如权利要求45所述的干细胞，其中所述的干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
49.一种分离的ABCG2阳性人胰腺或肝的干细胞，它不是神经干细胞。
50.如权利要求49所述的干细胞，其中所述的干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
51.如权利要求49所述的细胞，其中所述的干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
52.如权利要求49所述的干细胞，其中所述的干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
53.如权利要求45或49所述的干细胞，它分化形成产生胰岛素的β细胞。
54.如权利要求45或49所述的干细胞，它分化形成产生高血糖素的α细胞。
55.如权利要求45或49所述的干细胞，它分化形成假胰岛样聚集体。
56.如权利要求45或49所述的干细胞，它分化形成肝细胞。
57.一种鉴别胰腺细胞为干细胞的方法，包括下述步骤：将胰腺细胞与一种标记的巢素特异抗体接触，如果该细胞被该抗体标记，那么该细胞就被鉴别为干细胞。
58.如权利要求57所述的方法，还含有下述步骤：将胰腺细胞与一种标记的能够与下述的一种标记相结合的抗体接触，如果该细胞被该抗体标记，那么该细胞就被鉴别为干细胞：
ABCG2、Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
59.如权利要求30所述的方法，还含有下述步骤：将该细胞与一种标记的细胞角蛋白-19特异抗体接触，如果该细胞未被该抗体标记，那么该细胞就被鉴别为干细胞。
60.如权利要求57所述的方法，还含有下述步骤：将该细胞与一种标记的胶原IV特异抗体接触，如果该细胞未被该抗体标记，那么该细胞就被鉴别为干细胞。
61.如权利要求57所述的方法，还含有下述步骤：将该细胞与一种标记的能够与下述的一种标记相结合的抗体接触，如果该细胞未被该抗体标记，那么该细胞就被鉴别为干细胞：
CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
62.一种诱导巢素阳性胰腺干细胞分化成肝细胞的方法，它包括下述步骤：
以有效量的能够诱导干细胞分化成肝细胞或能够分化成肝细胞的祖细胞的试剂处理巢素阳性胰腺干细胞。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
64.如权利要求1所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
65.如权利要求62所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
66.一种诱导ABCG2阳性胰腺干细胞分化成肝细胞的方法，它包括下述步骤：
以有效量的能够诱导干细胞分化成肝细胞或能够分化成肝细胞的祖细胞的试剂处理ABCG2阳性胰腺干细胞。
67.如权利要求62或66所述的方法，其中所述的试剂是环杷明。
68.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；和
(b)将该干细胞转移进患者中，其中所述的干细胞分化形成肝细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
70.如权利要求68所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
71.如权利要求68所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
72.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；和
(b)将该干细胞转移进患者中，其中所述的干细胞分化形成肝细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述的ABCG2阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
73.如权利要求68或72所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述干细胞的供体。
74.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；和
(c)将该祖细胞转移进患者中，其中祖细胞分化形成肝细胞。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
78.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；
(b)体外扩增该干细胞以产生祖细胞；和
(c)将该祖细胞转移进患者中，其中祖细胞分化形成肝细胞。
79.如权利要求74或78所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述干细胞的供体。
80.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；
(b)使该干细胞体外分化成肝细胞；和
(c)将该肝细胞转移进患者。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞也是ABCG2阳性的。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞还对下述的至少一种标记呈现阳性：Oct3/4、GLP-1受体、latrophilin(2型)、Hes-1、巢素、整合素亚单元α6、整合素亚单元β1、C-kit、MDR-1、SUR-1、Kir6.2。
83.如权利要求80所述的方法，其中所述的巢素阳性胰腺干细胞不表达下述的至少一种标记：CD34、CD45、CD133、MHC I型和MHC II型。
84.一种治疗肝病患者的方法，包括以下步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出ABCG2阳性胰腺干细胞；
(b)使该干细胞体外分化成肝细胞；和
(c)将该肝细胞转移进患者。
85.如权利要求80或84所述的方法，其中所述的患者作为步骤(a)中所述干细胞的供体。
86.一种药物组合物，它含有权利要求45的干细胞，其与生理上可以相容的载体相混合。
87.一种药物组合物，它含有权利要求46的干细胞，其与生理上可以相容的载体相混合。
88.一种药物组合物，它含有权利要求49的干细胞，其与生理上可以相容的载体相混合。
89.一种在哺乳动物器官移植之前预诱导免疫耐受状态的方法，它包括下述步骤：
(a)从供体的胰岛中分离出巢素阳性胰腺干细胞；
(b)将所述的巢素阳性胰腺干细胞移植到受体中；
(c)诱导供体干细胞在受体中的免疫耐受状态；和
(d)在不使用免疫抑制剂的条件下，从所述供体移植器官到所述受体中。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication