BRPI0923177A2

BRPI0923177A2 - usos de composições para tratar dor neuropática e espacidade, as referidas composições, e kit

Info

Publication number: BRPI0923177A2
Application number: BRPI0923177-3A
Authority: BR
Inventors: Brian C. Kramer; Uri Herzberg
Original assignee: Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc
Priority date: 2008-12-19
Filing date: 2009-12-19
Publication date: 2020-08-25
Also published as: ES2520393T3; WO2010071862A1; CA2747757C; JP2012512909A; PT2379087E; AU2009327382A1; EP2379087B1; EP2379087A1; JP5646502B2; DK2379087T3; US20190105351A9; US20100159025A1; CY1116344T1; CN102481321B; AU2009327382B2; CN102481321A; CA2747757A1; SI2379087T1

Abstract

USOS DE COMPOSIÇÕES PARA TRATAR DOR NEUROPÁTICA E ESPASTICIDADE, AS REFERIDAS COMPOSIÇÕES, E KIT. A presente invenção refere-se a métodos, que são fornecidos para tratar dor crônica, dor neuropática ou espasticidade. Algumas modalidade são para métodos para tratamento compreendendo administrar células obtidas de tecido de cordão umbilical humano, ou administrar composições farmacêuticas compreendendo tais células ou preparadas de tais células. Em algumas modalidades, a administração das células promove o reparo e regeneração de nervos no paciente para reduzir dor crônica, dor neuropática ou espasticidade. São também fornecidas composições farmacêuticas para uso nos métodos inventivos, bem como kits para praticar os métodos.

Description

: Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAS

DERIVADAS DE TECIDO DO CORDÃO UMBILICAL PARA TRATAR DOR NEUROPÁTICA E ESPASTICIDADE". . REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício para o Pedido de Patente Pro- É visória dos Estados Unidos nº 61/139.169, depositado em 19 de dezembro de 2008, os conteúdos do qual são incorporados por referência aqui em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a composições, mé- todos e Kkits para tratar dor neuropática por administração de células. Em particular, a invenção fornece administração de células localmente ou siste- micamente a um paciente para normalizar um estado inflamatório ou dege- nerativo ou de patologia do sistema nervoso. Tal patologia pode ser no meio ' 15 —subcelular, celular e tecidual, desse modo modificando as interações neuro- : nais e diminuindo a dor.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO Várias patentes e outras publicações são referidas ao longo da relatório descritivo. Cada destas publicações é incorporada por referência aqui em sua totalidade.

A dor crônica em geral é uma questão de saúde pública que afe- ta de 30 a 60% de todos os americanos. Na maioria dos casos, existe pouca ou nenhuma correlação entre descobertas de doenças objetivas (raio X, var- redura de MRI e CT da região da dor) e relatórios de dor subjetiva. A dor crônica inclui dor que persiste além do tempo de cicatrização normal para uma doença ou ferimento, dor relacionada com doença degenerativa crônica ou uma condição neurológica persistente, dor que emerge ou persiste, mesmo recorrendo durantes meses a anos sem uma causa identificável, ou dor associada com câncer.

A dor crônica é frequentemente causada por distúrbios do siste- ma nervoso, também conhecido como neuropatia ou dor neuropática. A dor neuropática é tipicamente acompanhada por lesão de tecido, incluindo fibras nervosas que são danificadas, desfuncionalizadas ou lesionadas. A dor neu- ropática pode ser causada por vários problemas, incluindo lesões patológi- cas, processos de neurodegeneração, ou disfunção prolongada de partes do . sistema nervoso periférico ou central. A dor neuropática pode também estar presente quando nenhum dano detectável pode ser avaliado ou definido.

Ã A literatura clínica e científica aponta para dor neuropática quan- do tendo dois componentes: plasticidade central e mudanças nos nervos centrais. A plasticidade central pode ser o resultado de mudanças na popu- lação de receptor ou sensibilidade do receptor em qualquer nível do CNS.

Além disso, há evidência que aponta para mudanças que ocorrem nos neu- rônios e em micróglia. De fato, dados recentes apontam para atividades mi- crogliais como um mediador importante de sensibilização central da medula espinhal. Tal sensibilização central é conhecida por apresentar um papel importante na mediação inflamatória crônica bem como dor neuropática. Na periferia, as mudanças em célula de Schwann - interação axonal são conhe- - cidas por apresentar um papel na indução e manutenção de dor neuropática.

O curso padrão de tratamento para dor crônica envolve um mé- todo de graduação por etapa que começa com analgésicos não opioide e progressos de opiatos moderados a opiatos potentes. Os opiatos são fre- quentemente usados em combinação com outros agentes. Desta forma, um médico é capaz de monitorar e ajustar a dose do agente para limitar os efei- tos colaterais indesejados de opioides, que inclui sedação, comprometimen- to cognitivo, mioclônus, vício, tolerância, e depressão respiratória. Entretan- to, os opioides podem também incluir náusea, constipação, confusão, de- pressão respiratória, e dependência. Além disso, a tolerância ao opiato é um efeito colateral bem documentado observado em pacientes com dor crônica. Outros agentes usados para tratar dor crônica incluem fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDs), que são tanto anti-inflamatórios quanto analgésicos, antidepressivos, anticonvulsivantes, agentes tópicos, canabinoides, toxina botulínica, antagonistas de NMDA, antiepilépicos, anti- depressivos e suplementos alimentares. Todos estes compostos, entretanto, têm efeito colateral que pode ser debilitante, incluindo depressão do CNS,

efeitos cardiovasculares, distúrbios gastrointestinais, ulceração, dano renal, libido diminuída e reações de hipersensibilidade. Além disso, estes compos- tos devem ser tomados repetidamente, tipicamente mais do que uma vez ao í: dia, e alguns compostos tornam-se ineficazes com o tempo, resultando em tolerância ao fármaco.

f Além disso, os tratamentos atuais são incapazes de aliviar dor em distúrbios neuropáticos crônicos clinicamente muito severos, tais como neuropatia diabética, radiculopatia cervical, amiotrofia nevrálgica, neuropatia de HIV, amiotrofia nevrálgica, ou neuralgia pós-herpética. Outras condições crônicas intratáveis para as estratégias médicas atuais estão associadas com ambas as dores periférica e/ou central tais como, lesão espinhal pós- medula, distrofia muscular, neuralgia trigeminal, dor do membro fantasma, síndrome da fibromialgia, causalgia, e polineuropatias diabéticas e alcoóli- . cas. A espasticidade de origem na medula espinhal, que resulta de esclero- se múltipla ou lesão da medula espinhal, é outra condição que frequente- ” mente resiste aos tratamentos atuais e que podem resultar em dor crônica. Atualmente, existe interesse em usar células transplantadas no sítio de dano neural para assistir no reparo ou reversão de dano celular neu- ral. Por exemplo, alguns pesquisadores têm células neurais transplantadas nosítio de lesão de um paciente com um distúrbio ou lesão da trilha neural sensória. Ver, Pedido de Patente dos Estados Unidos nº 09/163.684. Outros pesquisadores focam no transplante de células-troncos para reconstituir um tecido alvo, desse modo restaurando a funcionalidade fisiológica e anatômi- ca. Por exemplo, Klass administrou células mononucleares da medula con- tendo populações de célula-tronco a um modelo de dor neuropática para descobrir se a dor diminui. Veja, Klass e outro, Anesth Analg., 2007; 104:944 - 49. Um método confiável, viável de administração de células para reduzir dor neuropática não existe atualmente. Dada as limitações atuais no tratamento de dor crônica e neuro- pática, existe uma necessidade de aliviar dor crônica e neuropática em indi- víduos com tratamentos que não precisam ser administrados em uma base diária.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Os problemas apresentados são resolvidos pelas composições, métodos e kits das modalidades ilustrativas descritas aqui.

Estas modalida- . des fornecem métodos de tratar dor crônica e neuropática administrando-se uma população de células.

Embora não querendo estar preso a qualquer é mecanismo de ação, os inventores acreditam que as células administradas têm a capacidade de normalizar o meio celular e tecidual inflamatório ou de- generativo na célula de Schwann - interação axonal e/ou a micróglia - intera- ção neuronal para diminuir a dor.

Além disso, a administração de célula pode bloquear descarga neuronal ectópica, desse modo diminuindo a dor.

A pre- sente invenção é com base, pelo menos em parte, na descoberta de que células, incluindo células derivadas de tecido do cordão umbilical humano, podem ser administradas localmente ou sistemicamente a um paciente com necessidade de tratamento de dor crônica. í 15 As modalidades específicas da invenção são direcionadas ao . reparo direto, regeneração, substituição de, ou o suporte do reparo, regene- ração, ou substituição de células neurais do tratamento de dano, lesão e/ou dor neural.

Em outra modalidade, a invenção pertence ao método de tratar um indivíduo tendo dano, lesão e/ou dor neural administrando-se uma popu- lação de células em uma quantidade eficaz, de modo que o dano, lesão e/ou dor sejam tratados.

Em várias modalidades, as células administradas são células derivadas de tecido do cordão umbilical.

Em algumas modalidades, a população de células é administra- —dalocalmente à área de sítio de dor e/ou dano neural.

O sítio de administra- ção pode ser qualquer que seja determinado pelo profissional médico para ser mais eficaz, e desse modo pode ser proximal ou distal ao sítio de dor ou dano neural.

A administração de célula pode ser por qualquer meio, incluin- do, porém não limitado a, subcutânea, intradiscal, intraneural, ou intramuscu- lar, liberação por meio de seringas com agulhas e/ou catéteres, e implante com um líquido, hidrogel, ou andaime.

Além disso, em algumas modalidades específicas a população de células é administrada com um hidrogel.

Outras modalidades são de hidrogéis específicos, tais como colágeno, atelocoláge- no, constructos de fibrina, e constructos de trombina-fibrina. Além disso, al- gumas modalidades incluem o uso de um ou mais fatores de crescimento 7 injetados em paralelo, sequencialmente, ou formulados diretamente em um hidrogel.

Em outras modalidades, as células são administradas sistemi- camente. Nestas modalidades, as células podem ser administradas por qualquer meio que permita distribuição sistêmica das células, incluindo, po- rém não limitado a, liberação intramuscular, intravenoso, ou intra-arterial por meio de seringas com agulhas e/ou cateteres com ou sem dispositivos de bomba. Em algumas modalidades específicas a população de células é ad- ministrada com um hidrogel. Outras modalidades são de hidrogéis específi- cos, tais como colágeno, atelocolágeno, constructos de fibrina, constructos ã de trombina-fibrina. Além disso, algumas modalidades incluem o uso de um oumais fatores de crescimento injetados em paralelo, sequencialmente, ou . formulados diretamente em um hidrogel.

Em algumas modalidades, a população de células é induzida in vitro para se diferenciar de um tipo específico de célula. Em outras modali- dades, as células são geneticamente construídas para produzir um produto degene que promove tratamento de dor crônica.

Em algumas modalidades, as populações de células são admi- nistradas com pelo menos outro agente, incluindo, porém não limitado a, componentes da matriz extracelular selecionados, agentes antiapoptóticos, compostos anti-inflamatórios, agentes imunossupressores ou imunomodula- dores, anestésicos locais e outros fatores angiogênicos. O outro agente po- de ser administrado simultaneamente com, antes, ou após a população de células. Em uma modalidade, a composição também compreende pelo me- nos um dos agentes ou fatores selecionados do grupo que consiste em fato- res neurotróficos. Em uma modalidade, a população de células é administra- da com fatores de crescimento e/ou outros agentes que promovam a dife- renciação das células em uma célula neural desejada, predeterminada. Em outra modalidade, as células neurais desejadas são capazes de secretar um ou mais neurotransmissores. Outras modalidades da invenção caracterizam composições e kits para tratar um paciente com dor crônica compreendendo pelo menos . uma população de células e um veículo farmaceuticamente aceitável. Outras modalidades de composição e kit podem incluir outros agentes, fatores de crescimento, e compostos para promover o desenvolvimento e/ou cicatriza- ção do tecido, de modo que a dor crônica diminua em severidade ou exten- são. As composições farmacêuticas e kits são planejados e/ou formulados para praticar os métodos da invenção como delineado acima e abaixo.

Os objetivos, características, e vantagens das modalidades ilus- trativas tornar-se-ão evidentes com referência aos desenhos e descrição detalhada que seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS S A figura 1 é uma fotografia a cores mostrando disponibilidade de célula hUTC após quatro dias de implante em um constructo. A figura 2 é um gráfico mostrando o efeito da injeção local sobre os animais separados nos grupos de constructo, veículo e lesão. A figura 3 é um gráfico mostrando o efeito de injeção sistêmica sobre animais separados nos grupos de constructo, veículo e lesão.

A figura 4 é um gráfico mostrando os resultados com colágeno (Colbar). A administração foi realizada localmente ao lado afetado (esquer- do). A mudança de dor neuropática é (score em dia testado seguindo a ad- ministração - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100).

A figura 5 é um gráfico mostrando os resultados com colágeno (Colbar). A administração foi realizada localmente ao lado contralateral (di- reito). A mudança de dor neuropática é (score em dia testado seguindo a administração - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100).

A figura 6 é um gráfico mostrando os resultados com Evicel (O- mrix). A administração foi realizada localmente ao lado afetado (esquerdo). À mudança de dor neuropática é (score em dia testado seguindo a administra- ção - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100).

A figura 7 é um gráfico mostrando os resultados com Evicel (O-

mrix). A administração foi realizada localmente ao lado contralateral (direito). A mudança de dor neuropática é (score em dia testado seguindo a adminis- tração - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100). r A figura 8 é um gráfico mostrando os resultados de hUTC.

A administração foi sistêmica e a mudança de dor neuropática é (score em dia À testado seguindo a administração - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100). A figura 9 é um gráfico mostrando os resultados de hUTC.

A administração foi sistêmica e a mudança de dor neuropática é (score em dia testado seguindo a administração - score em dor neuropática/score em dor neuropática x 100). As figuras 10 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura 4. E As figuras 11 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura5. sa As figuras 12 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura 6. As figuras 13 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura 7. As figuras 14 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura 8. As figuras 15 de A a C contêm resultados estatísticos para a fi- gura 9. A figura 16 é uma representação esquemática de operação e tratamento para os procedimentos de teste no Exemplo 4. A figura 17 fornece o peso corporal médio dos grupos.

A figura 18 é o ganho de peso corporal após cirurgia de Chung e o tratamento de hUTC por administração sistêmica.

A figura 19 é a delta média da resposta de Von Frey.

O cálculo usado foi: média da perna direita menos a média da perna esquerda.

A figura 20 é a delta média da resposta de Von Frey de retirada de perna após a cirurgia de Chung a após a administração sistêmica de hUTC no dia 6 de estudo. A figura 21 é a delta média da resposta de Von Frey de retirada de perna após a cirurgia de Chung e a administração sistêmica de huTC em " 6 dias.

A figura 22 é o exame de Von Frey médio.

É A figura 23 é a diferença entre as patas (representada pelo Log de força de retirada mínimo da perna direita dividido pelo Log de força da perna esquerda) após a administração sistêmica de hUTC no dia 6 de estu- do seguindo a cirurgia de Chung.

As figuras 24 de A a C são tabelas de dados individuais de peso corporal individual.

As figuras 25 de A a C são tabelas de dados individuais de res- posta de Von Frey.

S DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Na descrição detalhada seguinte das modalidades ilustrativas, a referência é feita aos desenhos acompanhantes que formam uma parte da mesma. Estas modalidades são descritas com detalhe suficiente para permi- tir que aqueles versados pratiquem a invenção, e entende-se que outras modalidades podem ser utilizadas e que as mudanças estruturais, mecâni- cas, elétricas e químicas lógicas podem ser feitas sem afastamento do espí- rito ou escopo da invenção. Para evitar detalhe desnecessário para permitir que aqueles versados na técnica pratiquem as modalidades descritas aqui, a descrição pode omitir certa informação conhecida por aqueles versados na técnica. A seguinte descrição detalhada não é, portanto, tomada em um sen- tidolimitante. Para melhor esclarecer a invenção, as definições abaixo são fornecidas. Os termos "dor crônica” e "dor neuropática" como usado alterna- damente aqui geralmente referem-se às condições em que a dor persiste e — não responde ao tratamento convencional. Estes termos incluem dor de lon- ga duração e dor que pode ser medicamente refratária. Estes termos tam- bém incluem dor caracterizada por um aumento persistente no nível de exci-

tabilidade neural ou na presença de sensações anormais na área afetada. As condições de dor crônica exemplares incluem neuropatia diabética, radi- culopatia cervical, amiotrofia nevrálgica, neuropatia de HIV, amiotrofia ne- - vrálgica, neuralgia pós-herpética, lesão espinhal pós-medula, distrofia mus- cular, neuralgia trigeminal, dor do membro fantasma, causalgia, espasticida- É de de origem da medula espinhal, e polineuropatias diabéticas e alcoólicas.

Os termos "sítio tecidual," "dano neural," "lesão neural” e "sítio de dano neural" como usado aqui são intercambiáveis e geralmente referem- se a um ferimento ou defeito localizado sobre, dentro, ou adjacente ao tecido neural de um indivíduo; e podem incluir, porém não estão limitados a, tecido dérmico, tecido vascular, tecido conjuntivo, cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular, tendões ou ligamentos. Os termos podem também se referir às áreas de quaisquer tecidos que não estejam necessariamente feridos ou Y é defeituosos, porém sejam em vez disso áreas em que seja desejado adicio- —narou promover desenvolvimento de tecido adicional. O termo pode também ” se referir ao tecido nervoso que, embora não tendo nenhum dano aparente, observações clínicas, testes e relato de paciente indicam a presença de uma anormalidade.

Os termos "indivíduo," "paciente" ou "paciente" como usado aqui geralmente referem-se a qualquer forma de animal, incluindo mamíferos, tais como seres humanos e macacos, que são tratados com as composições farmacêuticas ou terapêuticas ou de acordo com os métodos descritos. O termo "xenogênico" como usado aqui se refere ao transplante de células de um doador de uma espécie para um paciente de uma espécie diferente.

Os termos "tratar," "tratando" ou "tratamento" como usado aqui geralmente se referem à melhora ou redução na dor ou lesão durante um período de tempo seguindo a administração de uma população de células a um paciente sofrendo de dor crônica. A melhora ou redução também inclui qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo tal como abatimento, remissão, diminuição de sintomas ou criação da lesão, patologia, ou condição mais tolerável ao paciente, diminuição na taxa de degeneração ou declínio, tor- nando o ponto final de degeneração menos debilitante, melhora do bem es-

tar físico ou mental do paciente, ou prolongamento do tempo de sobrevivên- cia. O tratamento ou melhora de sintomas pode ser com base em parâme- tros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico ou x exame neurológico.

Os termos "período eficaz," "período eficaz de tempo" ou "condi- Ê ções eficazes" referem-se a um período de tempo ou condições controláveis (por exemplo, temperatura, umidade para métodos in vitro), necessários ou preferidos para um agente ou composição farmacêutica obter o seu resulta- do pretendido.

O termo "quantidade eficaz" como usado aqui geralmente se re- fere a uma concentração ou quantidade de um composto, material, ou com- posição, como descrito aqui, que é eficaz para obter um resultado biológico particular. Tais resultados incluem, porém não são limitados a, a geração, S reparo, ou melhora de tecido neural, a melhora do fluxo de sangue, e/ou a diminuição da inflamação em pacientes com dor crônica. Tal atividade eficaz * pode ser obtida, por exemplo, administrando-se as células e/ou composições da presente invenção aos pacientes com dor crônica. Com relação à popula- ção de células como administrado a um paciente, uma quantidade eficaz é geralmente mais do que cerca de 10º células/kg em peso corporal, e pode variar de cerca de 10º células/kg em peso corporal a cerca de 10º célutas/kg em peso corporal quando liberada localmente, ou de cerca de 10º a cerca de 10” células/kg em peso corporal quando liberada sistemicamente. Em moda- lidades específicas, uma quantidade eficaz pode variar de cerca de 10º a cerca de 10º células/kg em peso corporal. Será apreciado que o número de célulasa serem administradas variará dependendo das especificidades do distúrbio a ser tratado, incluindo, porém não limitadas a, tamanho ou total do volume/área de superfície a ser tratado, e proximidade do sítio de adminis- tração ao local da região a ser tratada, entre outros fatores familiares ao bió- logo medicinal.

As "células-tronco" são células não diferenciadas definidas pela capacidade de uma única célula tanto autorrenovar-se, quanto diferenciar-se para produzir células descendentes, incluindo progenitores de autorrenova-

ção, progenitores não renováveis, e células terminalmente diferenciadas. As células-troncos são também caracterizadas por sua capacidade de se dife- renciar in vitro de células funcionais de várias linhagens celulares de múlti- õ plas camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), bem comodar origem a tecidos de múltiplas camadas germinativas após o trans- f plante, e contribuir substancialmente com a maioria, se não todos, dos teci- dos após a injeção em blastocistos.

As células-troncos são classificadas de acordo com seu potenci- al de desenvolvimento como: (1) totipotente; (2) pluripotente; (3) multipoten- te; (4) oligopotente; e (5) unipotente. As células totipotentes são capazes de dar origem a todos os tipos de células embrionárias e extra-embrionárias. As células pluripotentes são capazes de dar origem a todos os tipos embriôni- cos. As células multipotentes incluem aquelas capazes de dar origem a um S subgrupo de linhagens de célula, porém todas dentro de um tecido órgão, ou sistema fisiológico. Por exemplo, as células-troncos hematopoéticas (HSC) . podem produzir descendentes que incluem HSC (autorrenovável), progenito- res oligopotentes restritos às células sanguíneas, e todos os tipos e elemen- tos de célula (por exemplo, plaquetas) que são componentes normais do sangue. As células que são oligopotentes podem dar origem a um subgrupo mais restrito do que linhagens de células do que células-tronco multipoten- tes. As células que são unipotentes são capazes de dar origem a uma linha- gem de células (por exemplo, células-troncos espermatogênicas). As células-troncos são também categorizadas na base da fonte da qual elas são obtidas. Uma "célula-tronco adulta" é geralmente uma célu- lanão diferenciada multipotente encontrada em tecido compreendendo múl- tiplos tipos de célula diferenciada. A célula-tronco adulta pode se renovar sozinha. Em circunstâncias anormais, ela pode também se diferenciar para produzir os tipos de célula especializados do tecido do qual ela se originou, e possivelmente outros tipos de tecido. Uma "célula-tronco embrionária" é uma célula pluripotente do interior da massa de um embrião em estágio de blas- tocisto. Uma célula-tronco fetal é aquela que se origina de tecidos ou mem- branas fetais. Uma "célula-tronco pós-parto" é uma célula multipotente ou pluripotente que se origina substancialmente de tecido extra-embrionário disponível após o parto, isto é, a placenta e o cordão umbilical. Descobriu-se que estas células possuem aspectos característicos de células-troncos pluri- potentes, incluindo proliferação rápida e o potencial para diferenciação em muitaslinhagens de células. As células-troncos pós-parto podem ser deriva- das de sangue (por exemplo, como são aquelas obtidas de sangue do cor- dão umbilical) ou não derivadas de sangue (por exemplo, como obtido dos tecidos não sanguíneos do cordão umbilical e placenta).

Vários termos são usados para descrever as células em cultura.

"Culturade célula" refere-se geralmente a células retiradas de um organismo vivo e desenvolvidas sob condição de controle ("em cultura" ou "cultivadas"). Uma "cultura de célula primária" é uma cultura de células, tecidos, ou órgãos retirada diretamente de organismo(s) antes da primeira subcultura. As célu- é las são "expandidas" em cultura quando elas são colocadas em um meio de cultura sob condições que facilitam o desenvolvimento e/ou divisão celular, " resultando em uma população maior das células. Quando as células são expandidas em cultura, a taxa de proliferação celular é às vezes medida pela quantidade de tempo necessária para as células duplicarem em número. Isto é referido como "tempo de duplicação".

O termo "condições de desenvolvimento padrões," como usado aqui se refere à cultura de células a 37ºC, em uma atmosfera padrão com- preendendo 5% de CO, e umidade relativa mantida a cerca de 100%. Ao mesmo tempo em que as condições antecedentes são úteis para cultura, deve ser entendido que tais condições são capazes de ser variadas pelo técnico versado que apreciará as opções disponíveis na técnica para cultura de células.

Um "meio condicionado" é um meio em que uma célula específi- ca ou população de células foram cultivadas, e em seguida removidas. Quando as células são cultivadas em um meio, elas podem secretar os fato- res celulares que podem fornecer suporte trófico a outras células. Tais fato- res tróficos incluem, porém não são limitados a, hormônios, citocinas, matriz extracelular (ECM), proteínas, vesículas, anticorpos, e grânulos. O meio con-

tendo os fatores celulares é o meio condicionado. "Diferenciação" é o processo pelo qual uma célula não especiali- zada ("não comprometidas") ou menos especializada adquire as característi- f cas de uma célula especializada, tal como uma célula nervosa ou uma célula Ss muscular, por exemplo. Uma célula "diferenciada" é aquela que assumiu uma posição especializada ("comprometida") dentro da linhagem de uma célula. O termo "comprometido," quando aplicado ao processo de diferencia- ção, refere-se a uma célula que prosseguiu na trilha de diferenciação até um ponto onde, em circunstâncias anormais, ela continuará a diferenciar-se de um tipo de célula específica ou subgrupo de tipos de célula, e não poderá, em circunstâncias anormais, se diferenciar de tipo de célula diferente ou se reverter para um tipo de célula menos diferenciado. "Não diferenciação" refe- re-se a um processo pelo qual uma célula reverte-se para uma posição me- nos especializada (ou comprometida) dentro de uma linhagem de uma célu- la. Como usado aqui, a "linhagem" de uma célula define a hereditariedade ,: da célula, isto é, quais células vieram de e que células podem dar origem a. A linhagem de uma célula coloca a célula dentro de um esquema hereditário de desenvolvimento de diferenciação.

Em um sentido amplo, uma "célula progenitora" é uma célula quetema capacidade de criar descendentes que são mais diferenciados do que ela própria, e ainda mantém a capacidade de reabastecer a mistura de progenitores. Por essa definição, as próprias células-troncos são células progenitoras, como são os precursores mais imediatos às células terminal- mente diferenciadas. Quando se referindo às células da presente invenção, | 25 como descrito em maiores detalhes abaixo, esta ampla definição de célula progenitora pode ser usada. Em um sentido mais restrito, uma célula proge- nitora é frequentemente definida como uma célula que é intermediária na trilha de diferenciação, isto é, origina-se de uma célula-tronco e é intermediá- ria na produção de um tipo de célula madura ou subgrupo de tipos de célula. Este tipode célula progenitora não é geralmente capaz de autorrenovar-se. Consequentemente, se este tipo de célula for referido aqui, será referido como uma "célula progenitora não renovável" ou como uma "célula progeni-

tora ou precursora intermediária". Vários termos são usados aqui com relação a transplante de cé- lula ou tecido ou terapia de substituição de célula. Os termos "transferência autóloga," "transplante autólogo," "autoenxerto" e similares referem-se a tra- Ss tamentos em que o doador de célula ou transplante é também o recipiente de célula ou transplante. Os termos "transferência alogênica," "transplante alogênico," "aloenxerto" e similares referem-se a tratamentos em que o doa- dor de célula ou transplante é da mesma espécie como o recipiente, porém não é o mesmo indivíduo. Uma transferência celular em que as células do doador foram histocompativelmente emparelhadas com um recipiente é às vezes referida como uma "transferência singênica". Os termos "transferência xenogênica," "transplante xenogênico," "xenoenxerto" e similares referem-se a tratamentos em que o doador de célula ou transplante é de uma espécie : diferente do que o recipiente. Como usado aqui, a frase "célula neural" inclui ambas as células ” nervosas (isto é, neurônios, por exemplo, neurônios uni-, bi-, ou multipola- res) e seus precursores e células gliais (por exemplo, macróglia tais como oligodendrócitos, células de Schwann, e astrócitos, ou micróglia) e seus pre- Cursores.

As células usadas na presente invenção são geralmente referi- das como "células pós-parto” ou "células derivadas do pós-parto" (PPDC(s))." As células são mais especificamente "células derivadas do um- bigo " ou "célula derivadas do cordão umbilical" (UDC(s)), ou "células deri- vadas de tecido do cordão umbilical" (UTC(s)). Além disso, as células podem ser descritas como sendo células-troncos ou progenitoras, o último termo sendo usado no sentido mais amplo. O termo "derivado" é usado para indi- car que as células foram obtidas de sua fonte biológica e desenvolvida ou de outro modo manipulada in vitro (por exemplo, cultivada em um meio de cultu- ra para expandir a população e/ou produzir uma linhagem celular). As mani- pulações in vitrode células-troncos umbilicais a as características únicas das células derivadas do umbigo da presente invenção são descritas aqui em detalhes abaixo.

O termo "isolar" como usado aqui geralmente refere-se a uma célula que foi separada de seu ambiente natural. Este termo inclui separação física grosseira de seu ambiente natural, por exemplo, remoção do animal , doador. Em modalidades preferidas, uma célula isolada não está presente S em um tecido, isto é, a célula é separada ou dissociada das células vizinhas com as quais ela está normalmente em contato. Preferivelmente, as células são administradas como uma suspensão celular. Como usado aqui, a frase "suspensão celular" inclui células que estão em contato com um meio e que foram dissociadas, por exemplo, submetendo-se uma peça de tecido à tritu- ração suave.

Como usado aqui, o termo "meio de cultura" geralmente refere- se a um meio suficiente para a cultura de células derivadas de tecido do cor- dão umbilical. Em particular, um meio para o cultivo das células da invenção : compreende Meio Essencial modificado por Dulbecco (DMEM). DMEM — com baixo teor de glicose é particularmente preferido (DMEM-LG) (Invitro- : gen, Carisbad, Ca.). O DMEM-LG é preferivelmente suplementado com soro, mais preferivelmente soro bovino fetal ou soro humano. Tipicamente, 15% (volume/volume) de soro bovino fetal (por exemplo, soro bovino fetal defini- do, Hyclone, Logan Ut.) são adicionados, juntamente com antibióti- cos/antimicóticos (preferivelmente 100 Unidade/mililitro de penicilina, 100 microgramas/ímililitro de estreptomicina, e 0,25 micrograma/mililitro de anfo- tericina B; Invitrogen, Carisbad, Ca.), e 0,001% (volume/volume) 2- mercaptoetanol (Sigma, St. Louis Mo.). Em alguns casos, os diferentes mei- os de desenvolvimento são usados ou suplementações diferentes são forne- cidas,eestassão normalmente indicadas no texto como suplementações ao meio de cultura. Em certos meios quimicamente definidos as células podem ser desenvolvidas sem o soro estar presente em todos. Em tais casos, as células podem requerer certos fatores de crescimento, que podem ser adi- cionados ao meio para suportar e sustentar as células. Os fatores atualmen- te preferidos a serem adicionados para desenvolvimento em meios livre soro incluem um ou mais de bFGF, EGF, IGF-I, e PDGF. Em modalidades mais preferidas, dois, três ou todos os quatro fatores são adicionados aos meios quimicamente definidos ou livre de soro. Em outras modalidades, LIF é adi- cionado ao meio livre de soro para suportar ou melhorar o desenvolvimento das células.

O termo "linhagem de células" geralmente refere-se a uma popu- laçãode células formada por um ou mais subcultivos de uma cultura de célu- la primária. Cada ciclo de subcultura é referido como uma passagem. Quan- do as células são subcultivadas, elas são referidas como tendo sido "passa- das." Uma população específica de células, ou uma linhagem de células, é às vezes referida como ou caracterizada pelo número de vezes que foi pas- sada. Por exemplo, uma população de célula cultivada que foi passada dez vezes pode ser referida como uma cultura de P10O. A cultura primária, isto é, a primeira cultura após o isolamento de células de tecido, é designada PO. Seguindo a primeira subcultura, as células as células são descritas como : uma cultura secundária (P1 ou passagem 1). Após a segunda subcultura, as células tornam-se uma cultura terciária (P2 ou passagem T), e assim por f diante. Será entendido por aqueles versados na técnica que pode haver mui- tas duplicações de população durante o período de passagem; portanto, o número de duplicações de população de uma cultura é maior do que o nú- mero de passagem. A expansão de células (isto é, o número de duplicações de população) durante o período entre a passagem depende de muitos fato- res, incluindo, porém não limitados a, a densidade de semeadura, substrato, meio, condições de desenvolvimento, e o tempo entre a passagem. Os termos "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "meio far- maceuticamente aceitável," que podem ser usados alternadamente com os termos "veículo biologicamente compatível" ou "meio biologicamente compa- tível,|" geralmente referem-se a reagente, células, compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que não são apenas compatíveis com as células e outros agentes a serem administrados terapeuticamente, mas também são adequadas para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outra complicação comensurável com uma relação de benefício/risco razoá- vel. Como descrito com maior detalhe aqui, os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados para uso na presente invenção incluem líquidos, mate- riais semissólidos (por exemplo, géis) e sólidos (por exemplo, andaimes e matrizes celulares, tubos, folhas e outros tais materiais conhecidos na técni- À ca e descritos com maiores detalhes aqui). Estes materiais semissólidos e sólidos podem ser projetados para a degradação dentro do corpo (não de- gradáveis) ou eles podem ser projetados para se degradar dentro do corpo (biodegradáveis, biodesgastáveis). Um material biodegradável pode também ser biorreabsorvível ou bioabsorvível, isto é, pode ser dissolvido e absorvido em fluidos corporais (implantes solúveis em água são um exemplo), ou de- gradado e ultimamente eliminado do corpo, por conversão em outros materi- ais ou ruptura e eliminação através das trilhas naturais. A taxa de biodegra- dação pode variar de acordo com a taxa de liberação desejada logo que im- plantada no corpo.

: O termo "matriz" como usado aqui geralmente refere-se a mate- riais biodegradável e/ou biorreabsorvível que são administrados com as cé- : lulas a um paciente. A matriz pode agir como um andaime temporário até ser substituída por células desenvolvidas. Em algumas modalidades, a matriz pode fornecer liberação prolongada de fatores neurotróficos ou outros agen- tes usados juntamente com as células e pode fornecer uma estrutura para desenvolver o desenvolvimento de tecido no paciente. Em outras modalida- des, a matriz simplesmente fornece um andaime temporário para o desen- volvimento do tecido. A matriz pode ser em forma particulada (macropartícu- las maiores do que 10 mícrons em diâmetro ou micropartículas menores do que 10 mícron em diâmetro), ou pode ser na forma de um implante tridimen- sional, estruturalmente estável (por exemplo, um andaime). A matriz pode ser uma suspensão, hidrogel ou alternativamente uma estrutura tridimensio- nal tal como um cubo, cilindro, tubo, bloco, película, folha ou uma forma a- propriada anatômica. O termo "andaime" como usado aqui geralmente refere-se a uma estrutura porosa tridimensional que fornece um padrão para o desen- volvimento celular. Um andaime é feito de materiais biodegradáveis e/ou biorreabsorvíveis que se degradam durante o tempo dentro do corpo. O pe-

ríodo de tempo considerado para o andaime se degradar pode depender do peso particular dos materiais. Desse modo, material de peso molecular ele- vado pode resultar em andaimes de polímero que retêm sua integridade es- f trutural durante longos períodos de tempo; ao mesmo tempo em que pesos moleculares baixos resultam tanto em liberação mais lenta quanto vidas de andaime mais curta. O andaime pode ser feito por qualquer meio conhecido na técnica. Os exemplos de polímeros que podem ser usados para formar o andaime incluem polímeros sintéticos e naturais.

Em algumas modalidades da invenção, o andaime pode ser in- fundido com, revestido com, ou compreendido de uma população de células, fatores de crescimento, ou outros nutrientes para promover o desenvolvi- mento celular. Em algumas modalidades preferidas, o andaime contém a- gente de indução de desenvolvimento incluindo neurotrofinas. Além disso, os . agentes de indução de desenvolvimento podem ser sintéticos ou natural- mente produzidos, e podem ser um fragmento, derivado ou análogo de um f agente de indução de desenvolvimento.

"Fator neurotrófico" ou "fator trófico" é definido como uma subs- tância que promove a sobrevivência, desenvolvimento, proliferação e/ou ma- turação de uma célula, ou estimula a atividade aumentada de uma célula.

“MODALIDADES ESPECÍFICAS Em suas várias modalidades descritas aqui, a presente invenção caracteriza métodos e composições farmacêuticas para tratamento de dor crônica e neuropática. Estes métodos e composições farmacêuticas são pla- nejados para estimular e suportar o desenvolvimento ou cicatrização de teci- do neural, e melhorar a regeneração e reparo de tecidos em torno do tecido neural, incluindo porém não limitado a, tecido dérmico, tecido vascular, teci- do conjuntivo, cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular, tendões ou liga- mentos.

As células da invenção incluem, porém não são limitadas a, cé- lulas progenitoras e populações de células derivadas de tecidos pós-parto, tecido do umbigo em particular e similares. Uma explicação mais detalhada de células preferidas pode ser encontrada abaixo.

Células A descrição do isolamento e caracterização das células preferi- das da invenção são descritas nos Pedidos de Patente dos Estados Unidos T nº 2005/0032209, 2005/0058631 e 2005/0054098 que são incorporados em S suatotalidade.

Em algumas modalidades, as células são células-tronco. As cé- lulas-troncos são células não diferenciadas definidas pela capacidade de uma única célula tanto autorrenovar-se quanto diferenciar-se para produzir células descendentes, incluindo progenitores de autorrenovação, progenito- resde não renovação e células terminalmente diferenciadas.

Em uma modalidade preferida, as células-troncos são células derivadas de tecido do cordão umbilical. Para isolar as células derivadas de tecido do cordão umbilical, um cordão umbilical é recuperado no, ou após o E término de uma gravidez de tempo completo ou pré-termo, por exemplo, a- pósa expulsão ou após o nascimento. O tecido de cordão umbilical pode ser " transplantado do local do nascimento para um laboratório em um recipiente estéril tal como um frasco, béquer, placa de cultura, ou saco. O recipiente pode ter uma solução ou meio, incluindo, porém não limitado a, uma solução de sal, tal como Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (também conhecido como Meio Essencial Mínimo de Dubecco) ou solução salina tamponada por fosfato (PBS), ou qualquer solução usada para o transplante de órgãos usados para transplante, tal como solução University of Wisconsin ou solução perfluoroquímica. Um ou mais agentes antibióticos e/ou antimicó- ticos, tais como, porém não limitados a, penicilina, estreptomicina, anfoterici- naB,gentamicina, e nistatina, podem ser adicionados ao meio ou tampão. O tecido de cordão umbilical pode ser enxaguado com uma solução anticoagu- lante tal como solução contendo heparina. É preferível manter o tecido a cerca de 4 a cerca de 10ºC antes da extração das células. É ainda mais pre- ferível que o tecido não seja congelado antes da extração das células. As células derivadas de tecido do cordão umbilical são preferi- velmente isoladas em um ambiente assético. O cordão umbilical pode ser separado da placenta por meios conhecidos na técnica. O sangue e resíi-

duos são preferivelmente removidos do tecido pós-parto antes do isolamento de células derivadas de tecido do cordão umbilical.

Por exemplo, o tecido pós-parto pode ser lavado com solução de tampão, incluindo, porém não : limitada a, solução salina tamponada por fosfato.

O tampão de lavagem também pode compreender um ou mais agentes antimicóticos e/ou antibióti- cos, incluindo, porém não limitados a, penicilina, estreptomicina, anfotericina

B, gentamicina, e nistatina.

O tecido pós-parto compreendendo um umbigo inteiro ou um fragmento ou seção do mesmo é preferivelmente desagregado por força mecânica (forças de cisalhamento ou picagem). Em uma modalidade atual- mente preferida, o procedimento de isolamento pode também utilizar um processo de digestão enzimático.

Muitas enzimas são conhecidas na técnica por serem úteis para o isolamento de células individuais de matrizes tecidu- E ais complexas para facilitar o desenvolvimento em cultura.

As enzimas de digestão abrangem de fracamente digestivas (por exemplo, desoxirribonu- Cleases e a protease neutra, dispase) a fortemente digestivas (por exemplo, papaína e tripsina), e são comercialmente disponíveis.

Uma lista não exaus- tiva de tais enzimas inclui atividade enzimática mucolítica, metaloproteases, proteases neutras, serina proteases (tal como tripsina, quimotripsina, ou e- lastase), e desoxirribonucleases.

As atividades enzimáticas selecionadas de metaloproteases, proteases neutras e atividades mucolíticas são atualmente preferidas.

Por exemplo, as colagenases são conhecidas por serem úteis para isolar várias células de tecidos.

As desoxirribonucleases podem digerir DNA de filamento único e podem minimizar a formação de grumo celular durante o isolamento.

Os métodos preferidos envolvem tratamento enzimáti- co com colagenase e dispase, ou colagenase, dispase, e hialuronidase.

O técnico versado apreciará que muitos tais tratamentos enzimáticos são co- nhecidos na técnica por isolar células de várias fontes de tecido, e está bem guarnecido para avaliar enzimas novas ou adicionais ou combinações de enzima quanto sua capacidades de isolar as células da invenção.

Os trata- mentos enzimáticos preferidos podem ser de cerca de 0,5 a 2 horas ou mais.

Em outras modalidades preferidas, o tecido é incubado a 37ºC durante o tratamento enzimático da etapa de dissociação.

Os métodos para a seleção do meio de cultura mais apropriado, preparação do meio, e técnicas de cultura celular são bem conhecidos na : técnica e são descritos em várias fontes, incluindo Doyle e outro, (edições), 1995, Cell & Tissue Culture Laboratory Procecdures, John Wiley & Sons, Chichester; e Ho and Wang (edições), 1991, Animal Cell Biorreators, Butter- worth-Heinemann, Boston, que são incorporados aqui por referência.

Em algumas modalidades da invenção, as células são passadas ou removidas para um vaso de cultura separado contendo meio fresco do mesmo tipo ou um diferente como aquele usado inicialmente, onde a popu- lação de células pode ser mitoticamente expandida.

As células da invenção podem ser usadas em um ponto entre a passagem 0 e a senescência.

As células preferivelmente são passadas entre cerca de 3 e cerca de 25 vezes, - mais preferivelmente são passadas cerca de 4 a cerca de 12 vezes e prefe- rivelmente são passadas 10 ou 11 vezes.

A clonagem ou subclonagem pode " ser realizada para confirmar que uma população de células clonais foi isola- da.

Em alguns aspectos da invenção, os tipos de célula diferentes presentes em tecido pós-parto são fracionados em subpopulações das quais as células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser isoladas.

À fração ou Seleção pode ser realizada usando técnicas padrões para separa- ção celular.

Tais técnicas incluem, porém não são limitadas a, tratamento enzimático para dissociar o tecido pós-parto em suas células componentes, seguido por clonagem e seleção de tipos de célula específicos, incluindo, porém não limitada a, seleção com base em marcadores morfológicos e/ou bioquímicos; desenvolvimento seletivo de células desejadas (seleção positi- va), destruição seletiva de células indesejadas (seleção seletiva); separação com base em aglutinação celular diferencial na população mista como, por exemplo, com aglutinina de feijão de soja; procedimentos de congelamento e —descongelamento; propriedades de aderência diferenciais das células na população mista; filtragem; centrifugação convencional e zonal; elutriação centrífuga (centrifugação contra-corrente); separação de gravidade unitária;

distribuição contracorrente; eletroforese; e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).

O meio de cultura é mudado conforme necessário. Por exemplo, Í cuidadosamente aspirando-se o meio da placa com uma pipeta e substituin- do-secom meio fresco.

A incubação é continuada até um número ou densidade suficien- te de células acumularem-se na placa. Depois disso, qualquer seção de te- cido expandida original que existir pode ser removida e a células restantes separadas da placa por tripsinação usando técnicas padrões ou usando um —raspador celular. Após tripsinização as células são coletadas, removidas pa- ra meio fresco e incubadas como acima. Em algumas modalidades, o meio é mudado pelo menos uma vez em aproximadamente 24 horas após tripsini- zação para remover quaisquer células flutuantes. As células permanecentes : na cultura são consideradas ser células derivadas de tecido do cordão umbi- lical.

f As células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser criopreservadas. Consequentemente, em uma modalidade preferida descrita com maior detalhe abaixo, as células derivadas de tecido do cordão umbili- cal para transferência autóloga (para mão ou criança) podem ser derivadas de tecidos pós-parto apropriados após o nascimento de uma criança, em seguida criopreservadas de modo que estejam disponíveis para o evento que elas mais tarde são necessárias para o transplante.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser caracterizadas, por exemplo, por características de desenvolvimento (por exemplo, capacidade de duplicação de população, tempo de duplicação, passagens para a senescência), análise de cariótipo (por exemplo, cariótipo normal; linhagem materna ou neonatal), citometria de fluxo (por exemplo, análise de FACS), imuno-histoquímica e/ou imunocitoquímica (por exemplo, para detecção de epítopos), perfil de expressão gênica (por exemplo, as dis- posições de fragmento de gene; reação em cadeia da polimerase (por e- xemplo, PCR de transcriptase reversa, PCR em tempo real, e PCR conven- cional)), disposições de proteína, secreção de proteína (por exemplo, por ensaio ou análise de coagulação de plasma de meio condicionado por PDC, por exemplo, por ensaio de imunossorvente ligado à enzima (ELISA), reação de linfócito misturada (por exemplo, como meio de estimulação de PBMC's), E e/ou outros métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos de células derivadas de tecido do cordão umbilical foram depositados com a Coleção de Cultura do Tipo Americano em 10 de junho de 2004, e designados Números de acesso da ATCC como segue: (1) a designação de linhagem UMB 022803 (P7) foi designada acesso nº PTA- 6067; e (2) a designação de linhagem UMB 022803 (P17) foi designada a- cessonºPTA-6068.

Em várias modalidades, as células derivadas de tecido do cor- dão umbilical possuem uma ou mais das seguintes características de desen- volvimento: (1) elas requerem L-valina para desenvolvimento em cultura; (2) & elas são capazes de se desenvolver em atmosferas contendo oxigênio de cercade 5% a cerca de 20%; (3) elas têm o potencial de pelo menos cerca de 40 duplicações em cultura antes de atingir a senescência; e (4) elas ligam e dilatam vasos de cultura de tecido que são não revestidos ou que são re- vestidos com gelatina, laminina, colágeno, poliornitina, vitronectina ou fibro- nectina.

Em certas modalidades, as células derivadas de tecido do cor- dão umbilical possuem um cariótipo normal, que é mantido conforme as cé- lulas são passadas. Os métodos de cariotipagem são disponíveis e conheci- dos por aqueles versados na técnica.

Em outras modalidades, as células derivadas de tecido do cor- dão umbilical podem ser caracterizadas por produção de certas proteínas, incluindo: (1) produção de pelo menos uma de fator tecidual, vimentina, e alfa-actina do músculo liso; e (2) produção de pelo menos um de: marcado- res de superfície celular CD10, a capacidade de ligar-se e expandir-se em um vaso de cultura de tecido não revestido, CD44, CD73, CD90, PDGFr- alfa, PD-L2 e HLA-A,B,C, como detectado por citometria de fluxo. Em outras modalidades, as células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser caracterizadas pela falta de produção de pelo menos um de: marcadores de superfície celular CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CDI 17, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G, e HLA-DR,DP,DQ, como detectado por citometria de fluxo. Particularmente preferidas em algumas aplicações são células que produ- f zem pelo menos dois de: fator tecidual; vimentina; e alfa-actina do músculo liso Mais preferidas são aquelas células que produzem todas as três proteí- nas: fator tecidual; vimentina; e alfa-actina do músculo liso. Em outras modalidades, as células derivadas de tecido do cor- dão umbilical podem ser caracterizadas por expressão de gene relativa a uma célula humana que é um fibroblasto, uma célula-tronco mesenquimato- sa, ou uma medula óssea da crista iliíaca, que é aumentada para um gene codificando pelo menos uma de: interleucina 8; reticulon 1; ligante 1 de qui- miocina (motivo de C-X-C) (atividade estimulante de desenvolvimento de melonoma, alfa); ligante 6 de quimiocina (motivo de C-X-C) (proteína quimio- : tática de granulócito 2); ligante 3 de quimiocina (motivo de C-X-C); fator de necrose tumoral, alfa-proteína induzida 3; membro de superfamília da lectina ii do tipo C 2; Tumor de Wilms 1; membro da família aldeído desidrogenase A2 1; renina; receptor de lipoproteína de baixa densidade oxidada 1; clone |- MAGE de Homo sapiens: 4179671; proteína cinase C zeta; proteina hipotéti- ca DKFZp564F013; subregulado em câncer ovariano 1; e/ou gene de Homo sapiens de clone DKFZp547KI| 113.

Em ainda outras modalidades, as células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser caracterizadas por expressão de gene relativa a uma célula humana que é um fibroblasto, uma célula tronco mesenquimato- sa, ou uma medula óssea da crista iliaca, que é reduzida para um gene codi- ficando pelo menos uma de: homeocaixa na baixa estatura 2; proteina de choque térmico 27 KDa 2; ligante 12 quimiocina (motivo de C-X-C) (fator de- rivado de célula estromal 1); elastina (estenose aórtica supravalvular, sin- drome de Wiliams-Beurenj MRNA de Homo sapiens; cDNA DKFZp586M2022 (de clone DKFZp586M2022); homeocaixa 2 de mezên- — quima (homeocaixa de interrupção específica de desenvolvimento); homólo- go de homeocaixa sine oculis 1 (Drosophila); cristalina, alfa B; ativador de morfogênese 2 associado com disheveled; proteina DKFZP586B2420; simi-

lar à neuralina 1; tetranectina (proteína de ligação do plasminogênio); homo- logia três de src (SH3) e domínio rico em cisteina; colesterol 25-hidroxilase; fator 3 de transcrição relacionado a nanismo; receptor alfa de interleucina E 11; realçador de colágeno C-endopeptidase; homólogo 7 escrepado (Droso- phila); gene hipotético BCO08967; colágeno, tipo VIII, alfa 1; tenascina C (hexabraquion); proteina 5 de homeocaixa de iroquois; hefaestina; integrina, beta 8; glicoproteína da vesícula sináptica 2; neuroblastoma, supressão de tumorigenicidade 1; proteína ligada ao fator de crescimento tipo insulina 2, 36kDa; cDNA FLJ12280 fis de Homo sapiens, clone MAMMA 1001744; fator tiporeceptor de citocina 1; intermediário de potássio/canal ativado por cálcio de pequena condução, subfamília N, membro 4; integrina, beta 7; co- ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ); homólogo de ho- meocaixa sine oculis 2 (Drosophila); proteína KIAA 1034; proteína da mem- S brana associada à vesícula 5 (myobrevin); proteina 1 de matriz extracelular similar à fibulina contendo EGF; resposta de crescimento inicial 3; homeo- a caixa 5 menos distal; proteína hipotética FLJ20373; família 1 de aldo-ceto reductase, membro C3 (hidroxiesteroide desidrogenase 3-alfa, tipo 11); bigli- cano; co-ativador transcricional com motivo de ligação PDZ (TAZ); fibronec- tina 1; proencefalina; integrina, tipo beta 1 (com domínios de repetição tipo EGF); clone EUROIMAGE 1968422 de cDNA de inserção de comprimento total de MRNA de Homo sapiens mRNA; EphA3; proteína KIAA0O367; recep- tor C de peptídeo natriurético/guanilato ciclase C (receptor C de peptídeo atrionatriurético); proteína hipotética FLJ14054; mRNA de Homo sapiens; CDNA DKFZp564B222 (de clone DKFZp564B222); BCL2/tipo proteina 3 de interação de 19kDa de EIB adeno vírus; proteína 1 de ligação AE; e/ou poli- peptídeo 1 de subunidade Villa citocromo c oxidase (músculo).

Em outras modalidades, as células derivadas de tecido do cor- dão umbilical podem ser caracterizadas por secreção de pelo menos um de: MCP-I; IL-6; 11-8; GCP-2; HGF; KGF; FGF; HB- EGF; BDNF; TPO; MIPIa; —RANTES; e TIMPI. Em algumas modalidades, as células derivadas de tecido do cordão umbilical podem ser caracterizadas por uma falta de secreção de pelo menos um de: TGF-beta2; ANG2; PDGFbb; MIPIb; 1309; MDC; e

VEGF, como detectado por ELISA.

Em algumas modalidades preferidas, as células derivadas de te- cido do cordão umbilical são derivadas de tecido de cordão umbilical subs- ] tancialmente livre de sangue, são capazes de autorrenovação e expansão S em cultura, requerem L-valina para desenvolvimento, podem se desenvolver em pelo menos cerca de 5% de oxigênio, e compreendem pelo menos uma das seguintes características: (1) o potencial para pelo menos cerca de 40 duplicações em cultura; (2) a capacidade de se ligar e se expandir em um tecido um tecido a capacidade de se ligar e expandir-se em um vaso de cul- tura de tecido não revestido e revestido com gelatina, laminina. Colágeno, poliornitina, vitronectina, ou fibronectina; (3) produção de vimentina e alfa- actina do músculo liso; (4) produção de CD10, CD13, CD44, CD73, e CD90; e (5) expressão de um gene, que com relação a uma célula humana que é : um fibroblasto, uma célula tronco mesenquimatosa, ou uma medula óssea dacristailiaca, é aumentada para um gene codificando interleucina 8 e reti- E culon 1. Em algumas modalidades, tais células derivadas do tecido do cor- dão umbilical não produzem CD45 e CDI 17.

Em modalidades preferidas, a célula compreende dois ou mais do desenvolvimento listado acima, produção de marcador de superfi- cie/proteina, expressão de gene ou características de secreção de substân- cia. Mais preferidas, são aquelas células compreendendo três, quatro, cinco ou mais das características. Ainda mais preferidas são as células derivadas de tecido do cordão umbilical compreendendo seis, sete, oito ou mais das características. Ainda mais preferidas atualmente são as células compreen- — dendotodas as características acima.

Entre as células que são atualmente preferidas para uso com a invenção em vários dos seus aspectos são as células derivadas de tecido do cordão umbilical tendo as características descritas acima e mais particular- mente aquelas em que as células têm cariótipos normais e mantêm carióti- pos normais com passagem, e também em que as células expressam cada dos marcadores CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, e HLA- A,B,C, e em que as células produzem as proteínas imunologicamente inden-

tificáveis que correspondem aos marcadores listados. Ainda mais preferidas são aquelas células que, além das anteriores, não produzem proteínas cor- respondentes a quaisquer dos marcadores CD31, CD34, CD45, CDI 17, CD ” 141, ou HLA-DR,DP,DQ, como detectado por citometria de fluxo.

Ss Certas células tendo o potencial de se diferenciar entre linha- gens levando a vários fenótipos são instáveis e desse modo podem espon- taneamente diferenciar-se. Atualmente preferidas para uso com a invenção são células que não se diferenciam espontaneamente, por exemplo, ao lon- go do mioblasto, músculo esqueletal, músculo liso vascular, periscito, linha- gens hemangiogênicas, angiogênicas, vasculogênicas, ou endoteliais vascu- lares. As células preferidas, quando desenvolvidas em meio de cultura, são substancialmente estáveis com relação aos marcadores celulares produzi- dos sua superfície, e com relação ao padrão de expressão de vários genes, ê por exemplo, como determinado usando um teste de diagnóstico médico vendido sob o nome comercial GENECHIP (Affymetrix, Inc., Santa Clara, fg CA). As células permanecem substancialmente constantes, por exemplo, em suas características de marcador de superfície na passagem e através de múltiplas duplicações de população.

Outro aspecto da invenção caracteriza o uso de populações das células derivadas de tecido do cordão umbilical descritas acima. Em algu- mas modalidades, a população celular é heterogênea. Uma população celu- lar heterogênea da invenção pode compreender pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% de células deri- vadas de tecido do cordão umbilical da invenção. As populações celulares —heterogêneas da invenção podem também compreender células-troncos ou outras células progenitoras, tais como mioblastos ou outras células progeni- toras musculares, hemangioblastos, ou células precursoras do vaso sanguí- neo; ou podem também compreender células do músculo esqueletal total- mente diferenciadas, células do músculo liso, periscitos, ou células endoteli- aisdo vaso sanguíneo. Em algumas modalidades, a população é substanci- almente homogênea, isto é, compreende substancialmente apenas células derivadas de tecido do cordão umbilical (preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais células derivadas de tecido do cordão um- bilical). A população celular homogênea da invenção pode compreender cé- lulas derivadas do umbigo. As populações homogêneas de células derivadas f do umbigo são preferivelmente livre de células de linhagem materna. A ho- .5 — mogeneidade de uma população celular pode ser obtida por qualquer méto- do conhecido na técnica, por exemplo, por classificação celular (por exem- plo, citometria de fluxo) ou por expansão clonal de acordo com métodos co- nhecidos. Desse modo, as populações de células derivadas do tecido do cordão umbilical homogêneas preferidas podem compreender uma linhagem celular clonal de células derivadas de tecido do cordão umbilical. Tais popu- lações são particularmente úteis quando um clone de célula com funcionali- dade altamente deseja foi isolado.

Em uma modalidade, as células são células derivadas de tecido S: do cordão umbilical que são administradas como células não diferenciadas, isto é, como cultivado em meio de cultura. Alternativamente, as células deri- Ê vadas de tecido do cordão umbilical podem ser administradas seguindo ex- posição em cultura a condições que estimulem a diferenciação com respeito a um tecido neural desejado. Em uma modalidade preferida, as células são UTC. Em outra modalidade, as células são huTC.

Além disso, a população de células pode incluir mais do que um tipo de célula. De fato, algumas modalidades incluem a administração de células que circundam e suportam a célula neural. Tais células podem inclu- ir, porém não estão limitadas a, tecido dérmico, tecido vascular, tecido con- juntivo, cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular, tendões ou ligamentos.

O protocolo geral, isolamento e caracterização de uma célula de- rivada de um tecido do cordão umbilical, pode ser encontrado nos exemplos de5a15.

Células Modificadas Geneticamente As células usadas na invenção podem também ser genetica- mente modificadas para produzir produtos de gene terapeuticamente úteis, produzir agentes para facilitar ou suportar a formação de tecido neural, cica- trização e/ou crescimento, ou produzir fatores para recrutar células progeni-

toras para a área de dano neural. A modificação genética pode ser realizada usando quaisquer de vários fatores incluindo, porém não limitados a, integração de vetores veto- É res virais, por exemplo, vetor retrovírus ou vetores virais adenoassociados; .5 vetores de replicação não integrantes, por exemplo, vetores de papilomavi- rus, vetores SV40, vetores adenovirais; ou vetores virais de replicação defei- tuosa. Outros métodos de introduzir DNA nas células inclui o uso de lipos- somas, eletroporação, uma pistola de partícula, ou por injeção de DNA dire- ta.

Por exemplo, as células podem ser geneticamente construídas para expressar e/ou secretar uma molécula diferente (por exemplo, uma mo- lécula heteróloga não normalmente feita pela célula) ou modificar a produção de uma molécula para tratar dor crônica. Tais moléculas podem ser produzi- E das pelas células sob introdução de moléculas de ácido nucleico heterogê- —neas usando técnicas que são bem-conhecidas na técnica.

À Em uma modalidade, as células da invenção podem ser modifi- cadas para expressar um receptor para um neurotransmissor. Em outra mo- dalidade, as células da invenção são modificadas para produzir um neuro- transmissor, incluindo, porém não limitado a, serotonina, histamina, ácido gama aminobutírico, glutamato, aspartato, glicina, neuropeptídeo Y, ATP, GRP, adenosina, epinefrina, neuroepinefrina, dopamina, acetilcolina, mela- tonina, n-acetilaspartilglutamato, octapamina, tiramina, gastrina, colecitocini- na, vasopressina, oxitocina, neurofisina | e Il, polipeptídeo pancreático, pep- tídeo YY, corticotrofina, dinorfina, endorfina, encefalina, secretina, motilina, —glucagons, peptídeo intestinal vasoativo, fator de liberação de hormônio de crescimento, somatostatina, neurocinina A e B, substância P, bombesina, peptídeo de liberação gástrica, óxido nítrico, monóxido de carbono, e anan- damida. Em ainda outra modalidade, as células da invenção são modificadas para produzir um fragmento de um neurotransmissor, incluindo, porém não limitadoa,um fragmento do C terminal ou N terminal.

Em outra modalidade uma molécula diferente realça a capacida- de neurorregenerativa das células transplantadas, auxilia no restabelecimen-

to da comunicação sensorial de interneurônios GABA, e/ou auxilia no resta- belecimento do equilíbrio neurotransmissor balanço excitatório/inibidor no paciente. , Em ainda outra modalidade, as células são geneticamente cons- truídas para expressar e/ou secretar moléculas diferentes que diretamente reduzem a dor no paciente, promovem o sucesso do transplante (por exem- plo, por submodulação de uma resposta imune no paciente), e/ou promovem sobrevivência ou função das células transplantadas. As moléculas exempla- res incluem, por exemplo, um fator neurotrófico, ou um agente neuroprotetor. Em ainda outra modalidade, as células modificadas ou não mo- dificadas podem ser introduzidas junto com outros tipos de células geneti- camente modificadas para realizar uma função útil. Por exemplo, para pro- mover o desenvolvimento de neurônios, as células podem ser administradas junto com outras células que secretam ou foram modificadas para secretar, porexemplo, um fator neurotrófico. Os exemplos de células que agem como É veículos de transgenes para um paciente incluem fibroblastos, células cro- mafins adrenais, astrócitos, e mioblastos. Tais células, por exemplo, fibro- blastos e células gliais, podem também ser usadas para liberar retrovírus contendo genes tais como o gene timidina cinase de herpes simples, os pro- dutos de gene dos quais são alvos para outros fármacos ou agentes tera- pêuticos tais como ganciclovir para células-alvo.

As células hospedeiras podem ser transformadas ou transfecta- das com DNA controlado por, ou em associação operativa com, um ou mais elementos de controle de expressão apropriados tais como sequências de promotor ou realçador, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, entre outros, e um marcador selecionável. Qualquer promotor pode ser usa- do para direcionar a expressão do gene inserido. Por exemplo, os promoto- res virais incluem, porém não são limitados a, o promotor/realçador de CMV, SV 40, papilomavírus, vírus Epstein-Barr ou o promotor do gene de elastina.

Em algumas modalidades, os elementos de controle usados para controlar a expressão do gene de interesse podem permitir a expressão regulada do gene de modo que o produto seja sintetizado apenas quando necessário in vivo. Se a expressão transitória for desejada, os promotores constitutivos são preferivelmente usados em um vetor não integrante e/ou de replicação defeituosa. Alternativamente, os promotores induzíveis podem ser usados f para direcionar a expressão do gene inserido quando necessário. Os promo- tores induzíveis incluem, porém não são limitados a, aqueles associados com metalotioneína e proteínas de choque térmico.

Após a introdução do DNA estranho, as células construídas po- dem ser deixadas se desenvolver em meios enriquecidos e em seguida co- mutadas para meios seletivos. O marcador selecionável no DNA estranho confere resistência à seleção e permite as células estáveis integrar o DNA estranho como, por exemplo, em um plasmídeo, em seus cromossomos e se desenvolver para formar focos que, sucessivamente, podem ser clonados e expandidos em linhagens celulares. Estes métodos podem ser vantajosa- ; mente usados para planejar as linhagens de célula que expressam o produto dogene.

: As células da invenção podem ser geneticamente construídas expressão "nocaute" ou "derrubamento" de fatores que promovem a infla- mação ou rejeição no sítio de implante. As técnicas moduladoras negativas para a produção de níveis de expressão alvo ou níveis de atividade de pro- dutode gene-alvo são discutidas abaixo. "Modulação negativa", como usado aqui, refere-se a uma redução no nível e/ou atividade de produto de gene- alvo em relação ao nível e/ou atividade do produto de gene-alvo na ausência do tratamento modulador. A expressão de um gene nativo de uma célula do músculo esqueletal, célula do músculo liso vascular, periscito, célula endote- lial vascular, célula neural, ou células progenitoras das mesmas pode ser reduzida ou nocauteada usando várias técnicas incluindo, por exemplo, ini- : bição de expressão por inativação do gene usando a técnica de recombina- ção homóloga. Tipicamente, um exon codificando uma importante região da proteína (ou um exon 5' para aquela região) é interrompido por um marcador — selecionável positivo, por exemplo, neo, prevenindo a produção de mMRNA normal do gene-alvo e resultando na inativação do gene. Um gene pode também ser inativado criando-se uma deleção em parte de um gene, ou de-

letando-se o gene inteiro. Usando-se um constructo com duas regiões de homologia ao gene que são partes distantes no genoma, as sequências in- tervindo nas duas regiões podem ser deletadas (Mombaerts e outro, Proc. ; Nat. Acad. ScL Estados Unidos da América, 1991; 88:3084). DNAzimas, ri- bozimas, RNA de interferência pequeno (siRNA) e outras tais moléculas an- tissentido que inibem a expressão do gene-alvo podem também ser usadas para reduzir o nível de atividade de gene-alvo. Por exemplo, as moléculas de RNA antissentido que inibem a expressão de complexos principais de gene de histocompatibilidade (HLA) foram mostradas ser mais versáteis com res- peito a respostas imunes. Ainda, além disso, as moléculas de hélice tripla podem ser utilizadas na redução do nível de atividade de gene-alvo. Estas técnicas são descritas em detalhe por Davis, L.g. e outro, (edições), Basic Methods in Molecular Biology, 2º edição, 1994, Appleton & Lange, Norwalk, E ct.

Em outros aspectos, a invenção utiliza lisados de célula e fra- f ções solúveis de células preparadas das células derivadas de tecido do cor- dão umbilical. Tais lisados e frações dos mesmos têm muitas utilidades. O uso de tais frações solúveis de lisado (isto é, substancialmente livre de membranas) in vivo, por exemplo, permite que o ambiente intracelular bené- ficoseja usado alogenicamente em um paciente sem introduzir uma quanti- dade apreciável das proteínas de superfície celular mais provável de causar rejeição, ou outras respostas imunológicas adversas. Os métodos de causar lise em células são bem conhecidos na técnica e incluem vários meios de ruptura mecânica, ruptura enzimática, ou ruptura química, ou combinações dos mesmos. Tais lisados de célula podem ser preparados a partir de célu- las diretamente em seu meio de cultura, e desse modo conter os fatores de crescimento secretados e similares, ou eles podem ser preparados a partir células lavadas livre de meio em, por exemplo, PBS outra solução. As célu- las lavadas podem ser novamente suspensas em concentrações maiores do queadensidade de população original se preferido. Em uma modalidade, os lisados de célula total são preparados, por exemplo, rompendo-se as células sem separação subsequente de fra-

ções de célula. Em outra modalidade, uma fração de membrana celular é separada de uma fração solúvel das células por métodos de via conhecidos na técnica, por exemplo, centrifugação, filtragem, ou métodos similares. . Os lisados de célula ou frações solúveis de célula preparados de .5 — populações de células derivadas de pós-parto podem ser usados no estado em que se encontra, também concentrados por, por exemplo, ultrafiltragem ou liofilização, ou ainda secados, parcialmente purificados, combinados com veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis como são conhecidos na técnica, ou combinados com outros compostos tais como biológicos, por e- xemplo, composições de proteína farmaceuticamente úteis. Os lisados de célula ou frações dos mesmos podem ser usados in vitro ou in vivo, sozinhos ou, por exemplo, com células vivas autólogas ou singênicas. Os lisados, se : introduzidos in vivo, podem ser introduzidos localmente em um sítio de tra- , tamento, ou remotamente para fornecer, por exemplo, fatores de crescimen- to celular necessários a um paciente.

" Em outra modalidade, uma UTC pode ser cultivada in vitro para produzir produtos biológicos em alta produção. Uma célula derivada do teci- do do cordão umbilical que naturalmente produzem um produto biológico particular de interesse (por exemplo, um fator trófico), ou que foram geneti- camente construídas para produzir tal efeito biológico, podem ser clonalmen- te expandidas usando as técnicas de cultura descritas aqui. Alternativamen- te, as células podem ser expandidas em um meio que induz a diferenciação a uma célula neural. Em cada caso, os produtos biológicos produzidos pela célula e secretados no meio podem ser facilmente isolados do meio condi- cionado usando técnicas de separação padrões, por exemplo, tais como precipitação de proteína diferencial, cromatografia de permuta de fon, cro- matografia de filtragem em gel, eletroforese, e HPLC, para designar alguns. Um "biorreator" pode ser usado para aproveitar o método de fluxo para ali- mentação, por exemplo, uma cultura tridimensional in vitro. Essencialmente, como o meio fresco é passado através da cultura tridimensional, o produto biológico é lavado fora da cultura e pode em seguida ser isolado a partir do escoamento, como acima.

Alternativamente, um produto biológico de interesse pode per- manecer dentro da célula e, desse modo, sua coleção pode exigir que as células sejam lisadas, como descrito acima.

T Em outras modalidades, a invenção utiliza meio condicionado de células derivadas de tecido do cordão umbilical cultivadas para uso in vitro e in vivo como descrito abaixo.

O uso do meio condicionado de células deriva- das de tecido do cordão umbilical permite que os fatores tróficos benéficos secretados pelas células derivadas de tecido do cordão umbilical sejam usa- dos alogenicamente em um paciente sem introduzir células intactas que po- dem causar rejeição, ou outras respostas imunológicas adversas.

O meio condicionado é preparado por cultura de células em um meio de cultura, em seguida removendo as células do meio.

O meio condicionado preparado de populações de células deri- . vadas do cordão umbilical pode ser usado no estado em que se encontra, também concentrado, por exemplo, por ultrafiltragem ou liofilização, ou ainda f secado, parcialmente purificado, combinado com veículos ou diluentes far- maceuticamente aceitáveis como são conhecidos na técnica, ou combinados com outros compostos tais como biológicos, por exemplo, composições de proteína farmaceuticamente úteis.

O meio condicionado podem ser usado in vitroouin vivo, sozinho ou combinado com células vivas autólogas ou sin- gênicas, por exemplo.

O meio condicionado, se introduzido in vivo, pode ser introduzido localmente em um sítio de tratamento, ou remotamente para for- necer fatores tróficos ou de crescimento celular necessários a um paciente.

Em outra modalidade, uma matriz extracelular (ECM) produzida por cultura das células derivadas de tecido do cordão umbilical em substra- tos líquidos, sólidos ou semissólidos é preparada, coletada e utilizada como uma alternativa ao implante de células vivas em um paciente com necessi- dade do reparo, substituição, ou regeneração de células neurais.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical são cultivadas in vitro, em uma es- trutura tridimensional como descrito aqui em outro lugar, sob condições de modo que uma quantidade de ECM seja secretada sobre a estrutura.

As cé- lulas compreendendo o tecido novo são removidas, e a ECM processada para outro uso, por exemplo, como uma preparação injetável.

Para realizar isto, as células sobre a estrutura são mortas e qualquer resíduo é removido da estrutura.

Este processo pode ser realizado de várias maneiras diferen- tes.

Por exemplo, o tecido vivo pode ser submetido ao congelamento flash .5 em nitrogênio líquido sem crioconservante, ou o tecido pode ser imerso em água destilada estéril de modo que as células rompam em resposta à pres- são osmótica.

Assim que as células forem mortas, as membranas podem ser rompidas e o resíduo celular removido por tratamento com um enxaguadela de detergente suave, tais como EDTA, CHAPS ou um detergente zwitteriôni- co.

Alternativamente, o tecido pode ser enzimaticamente digerido e/ou extra- ido com reagentes que quebram as membranas celulares e permitem a re- moção de conteúdos celulares.

Os exemplos de tais enzimas incluem, po- . rém não são limitados a, hialuronidase, dispase, proteases, e nucleases.

Os exemplos de detergentes incluem detergentes não iônicos tais como, por f exemplo, álcool alquilaril poliéter (TRITON X-IOO), polietóxi-etanol de octil- fenóxi (Rohm and Haas, Filadélfia, Pa.), BRIJ-35, um éter de laurila de polie- toxietanol (Atlas Chemical Co., San Diego, Ca.), polissorbato 20 (TWEEN 20), um monolaurato de sorbitol de polietoxietanol (Rohm and Haas, Filadél- fia Pa), éter de laurila de polietileno (Rohm and Haas, Filadélfia, Pa.); e de- tergentes iônicos tais como dodecil sulfato de sódio, álcoois alifáticos superi- ores sulfatados, alcanos sulfonados e alquilarenos sulfonados contendo de 7 a 22 átomos de carbono em uma cadeia ramíificada ou não ramiíficada.

A coleção da ECM pode ser realizada de várias maneiras, de- —pendendo pelo menos, em parte, se o tecido novo foi formado em uma estru- tura tridimensional que é biodegradável ou não biodegradável, como no caso de metais.

Por exemplo, se a estrutura for não biodegradável, a ECM pode ser removida submetendo-se a estrutura a sonicação, jatos de água de alta pressão, raspagem mecânica, tratamento suave com detergentes ou enzi- —mas,ou qualquer combinação dos referidos acima.

Se a estrutura for biodegradável, a ECM pode ser coletada, por exemplo, permitindo-se a estrutura degradar-se ou dissolver-se em solução.

Alternativamente, se a estrutura biodegradável for composta de um material que possa sozinho ser injetado juntamente com a ECM, a estrutura e a ECM podem ser processadas in toto para injeção subsequente.

Alternativamente, ã a ECM pode ser removida da estrutura biodegradável por quaisquer dos mé- .5 todos descritos acima para coleção de ECM de uma estrutura não biodegra- dável.

Todos os processos de coleção são preferivelmente planejados de modo que não desnature a ECM.

Após ter sido coletada, a ECM pode ser processada também.

Por exemplo, a ECM pode ser homogenizada para partículas finas usando técnicas bem-conhecidas na técnica tal como sonicação, de modo que ela passe através de uma agulha cirúrgica.

Os componentes da ECM podem também ser reticulados, se desejado, irradiação gama.

Preferivelmente, a ECM pode ser irradiada entre 0,25 a 2 mega rads para esterilizar e reticular S a ECM.

A reticulação química usando agentes que são tóxicos, tal como glu- taraldeído, é possível, porém não geralmente preferida.

É As quantidades e/ou relações de proteínas, tais como os vários tipos de colágeno presente na ECM, podem ser ajustadas misturando-se a ECM produzida pelas células da invenção com a ECM de um ou mais outros tipos de célula.

Além disso, as substâncias biologicamente ativas tais como proteínas, fatores de crescimento e/ou fármacos, podem ser incorporadas na ECM.

As substâncias biologicamente ativas exemplares incluem fatores de crescimento teciduais, tais como TGF-beta, e similares, que promovem a cicatrização e reparo do tecido no sítio da injeção.

Tais agentes adicionais podem ser utilizados em quaisquer das modalidades descritas aqui acima, por exemplo, com lisados de célula total, frações de célula solúveis, ou ou- tros componentes e produtos produzidos pelas células derivadas de tecido do cordão umbilical.

Cultura de Célula As células isoladas podem ser usadas para iniciar, ou semear, — culturas de células.

As células isoladas são transferidas para vasos de cultu- ra de tecido estéreis não revestidos ou revestidos com matrizes extracelula- res ou ligantes tais laminina, colágeno (nativo, desnaturado ou reticulado),

gelatina, fibronectina, e outras proteinas de matriz extracelular.

As células são cultivadas em qualquer meio de cultura capaz de sustentar o desenvol- vimento das células tais como, porém não limitado a, DMEM (glicose alta ou q baixa), DMEM avançado, DMEM/MCDB 201, Meio essencial de Eagle, meio FIO deHam (FIO), meio F-12 de Ham (F12), meio de Dulbecco modificado de Iscove, meio de cultura de célula-tronco mesenquimatosa (MSCGM), DMEM/F12, RPMI 1640, e meio livre de soro/meios vendido sob o nome comercial CELL-GRO-FREE (Mediatech, Inc., Herndon, Va.). O meio de cul- tura pode ser suplementado com um ou mais componentes incluindo, por exemplo, soro bovino fetal (FBS), preferivelmente cerca de 2 a 15% (volu- me/volume); soro equino (ES); soro humano (HS); beta-mercaptoetanol (BME ou 2-ME), preferivelmente cerca de 0,001% (volume/volume); um ou mais fatores de crescimento, por exemplo, fator de crescimento derivado das ã plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de cresci- mento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Ê fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-I), fator inibidor de leucóci- to (LIF) e eritropoetina (EPO); aminoácidos, incluindo L-valina; e um ou mais agentes antibióticos e/ou antimicóticos para controlar contaminação microbi- ana, tais como penicilinag, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, genta- miícina,e nistatina, sozinhos ou em combinação.

O meio de cultura preferi- velmente compreende meio de cultura, (por exemplo, DMEM - com baixo teor de glicose, soro, BME e um agente antibiótico). As células são semeadas em vasos de cultura em uma densida- de para permitir o cultivo de célula.

Em uma modalidade preferida, as células são cultivadas a cerca de O a cerca de 5 por cento por volume de CO» no ar.

Em algumas modalidades preferidas, as células são cultivadas a cerca de 2 a cerca de 25 por cento de O, no ar, preferivelmente cerca de 5 a cerca de 20 por cento de O; no ar.

As células preferivelmente são cultivadas em uma temperatura de cerca de 25 a cerca de 40ºC e mais preferivelmente são cul- tivadasa37ºC.As células são preferivelmente cultivadas em um incubador.

O meio no vaso de cultura pode ser estático ou agitado, por exemplo, usan- do um biorreator.

Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob estresse oxidativo baixo (por exemplo, com adição de glutationa, vitamina C, catalase, vitamina E, N-acetilcisteína). "estresse oxidativo baixo", como usa- do aqui, refere-se a condições de nenhum ou mínimo dano de radical livre às ' células cultivadas.

S Administração Local Para todas as modalidades, a um indivíduo tendo dor neuropáti- ca é administrada uma população de células em uma quantidade eficaz para tratar a dor.

As modalidades específicas da invenção são direcionadas à administração local de uma população de células para reparo direto, regene- ração, substituição de, ou o suporte do reparo, regeneração, ou substituição de células neurais para o tratamento de dano, lesão e/ou dor neural.

As composições administradas ao indivíduo incluem uma população de células, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

Tais composições podem ser usadas em Kkits para preparar, usar, e praticar tais métodos e composições farmacêuticas como descrito e exemplificado aqui.

Os kits podem também É conter disposítivos para ajudar a facilitar a administração da população de células, tais como, por exemplo, agulhas, tubos, micropipetas, e similares.

Em uma modalidade, o kit compreende pelo menos uma população de célu- las, um constructo e um dispositivo de injeção.

Além disso, em algumas mo- 20: dalidades, os kits podem também ser acoplados com dispositivos de image- amento que indicam a colocação de substrato das células.

As células podem ser também modificadas para emitir uma energia que permite a detecção da colocação das células.

Em uma modalidade, a população de células é administrada lo- calmente à área de sítio de dor e/ou dano neural, ou ao sítio da patologia ou anormalidade que media a dor.

O sítio de administração pode ser qualquer sítio determinado pelo profissional médico para ser mais eficaz, e desse mo- do pode ser próximo ou distal ao sítio de dor ou dano neural.

A administra- ção de célula pode ser administrada por qualquer meio que coloque as po- — pulações de células próximas ou distais ao sítio, incluindo cateter, seringa, desvio, stent, microcateter, bomba, implante com um dispositivo ou implante com um andaime.

As composições farmacêuticas compreendendo a população de células podem ser formuladas como líquidos, semissólidos (por exemplo, géis) ou sólidos (por exemplo, matrizes, andaimes e similares, como apro- ' priado pra planejamento de tecido do músculo esqueletal ou vascular).

As composições líquidas são formuladas para administração por qualquer via aceitável conhecida na técnica para obter liberação da popula- ção de células para os tecidos neurais alvos. Tipicamente, estas incluem injeção ou infusão, em um modelo de difusão, ou alvejada ao sítio de lesão isquêmica periférica, dano, ou angústia, por uma via de administração inclu- indo, porém não limitada a, liberação intramuscular, intravenosa, ou intra- arterial por meio de seringas com agulhas e/ou cateteres com ou sem dispo- sitivos de bomba.

Por exemplo, em uma modalidade, a população de células é - administrada por injeção esterotáxica direta, por exemplo, agulhas. A agulha pode ter qualquer tamanho para facilitar o movimento de células através do á buraco vazio. A agulha pode ser inserida diretamente através da pele no sí- tio de tecido de interesse, ou alternativamente a agulha pode se usada como um dispositivo para facilitar a orientação da agulha para o sítio do tecido, tal como, por exemplo, um fio-guia. A agulha e o dispositivo de orientação po- dem ser pré-montados ou entregues ao médico treinado; o médico treinado pode montar o dispositivo exatamente antes do ou durante o uso.

Em uma modalidade alternada, um cateter de liberação pode ser usado para liberar a população de células em um dispositivo de liberação que facilite a introdução, por exemplo, injeção das células nos pacientes.

Tais dispositivos de liberação incluem tubos, por exemplo, cateteres, para injetar células e fluídos no corpo de um paciente receptor. Em uma modali- dade, as células da invenção podem ser introduzidas no paciente em um local desejado usando uma micropipeta. As células da invenção podem ser inseridas em um dispositivo de liberação, por exemplo, uma micropipeta ou seringa, na forma de uma solução, por exemplo, uma suspensão de célula. Além disso, as células da invenção podem ser administradas em um canal de orientação (por exemplo, canais de orientação de poliacrilonitri-

la/polivinilcloreto (PAN/PVC)), tais como aqueles descritos no Bunge e outro, J.

Neurology, 1994; 241:536, que pode servir como um guia para a regene- ração de axônios.

E As populações de células ou composições e/ou matrizes com- .5 —preendendo as células podem ser liberadas para o sítio por meio de um mi- crocateter, intracateterização, ou por meio de uma minibomba.

O excipiente veículo ou portador pode ser quaisquer daqueles conhecidos por serem far- maceuticamente aceitáveis para administração a um paciente, particular- mente localmente no sítio em que a diferenciação celular deve ser induzida.

Além disso, a população de células pode ser administrada em qualquer veículo fisiologicamente compatível, tal como uma solução de solu- ção salina tamponada.

Os veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis discutidos dentro da descrição, incluindo, porém não limitados a, solução salina, soluções de tampão aquosas, solventes e/ou meio de dispersão.

O usode tais veículos e diluentes é bem conhecido na técnica.

Outros exem- É plos incluem meios líquidos, por exemplo, meio de eagle modificado de Dul- beccos (DMEM), solução salina estéril, solução salina estéril tamponada por fosfato, meio de Leibovitz (L15, Invitrogen, Carilsbad, Ca.), dextrose em água estéril, e qualquer outro líquido fisiologicamente aceitável.

A solução é prefe- rivelmente estéril e fluído na medida em que existir seringabilidade fácil.

Pre- ferivelmente, a solução é estável sob as condições de fabricação e armaze- nagem e preservadas contra ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias e fungos por meio do uso de, por exemplo, parabenos, clo- robutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosol|, e similares.

As soluções da in- venção podem ser preparadas usando-se um veículo ou diluente farmaceuti- camente aceitável e, como requerido, outros ingredientes enumerados aci- ma, seguido por esterilização filtrada, e em seguida incorporando a popula- ção de células como descrito aqui.

As composições farmacêuticas compreendendo as células em um veículo semissólido ou sólido são tipicamente formuladas para implante cirúrgico no sítio de lesão neural, dano, ou angústia.

Será apreciado que as composições líquidas também podem ser administradas por procedimentos cirúrgicos. Em modalidades particulares, as composições farmacêuticas se- missólidas ou sólidas podem compreender géis semipermeáveis, matrizes, andaimes celulares e similares, que podem ser não biodegradáveis ou bio- f degradáveis. Por exemplo, em certas modalidades, pode ser desejável ou .5 apropriado sequestrar as células exógenas de seus arredores, ainda permitir as células secretarem e liberarem moléculas biológicas (por exemplo, fatores de neurotropina) para células neurais circundantes. Nestas modalidades, as células podem ser formuladas como implantes autônomos compreendendo células derivadas de tecido do cordão umbilical cercadas por uma barreira seletivamente permeável, não degradável que fisicamente separa as células transplantadas de tecido hospedeiro. Tais implantes são às vezes referidos como "imunoprotetores," como eles têm a capacidade de impedir células e macromoléculas imunes de matar as células transplantadas na ausência de " imunossupressão farmacolgicamente induzida.

Em outras modalidades, diferentes variedades de redes e géis Ê degradáveis são utilizados para as composições farmacêuticas da invenção. Por exemplo, os materiais degradáveis particularmente adequados incluem qualquer discutido dentro desta descrição, incluindo, porém não limitado a, polímeros biocompatíveis, tais como poli(ácido lático), polifácido lático-co- ácidoglicólico), metilcelulose, ácido hilaurônico, colágeno, e similares.

Em outra modalidade, um ou mais hidrogéis são usados para as composições farmacêuticas. Um ou mais hidrogéis podem incluir colágeno, atelocolágeno, constructos de fibrina, polímeros de vinila hidrofílicos e acríli- cos, polissacarídeos tais como alginato de cálcio, e polifácido de etileno).

Além disso, o hidrogel pode ser formado de poli(2-hidroxietilmetacrilato), po- liáácido acrílico), peptídeos de automontagem (por exemplo, RAD 16), ácido poli(metacrílico), poli(N-vinil-2-pirrolidinona), álcool poli(vinílico) e seus copo- límeros entre si e com monômeros hidrofóbicos tais como metacrilato de de metila, acetato de vinila, e similares. Também preferidos são poliuretanos — hidrofílicos contendo blocos de poli(etileno óxido) grandes. Outros materiais preferidos incluem hidrogéis compreendendo redes interpenetrantes de po- límeros, que podem ser formadas por adição ou por polímero de condensa-

ção, os componentes dos quais podem compreender monômeros hidrofílicos e hidrofóbicos tais como aqueles exatamente enumerados. Em formação de szYw as redes degradáveis são também adequadas para uso na invenção " (veja, por exemplo, Anseth, KS e outro, J. Controlled Release, 2002; 78:199- .5 209; Wang, D.8e outro, Biomaterials, 2003; 24:3969-3980; Publicação de Pa- tente dos Estados Unidos 2002/0022676). Estes materiais de formação in situ são formulados como fluidos adequados para injeção; em seguida po- dem ser introduzidos para formar um hidrogel por vários meios tais como mudança na temperatura, pH, e exposição à luz in situ ou in vivo. Em uma modalidade, a constructo contém cola de fibrina contendo géis. Em outra modalidade, a constructo contém atelocolágeno contendo géis. Em um aspecto da invenção, o polímero usado para formar a matriz é na forma de um hidrogel. Em geral, os hidrogéis são materiais poli- - méricos reticulados que podem absorver mais do que 20% de seu peso em água ao mesmo tempo em que mantendo uma estrutura tridimensional dis- ã tinta. Esta definição inclui polímeros reticulados secos que incharão em am- bientes aquosos, bem como materiais dilatados em água. Um hospedeiro de polímeros hidrofílicos pode ser reticulado para produzir hidrogéis, se o polí- mero for de origem biológica, semissintético ou totalmente sintético. O hidro- gel pode ser produzido a partir de um material polimérico sintético. Tais po- límeros sintéticos podem ser adaptados a uma faixa de propriedades e uni- formidades lote a lote previsíveis, e representam uma fonte confiável de ma- terial que geralmente é livre de relações de imunogenicidade. As matrizes podem incluir hidrogéis formados de peptídeos de automontagem, tais como aqueles discutidos nas Patentes dos Estados Unidos nº 5.670.483 and

5.955.343, Pedido de Patente dos Estados Unidos nº 2002/0160471, e Pedi- do PCT nº WO 02/062969.

As propriedades que tornam os hidrogéis valiosos em aplicações de liberação de fármaco incluem o grau de dilatação de equilíbrio, cinéticos de absorção, permeabilidade de soluto, e suas características de execução in vivo. A permeabilidade de compostos depende, em parte, do grau de grau de dilatação ou teor de água e da taxa de biodegradação. Visto que a resis-

tência mecânica de um gel pode declinar em proporção ao grau de dilatação, incluem-se também bem na contemplação da presente invenção que o hi- drogel pode ser ligado a um substrato de modo que o sistema de composto ' realce a resistência mecânica.

Em algumas modalidades, o hidrogel pode .5 ser impregnado dentro do substrato poroso, para ganhar a resistência me- cânica do substrato, juntamente com as propriedades de liberação úteis do hidrogel.

Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreen- de uma matriz biocompatível feita de polímeros biodegradáveis sintéticos ou naturais modificados, natural, incluindo homopolímeros, copolímeros políme- ros de bloqueio, bem como combinações dos mesmos.

Os exemplos de polímeros biodegradáveis adequados ou clas- ses de polímeros incluem polímeros biodegradáveis discutidos dentro desta : descrição, incluindo, porém não limitado a, fibrina, colágeno tipo |, II, III, IV e V, elastina, gelatina, vitronectina, fibronectina, laminina. trombina, po- ' li(aminoácido), celulose oxidada, tropoelastina, seda, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleico; proteínas, polinucleotídeos, goma arábica, matri- zes de membrana basal reconstituída, amidos, destranas, alginatos, hilau- ron, quitina, quitosano, agarose, polissacarídeos, ácido hilaurônico, po- lifácido lático), polifácido glicólico), polietileno glicol, tecido decelularizado, peptídeos de automontagem, polipeptídeos, glicosaminoglicanos, seus deri- vados e misturas dos mesmos.

Os polímeros adequados também incluem poli(lactídeo) (PLA) que podem ser formados de L(+) e D(-) polímeros, poli- ipoli-hidroxibutirato, —poliuretanos, polifosfazenos, poli(etileno glicol)- —poli(lactíideo-co-glicólido) co-polímero, policianoacrilatos degradáveis e poliu- retanos degradáveis.

Tanto para ácido glicólico quanto ácido lático, um dí- mero cíclico intermediário pode ser preparado e purificado antes da polimeri- zação.

Estes dímeros intermediários são chamados glicólido e lactídeo, res- pectivamente.

Outros polímeros biodegradáveis úteis ou classes de polímero incluem, sem limitados, poliésteres alifáticos, poli(alquileno oxalatos), poli- carbonatos derivados de tirosina, poli-iminocarbonatos, poliortoésteres, poli-

oxaésteres, poliamidoésteres, polioxaésteres contendo grupos amina, po- lifpropileno fumarato), polifumaratos, polidioxanonas, policarbonatos, polio- xalatos, poli(alfa-hidroxiácidos), polifésteres), poliuretano, poli(éster uretano), " poliféter uretano), polianidridos, poliacetatos, policaprolactonas, po- .5 lifortoésteres), poliaminoácidos, poliamidas e misturas e copolímeros dos mesmos. Polímeros biodegradáveis úteis adicionais incluem, sem limitação, estereopolímeros de ácido lático L e D, copolímeros de bis(para- carboxifenóxi)propano e ácido sebácico, copolímeros de ácido sebácico, co- polímeros de caprolactona, copolímeros de poli(ácido lático)/poli(ácido glicó- lico)/polietilenoglicol, copolímeros de poliuretano e poli(ácido lático), copoli- meros de alfa-aminoácidos, copolímeros de aifa-aminoácidos e ácido caprói- co, copolímeros de alfa-benzil glutamato e polietileno glicol, copolímeros de sucinato e poli(glicois), polifosfazeno, poli(hidroxialcanatos) e misturas dos : mesmos. Os sistemas binários e terciários também são contemplados.

Em geral, o material usado para uma matriz é desejavelmente Ê configurado de modo que ele: (1) tenha propriedades mecânicas que são adequadas para a aplicação pretendida; (2) permanece suficientemente in- tacto até o tecido ter encravado e cicatrizado; (3) não invoque uma resposta inflamatória ou tóxica; (4) seja metabolizado no corpo após cumprir seu obje- tivo; (5) seja facilmente processado no produto final desejado a ser formado; (6) demonstre vida de prateleira aceitável; e (7) seja facilmente esterilizado. Em outra modalidade, a população de células é administrada por uso de um andaime. A composição, forma, e porosidade do andaime podem ser descritas acima. Tipicamente estes biomateriais tridimensionais contêm as células vivas ligadas ao andaime, dispersas dentro do andaime ou incor- poradas na matriz extracelular aprisionada no andaime. Uma vez implanta- dos na região alvo do corpo, estes implantes integram-se com o tecido hos- pedeiro, ao qual as células transplantadas gradualmente estabilizam-se.

Os exemplos não limitantes de andaimes que podem ser usados na presente invenção incluem estruturas têxteis como teceduras, tricotados, trançados, malhas, não tecidos, e tricotados unidos; espumas porosas, es- pumas semiporosas, películas perfuradas ou folhas, micropartículas, contas,

e esferas e estruturas de composto sendo uma combinação das estruturas acima. Esteiras não tecido podem, por exemplo, se formadas usando fibras compreendidas de um polímero absorvível sintético de ácidos glicólicos e f láticos (PGA/PLA), vendido sob o nome comercial VICRYL sutures (Ethicon, Inc, Somerville, N. J.). As espumas, compostas de, por exemplo, copolímero de poli(epsilon-caprolactona)/poli(ácido glicólico) (PCL/PGA), formadas por processos tais como secagem por congelamento, ou liofilizadas, como discu- tido na Patente dos Estados Unidos nº 6.355.699, também podem ser utili- zadas.

Em outra modalidade, a estrutura é um feltro, que pode ser composto de um fio multifilamento feito de um material bioabsorvível. O fio é feito em um feltro usando técnicas de processamento têxtil padrões consis- tindo em plissamento, corte, cordagem e agulhamento. Em outra modalida- : de, as células são semeadas sobre andaimes de espuma que podem ser usados como estruturas de composto.

f Em muitas das modalidades acima mencionadas, a estrutura pode ser modelada em uma forma útil, tal como para preencher um vácuo de tecido. A estrutura pode, portanto, ser modelada não apenas para fornecer um canal para desenvolvimento neutro, mas também fornecer um andaime para os tecidos de apoio e circundantes, tais como tecido vascular, tecido muscular, e similares. Além disso, será apreciado que a população de célu- las pode ser cultivada em dispositivos implantáveis ou cirúrgicos não degra- dáveis, pré-formados.

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir prepa- rações feitas de células que são formuladas com um veículo ou meio farma- ceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis adequa- dos incluem qualquer discutido dentro desta descrição, incluindo, porém não limitado a, água, solução de sal (tal como solução de Ringer), álcoois, óleos, gelatinas, polivinil pirrolidina, carboidratos tais como lactose, amilose, ou a- —mido, ésteres de ácido graxo, e hidroximetilcelulose. Tais preparações po- dem ser esterilizadas, e se desejado, misturadas com agentes auxiliares tais como lubrificantes, conservantes, lubrificantes, conservantes, estabilizado-

res, agentes umectantes, emulsificantes, sais para influenciar a pressão os- mótica, tampões, e agentes corantes. Os veículos farmacêuticos adequados par uso na presente invenção são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, no Pharmaceutical Sciences (17º edição, Mack Pub. Co., Easton, .5 Pa)eWoO 96/05309.

Em outra modalidade, antes da administração, a população de células é incubada na presença de um ou mais fatores, ou sob condições, que estimulam a diferenciação de célula-tronco ao longo da trilha de célula neural. Tais fatores são conhecidos na técnica e o técnico versado apreciará que a determinação de condições adequadas para a diferenciação pode ser realizada com experimentação de via. A otimização de tais condições pode ser realizada por plano e análise experimental estatística, por exemplo, a resposta a metodologia de superfície permite a otmização simultânea de múltiplas variáveis, por exemplo, em uma cultura biológica. Os fatores atu- almente preferidos incluem, porém não estão limitados a, fatores tróficos ou E de crescimento, quimiocinas, citocinas, produtos celulares, agentes de des- metilação, e outros estímulos que são agora conhecidos ou posteriormente determinados para estimular a diferenciação, por exemplo, a população de células ao longo das linhagens ou trilhas angiogênicas, hemangiogênicas, vasculogênicas, do músculo esqueletal, músculo liso vascular, periscito, ou endoteliais vasculares. Alternativamente, a administração da composição ao paciente inclui uma população de células com um ou mais fatores que esti- mulem a diferenciação celular ao longo da trilha neural celular, onde a dife- renciação celular ocorre in vitro no sítio do tecido.

As formas e regimes de dosagem para administrar a população de células e quaisquer das outras composições farmacêuticas ou terapêuti- cas descritas aqui são desenvolvidas de acordo com boa prática médica, levando em conta a condição do paciente individual, por exemplo, natureza e extensão da dor ou lesão neural, idade, sexo, peso corporal e condição mé- dica geral, e outros fatores conhecidos por clínicos médicos. Desse modo, a quantidade eficaz de composição farmacêutica a ser administrada a um pa- ciente é determinada por estas considerações como conhecido na técnica.

Administração Sistêmica Em uma modalidade, a população de células é administrada sis- temicamente para tratar sítio de dor e/ou dano neural.

O sítio de administra- Ê ção pode ser qualquer determinado pelo profissional médico para ser me- .5 lhor, e desse modo pode ser intravenoso, intramuscular, intraperitoneal, e similares.

As células podem ser administradas por qualquer meio incluindo, porém não limitado a, injeção e infusão.

As modalidades específicas da invenção são direcionadas à administração sistêmica de uma população de células para o reparo direto, regeneração, substituição de, ou o suporte do reparo, regeneração, ou subs- tituição de células neurais para o tratamento de dano, lesão e/ou dor neural.

Vias de administração sistêmica de as células da invenção ou composições das mesmas incluem, porém não são limitadas a, intraveno- . sas, intraperitonealmente, intra-arterial, ou por meio de seringas com agu- Ilhas ou cateteres com ou sem disposítivos de bomba.

A migração da popu- É lação de células pode ser guiada por movimento de fluídos dentro do corpo do indivíduo, tal como movimento de sangue ou linfático, bem como sinais químicos, fatores de crescimento, e similares.

Em uma modalidade específica, um cateter de liberação pode serusado para liberar a população de células em um dispositivo de liberação que facilite a introdução por, por exemplo, injeção, das células nos pacien- tes.

Tais dispositivos de liberação incluem tubos, por exemplo, cateteres, para injetar células e fluídos no corpo de um paciente receptor.

Além disso, a população de células pode ser administrada em um veículo fisiologicamente compatível, tal como uma solução de solução salina tamponada.

Os veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções de tampão aquosas, solventes e/ou meio de dispersão.

Preferivelmente, a solução é estável sob as condições de fabricação e armazenagem e preser- vadas contra a ação contaminante de micro-organismos tais como bactérias efungos através do uso de antimicrobianos e antifúngicos incluindo, parabe- nos, clorobutanol, fenol ácido ascórbico, timerosol, e similares.

As soluções da invenção podem ser preparadas usando um veículo ou diluente farma-

ceuticamente aceitável e, como requerido, outros ingredientes enumerados acima, seguidos por esterilização filtrada, e em seguida incorporação da po- pulação de células como descrito acima.

É Tanto para células administradas sistemicamente quanto local- mente, as formas de dosagem e regimes para administrar a população de células ou quaisquer das outras composições farmacêuticas ou terapêuticas descritas aqui são desenvolvidas de acordo com a boa prática médica, le- vando em conta a condição do paciente individual, por exemplo, natureza e extensão da dor ou lesão neural, idade, sexo, peso corporal e condição mé- dicageral, e outros fatores conhecidos por clínicos médicos.

Desse modo, a quantidade eficaz de composição farmacêutica a ser administrada a um pa- ciente é determinada por estas considerações como conhecido na técnica.

Se a população de células usada pelo clínico médico é células : derivadas de tecido do cordão umbilical, em seguida o transplante com célu- las alogênicas, ou até xenogênicas, pode ser tolerado em alguns exemplos õ como estas células mostraram não estimular as PBMCs alogênicas em uma reação de linfócito misturada.

Consequentemente é reconhecido que as pró- prias células fornecem um efeito imunossupressor, desse modo impedindo a rejeição do hospedeiro da população transplantada de células.

Em tais e- xemplos, a imunossupressão farmacológica durante a terapia celular pode não ser necessária.

Entretanto, em outros exemplos podem ser desejável ou apro- priado para farmacologicamente imunossuprimir um paciente antes de iniciar a terapia celular.

Isto pode ser realizado através do uso de agentes imunos- —supressores sistêmicos ou locais, ou pode ser realizado liberando-se as cé- lulas em um dispositivo encapsulado, como descrito acima.

Estes e outros meios para reduzir ou eliminar a resposta imune às células transplantadas são conhecidos na técnica.

Como uma alternativa, a população de células pode ser geneticamente modificada para reduzir sua imunogenicidade, como mencionado acima.

Além disso, a sobrevivência de uma população transplantada de células em um paciente vivo pode ser determinada através do uso de várias técnicas de varredura, por exemplo, varredura de tomografia computadori- zada axial computada (CAT ou CT), varredura de imageamento de resso- nância magnética (MRI) ou tomografia por emissão de pósitron (PET). A de- f terminação de sobrevivência em transplante pode também ser feita pós- .5 morte por remoção dos tecidos neurais e tecidos circundantes, e examinan- do-os visualmente ou por meio de microscópio. Alternativamente, as células podem ser tratadas com linhagens que são específicas para tecido neural, ou seus tecidos circundantes. As células transplantadas podem também ser identificadas antes da incorporação de pigmentos traçadores, tais como mi- croesferas rotuladas por rondomina ou fluoresceína, azul fixo, micropartícu- las férricas, bisbenzamida ou produtos de gene repórter geneticamente in- troduzidos, tais como beta-galactosidase ou beta-glicuronidase. Agentes e Compostos Administrados com a População de Células . As células da presente invenção podem ser incubadas e/ou tra- tadas em qualquer estágio em sua preparação para transplante, por exem- É plo, durante a dissecação, digestão limitada, dissociação, revestimento, e/ou produção de suspensões celulares para transplante, com vários agentes ou fatores que promovem a sobrevivência, cultivo, diferenciação, e/ou integra- ção das células in vitro e/ou no paciente receptor, ou que também auxiliam no tratamento de dor crônica. A administração de agentes adicionais pode começar antes do transplante das células, pode começar no momento do transplante, ou pode começar após o transplante. A administração de agen- tes adicionais pode limitada ser na duração (por exemplo, pode consistir em uma administração única do agente) ou pode ser de duração prolongada (por exemplo, pode ser fornecida ao paciente repetidamente durante um longo período de tempo).

Em algumas modalidades, um ou mais compostos ou compo- nentes são administrados em paralelo, sequencialmente ou formulados dire- tamente com a população de células. Os exemplos de outros componentes que podem ser adicionados às células administradas incluem, porém não estão limitados a: (1) outros fatores neurotróficos tais como fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, neurotrofina-3, neurotrofina 4/5,

fator de crescimento do nervo, fator de crescimento de fibroblasto acídico, fator de crescimento de fibroblasto básico, fator de crescimento derivado da plaqueta, hormônio liberador da tirotropina, fator de crescimento epidérmico, ? anfireguilina, fator transformador do crescimento, fator transformador do .5 — crescimento, fator de crescimento similar à insulina; (2) componentes da ma- triz extracelular selecionados, tais como um ou mais tipos de colágeno co- nhecidos na técnica, e/ou fatores de crescimento, plasma rico em plaquetas, e fármacos (alternativamente, células derivadas de tecido do cordão umbili- cal podem ser geneticamente construídas para expressar e produzir fatores de crescimento); (3) agentes antiapoptóticos (por exemplo, eritropoetina (E- PO), memeticorpo EPO, trombopoietina, fator de crescimento similar à insu- lina (IGF)-I, IGF-II, fator de crescimento de hepatócito, inibidores de caspa- se); (4) compostos anti-inflamatórios (por exemplo, inibidores de p38 MAP . cinase, inibidores de TGF -beta, estatinas, IL-6 e IL-| inibidores, Pemirolast, Tranilast, Remicade (Centocor, Inc., Malvern, Pa.), Sirolimo, e fármacos anti- Ê inflamatórios não esteroidal (NSAIDS) (tais como Tepoxalina, Tolmetina, e Suprafeno); (5) agentes imunossupressores ou imunomoduladores, tais co- mo inibidores de calcineurina, inibidores de mTOR, antiproliferativos, corti- costeroides e vários outros anticorpos; (6) anestésicos locais; e (7) outros fatores angiogênicos, fármacos angiogênicos, ou fatores ou fármacos mior- regenerativos ou mioprotetores.

Em uma modalidade, tais agentes ou fatores podem ser adicio- nados ao sítio de transplante no paciente receptor após as células da inven- ção terem sido transplantadas aqui. Em alguns exemplos, por exemplo, es- tes agentes podem minimizar ou contrariar os efeitos sobre as células resul- tantes dos procedimentos usados para preparar as células para transplante. Por exemplo, as células preparadas para transplante podem experimentar trauma celular e/ou hipóxia que leva à produção de espécies de oxigênio reativas (ROS) tais como ânion radical superóxido, peróxido de hidrogênio, e oradical livre hidroxila. ROS são conhecidos por adversamente afetar a fun- ção celular, mais provavelmente por afetar vários compoenentes de mem- branas e intracelulares incluindo canais de íon, lipídeos de membrana, me-

canismos de transporte tais como transporte por permuta de Na/K ATPase e Na/glutamato e emzimas citosólicas ta! como glutamina sintase. Além disso, as espécies de oxigênio reativas provocam peroxidação de lipídeo de mem- * brana, e consequentemente podem reduzir a sobrevivência das células nós .5 transplantes.

Para minimizar e/ou contrariar os feitos adversos destes tipos de estresse oxidativo durante a preparação das células para transplante, as células da presente invenção podem ser incubadas e/ou tratados com antio- xidantes em qualquer estágio durante a preparação. Os exemplos de tais antioxidantes incluem antioxidantes enzimáticos superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase e agentes que promovem formação de gluta- tiona, por exemplo, N-acetil cisteína (NAC). Outros antioxidantes incluem lazaroides, por exemplo, U-74389G e U-83836E, que são aminoesteroides e que são planejados para se localizarem na membrana celular e inibir peroxi- dação de lipídeo ao mesmo tempo em que eliminando radicais livres. Outros À exemplos de antioxidantes que podem ser adicionados às culturas de célula e suspensões de célula incluem TGF, vitamina E, vitamina C, beta caroteno, e outros compostos que eliminam ROS, inibem a produção de ROS, e/ou inibem a peroxidação de lipídeo.

Enzimas antioxidantes, tais como SOD, eliminam ROS e impe- dem a reação de superóxido com óxido nítrico para formar ânion de peroxini- trila, que foi mostrado ser tóxico às células cultivadas. Estas enzimas podem ser incubadas com as células da invenção como descrito acima. Outro mé- todo, de introduzir estas enzimas nas preparações celulares da presente invenção, é geneticamente modificar as células para conter o ácido nucleico codificando tais enzimas. As células geneticamente modificadas podem em seguida produzir agentes que realçam a sobrevivência, cultivo, e diferencia- ção das células enxertadas no paciente receptor. Por exemplo, as células da invenção podem ser transferidas com o gene humano para Cu/Zn superóxi- do dismutase, uma enzima pivotal na desintoxicação de radicais livres de oxigênio, o que resulta nas células transferidas expressando SOD e, conse- quentemente, eficientemente desentoxicando a ROS construída durante a preparação e implante de tecido para desse modo aumentar a sobrevivência de células transplantadas.

Além disso, o ambiente oxidativo das células in vitro pode ser : modificado para inibir o estresse oxidativo celular. Por exemplo, antes do .5 transplante, a pressão parcial de oxigênio no ambiente das células pode ser diminuída da pressão parcial normal de oxigênio, isto é, aproximadamente 150 torr 02, para uma pressão parcial de oxigênio diminuída, isto é, 38 torr 02 (cerca de 5% de 02). Este método de diminuir o estresse oxidativo pode ser combinado com tratamento das células com um ou mais dos antioxidan- tes descritos acima.

Os inibidores de NOS, tais como glangliosídeos, FK506, e ci- closporina A, podem ser adicionados às preparações celulares para inibir a produção de NO, desse modo diminuindo a produção de peroxinitrila e seus : derivados. O superóxido dismutase é outro agente que pode diminuir os efei- tos adversos de superprodução de NO e os efeitos tóxicos ele medeia.

Ú Para prevenir o trauma e seus efeitos adversos associados, por exemplo, peroxidação de membrana, dano celular induzido por radical livre induzidos por preparação das células da invenção para implante, as células da invenção pode ser transfectadas com ácidos nucleicos codificando produ- tos de gene antiapoptóticos tal como o produto de gene bcl-2 e/ou o crmA. Além disso, as células transfectadas da invenção podem ser tratadas com agentes que desrregulam a expressão ou função destes produtos de gene, por exemplo, TGFI e TGF3 que superregulam a expressão de bcl- 2, fator de crescimento de nervo (NGF) e fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF). Além disso, as células da invenção podem também ser transfecta- das com ácido nucleico codificando estes fatores.

Para também promover a sobrevivência das células da invenção no paciente receptor, as células podem ser transplantadas junto com um agente angiogênico ou transfectada com ácido nucleico codificando um a- gente angiogênico. No transplante, o agente angiogênico promove o encra- vamento de vasos sanguíneos na população de células. Como resultado desse encravamento do vaso, as células transplantadas obtêm nutrientes suficientes se proliferar e sobreviver dentro do paciente receptor. Muitos fa- tores de crescimento apresentam atividade angiogênica. Por exemplo, o fa- tor de crescimento endotelial vascular (VEGF), PDGF, o fator de crescimento É de fibroblasto (FGF) acídico e básico, fator de crescimento epidérmico (EGF))eokK-FGF possui atividade angiogênioca e pode ser usada nos mé- todos da invenção para encorajar o crescimento de vaso sanguíneo nas cé- lulas transplantadas da invenção.

Outros fatores, tais como fatores neurotróficos, que contribu- em para o desenvolvimento neural, formação de fibra nervosa, e manu- tenção de neurônios podem ser adicionados às células da invenção in vitro durante a preparação para transplante e/ou à própria suspensão ce- lular para a introdução no paciente individual juntamente com as células da invenção. As células da invenção podem também ser geneticamente . modificadas para produzir tais fatores neurotróficos como descrito aqui. O fator neurotrófico que é adicionado às células da presente invenção pode Í ser selecionado com base na presença de seus receptores sobre as célu- las que devem ser transplantadas. Por exemplo, as células mesencefáli- cas possuem receptores para os seguintes fatores neurotróficos: fator neurotrófico derivado de linhagem de células glicais (GDNF), que promo- vema sobrevivência de, diferenciação morfológica de, e captação de do- pamina de alta afinidade em células mesencefálicas; fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); fator neurotrófico ciliar (CNTF), que previne a degeneração induzida por axo tomia de células mesencefálicas; midci- na, que promove a sobrevivência e diferenciação de células mesencefáli- cas; EGF, que aumenta a sobrevivência e maturação de células mesence- fálicas; fator de crescimento similar à insulina | e Il e insulina; FGF acídi- co; FGF básico, que induz um aumento significante no número de células tranportando neurito bem como no grau de sua rede de fibra; neurotrofina- 3 (NT-3) e neurotrofina 4/5 (NT-4/5); e fator transformador do crescimen- to-2(TGF2)e fator transformador do crescimento-3 (TGF3). Os fatores neurotróficos que promovem a sobrevivência de célu- las neurais podem ser selecionados com base na presença de receptores nas células.

Os receptores para FGF, BDNF, NT-3 e NTA4/5 básicas podem ser encontrados em certas células neurais.

Desse modo, em uma modalida- de, as células da invenção podem ser transfectadas com os ácidos nucleicos ' codificando uma ou mais destes fatores.

Em outra modalidade, um ou mais .5 destesfatores podem ser adicionados à preparação de células neurais antes do transplante.

Estes fatores neurotróficos realçam a sobrevivência das célu- las da invenção no paciente receptor.

Similarmente, os fatores neurotróficos que apresentam especificidade para células corticais, e consequentemente, que podem ser usados para promover a sobrevivência de tais células sobre enxerto em um paciente receptor, incluem fator de crescimento de nervo (NGF), que previne, por exemplo, atrofia de neurônios colinérgicos de cére- bro anferior axotomizados; BDNF, e NT-3 e NT4/5. Em outra modalidade, os fatores neurotróficos descritos aqui po- . dem ser usados junto ou em combinação com outros compostos, tais como —neurotransmissores, para aumentar seus efeitos neurotróficos.

Além disso, é é contemplado que várias combinações de fatores neurotróficos descritos aqui podem agir sinergicamente e, portanto, podem ser usadas juntas para pro- mover a sobrevivência das células transplantadas da invenção.

Certos fármacos também possuem atividade neurotrófica.

Os exemplos de tais fármacos incluem FK506 e ciclosporina A que bloqueiam a neurotoxicidade obtida por ação de glutamato em receptores de N-metil- D-aspartato (NMDA), por exemplo, aumentando-se os níveis fosforilado de NOS.

Como o NOS fosforilado inibe sua atividade catalítica, estes fár- macos eficazmente reduzem a formação de NO e previnem os efeitos —neurotóxicos de NMDA sobre estas células.

Outros fármacos que possu- em atividade neurotrófica e podem ser usados na presente invenção são aquelas moléculas pequenas que se ligam às mesmas proteínas de liga- ção como FK506 e/ou ciclosporina A e, portanto, mediam os efeitos neu- roprotetores similares.

Em uma modalidade, estes fármacos são adminis- trados ao paciente além da população de células para tratar dor crônica e/ou espasticidade.

Em uma modalidade, as combinações de um ou mais dos a-

gentes e fatores descritos acima podem ser usados para promover a so- brevivência das células da invenção antes ou após as células serem transplantadas em pacientes receptores. Por exemplo, as células da pre- f sente invenção podem ser contactadas com um ou mais dos agentes ou .5 fatores descritos aqui para promover a sobrevivência das células in vitro elou in vivo. Em outra modalidade, as células da invenção podem ser transfectadas com o ácido nucleico de um ou mais dos agentes ou fatores descritos aqui e também contactadas com um ou mais dos agentes ou fatores descritos aqui. Além disso, embora muito dos fatores neurotróficos descritos aqui sejam específicos para um tipo de célula particular, a asso- ciação destes fatores com tal tipo de célula não exclui o uso daquele fator com um tipo de célula diferente. O tratamento das células da invenção com os agentes ou fatores descritos aqui pode ocorrer simultaneamente e ou sequencialmente. Em outra modalidade, a administração da população de células ' para tratar dor crônica pode ser acoplada com a administração de terapias tradicionais para estas condições (por exemplo, com opioides ou baclofeno). Em certos pacientes, tais terapias de combinação podem resultar em melho- ra ideal de sintomas.

Em outra modalidade, os agentes que inibem a atividade de cé- lula T no paciente podem ser administrados além das células do indivíduo. Como usado aqui, um agente que inibe a atividade de célula T é definido como um agente que resulta na remoção ou destruição de células T dentro de um indivíduo ou inibe as funções de célula T dentro de um indivíduo, des- se modo as células T podem ainda estar presente no paciente, porém estar presente em um estado não funcional, de modo que elas sejam incapazes de proliferar ou elicitar ou executar funções efetoras, tais como produção de citocina, citotoxicidade etc. O termo "célula T" abrange linfócitos T de sangue periférico maduro. O agente que inibe a atividade de célula T pode também inibira atividade ou maturação de células T imaturas.

Os seguintes exemplos descrevem a invenção com maior deta- lhe. Os exemplos são destinados a ilustrar, não limitar, os aspectos da in-

venção descritos aqui. EXEMPLO 1 Semeação de Células em Constructos de Fibrinogênio-Trombina É As UTCs humanas foram removidas de armazenagem criogêni- .5 ca,removidas de crioprotetor e lavadas com PBS contendo Ca/Mg. As célu- las foram novamente suspensas em um volume de 200-300 ul. O fibrinogê- nio e a trombina foram diluídos em 50 um de alíquotas de modo que a adi- ção de 50 ul de trombina e 50 ul de fibrinogênio às células resultou em uma diluição final de 1:133 e 1:8 respectivamente. Imediatamente sob adição do componente de trombina, o material foi dispensado em uma placa de cultura de célula de feixe baixo e semeado no incubador com meios de cultura como anteriormente descrito. As células e constructo foram semeadas em um in- cubador a 37ºC com 5% de CO, durante 4 dias. Para avaliar a disponibilida- . de, as células foram incubadas com corante Live/Dead (Invitrogen, Carisbad CA) usando instruções de fabricantes e vistas sob um microscópio fluores- ' cente.

As UTCs humanas foram semeadas com trombina e fibrinogê- nio. Após quatro dias, as huTCs foram checadas quanto à disponibilidade por microscopia fluorescente após a aplicação de um corante viável. Os constructos eram viáveis para liberação de huUTCs por que as hUTCs per- Mmaneciam viáveis em constructos de fibrinogênio-trombina in vitro em quatro dias Uma fotografia mostrando disponibilidade de célula é ilustrada na figura 1.

EXEMPLO2 Administração Sistêmica e Local de Células Para demonstrar que a administração sistêmica e local de hUTCs a animais reduziu o comportamento da dor, os inventores submete- ram animais à lesão de contrição crônica (CCI). A CCI é um modelo comum para testar agentes e terapias quanto à dor neuropática (veja Bennett and Xie, Pain, 1988; 33:87 - 107). Os ratos Sprague-Dawley pesando 200-225g foram primeiro anestesiados com xilazina e cetamina. O nervo ciático dos animais foi isolado. As quatro ligaduras soltas usando fio categute crômico 4- O foram colocadas no nervo ciático quando ele sai do entalhe ciático. O comportamento de referência (sensibilidade mecânica aos filamentos Sem- : mes Weinstein) foi obtido para todos os animais antes da cirurgia. Cinco ou .5 seisdias após a cirurgia, os animais foram novamente testados e os grupos foram estratificados para assegurar que cada grupo demonstrasse compor- tamento de dor similar e que a distribuição de severidade da dor em cada grupo fosse similar.

Em 5 a 6 dias após a cirurgia, imediatamente após o teste, os animais foram tratados com um dos seguintes:

1. Oito animais foram tratados com um constructo de trombina- fibrinogênio modificado. O constructo (um hemóstato modificado) foi aplicado ao nervo lesionado: ao mesmo tempo em que sob anestesia, 300 ul a 400 ul : de material em gel foram injetados nos arredores do nervo lesionado. O gel foipreparado como segue: 300ul de PBS contendo cálcio e magnésio foram : misturados com 50 ul de trombina (1:133, final) e 50 ul de fibrinogênio (1:8, final).

2. Oito animais foram tratados com uma formulação local de cé- lulas. A formulação compreendia de uma dose de 3eº de células em 300ul de PBS contendo cálcio e magnésio, 504! de trombina (1: 133, final) e 50 ul de fibrinogênio (1:8, final). Ao mesmo tempo em que sob anestesia 300 ul a 400 ul de material em gel foram injetados nos arredores do nervo ciático le- sionado.

3. Oito animais foram tratados com uma dose IV de 3eº de célu- lasem2mlde PBS contendo cálcio e magnésio.

4. Oito animais foram tratados com uma dose IV de 2 ml de PBS contendo cálcio e magnésio.

5. Dezesseis animais de controle que suportaram a CCI perma- neceram sem tratamento.

Administração Local Os resultados da administração local são ilustrados na figura 2. Os scores de referência de pré-tratamento não foram significan-

temente diferentes dos valores normais previstos (diferença de scores de 'zero'). Além disso, não houve nenhuma diferença significante entre os gru- pos para os scores de referência. : Cinco dias após a cirurgia, todos os três grupos desenvolveram .5 —alodinia mecânica significante (Gupo de CCI: -0,36+0,08 log10gm, grupo veículo: -0,31+0,07 log10mg, grupo de constructo: -0,34+0,08 log10mg) em comparação com níveis de referência (Gupo de CCI: -0,02+0,01 log1i0mg, grupo veículo: -0,05+0,02 logiOmg, grupo de constructo: -0,06+0,04 log10mg). Onze e 20 dias após a administração, o grupo de CCI (nenhum tratamento) permanecia significativamente hipersensível em comparação com níveis de referência (-0,54+0.12 log10mg e -0,78+0,14 log10mg respec- tivamente). O grupo veículo permanecia significativamente hipersensível em comparação com a referência nos 11º e 20º dias após a administração, en- tretanto significativamente menos sensível do que o grupo de CCI (- 0,18+0,01 logi0Omg e -0,27+0,12 logi0mg respectivamente). O grupo de À constructo desenvolveu hipossensibilidade significante em 11 dias após a administração (0,21+0,19 logi0mg) e hipersensibilidade significantemente reduzida em 20 dias (-0,08+0,03 log10mg). Administração Sistêmica (LV. Os resultados de administração sistêmica (i.V) são ilustrados na figura 3.

Os scores de referência de pré-tratamento não foram significan- temente diferentes dos valores normais previstos (diferença de scores de 'zero'). Além disso, não houve nenhuma diferença significante entre os gru- posparaos scores de referência.

Cinco dias após a cirurgia todos os três grupos desenvolveram alodinia mecânica significante (Gupo de CCI: -0,35+0,08 log10mg, grupo veículo: -0,40+0,05 log10mg, grupo de constructo: -0,55+0,09 log10mg) em comparação com níveis de referência (Gupo de CCI: -0,02+0,01 log10mg, grupo veículo: -0,01+0,01 logiOmg, grupo de constructo: -0,00+0,01 log10mg). Dez e 20 dias após a administração, a CCI (nenhum tratamento) e os grupos veículos permaneciam significativamente hipersensíveis em com-

paração com níveis de referência (CCI: -0,53+0,11 log 10mg e - 0,76+0,10 log10mg respectivamente, veículo: -0,61+0,14 logi0mg e -0,83+0,11 log10mg respectivamente). A hipersensibilidade do grupo de constructo foi É significantemente reduzida em 10 dias e 20 dias em comparação com dois .5 — outros grupos (-0,33+0,10 log10mg e -0,41+0,11 log10mg).

EXEMPLO 3 Eficácia do Constructo Biológica no Alívio da Dor Neuropática Comportamento de dor foi examinado após a injeção local e a- pós a administração à veia da cauda.

Materiais e Métodos Todos os ratos foram submetidos a CCI como anteriormente descrito. Resumidamente, sob anestesia de xilazina/cetamina, o nervo ciáti- co dos animais foi isolado. Quatro ligaduras soltas usando fio categute crô- . mico 4-0 foram colocadas no nervo ciático quando ele sai do entalhe ciático. O comportamento de referência (sensibilidade mecânica aos filamentos de : Semmes Weinstein) foi obtido para todos os animais antes da cirurgia. Seis dias após a cirurgia os animais foram novamente testados e os grupos foram estratificados para assegurar que cada grupo demonstrasse comportamento de dor similar e que a distribuição de severidade da dor em cada grupo fosse similar.

Em 6 dias após a cirurgia (como uma dor neuropática foi verifi- cada pela presença de alodinia tátil) os animais foram tratados com um dos seguintes tratamentos:

1. Administração sistêmica de cerca de 2 ml de fluido contendo células ou veículo à veia da cauda (Tabela 3-1).

2. Administração local de células ou veículo (Tabela 3-2)

3. Animais de controle que foram tratados com gabapentina antes do teste.

Os animais foram em seguida testados quanto à sensibilidade mecânica (alodinia tátil) em 7, 10, 14, 17 e 21 dias após o tratamento. Os examinadores eram cegos para o tratamento; o código foi aberto apenas no final do estudo e após a submissão dos resultados ao doutor encarregado do estudo.

O estudo foi realizado em três sessões separadas.

Tabela 3-1: Administração Sistêmica A Células huUTC le6 — |Uma vez no dia 6 de jAntes da lesão. 5-6 s estudo dias após a lesão. 7, 10, 14, 17, 21 dias a- pós o tratamento IB — |céluasnhuTcIe7 e des iD —— Jcéluas huTC 3e6 Tabela 3-2: Administração Local 1 Células 1.00E+06 [Uma vez no dia 6 |Antes da lesão. 5-6 dias . de estudo após a lesão. 7, 10, 14, 17, 21 dias após o trata- mento 2 Collagen (Colbar) 1,00E+06 3,00E+05 1,00+05 0,00+00 Evicel (Omrix) 1,00E+06 3,00E+05 1,00+05 0,00+00 Após a eutanásia os nervos relevantes foram colhidos e arma- zenados em formalina.

A administração do constructo e o teste de compor-

tamento foram realizados por uma pessoa que foi cegada para o grupo de tratamento. Análise Estatística: Cada animal foi avaliado contra sua própria referência : (por avaliação do comportamento de dor de referência) e contra seu próprio .5 comportamento de dor e contrastado com sua própria sensibilidade mecâni- ca pré-cirúrgica para avaliar a recuperação. Os dados são apresentados como porcentagem de mudança dos níveis no estágio de dor neuropática (5- 6 dias após a cirurgia). Para as medições repetidas de tratamento ANOVA foi realizada seguida por teste de PLSD de Fisher. Os dados separados para aspatas afetadas e contralaterais são fornecidos.

Resultados: Administração Local Os scores de referência de pré-tratamento não eram significan- : temente diferentes dos valores normais previstos (diferença de scores de 'zero' entre duas patas). Além disso, não houve nenhuma diferença signifi- cante entre os grupos para os scores de referência. Cinco dias após a cirur- gia todos os três grupos desenvolveram alodinia mecânica significante em comparação com níveis de referência (ver por dados da fileira). Lado Afetado: Como mostrado na figura 4 para o colágeno (Colbar) esperado, a gabapentina reduziu a dor. O veículo e as células sozinhos não afetaram o comportamento da dor. A dose baixa (grupo 4) tinha um efeito curto, até 10 dias após a administração. A dose alta (grupo 2) tinha o efeito mais signifi- cante que para análise global (teste de PLSD de Fisher) não foi significan- temente diferente do tratamento bem sucedido com gabapentina. Entretanto é importante notar que este tratamento não foi significantemente diferente do efeito de outros grupos. (a análise estatística é fornecida na figura 10).

As patas contralaterais não demonstravam alodinia tátil signifi- cante, nenhum dos grupos de tratamento tinha um efeito significante sobre estes testes de lado. (os resultados na figura 5 e análise estatística são for- necidos na figura 11).

Evicel (Omri) Como mostrado na figura 6 para Evicel (Omrix), o tratamento de gabapentina reduziu a dor.

A dose baixa (grupo 8) foi tão eficaz quanto ga- E bapentina, e mesmo ligeiramente superior em 14 dias.

O veículo (grupo 9) foimais eficaz do que as duas doses superiores (grupos 6 e 7), que não tive- ram efeito paliativo de modo algum. (Resultados mostrados na figura 6 e a análise estatística é fornecida na figura 12). As patas contralaterais não demonstravam alodinia tátil, nenhum dos grupos de tratamento tinha um efeito significante sobre estes testes de lado. (Análise estatística fornecida na figura 7). Administração Sistêmica Lado Afetado: Lado Afetado pela Administração Sistêmica (esquerdo), Mu- dança de Dor Neuropática : Como mostrado na figura 8 a gabapentina reduziu a dor.

O efeito dele7 (grupo B) foi próximo ao efeito da gabapentina.

O efeito dos outros : dois grupos (A e D) não foi diferente do que o efeito do pbs. (análise estatís- tica é fornecida na figura 14) Lado Contralateral: Lado Contralateral com Administração Sistêmica (direi- to), Mudança De Dor Neuropática As patas contralaterais não demonstravam alodinia tátil, nenhum dos grupos de tratamento tinha um efeito significante sobre a sensibilidade mecânica. (resultados mostrados na figura 9 e análise estatística fornecida na figura 15). Conclusões A dor foi significantemente reduzida por administração sistêmica de células huTC de 1e7 e por administração local de dose alta (1.00E+065) de células em veículo Colbar.

Entretanto o efeito mais significante foi induzi- do por administração local de dose baixa (1,00E+05) de células de veículo Evicel.

Este efeito não foi inferior ao efeito induzido pela gabapentina das medicações de dor neuropática comum.

EXEMPLO 4 A Avaliação de Tratamento e Efeito de Analgésico de Células Injetadas Sis-

temicamente no Modelo Chung de Dor em Ratos Este estudo foi para examinar o efeito antinociceptivo de células UuHTC no modelo Chung de dor neuropática. Os tratamentos de célula foram É dados por administração sistêmica no dia 6 de estudo após a cirurgia e seu .5 efeito sobre a resposta de dor foi medido. Este estudo não seguiu nenhum protocolo regulador específico. Os resultados demonstram que houve um efeito de alívio da dor significante em todas as doses fornecidas de células hUTC. A Gabapentina, que foi administrada em uma dose de 150 mg/kg e serviu como o controle positivo, foi significantemente ativa na redução da dor como um composto analgésico em todos os dias de teste em comparação com o Veículo. No começo do estudo, o peso corporal médio total de todos os animais no estudo foi de 192,62 + 1,429. Todos os animais ganharam peso E durante todo o estudo e nenhuma diferença significante em ganho de peso foiencontrada.

: Von Frey foi usado para avaliar a resposta dos animais à dor. Os resultados foram calculados usando os três métodos diferentes seguintes. Resultados de Von Frey calculados por divisão de log: A resposta à dor foi avaliada usando o aparato Von Frey (Touch Test). Os gramas de força necessária para retirada da perna foram convertidos em log de força de acordo com os valores fornecidos por Touch Testº. O log de for- ça necessário para retirada da perna saudável (direito) foi dividido pelo log de força necessário para retirada da perna operada (esquerdo). A compara- ção de cada grupo de tratamento como o grupo de controle do Veículo a ca- da momento da medição mostrou um alívio da dor significante em todos os grupos tratados versus o grupo do Veículo em vários momentos (p<0,01 e p<0,05). O tratamento com o item de controle positivo, gabapentina (grupo SM), foi ativo como um composto de alívio de dor durante todos os dias de teste comparado ao grupo tratado pelo veículo (grupo 4M; p<0,01).

Resultados de Von Frey calculados por subtrações simples: Outra maneira de calcular os valores de Von Frey foi por subtração simples da força necessária da retirada da perna saudável direita menos a força ne-

cessária para retirada da perna dolorosa esquerda. Quando comparando os valores de Von Frey de cada grupo de tratamento com o grupo de controle do Veículo a cada momento da medição, os resultados mostraram um alívio É da dor significante em todos os grupos tratados versus o grupo veículo em .5 — vários momentos. O controle positivo, gabapentina (grupo SM), tinha pontos de alívio da dor significantes durante todos os dias de teste em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M; p<0,01).

Resultados de Von Frey calculados por subtrações simples versus pré- tratamento: A comparação de valores de Von Frey de cada grupo de tratamento a cada momento da medição com o pré-tratamento valores de Von Frey medidos em 5 dias de estudo mostrou um alívio da dor significante em todos os gru- pos tratados versus o grupo veículo em vários momentos. O controle positi- vo, gabapentina (grupo 5M), tinha um efeito de alívio da dor significante em todos os dias testados dias em comparação com o mesmo grupo em 5 dias 7 de estudo antes tratamento (p<0.01).

O objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade terapêutica de células huTC fornecidas por administração sistêmica por meio de uma veia da cauda em 6 dias após a cirurgia no modelo de dor neuropática Chungemratos.

Itens de Teste Experimental: estas) eme [one] tor [199 [ronecedo retido ata Teste

E EEE E ambiente de 2011 A 10110 [industries de 2009 positivo ambiente Control anestesia 0122 ambiente de 2011 Items Cr ee e 118 |Supply ambiente 2009 pa] 1 Tear] or [o [EE [EE [EEE eee eo e De Preparação de hUTC para Injeção Sistêmica: Todas as etapas foram realizadas com frasconetes abertos de . hUTC usando técnica assética em um gabinete de biossegurança BSL |l cer- tificado. —Descongelamento da huUTC (as células foram armazenadas a -8ºC): O criofrasco de huTC foi descongelado por turbilhonamento su- ave do frasconete em um banho de gelo a 37ºC durante aproximadamente 1 a 2 minutos até estar exatamente descongelado.

O frasconete foi vaporizado com etanol, secado com um Kimwipe e semeado no gabinete de biossegu- rança.

A tampa do criofrasco foi removida e os conteúdos foram suavemente misturados por pipetagem para cima e para baixo duas vezes usando uma f pipeta de 1 ml. 1 ml! de suspensão de huUTC descongelada foi em seguida : transferida usando a pipeta para um tubo de 15 ml.

Uma pipeta de 1 ml! fres- ca foi usada para adicionar 1 ml de PBS estéril ao criofrasco.

Para suspen- deras células huUTC descongeladas residuais, a PBS foi pipetada para cima e para baixo duas vezes.

Um ml da suspensão de hUTC residual foi pipeta- do no tubo de 15 ml contendo a suspensão de huTC descongelada.

Usando uma pipeta de 10 ml fresca, 11 m! de PBS foram adicio- nados à suspensão de hUTC para alcançar um total de 13 ml.

Para cada frasconete de células, 1 ml de loção + 12 ml de loção foram usados.

A suspensão de hUTC foi centrifugada a 250g (ou 1200 rpm) du- rante 5 minutos em temperatura ambiente.

O tubo foi removido da centrífuga e ao mesmo tempo em que tomando o cuidado de não agitar a huTC peleti- zada, 12,7 ml de sobrenadante foram pipetado para cima e descartados u- —sando uma pipeta de 10 ml.

Uma mi! de PBS estéril foi adicionado por frasconete de pélete de hUTC descongelada a um volume total igual de aproximadamente 1 míl/frasconete usando uma pipeta de 5 ml! estéril.

O pélete foi novamente suspenso por pipetagem suave para cima e para baixo assegurando a não criarbolhas.

Cinco ul de solução azul de tripano foram adicionados ao tubo de contagem microfuge de huTC. Usando um P200 Pipetman, as células foram diluídas 1: 10 (50 ul em 500 ul) em PBS. Cinco ul de suspensão de E hUTC diluída foram adicionados à solução azul de tripano no tubo microfuge -5 usando um P200 Pipetman. O conteúdo do tubo foi suavemente, porém completamente, misturados por pipeta e 10 ul de huTC manchadas de azul de tripano foram carregados em um hemocitômetro. As huTC foram conta- das usando quatro faixas usando quatro faixas de hemocitômetro grandes externas. O número e a soma de tanto de huTC incolor (viável) quanto man- chada de azul (não viável) foram registrados. A concentração de hUTC viá- vel, teor de huUTC viável total da suspensão celular, e a % de hUTC viável, foram calculados como segue:

1. Total de huTC incolor + 4 * 20 * 10.000 = Concentração de huUTC viável - em huTC /ml.

2. Volume total * Concentração de huTC viável em huTC /ml = Total de huTC Viável.

3. Total de hUTC incolor + Total de hnuTC manchada de azul e incolor* 100 = % de hUTC viável. O volume para novamente suspender as huUTC para alcançar a concentração apropriada de huTC /ul foi calculado. Para 2 ml/animal: - Para 1*106: 5-105/ml - Para 3*106: 1.5-106 / ml - Para 10*106: 5*106 / ml As células foram puxadas para cima por seringa antecipadamen- te, armazenadas horizontalmente sobre gelo e as misturadas por rotação suave imediatamente antes da injeção.

SISTEMAS DE TESTE Espécies/Linhagem: Rato Sprague Dawley. Fonte: Harlan Laboratories Israel, Ltd. (ISO 9001:2000 Certifi- cate nº:US2002/3081). Gênero: Macho

Nº Total de Animais: n= 60 Idade: Adultos jovens; pesando 160-189g no início do estudo.

Peso corporal: A variação de peso de animais no tempo de início de r tratamento não excedeu + 20% do peso médio.

+ SaúdedoAnimal O estado de saúde dos animais usados neste estudo foi examinado em sua chegada. Apenas os animais com boa saúde foram aclimatados às condições de la- boratório e foram usados no estudo.

Aclimatação: 5 dias.

Alojamento: Durante a aclimatação e por toda a duração do estudo inteiro, os animais foram alojados dentro de uma insta- lação de roedor de acesso limitado e mantidos em gru- pos com um máximo de 5 ratos por gaiolas de polipro- : pileno. As gaiolas foram equipadas com fundo sólido e carregadas com cavacos de madeira estéreis como material de cama.

Alimento e Água: foram fornecidos aos animais ad libitum com uma dieta de roedor, comercial e livre acesso à água potável que foi que foi fornecida a cada gaiola por meio de garrafas de polietileno com tubos zipper de ácido inoxidável. Uma análise do lote de alimentação da batelada de die- ta usada no estudo foi incluída nos arquivos com os dados do estudo. A água foi monitorada periodicamen- te.

Ambiente: As condições ambientais automaticamente controladas foram fixadas para manter a temperatura a 20 a 24ºC com uma umidade relativa (RH) de 30-70%, um ciclo claro-escuro 12: 12 horas e mudanças de ar 15-30/h no ambiente de estudo. A temperatura e RH foram monito- rados diariamente. O computador de controle monito- rou o ciclo claro.

Identificação: foi dada aos animais uma marca de orelha de identifi-

cação de animal única.

Este número também aparecia em um cartão de gaiola, visível na frente de cada gaio- la.

O cartão de gaiola também continha no número de ó estudo todos os outros detalhes relevantes quanto ao So grupo de tratamento.

Randomização: os animais foram randomicamente designados aos grupos experimentais.

Terminação: No final do estudo, os animais sobreviventes foram eu- tanizados por asfixia por CO2. Justificativa: o rato foi selecionado porque ele representava a espé- Cie de escolha para este modelo de animal |. CONSTITUIÇÃO DE GRUPOS DE TESTE E NÍVEIS DE DOSE: A tabela seguinte lista os 5 grupos experimentais compreendendo o estudo. * Tabela 4-1 Tamanho Item fi. ao de de Via eta ao Regime Grupo Teste N=12 Células sistêmica |1* 10º l2ml Uma vez, no (baixa dia 6 de estu- concentração) do 2M N=12 Células sistêmica [310º /2ml Uma vez, no (concentração dia 6 de estu- médio) do 3M iN=12 Células sistêmica [10*10º [2 ml Uma vez, no (alta dia 6 de estu- concentração) do N=12 Controle 2m Uma vez, no Veículo dia 6 de estu- (PBS) do N=12 Controle 120 minutos Positivo antes de cada (Gabapentina) avaliação de comportamen- to começando no dia 7 de estudo í 69/121 Administração do Teste eo essstraneçtto | ” [Avaliação da Dor (referência) lo operação crung PD os Da [Avaliação da Dor; Agrupamento E imtamento sistêmica comedia [Avaliação da Dor Avaliação da Dor; Térmico do estudo Indução de Dor Neuropática: ã Sob anestesia, o rato foi colocado em uma posição propensa e os músculos É parespinhais esquerdos foram separados do processo espinhal nos níveis del4-S2.O processo transverso L6 foi cuidadosamente removido com um rongeur pequeno para visualmente identificar os nervos espinhais L4-L6. Os nervos espinhais L5 e L6 esquerdos foram isolados e firmemente ligados com fios de seda 3-0, e em seguida cortados com uma lâmina. Após a cirur- gia, os ratos foram reconduzidos às gaiolas e permaneceram sob uma lâm- padade aquecimento até eles acordarem.

Para formar grupos de tratamento homogêneos e aderir à ran- domização, todos os ratos operados foram agrupados de acordo com os cri- térios de inclusão/exclusão. Apenas 60 animais operados foram seleciona- dos em 5 dias de estudo após o procedimento Chung de acordo com os cri- térios de inclusão/exclusão. Critérios de Inclusão: * Lambida da pata operada, acompanhada por mordida suave ou tração so- bre as unhas com a boca; * Manutenção da perna no ar; Suporte do peso sobre o lado contralateral da lesão do nervo;

* Deformidades da pata traseira e postura e caminhada anormais; e * Fraqueza da pata traseira esquerda. Critérios de Exclusão: Para os animais que demonstravam sinais de não poder mover aspatasoL4foiinterrompido. Estes animais foram excluídos do estudo. Tratamento: No dia 6 de estudo após a cirurgia de Chung, foram dados aos animais (Grupos 1M, 2M, 3M e 4M) seus respectivos tratamentos por meio de administração sistêmica à veia da cauda. Os animais no Grupo 5M rece- beram tratamento com gabapentina, em uma dose de 150 mg/kg por mio de IP, 120 minutos antes de cada avaliação de comportamento partindo do dia de estudo 7. Em todos os exemplos, toda a dosagem foi aplicada como uma administração única. No final do estudo, os animais foram eutanizados com : exposição à CO,. OBSERVAÇÕES E EXEMPLOS: 7 Exemplos de Von Frey: A resposta à dor foi avaliada usando um aparato de Von Fray (Touch Testº) quanto à alodinia mecânica. O rato foi colocado em um recinto posicionado em uma superfície de malha de metal, porém deixado mover-se livremente.

As cabinas de rato foram revestidas com celofane vermelho para diminuir as distribuições ambientais. Os testes começaram após a cessação de compor- tamento exploratório. O conjunto de monofilamentos forneceu uma escala aproximadamente logarítmica de força real e uma escala linear de intensida- de percebida. A escala logarítmica usada para cálculos é como abaixo: [ ane | once | aos | om | axe | neo [ om | 10 | 140 [ am [am | emo [am [10 13 [as [e Dm [1 | O princípio operante: Quando a extremidade de uma fibra de comprimento e diâmetro determinados é pressionada contra a pele em ângu- los direitos, a força de aplicação aumenta enquanto o pesquisador continua a avançar a sonda até a fibra dobrar. Após a fibra dobrar, a sonda pode con- tinuar a avançar o que faz a fibra dobrar mais, mas sem aplicar força adicio- nal. Este princípio torna possível para o pesquisador usar uma sonda portátil para aplicar uma força reproduzível dentro de uma ampla tolerância à pata.

Os roedores apresentam um reflexo de retiradas da pata quando a pata é inesperadamente tocada.

O Touch Test!“ Sensory Evaluator pode ser usado sobre as superfícies plantares do pé do rato e o animal indicará a sensação puxando-se para trás a sua pata.

A força mínima necessária para levar o reflexo de retiradas é considerada como o valor de referência Método de cálculo: Os dados brutos de força de Von Frey em gramas foram convertidos no log de força de acordo com a tabela acima.

Além disso, o máximo (60 g) foi aplicado para diminuir a abertura elevada arbitrária entre as duas pernas.

O log de força necessário para retirada da perna saudável (direita) foi dividido pelo log de força necessário para retirada da perna operada (esquerda). O cálculo apresenta os valores de pernas no estado saudável .: próximo a 1 quanto a relação entre a força de cada perna for similar.

O au- mento nos valores apresenta um estado mais doloroso.

Os resultados dos 7 valores de referência indicaram um valor de 1. Pesos Corporais: A determinação dos pesos corporais individuais dos animais foi feita em ca- da dia e teste.

Análise Estatística: Todos os parâmetros são representados como médias e erro padrão da mé- dia (SEM) e analisados usando um teste T, binário e não binário, de duas caudas (Microsoft Excel). Os valores de probabilidade (p) menores do que 0,05 ou menores do que 0,01 foram considerados significantes.

Finalidades Humanitárias: No final do estudo, os animais foram eutanizados com exposição à CO” Resultados: No começo do estudo, o peso corporal médio total para todos os animais foi de 192,62 + 1,429. Apesar dos animais terem ganhado peso durante o perí- —odo de estudo, não havia nenhuma diferença significante entre os grupos. (figuras 17 e 18.) Exame de Von Frey:

A resposta à dor foi avaliada usando aparato de Von Frey (Touch Testº) quanto à alodinia mecânica.

A força de retiradas em gramas foir convertida em log de força de acordo com os valores fornecidos por Touch Testº (Se- ção de Referência 7.1). O log de força necessário para retirada da perna

— saudável (direita) foi dividido pelo log de força necessário para retirada da perna operada (esquerda). O cálculo apresenta os valores de pernas no es- tado saudável próximo a 1 quando a relação entre a força de cada perna for similar.

O aumento nos valores apresenta um estado mais doloroso. (figuras 19,20 e 21.)

Resultados de Von Frey calculados por Divisão de Log:

Ao comparar cada grupo de tratamento com o grupo de controle do Veículo a cada momento, os grupos de tratamentos mostravam alívio da dor signifi- cante como segue:

: Os animais tratados com células em uma baixa concentração 8 (grupo IM) mostravam alívio da dor significante em 7, 10, 26 e 30 dias de 7 estudo em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 1,1

0+0,03 versus 1,17+0,02 no Grupo 4M em 7 dias de estudo (p<0.05). Os animais tratados com células em uma concentração média (grupo 2M) mostravam alívio da dor significante em 7, 10 e 26 dias de estu- do com p<0,05e em 17 e 30 dias de estudo com p<0,01 em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 1,1 0+0,02 versus 1,17=1=0,02 no Grupo 4M em 7 dias de estudo (p<0,05). Os animais tratados com células em uma concentração alta (grupo 3M) mostravam alívio da dor significante em 7, 21, 26 e 30 dias de estudo em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 1,07+0,02 versus 1,17+0,02 em Grupo 4M em 7 dias de estudo (p<0,01). O tratamento com o item de controle positivo, gabapentina (grupo 5M), foi ativo como um composto de alívio de dor durante todos os dias de teste em com- paração com o grupo tratado pelo Veículo: 1,04:+0,02 versus 1,17=1=0,02 no Grupo4Mem7 dias de estudo (p<0,01). Resultados de Von Frey calculados por subtrações simples: Os resultados de Von Frey foram também calculados usando subtração simples:

A força necessária para retirada da perna saudável direita menos a força necessária para retirada da perna dolorosa esquerda. A comparação de valores de Von Frey para cada grupo de tra- tamento com o grupo de controle do Veículo a cada momento mostrava alí- viodador significante como segue. Os animais tratados com células em uma baixa concentração (grupo IM) mostravam alívio da dor significante em 7 dias de estudo (p<0,05) e em 10 e 26 dias de estudo (p < 0,01) em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 15,67+6,18g versus 40,25+5,82g no Grupo 4M em 10diasde estudo (p<0,01). Os animais tratados com células em uma con- centração média (grupo 2M) mostravam alívio da dor significante em 7, 10 e 17 dias de estudo (p<0,05) e em 30 dias de estudo (p<0,01) em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 17,33+6,73g versus . 40,25+5,82g no Grupo 4M em 10 dias de estudo (p<0,05). Os animais trata- dos com células em uma concentração alta (grupo 3M) mostravam alívio da dor significante em 7, 21, 26 e 30 dias de estudo (p<0,01) em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 18,83+8,25g versus 46,67+2,68g no Grupo 4M em 26 dias de estudo (p<0,01). O tratamento com o item de controle positivo, gabapentina (grupo 5M), foi ativo como um com- posto de alívio de dor durante todos os dias de teste em comparação com o grupo tratado pelo Veículo (grupo 4M): 7,92+5,35g versus 40,25+5,82g no Grupo 4M em 10 dias de estudo (p<0,01).

Resultados de Von Frey calculados por subtrações simples ver- sus pré-tratamento: A comparação de valores de Von Frey para cada grupo de tratamento a cada momento com os valores de Von Frey de pré- tratamento medidos em 5 dias de estudo mostrava alívio da dor significante como segue. Os animais tratados com células em uma baixa concentração (grupo 1M) mostravam alívio da dor significante em 7, 21 e 26 dias de estu- do (p<0,05) e em dias de estudo 10, 14 e 17 (p<0e01) em comparação com omesmo grupo em ;s5 dias de estudo antes do tratamento: 28,08+7.30g em 7 dias de estudo versus 46,67+2,79g em 5 dias de estudo (p<0,05). Os ani- mais tratados com células em uma concentração média (grupo 2M) tinham alívio da dor significante em dias de estudo 14 (p<0,05) e em 10, 17 e 30 dias de estudo (p<0,011) em comparação com o mesmo grupo em 5 dias de estudo antes do tratamento: 17,33+6,73g em 10 dias de estudo versus 47,25+2,77g em 5 dias de estudo (p<0,01). Os animais tratados com células em uma concentração alta (grupo 3M) tinham alívio da dor significante du- rante todos os dias de teste (7, 10, 14, 17, 21, 26, 30) em comparação com o mesmo grupo em 5 dias de estudo antes do tratamento: 23,58+6,26g em 7 dias de estudo versus 46,58+2,30g em 5 dias de estudo (p<0,01). O tratamento com o item de controle positivo, gabapentina (gru- po 5SM), tinha alívio da dor significante durante todos os dias de teste em comparação com o mesmo grupo em 5 dias de estudo antes do tratamento: 14,92 + 6,46g em 7 dias de estudo versus 45,17 + 3,66g em 5 dias de estu- do (p<0,01). . Em vista das descobertas obtidas sob as condições deste estu- É 15 doe confinadas aos dados em vida, as huUTC em baixas, médias, e altas - doses foram eficazes como itens analgésicos para dor como refletido nos parâmetros do teste de Von Frey.

EXEMPLO 5: Isolamento de Células Isolamento de célula umbilical.

Os cordões umbilicais foram ob- tidos de Disease Research Interchange (NDRI, Filadélfia, Pa.). Os tecidos foram obtidos após partos normais.

Os protocolos de isolamento de célula foram realizados assepticamente em um capuz de fluxo laminar.

Para remo- ver sangue e resíduos, o cordão foi lavado em solução salina tamponada por fosfato (PBS; Invitrogen, Carlisbad, Ca.) na presença de penicilina a 100 uni- dades/mililitro, estreptomicina em 100 microgramas/mililitro e anfotericina B em 0,25 microgramas/mililitro (Invitrogen, Carlsbad, Ca.). Os tecidos foram em seguida mecanicamente dissociados em 150 cm? de placas de cultura de tecido na presença de 50 mililitros de meio (DMEM - com baixo teor de gli- cosee DMEM-com alto teor de glicose; Invitrogen) até o tecido ser picado em uma polpa fina.

Os tecidos cortados foram transferidos para tubos côni- cos de 50 mililitros (aproximadamente 5 gramas de tecido por tubo).

O tecido foi em seguida digerido em meio DMEM - com baixo te- or de glicose ou meio DMEM - com alto teor de glicose, cada contendo peni- cilina em 100 unidades/mililitro, estreptomicina em 100 microgramas/mililitro, anfotericina B em 0,25 microgramas/mililitro e as enzimas de digestão.

Em alguns experimentos uma mistura de enzima de colagenase e dispase foi usado ("C:D") (colagenase (Sigma, St Louis, Mo.), 500 unidades/miílilitro; e dipase (Invitrogen), 50 unidades/mililitro, em meio DMEM - com baixo teor de glicose). Em outros experimentos uma mistura de colagenase, dispase e hialuronidase ("C:D:H") foi usada (C:D:H = colagenase, 500 unida- desímililitro; dispase, 50 unidades/mililitro; e hialuronidase (Sigma), 5 unida- desímililitro, em DMEM - com baixo teor de glicose). Os tubos cônicos con- tendo o tecido, meio e enzimas de digestão foram incubados a 37ºC em um agitador orbital (Environ, Brooklyn, N.Y.) em 225 rpm durante 2 horas. . Após digestão, os tecidos foram centrifugados a 150 xg durante Ê 15 5 minutos, o sobrenadante foi aspirado.

A pélete foi novamente suspensa em 20 mililitros de meio de cultura (DMEM:baixo teor de glicose (Invitrogen), por cento (volume/volume) e soro bovino fetal (FBS; soro bovino fetal de- finido; Lot XAND18475; Hyclone, Logan, Ut.), 0,001% (volume/volume) de 2- mercaptoetano! (Sigma), penicilina em 100 unidades por mililitro, estreptomi- cinaem 100 microgramas por mililitro, e anfotericina B em 0,25 microgramas por mililitro; (cada de Invitrogen, Carisbad, Ca)). A suspensão celular foi fil- trada através de um coador de células BD FALCON de náilon de 70 mícrons (BD Biosciences, San Jose, Ca.). Uma enxágue de 5 mililitros adicionais compreendendo meio de cultura foi passada através do coador.

A suspen- são celular foi em seguida passada através de um coador de células de nái- lon de 40 micrômetros (BD Biosciences, San Jose, CA) e caçada com um enxágue de mais 5 mililitros de meio de cultura.

O filtrado foi novamente suspenso em meio de cultura (volume total de 50 mililitros) e centrifugado a 150 xg durante 5 minutos.

O sobrena- dante foiaspirado e as células foram novamente suspensas em 50 mililitros de meio de cultura fresco.

Este processo foi repetido mais duas vezes.

Após a centrifugação final, o sobrenadante foi aspirado e o péle-

te de células foi novamente suspenso em 5 minutos de meio de cultura fres- co. O número de células viáveis foi determinado usando manchamento de azul de tripano. As células foram em seguida cultivadas sob condições- padrão. As células isoladas de tecidos do cordão umbilical foram semea- das em 5.000 células/cm? sobre frascos T-75 revestidos por gelatina (Cor- ning Inc., Corning, N.Y.) em meio de cultura. Após dois dias, meio gasto e células não aderidas foram aspirados dos frascos. As células aderidas foram lavadas com PBS três vezes para remover os resíduos e as células deriva- das do sangue. As células foram em seguida reabastecidas com meio de cultura e deixadas cultivar até a confluência (cerca de 10 dias de passagem O (para passagem 1). Nas passagens subsequentes (de passagem 1 para 2 etc), as células alcançaram a subconfluência (75-85 por cento de confluên- : cia) em 4 a 5 dias. Para estas passagens subsequentes, as células foram “15 semeadas em 5.000 células/cm?. As células foram cultivadas em uma incu- - badora umidificada com 5 por cento de dióxido de carbono a 37ºC.

Em alguns experimentos, as células foram isoladas de tecidos do cordão umbilical em meio DMEM - com baixo teor de glicose depois de digeridas com LIBERASETY (2,5 microgramas por mililitro, Blendzima 3; Ro- che Applied Sciences, Indianapolis, IN) e hialuronidase (5 unidades/mililitro, Sigma). A digestão do tecido e isolamento das células foi como descrito para outras digestões acima, entretanto, a mistura LIB ERASETY /hialuronidase foi usada no lugar da mistura de enzima C:D ou C:D:H. A digestão de tecido com LIBERASE"Y resultou no isolamento de populações de tecidos pós- partoque expandiram-se rapidamente.

Os procedimentos foram comparados para isolar as células do cordão umbilical usando combinações de enzima diferentes. As enzimas comparadas para digestão incluíam: i) colagenase; ii) dispase; iii) hialuroni- dase; iv) colagenase:mistura de dispase (C:D); v) colagenase:mistura de —hialuronidase (C:H); vi) dispase:mistura de hialuronidase (D:H); e vii) colage- nase:dispase:mistura de hialuronidase (C:D:H). As diferenças no isolamento das células utilizando estas diferentes condições de digestão de enzima fo-

ram observadas (Tabela 4-1).

Outras tentativas foram feitas para isolar misturas de células de cordão umbilical por métodos diferentes. Em um exemplo, o cordão umbilical foi cortado e lavado com meio de cultura para desalojar os coágulos sanguí- neoseomaterial gelatinoso. A mistura de sangue, material gelatinoso e meio de cultura foi coletada e centrifugada a 150 xg. O pélete foi novamente suspenso e semeado sobre os frascos revestidos por gelatina em meio de cultura. A partir destes experimentos uma população de célula foi isolada, a qual expandiu-se rapidamente.

As células foram também isoladas das amostras de sangue do cordão obtidas de NDRI. O protocolo de isolamento usado foi aquele do Pe- dido de Patente Internacional POCT/US2002/029971 por Ho e outro. As amos- tras (50 mililitro e 10,5 mililitros, respectivamente) de sangue de cordão um- . bilical (NDRI, Filadélfia Pa.) foram misturadas com tampão de lise (155 mili- í 15 molar de cloreto de amônio esterilizados em filtro, 10 milimolar de bicarbona- - to de potássio, 0,1 milimolar de EDTA tamponado a pH 7,2 (todos os com- ponentes de Sigma, St. Louis, Mo.). As células foram lisadas em uma rela- ção de 1:20 de sangue de cordão para tampão de lise. A suspensão celular resultante foi turbilhonada durante 5 segundos, e incubadas durante 2 minu- tosem temperatura ambiente. O lisado foi centrifugado (10 minutos a 200 x g). O pélete de células foi novamente suspenso em Meio Essencial Mínimo Completo (Gibco, Carlsbad Ca.) contendo 10 por cento de soro bovino fetal (Hyclone, Logan Ut.), 4 milimolar de glutamina (Mediatech Herndon, Va.), penicilina em 100 unidades por mililitro e estreptomicina em 100 microgra- mas por mililitto (Gibco, Carlsbad, Ca.). Ás células novamente suspensas foram centrifugadas (10 minutos a 200 x g), o sobrenadante foi aspirado, e o pélete de células foi lavado em meio completo. As células foram semeadas diretamente em frascos T75 (Corning, N.Y.), frascos revestidos por laminina T75, ou frascos revestidos por fibronectina T175 (ambos Becton Dickinson, Bedford, Ma).

Para determinar se as populações podem ser isoladas sob con- dições diferentes e expandidas sob várias condições imediatamente após o

7T8/121 isolamento, as células foram digeridas em meio de cultura com ou sem 0,001 por cento (volume/volume) de 2-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, Mo.), usando a combinação de enzima de C:D:H, de acordo com os proce- dimentos fornecidos acima. Todas as células foram cultivadas na presença de penicilina em 100 unidades por mililitro e estreptomicina em 100 micro- gramas por mililitro. Sob todas as condições testadas as células ligaram-se e expandiram-se bem entre a passagem 0 e 1 (Tabela 4-2). As células em condições 5-8 e 13-16 foram demonstradas proliferarem bem até 4 passa- gens após a semeação, ponto no qual elas foram criopreservadas.

A combinação de C:D:H, forneceu a melhor célula produzida se- guindo o isolamento, e gerou células que expandiram-se para muito mais gerações em cultura do que outras condições (Tabela 4-1). Uma população de células expansível não foi ligada usando colagenase ou hialuronidase + exclusivamente. Nenhuma tentativa foi feita para determinar se este resulta- À 15 doé específico à colagenase que foi testada. - Tabela 4-1: Isolamento de células de tecido do cordão umbilical usando combinações de enzima variadas se:Dispase:Hilauronidase Chave: + = bom, ++ = muito bom, +++ = excelente, X = nenhum sucesso Células ligadas e expandidas bem entre a passagem 0 e 1 sob todas as condições testadas quanto à digestão e desenvolvimento de enzi- mas (Tabela 4-2). As células em condições experimentais 5-8 e 13-16 proli- feraram bem até as 4 passagens após semeação, ponto no qual elas foram criopreservadas. Todas as células foram criopreservadas para outra análise.

Tabela 4-2: Isolamento e expansão de cultura de células pós-parto sob coni- ções de variadas: pa] um [FB [ee] cum Jeso] EmA | oe vo OOTO e bre DT e fi E een SR q breno OT vo Ji E evevislvemo fr fncammma fr esmas conam | 6 oveveshieem Ty canina fio — ese eo namo | le ovemshem | nFooncna vio epervesr | pre AN [e ven eg Ti [1 bre JR o Even TN. e o [je ovarnve fi vma o Jesrroreenem | fe ovanlvem fi fntemena ln fesFor consm) | [5 venho fi neoon — oeevesr — [e love Tv nm ve Poemvesr — As células nucleadas ligaram-se e desenvolveram-se rapida- mente. Estas células foram analisadas por citometria de fluxo e foram simila- resãàs células obtidas por digestão enzimática.

As preparações continham plaquetas e células vermelhas san- guíneas. Nenhuma célula nucleada se ligou e se dividiu durante as primeiras 3 semanas. O meio foi mudado 3 semanas após semeação e nenhuma célu- la foi observada ligar ou desenvolver.

As populações de células podem ser isoladas a partir de tecido umbilical eficientemente usando a combinação de enzima colagenase (a me- taloprotease), dispase (protease neutra) e hialuronidase (enzima mucolítica que quebra ácido ácido hilaurônico). LIBERASE, que é uma mistura de cola- genase e a protease neutra, pode também ser usada. Blendzima 3, que é —colagenase (4 Wunsch unidades/grama) e termolisina (1714 caseína unida- des/grama), foi também usada junto com hialuronidase para isolar as célu-

las. Estas células expandiram-se rapidamente durante muitas passagens quando cultivadas em meio de expansão de crescimento em plásticos reves- tidos por gelatina.

As células foram também isoladas a partir do sangue residual nos cordões, porém não sangue do cordão. A presença de células em coá- gulos de sangue lavados do tecido, que aderem e se desenvolvem sob as condições usadas, pode ser devido às células sendo liberadas durante o processo de dissecação.

EXEMPLO 6 Características de Cultivo de Células O potencial de expansão celular de células derivadas de tecido do cordão umbilical foi comparado com outras populações de células-troncos isoladas. O processo de expansão celular para senescência é referido como - limite de Hayflick (Hayflick L., J. Am. Geriatr. Soc. 1974; 22(1): 1-12; Hayflick õ 15 L, Gerontologist, 1974; 14(1):37-45.

7 Os frascos plásticos de cultura de tecido foram revestidos adi- cionando-se 20 mililitros, 2% (peso/volume), de gelatina (Tipo B: 225 Bloom; Sigma, St Louis, Mo.) a um frasco T75 (Corning Inc., Corning, N.Y.) durante minutos em temperatura ambiente. Após remover a solução de gelatina, 20 10 mililitros de solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Invitrogen, Car- Isbad, Ca.) foram adicionados e em seguida aspirados.

Para comparação de potencial de expansão de crescimento, as populações de células seguintes foram utilizadas; i) células-troncos mesen- quimatosas (MSC; Cambrex, Walkersville, Md.); ii) células derivadas do teci- do adiposo (Patente dos Estados Unidos nº 6.555.374 BI; Pedido de Patente dos Estados Unidos US20040058412); iii) fibroblastos de pele dérmica nor- mal (cc-2509 lot tt 9FO844; Cambrex, Walkersville, Md.); e iv) células deriva- das do umbigo. As células foram inicialmente selecionadas em 5.000 célu- las/em? em frascos T75 revestidos por gelatina em meio de cultura. Para passagens subsequentes, as culturas de células foram tratadas como segue. Após tripsinação, as células viáveis foram contadas após manchamento de azul de tripano. A suspensão celular (50 microlitros) foi combinada com azul de tripano (50 microlitros, Sigma, St. Louis Mo.). Os números de células viá- veis foram estimulados usando um hemocitômetro. Seguindo a contagem, as células foram semeadas em 5.000 cé- lulas/cm? sobre os frascos T75 revestidos por gelatina em 25 mililitros de meio de cultura fresco. As células foram cultivadas em uma atmosfera pa- drão (5 por cento de dióxido de carbono (volume/volume)) a 30ºC. O meio de cultura foi mudado duas vezes por semana. Quando as células alcançaram cerca de 85 por cento de confluência elas foram passadas; este processo foi repetido até as células alcançarem a senescência.

Em cada passagem, as células foram tripsinizadas e contadas. À produção de células viáveis, duplicações de população [In (células fi- nais/células iniciais/In2], e tempo de duplicação (tempo em cultu- ra/duplicação de população) foram calculados. Para os propósitos de deter- : minação da expansão celular ideal, o total da produção de células por pas- sagem foi determinado multiplicando-se a produção total da passagem ante- . rior pelo fator de expansão de cada passagem (isto é, fator de expansão = células finais/células iniciais). O potencial de expansão de células depositado na passagem 10 foi também testado. Um conjunto diferente de condições foi usado. Os fibro- blastosde pele dérmica normal (cc-2509 lot fé 9FO0844; Cambrex, Walkersvil- le, Md.), células derivadas do umbigo, foram testados. Estas populações de célula foram depositadas na passagem 10 anteriormente, tendo sido cultiva- das em 5.000 células/cm? em cada passagem àquele ponto. O efeito de densidade celular sobre as populações de célula após o degelo celular na passagem 10 foi determinado. As células foram descongeladas sob condi- ções padrões e contadas usando manchamento de azul de tripano. As célu- las descongeladas foram em seguida semeadas em 1.000 células/cm? em meio de cultura. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas pa- drões a 30ºC. O meio de cultura foi mudado duas vezes por semana. As cé- lulasforam quando elas alcançaram cerca de 85% de confluência. As célu- las foram subsequentemente passadas até a senescência, isto é, até que elas pudessem ser expandidas novamente. As células foram tripsinizadas e contadas em cada passagem. A produção de células, duplicação de popula- ção (In (células finais/células iniciais)/In2) e tempo de duplicação (tempo em cultura)/duplicação de população) foram calculados. O total da produção de células por passagem foi determinado multiplicando-se a produção total da passagem anterior pelo fator de expansão de cada passagem (isto é, fator de expansão = células finais/células iniciais).

O potencial de expansão de culturas de célula derivada do teci- do do cordão umbilical frescamente isolada sob baixas condições de semea- ção de célula foi testado em outro experimento. As células derivadas do um- bigo foram isoladas como descrito no Exemplo 4. As células foram semea- das em 1.000 células/cm? e passadas como descrito até a senescência. As células foram cultivadas sob condições atmosféricas padrões a 37ºC. O meio de cultura foi mudado duas vezes por semana. As células foram pas- . sadas quando elas alcançaram cerca de 85% de confluência. Em cada pas- sagem, as células foram tripsinizadas e contadas por manchamento de azul - de tripano. A produção de células, duplicação de população (In (célula fi- nal/célula inicial/In 2) e tempo de duplicação (tempo em cultura/duplicação de população) foram calculados para cada passagem. O total da produção de células por passagem foi determinado multiplicando-se a produção total da passagem anterior pelo fator de expansão de cada passagem (isto é, fa- tor de expansão = célula final/célula inicial). As células foram cultivadas em frascos revestidos com gelatina e não gelatina.

Foi demonstrado que as condições de cultura celular em Oz po- dem melhorar a expansão celular em certas circunstâncias (Publicação dos Estados Unidos Número US20040005704). Para determinar se a expansão celular de células derivadas do umbigo pode ser melhorada alternando-se as condições de cultura celular, as culturas de células derivadas do umbigo fo- ram cultivadas em baixas condições de oxigênio. As células foram semea- das em 5,000 células/cm? em meio de cultura em frascos revestidos por ge- latina. As células foram inicialmente cultivadas sob condições atmosféricas padrões através da passagem 5, ponto no qual elas foram transferidas para condições de cultura em oxigênio (5% de O;).

Em outros experimentos as células foram expandidas em placas não revestidas, revestidas por colágeno, revestidas por fibronectina, revesti- das por laminina e revestidas por matrigel.

As culturas foram demonstradas expandirem bem estas matrizes diferentes.

As células derivadas do umbigo expandiram-se para mais do que 40 passagens gerando produções de célula de >IEI 7 células em 60 di- as.

Em contraste, MSCs e fibroblastos senescidos após < 25 dias e <60 di- as, respectivamente.

Embora ambas as células derivadas do tecido adiposo e omentais expandiram-se por quase 60 dias, elas geraram produções de célula totais de 4,5x10"? e 4,24x10? respectivamente.

Desse modo, quando semeadas em 5.000 células/cm? sob as condições experimentais utilizadas, as células derivadas do umbigo expandiram-se muito melhor do que o outro tipo de células cultivadas sob as mesmas condições (Tabela 6-1). - Tabela 6-1: Características de cultivo para populações de células diferentes Ô 15 cultivadas até a senescência se RT O e do tecido adi- poso bwobastos | sea | 2 | 2868 | fossa Toa O OO As células derivadas do umbigo e células fibroblastos expandi- ram para mais do que 10 passagens gerando produções de célula de >IE!I 1 células em 60 dias (6-2). Após 60 dias sob estas condições, os fibroblastos tornaram-se senescidos; enquanto as células derivadas do umbigo senesce- ram após 80 dias, completando >50 duplicações de população.

Tabela 6-2: Características de cultivo para populações de células diferentes usando expansão de cultivo de baixa densidade a partir da passagem 10 através da senescência (P10) As células expandiram-se bem sob as condições de oxigênio re- —duzidas, entretanto, a cultura sob condições de oxigênio baixas não parece ter um efeito significante sobre a expansão celular para células derivadas de tecido do cordão umbilical. As condições atmosféricas-padrão já provaram ser bem-sucedidas para cultivar números suficientes de células, e a cultura em baixo oxigênio não é requerida para o cultivo de células derivadas de “10 tecidodo cordão umbilical. o As condições de expansão celular atuais de cultivo de células derivadas de tecido do cordão umbilical isoladas em densidades de cerca de

5.000 células/cm?, em meio de cultura em frascos revestidos por gelatina ou não revestidos, sob oxigênio atmosférico padrão, são suficientes para gerar grandes números de células na passagem 11. Além disso, os dados suge- rem que as células podem ser facilmente expandidas usando condições de cultura de densidade inferior (por exemplo, 1.000 células/cm?). O tecido de cordão umbilical — expansão celular derivada em condições de oxigênio bai- xas também facilita a expansão celular, embora nenhuma melhora incremen- talno potencial de expansão celular tenha ainda sido observado quando uti- lizando estas condições para cultivo. Atualmente, a cultura de células deri- vadas de tecido do cordão umbilical sob condições atmosféricas-padrão é preferida pra gerar grandes misturas de células. Quando as condições de cultura são alteradas, entretanto, a expansão de célula derivada do tecido do cordão umbilical pode igualmente ser alterada. Esta estratégia pode ser u- sada para realçar a capacidade proliferativa e diferenciativa destas popula- ções de células.

Sob as condições utilizadas, ao mesmo tempo em que o poten- cial de expansão de MSC e células derivadas do tecido adiposo são limita- dos, as células derivadas de tecido do cordão umbilical expandem facilmente para números grandes.

EXEMPLO7 Cultivo de Células em Meio contendo D- Valina Foi reportado que o meio contendo D-valina em vez da isoforma L-valina normal pode ser usado para seletivamente inibir o cultivo de células similares ao fibroblasto em cultura (Hongpaisan, Ceil Biol Int., 2000; 24:1-7; —Sordillo e outro, Cell Biol Int Rep., 1988; 12:355-64.). Os experimentos foram realizados para determinar se as células derivadas de tecido do cordão um- bilical podem desenvolver-se em meio contendo D-valina.

As células derivadas do umbigo (P5) e fibroblastos (P9) foram semeados em 5.000 células/cm? in frascos T75 revestidos por gelatina (Cor- “5 ning, Corning, N.Y.). Após 24 horas o meio foi removido e as células foram - lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carisbad, Ca.) para remover meio residual. O meio foi substituído com meio de cultura modificado (DMEM com D-valina (ordem especial Gibco), 15% (volu- me/volume) de soro bovino fetal dialisado (Hyclone, Logan, Ut.), 0,001% (vo- lume/volume) de betamercaptoetanol (Sigma), penicilina em 50 unida- des/mililitro e estreptomicina em 50 microgramas/mililitro (Gibco)).

As células derivadas do umbigo e células fibroblastos semeadas no meio contendo D-valina não se proliferam, diferente de células semeadas em meio de cultura contendo soro dialisado. As células fibroblastos permuta- ram morfologicamente, aumentando de tamanho e mudando de forma. To- das as células morreram e eventualmente desprenderam-se da superfície do frasco após quatro semanas. Desse modo, pode ser concluído que as célu- las derivadas de tecido do cordão umbilical requerem L-valina para cultivo de célula e para manter a viabilidade a longo prazo. A L-valina é preferivelmen- tenãoremovida do meio de cultura para células derivadas de tecido do cor- dão umbilical.

EXEMPLO 8 Análise de Cariótipo de Células As linhagens de células usadas em terapia celular são preferi- velmente homogêneas e livres de qualquer tipo de célula contaminante.

As células humanas usadas em terapia celular devem ter um número normal (46) de cromossomos com estrutura normal.

Para identificar as linhagens de célula derivada de tecido do cordão umbilical que são homogêneas e livres de células de origem de tecido não pós-parto, os cariótipos de amostras de célula foram analisados.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical de tecido pós-parto de um recém-nascido macho foram cultivadas em meio de cultura.

O tecido de cordão umbilical de um recém-nascido macho (X, Y) foi selecio- nado para permitir a distinção entre células derivadas de neonatal e células : derivadas maternas (XsX). As células foram semeadas em 5.000 células por | 15 centímetro quadrado em meio de cultura em um frasco T75 (Corning, Cor- - ning, N.Y.) e expandidas até 80% de confluência.

Um frasco T75 contendo células foi cheio até o gargalo com meio de cultura.

As amostras foram en- tregues a um laboratório de citogenética clínica por correio (o tempo estima- do de laboratório para laboratório é de uma hora). A análise de cromossomo foirealizada pelo Center for Human & Molecular Genetics na New Jersey Medical School, Newark, N.J.

As células foram analisadas durante a metafa- se quando os cromossomos foram visualizados melhor.

De trinta células em metafase contadas, cinco foram analisadas quanto ao número de cariótipo homogêneo normal (dois). Uma amostra de célula foi caracterizada como homogênea se dois cariótipos fossem observados.

Uma amostra era carac- terizada como heterogênea se mais do que dois cariótipos fossem observa- dos.

As células de metafase adicionais eram contadas e analisadas quando um número de cariótipos heterogêneos (quatro) era identificado.

Todas as amostras de célula enviadas para análise de cromos- —somo foram interpretadas pelo pessoal do laboratório de citogenética como apresentando uma aparência normal.

Três das dezesseis linhagens de célu- las analisadas apresentaram um fenótipo homogêneo (XX e XY) indicando a presença de células derivadas de ambas as origens neonatais e maternas (Tabela 8-1). Cada das amostras de célula foi caracterizada como homogê- nea. (Tabela 8-1).

Tabela 8-1: Resultados de cariótipos de células derivadas de tecido do cor- dãoumbilical contadas analisadas cariótipos ess Ee Os TOS ex) om [6 [a Os TOR sx | me o ese eee so se Chave: N- lado neonatal; V- região vilosa; M- lado de materno; C- clone A análise de cromossomo identificou as células derivadas do umbigo cujos os cariótipos parecem normais quando interpretados por um - laboratório citogenético clínico. A análise de cariótipo também identificou linhagens de células livres de células maternas, como determinado por carió- - tipos homogêneos. EXEMPLO 9: Avaliação Citométrica de Fluxo de Marcadores de Superfície Celular A caracterização de proteínas de superfície de célula ou "marca- dores" por citometria de fluxo pode ser usada para determinar uma identida- de da linhagem celular. A consistência de expressão pode ser determinada a partir de múltiplos doadores, e em células expostas a diferentes condições de processamento e cultura. As linhagens de células isoladas do umbigo foram caracterizadas por citometria de fluxo, fornecendo um perfil para a identificação destas linhagens de células.

As células foram cultivadas em meio de cultura, em frascos de cultura de tecido em T75, T150, e T225 tratados por plasma (Corning, Cor- ning, N. Y.) até confluentes. As superfícies de cultivo dos frascos foram re- vestidas com gelatina incubando-se 2% (peso/volume) de gelatina (Sigma, St Louis, Mo.) durante 20 minutos em temperatura ambiente.

As células aderentes em frascos foram lavadas em solução sali- na tamponada por fosfato (PBS); (Gibco, Carlsbad, Mo.) e desprendidas com tripsina/EDTA (Gibco). As células foram colhidas, centrifugadas, e novamen- te suspensas em 3% (volume/volume) de FBS em PBS em uma concentra- ção de células de 1x10” por mililitto. De acordo com as especificações do fabricante, o anticorpo para o marcador de superfície celular de interesse (veja abaixo)foi adicionado a 100 microlitros de suspensão celular e a mistu- ra foi incubada no escuro durante 30 minutos a 4ºC. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover anticorpo não ligado. As células foram novamente suspensas em 500 microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo. A análise de citometria de fluxo foi reali- zadacom um instrumento FACS calibur (Becton Dickinson, San Jose, Ca.). Os anticorpos seguintes para marcadores de superfície celular foram usados. Tabela 9-1: Anticorpos usados na caracterização de marcadores de superfi- s cie celular de um UDC.

[maDR DP.DA fsnPRamimgentambigga CM fsssse As células do cordão umbilical foram analisadas nas passagens 8, 15, e 20. Para comparar as diferenças entre doadores, as células deriva- das do cordão umbilical de doadores diferentes foram comparadas entre si. As células derivadas do cordão umbilical cultivadas em frascos revestidos por gelatina foram comparadas com células derivadas do cordão umbilical cultivadas em frascos não revestidos.

Quatro tratamentos usados para isolamento e preparação de cé- lulas foram comparados. As células derivadas de tecido pós-parto por trata- mento com: (1) colagenase; (2) colagenase/dispase; (3) colagena- se/hialuronidase; e (4) colagenase/hialuronidase/dispase foram comparadas.

Todas as células derivadas do cordão umbilical nas passagens 8, 15, e 20 analisadas por citometria de fluxo expressaram CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, indicado por fluorescência aumentada em relação ao controle IgG. Estas células foram negativas para CD31, CD34, CDA45, CDI 17, CD141, e HLA-DR, DP, DO, indicado por valo- res de fluorescência consistentes com o controle IgG.

As células derivadas do cordão umbilical isoladas a partir de do- : adores separados analisados por citometria de fluxo, cada mostrada positiva é 15 paraa produção de CD10, CD 13, CD44, CD73, CD 920, PDGFr- alfa e HLA- A, B, C, refletiram nos valores aumentados de fluorescência em relação ao controle IgG. Estas células foram negativas para produção de CD31, CD34, CD45, CDI 17, CD 141, e HLA-DR, DP, DQ com valores de fluorescência consistentes com o controle IgG.

As células derivadas do cordão umbilical expandidas em frascos revestidos por gelatina ou não revestidos analisados por citometria de fluxo foram todas positivas para a produção de CD10, CD 13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-alfa e HLA-A, B, C, com valores aumentados de fluorescência em relação ao controle IgG. Estas células foram negativas para produção de CD31,CD34, CD45, CDI 17, CD 141, e HLA-DR, DP, DO, com valores de fluorescência consistentes com o controle IgG.

A análise de células derivadas do cordão umbilical por citometria de fluxo estabeleceu uma identidade destas linhagens de células. Estas cé- lulas derivadas do cordão umbilical são positivas para CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-alfa, e HLA-A,B,C; e negativas para CD31, CD34, CDA45, CDI 17, CD141 e HLA-DR, DP, DQ. Esta identidade foi consistente entre variações em variáveis incluindo o donor, passagem, revestimento de superfície de vaso de cultura, enzimas de digestão, e camada placental. Al- gumas variações nas medias e faixas de curva de histograma de valor de fluorescência individual foram observadas, porém todas as curvas positivas sob todas as condições testadas foram normais e expressaram valores de fluorescência maiores do que o controle IgG, desse modo confirmando que as células compreendem uma população homogênea que têm expressão positiva dos marcadores. EXEMPLO 10: Análise de Células por Disposição de Oligonucleotídeo As disposições de oligonucleotídeo foram usadas para comparar o perfil de expressão de gene de células derivadas do umbigo e derivadas da placenta com fibroblastos, células-troncos mesenquimatosas humanas, e outra linhagem celular derivada da medula óssea humana. Esta análise for- : neceu uma caracterização das células derivadas de pós-parto e identificou marcadores moleculares únicos para estas células.

» Células derivadas de tecido de pós-parto. Os cordões umbilicais humanos e a placenta foram obtidos de National Disease Research Inter- change (NDRI, Filadélfia, Pa.) de liberações a termo completo normais com consentimento do paciente. Os tecidos foram recebidos e as células foram isoladas como descrito no Exemplo 4 após a digestão com uma mistura de C:D:H. As células foram cultivadas em meio de cultura em frascos de cultura de tecido plásticos revestidos por gelatina. As culturas foram incubados a 37º C com 5% de CO,. Fibroblastos. Os fibroblastos dérmicos humanos foram adquiri- dos de Cambrex Incorporated (Walkersville, Md.; Lot number 9FO0844) e ATCC CRL- 1501 (CCD39SK). Ambas as linhagens foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Invitrogen, Carisbad, Ca.) com 10% (volume/volume) de soro bovino fetal (Hyclone) e penicilina/estreptomicina (Invitrogen)). As célu- las foram cultivadas em plástico tratado por tecido padrão. Células-troncos mesenquimatosas humanas (hMSC). As hMSCs foram adquiridas de Cambrex Incorporated (Walkersville, Md.; Lot numbers 2FI 655, 2FI 656 and 2FI 657) e cultivadas de acordo com as especificações do fabricante em meios MSCGM (Cambrex). As células foram cultivadas em plástico de cultura de tecido padrão a 30ºC com 5% de CO?2.

Células da Medula Óssea da Crista lliaca Humana (ICBM). À medula óssea da crista ilíaca humana foi recebida de NDRI com o consenti- mento do paciente. A medula foi processada de acordo com o método deli- neado por Ho, e outro, (WO03/025149). A medula foi misturada com tampão de lise (155 mM NH,CI, 10 mM KHCO;, e 0,1 mM EDTA, pH 7,2) em uma relação de 1 parte da medula óssea para 20 partes de tampão de lise. À suspensão celular foi turbilhonada, incubada durante 2 minutos em tempera- tura ambiente, e centrifugada durante 10 minutos em 500 xg. O sobrenadan- te foi descartado e o pélete de células foi novamente suspenso em meio-alfa essencial mínimo (Invitrogen) suplementado com 10% (volume/volume) de soro bovino fetal e 4 mM de glutamina. As células foram centrifugadas no- " vamente e o pélete de células foi novamente suspenso em meio fresco. As células mononucleares viáveis foram contadas usando exclusão de azul de 7 tripano (Sigma, St. Louis, Mo.). As células mononucleares foram semeadas em frascos de cultura de tecido plásticos em 5 x 10º células/cm?. As células foram incubadas a 37ºC com 5% de CO, em padrão atmosférico O, ou a 5% de O>. As células foram cultivadas durante 5 dias sem uma mudança de meios. Os meios e células aderentes foram removidos após 5 dias de cultu- ra. As células aderentes foram mantidas em cultura.

As culturas celulares em desenvolvimento ativo foram removidas dos frascos com um raspador celular em solução salina tamponada por fos- fato fria (PBS). As células foram centrifugadas durante 5 minutos em 300 xg.

O sobrenadante foi removido e as células foram novamente suspensas em PBS fresca e centrifugadas novamente. O sobrenadante foi removido e o pélete de células foi imediatamente congelado e armazenado a - 80º C. O MRNA celular foi extraído e transcrito em cDNA. O cDNA foi em seguida transcrito em cRNA e rotulado biotina. O cRNA rotulado biotina foi hibridiza- do com disposições de oligopeptídeo Affymetrix GENECHIP HG-UI 33A (Affymetrix, Santa Clara, Ca.). As hibridizações e coleção de dados foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante. Os dados anali-

sados foram realizados usando software de computador "Significance Analy- sis de Microarrays" (SAM) versão 1.21 (Tusher, V.g. e outro, Proc. Natl. A- cad. Sci. Estados Unidos da América, 2001; 98:5116-5121). As populações de células diferentes foram analisadas neste es- tudo As células juntamente com a informação de passagem, substrato de cultura, e meios de cultura são listados na Tabela 9-1. Tabela 10-1: Células analisadas pelo estudo de microdisposição. As linha- gens de células são listadas por seu código de identificação juntamente com a passagem no tempo de análise, substrato de crescimento de célula, e meios de crescimento. Umbilical (022803) 2 Gelatina |DMEM, 15% de FBS, 2BME Umbilical (042103) 3 Gelatina |DMEM, 15% de FBS, 2BME Umbilical (071003) 4 Gelatina |DMEM, 15% de FBS, 2BME É Placenta (042203) 12 Gelatina |DMEM, 15% de FBS, 2BME Placenta (042903) 4 Gelatina = |DMEM, 15% de FBS, 2BME " Placenta (071003) 3 Gelatina |DMEM, 15% de FBS, 2BME ICBM (070203) (5% 02) |3 Plástico — |MEM 10% de FBS 1ICBM (062703) (std 02) |5 Plástico — |IMEM 10% de FBS ICBM (062703)(5% 02) |5 Plástico — |IMEM 10% de FBS hMSC (Lot 2F1655) 3 Plástico — |MSCGM hMSC (Lot 2F1656) 3 Plástico — |IMSCGM hMSC (Lot 2F1657) 3 Plástico — IMSCGM hFibriblasto (9FO0844) |9 Plástico — IDMEM-F12, 10% de FBS hFibriblasto (CCD39SK) |4 Plástico — /IDMEM-F12, 10% de FBS Os dados foram avaliados por princípio de análise de componen- te com software SAM como descrito acima. A análise revelou 290 genes que foram expressos em quantidades relativas diferentes nas células testadas. Esta análise forneceu comparações relativas entre as populações.

A Tabela 10-2 mostra as distâncias euclidianas que foram calcu- ladas para a comparação dos pares celulares. As distâncias euclidianas fo- ram com base na comparação das células com base no 290 genes que fo- ram diferencialmente expressas entre os tipos de célula. A distância euclidi-

ana é inversamente proporcional à similaridade entre a expressão dos 290 genes.

Tabela 10-2: As distâncias euclidianas para os pares célula.

A distância eu- Clidiana foi calculada para os tipos de célula usando os 290 genes que foram expressos diferencialmente entre os tipos de célula.

A similaridade entre as células é inversamente proporcional da distancia euclidiana.

Par de Célula Distância Euclidiana ICBM-hMSC 24,71 Placenta-umbilical 25,52 ICBM-Fibroblast 36,44 ICBM-Placenta 37,09 Fibroblast-MSC 39,63 ICBM-Umbilical 40,15 : Fibroblast-Umbilical 41,59 ' MSC-Placenta 42,84 MSC-Umbilical 46,86 ICBM-Placenta 48,41 Tabelas 10-3, 104, e 10-5 mostram a expressão de genes au- mentados em células derivadas de tecido umbilical (Tabela 10-3) e células derivadas de placenta (Tabela 10-4), aumentadas em, e reduzidas em célu- lasderivadas de cordão umbilical e placenta (Tabela 10-5). Tabela 10-3: Genes que são especificamente aumentados em expressão em células derivadas do cordão umbilical quando comparados às outras linha- gens de células ensaiadas.

Sonda ID de NCBI (atividade estimuladora de crescimento de melanoma

Genes aumentados em Células Derivadas do Umbigo Conjunto de Nome de Gene Número de Acesso Sonda ID de NCBI 206336 at Ligante 6 de quimiocina (Motivo C-X-C) |NM 002993 (proteína 2 quimiotática de granulócito) 207850 at Ligante 3 de quimiocina (Motivo C-X-C) NM 002090 202644 s at fator de necrose tumoral, alfa-proteina 3/NM 006290 induzida Tabela 104: Genes que são especificamente aumentados em expressão nas células derivadas da placenta em comparação com outras linhagens de célula ensaiadas Genes Aumentados em Células Derivadas de Placenta Conjunto de Número de Acesso -J 209732 at jLectinatipoC (dependente de cálcio, domínio |AFO70642 : de reconhecimento de carboidrato), membro 2 : de superfamília (activation-induced) 206067 s at |Tumor 1 de Wilms NM 024426 207016 s at |Família de aldeído desidrogenase 1, membro A2 210004 at |Receptor 1 de lipoproteína de baixa densidade |AFO035776 oxidada (similar à lecitina) 214993 at Homo sapiens, clone IMAGE:4179671, mRNA, j|AFO70642 cds parciais proteína cinase C, zeta NM 002744 209780 at jproteina hipotética DKFZp564F013 AL136883 204135 at |Sub-regulado em câncer ovariano 1 NM 014890 213542 at |Homo sapiens MRNA; cDNA DKFZp547K1113 |AI246730 (de clone DKFZp547K1113)

Tabela 10-5: Genes que foram diminuídos em expressão nas células deriva- das de placenta e derivadas de cordão umbilical quando comparados às ou- tras linhagens de células ensaiadas.

Genes Diminuídos em Células Derivadas de Umbigo e Placenta Conjunto de Número de Acesso de 205824 at proteina 2 27kDa de choque térmico NM 001541.1 209687 at |quimiocina (Motivo C-X-C) ligante 12 (fator 1 U 19495.1 derivado de célula do estroma) 203666 at |quimiocina (Motivo C-X-C) ligante 12 (fator 1 NM 000609.1 derivado de célula do estroma) 212670 at Jelastina (estenose aórtica supravascular, Sín- = [AA479278 drome de Williams-Beuren) 213381 at |Homo sapiens MRNA; cDNA DKFZp586M2022 (de clone DKFZp586M2022) " 206201 s at |/homeocaixa 2 do mesênquima (homeocaixa NM 005924.1 específica de interrupção de crescimento) - 205817 at Homólogo 1 de homeocaixa Sine oculis (Droso- |NM 005982.1 . |phila) 209283 at lcristalina, alfa B AFO07162.1 212793 at ativador de morfogênese 2 associado com di- = |[BF513244 shevelied 213488 at |Proteina DKFZPS86B2420 ALOS0143.1 1205200 at |Tetranectina (proteína de ligação de plasmino- |NM 003278.1 gênio) 205743 at Jhomologia três de src (SH3) e domínio rico em = |NM 0031491 cisteina 200921 s at |Gene 1 de translocação de célula B, antiprolife- |NM 001731.1 rativa 206932 at jeolesterol 25-hidroxilase NM 003956.1 204198 s at |Fator 3 de transcrição relacionado a nanismo — [AAS41630 219747 at iproteína hipotética FLJ23191 NM 024574.1 204773 at |Receptor de interleucina 11, alfa NM 004512.1 202465 at |Realçador de endopeptidase C de procolágeno |NM 002593.2 203706 s at |homólogo 7 de Frizzled (Drosophila) NM 003507.1 212736 at gene hipotético BCO0NS967 BE299456 214587 at |Colágeno, tipo VIII, alfa 1 BE877796 201645 at |Tenascina C (hexabraquion) NM 002160.1

Genes Diminuídos em Células Derivadas de Umbigo e Placenta Conjunto de Número de Acesso de 210239 at |Proteína 5 de homeocaixa de iroquois U90304.1 205816 at lintegrina, beta 8 NM 0022141 203069 at |Glicoproteína2 da vesicular sináptica NM 014849.1 213909 at |Homo sapiens CDNA FLJ12280 fis, clone AU147799 MAMMA 1001744 206315 at [Fator 1 similar ao receptor de citocina NM 004750.1 204401 at intermediário de potássio/canal ativado por cál- |NM 002250.1 cio de pequena condução, subfamíliar N, mem- bro 4 216331 at lintegrina, alfa 7 | AK022548.1 1209663 s at integrina, alfa 7 AFO072132.1 213125 at iproteina DKFZP586L151 | AWO0O7573 202133 at jco-ativador transcricional com motivo de ligação |AA081084 de PDZ (TAZ) ' homólogo 2 de homeocaixa Sine oculis (Droso- INM 016932.1 " |phila)

í 213435 at proteína KIAA1I034 | ABO028957.1 206115 at resposta 3 de crescimento inicial NM 0044301 213707 s at /|homeocaixa 5 menos distal NM 005221.3 218181 s at proteína hipotética FLJ20373 NM 0177921 209160 at Família 1 de aldo-ceto reductase, membro C3 — J|ABO18580.1

(hidroxiesteroide desidrogenase 3-alfa, tipo 1) 1202132 at |Co-ativador transcricional com motivo de ligação [AA081084 de PDZ (TAZ) 214701 s at |fibronectina 1 [AJ276395.1 1205422 s at ilntegrina, tipo beta 1 (com domínios de repeti- |NM 004791.1 ção de EGF) Clone EUROIMAGE 214927 at [1968422 de cDNA de inserção de comprimento |AL359052.1 total de MRNA de Homo sapiens 1206070 s at [EphA3 [AF213459.1 212805 at [Proteína KIAR0367 |ABO02365.1 219789 at Receptor de peptídeo natriurético C/guanilato | AIS28360 cilase C (receptor C de peptídeo atrionatriuréti- co)

(de clone DKFZp564B222) (myobrevin) contendo EGF adeno vírus EIB c oxidase (músculo) similar à insulina, 368kDa í As tabelas 10-6, 10-7, e 10-8 mostram a expressão de genes " aumentados em fibroblastos humanos (Tabela 10-6), células de ICBM (Ta- bela 10-7), e MSCs (Tabela 10-8). Tabela 10-6: Genes que foram aumentados em expressão em fibroblastos quando comparados às outras linhagens de células ensaiadas. fosfatatase/fofodiesterase 4 (função putativa) sapiens; CDONA DKFZp564A072 (de clone DKFZp564A072)

rato) de realçador de gene de polipeptídeo kappa light em células B, Tabela 10-7: Genes que foram aumentados em expressão nas células deri- vadas de ICBM quando comparados às outras linhagens de células ensaia- das. ó acetilgalactosaminiltransferase 3 (GalNAc-T3) são sexual autossômica) Tabela 10-8: Genes que foram aumentados em expressão nas células MSC quando comparados às outras linhagens de células ensaiadas.

: : O presente exemplo foi realizado para fornecer uma caracteriza- ção das células derivadas de cordão umbilical e placenta. Esta análise inclu- iu células derivadas de três cordões umbilicais diferentes e três placentas diferentes. O estudo também incluiu duas linhagens diferentes de fibroblas- tos dérmicos, três linhagens de células-troncos mesenquimatosas, e três linhagens de células da medula óssea da crista iíaca. O MRNA que foi ex- presso por estas células foi analisado em uma disposição de oligopeptídeo GENECHIP que tontinha sondas de oligonucleotídeo para 22.000 genes. A análise revelou que as transcrições para 290 genes eram pre- sentes em diferentes quantidades nestes cinco tipos celulares diferentes. Estes genes incluem sete genes especificamente aumentados nas células derivadas de tecido umbilical e dez genes que são especificamente aumen- tados nas células derivadas de placenta. Cinquenta e quatro genes foram descobertos ter níveis de expressão especificamente inferiores em células derivadas de cordão umbilical e derivadas de placenta.

A expressão de genes selecionados foi confirmada por PCR, como mostrado no Exemplo 10. As células derivadas de pós-parto geralmen-

te, e células derivadas umbilicais, em particular, têm perfis de expressão de gene distintos, por exemplo, em comparação com outras células humanas, tais como células derivadas da medula óssea e fibroblastos testados aqui.

EXEMPLO 11 Marcadores de Célula Os perfis de expressão de gene de células derivadas de cordão umbilical foram comparados com aqueles de células derivadas de outras fontes usando um Affymetrix GENECHIP.

Seis genes de "assinatura" foram identificados: receptor de LDL oxidado 1, interleucina-8 (IL-8), renina, reticu- lon, ligante receptor de quimiocina 3 (CXC ligante 3), e proteína quimiotática de granulócito 2 (GCP-2). Estes genes de "signature" foram expressos em níveis relativamente altos em células derivadas do umbigo.

Os procedimentos descritos neste exemplo foram conduzidos : para verificar os dados de microdisposição e compará-los para expressão de genee proteína, bem como estabelecer uma série de ensaios confiáveis pa- f ra detecção de identificadores únicos para células derivadas de tecido do cordão umbilical.

As células derivadas do umbigo (quatro isoladas), e fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF; neonatal e adulto) foram cultivados em meio de cultura em frascos T75 revestidos por gelatina, as células-troncos mesenquimatosas (MSCs) foram cultivadas em meio de cultura de célula tronco de Kkit de bala mesenquimatosa (MSCGM; Cambrex, Walkerville, Md.). Para os experimentos IL-8, as células foram descongeladas a partir de nitrogênio líquido e semeadas em frascos revestidos por gelatina em5.000 células/cm?, cultivadas durante 48 horas em meio de cultura e em seguida cultivadas durante 8 horas em 10 mililitros de meio de inanição de soro [DMEM1- com baixo teor de glicose (Gibco, Carisbad, Ca.), penicilina (50 unidades/mililitro), estreptomicina (50 microgramas/mililitro)(Gibco) e 0,1% (peso/volume) de Albumina de soro bovina (BSA; Sigma, St.

Louis, Mo) O RNA foi em seguida extraído e os sobrenadantes foram centrifuga- dos a 150 xg durante 5 minutos para remover os tecidos celulares.

Os so- brenadantes foram congelados a -80ºC até a análise de ELISA.

As células derivadas do cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados de prepúcio neonatal humano, foram cultivadas em meio de cultura em frascos T75 revestidos por gelatina. As células foram congela- das na passagem 11 em nitrogênio líquido. As células foram descongeladas etransferidas para tubos de centrífuga de 15 mililitros. Após centrifugação a 150 xg durante 5 minutos, o sobrenadante foi descartado.

As células foram novamente suspensas em 4 mililitros de meio de cultura e contadas. As células foram cultivadas em um fraco de 75 cm? contendo 15 mililitros de meio de cultura em 375.000 célula/frasco durante 24 horas. O meio foi mudado para um meio de inanição de soro durante 8 horas. O meio de inanição de soro foi coletado no final da incubação, centri- fugado a 14.000 xg durante 5 minutos (e armazenado a -20ºC).

Para estimar o número de células em cada frasco, 2 mililitros de É tripsina/EDTA (Gibco, Carlsbad, Ca.) foram adicionados a cada frasco. Após as células desprenderem do fraco, a atividade de tripsina foi neutralizada : com 8 mililitros de meio de cultura. As células foram transferidas para um tubo de centrífuga de 15 mililitro e centrifugadas a 150 xg durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e 1 mililitro de meio de cultura foi adicionado a cada tubo para novamente suspender as células. O número de célula foi de- terminado com um hemocitômetro.

A quantidade de IL-8 secretada pelas células em meio de inani- ção de soro foi analisada usando ensaio de ELISA (R&D Systems, Minnea- polis, Mn.). Todos os ensaios foram conduzidos de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

O RNA foi extraído de células e fibroblastos derivados de cordão umbilical confluentes, ou para expressão de IL-8, de células tratadas como descrito acima. As células foram lisadas com 350 microlitros de tampão RLT contendo beta-mercaptoetanol (Sigma, St. Louis, Mo.) de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit; Qiagen, Valencia, Ca.). O RNA foi extraído de acordo com as instruções do fabricante (RNeasy Mini Kit; Qia- gen, Valencia, Ca.) e submetido ao tratamento de DNase (2,7 unida- des/amostra) (Sigma St. Louis, Mo.). O RNA foi eluído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80ºC. O RNA foi também extraído de cordão umbilical humano. O tecido (30 microgramas) foi suspenso em 700 microlitros de tampão RLT contendo beta-mercaptoetanol. As amostras foram mecanicamente homogenizadas e a extração de RNA processada de —acordocom a especificação do fabricante. O RNA foi extraído com 50 micro- litros de água tratada com DEPC e armazenado a -80ºC.

O RNA foi reversamente transcrito usando hexâmeros randômi- cos com os reagentes de transcrição reversa TagMan (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) a 25ºC durante 10 minutos, 37ºC durante 60 minutos, e 95ºC durante 10 minutos. As amostras foram armazenadas a -20ºC.

Os genes identificados por microdisposição de cCDNA como ex- clusivamente regulado em células do cordão umbilical (genes de assinatura - incluindo receptor de LDL oxidado, interleucina-8, renina, e reticulon), foram é também investigados usando PCR em tempo real e convencional. A PCR convencional foi realizada em amostras de DNA usando " produtos de expressão de gene vendidos sob o nome comercial produtos de expressão de gene de Assays-On-Demand (Applied Biosystems). O receptor de LDL oxidado (Hs00234028); renina (HsOO166915); reticulon (Hs00382515); ligante CXC 3 (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103); e GAPDH foram misturadas com cDNA e TaqMan Universal PCR master mix de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosys- tems) usando um sistema de detecção de 7000 sequências com software ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). As condições de ciclotérmico foram inicialmente 50ºC durante 2 minutos e 95ºC durante 10 minutos, se- —guidos por 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos e 60ºC durante 1 minuto. Os dados de PCR foram analisados de acordo com as especificações do fabricante (User Bulletin %2 from Applied Biosystems for ABI Prism 7700 Se- quence Detection System).

O PCR convencional foi realizado usando um ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Boston, Ma.) para confirmar os resultados de PCR em tempo real. A PCR foi realizada usando 2 microlitros de tampão de PCR de mistura universal de solução de cDNA de 1x Taq polimerase

(nome comercial AMPLITAQ GOLD) (Applied Biosystems) e desnaturação a 94ºC durante 5 minutos.

A amplificação foi otimizada para cada conjunto de iniciador.

Para IL-8, ligante CXC 3, e reticulon (94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos e 72ºC durante 30 segundos para 30 ciclos); pa- ra renina (94ºC durante 15 segundos, 53ºC durante 15 segundos e 72ºC durante 30 segundos para 38 ciclos); para receptor de LDL oxidado e GAP- DH (94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 15 segundos e 72ºC durante 30 segundos para 33 ciclos). Os iniciadores usados para amplificação são listados na Tabela 11-1. A concentração de iniciador na reação PCR final era

1 micromolar, exceto para GAPDH que era de 0,5 micromolar.

Os iniciadores de GAPDH eram iguais para PCR em tempo real, exceto que a sonda Taq- Man do fabricante não foi adicionada à reação PCR final.

As amostras foram separadas em 2% (peso/volume) de gel de agarose e manchadas com bro-

É meto de etídio (Sigma, St.

Louis, Mo.). As imagens foram capturadas em 667 filmes (Universal Twinpack, VWR International, South Plainfield, N.J.) usan-

É do uma câmera POLAROID de distância focal (VWR International, South Plainfield, N.J.). Tabela 11-1: Iniciadores usados a Nome iniciador iniciadores

—ReceptordeLDL oxidado S: S- GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3 (SEQ ID NO: 1)

A: S-AGAATGGAAAACTGGAATAGG -3' (SEQ ID NO:2) Renina S: S-TCTTCGATGCTTCGGATTCC -3' (SEQ ID NO:3)

A: S-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG -3' (SEQ ID NO:4) Reticulon S: 5- TIACAAGCAGTGCAGAAAACC-3' (SEQ ID NO:5)

A: 5º AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3' (SEQ ID NO:6) Interleucina-8 S: S- TCOTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3' (SEQ ID NO:7)

A: S-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3' (SEQ ID NO:8) Quimiocina (CXC) ligante 3 — S:5º- COCACGCCACGCTCTCC-3' (SEQ ID NO:9) A: S-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC -3' (SEQ ID NO:10)

As células derivadas do cordão umbilical foram fixadas com 4% (peso/volume) de paraformaldeído frio (Sigma- Aldrich, St.

Louis, Mo.) duran- te 10 minutos em temperatura ambiente.

Um isolado de cada das células derivadas do cordão umbilical na passagem 0 (PO) (diretamente após o iso- lamento) e passagem 11 (P1 1) (dois isolados de células derivadas do cor-

dão umbilical) e fibroblastos (P1 1) foram usados.

A imunocitoquímica foi realizada usando anticorpos direcionados contra os seguintes epítopos: vi-

mentina (1:500, Sigma, St. Louis, Mo.), desmina (1:150; Sigma - elevada contra coelho; ou 1:300; Chemicon, Temecula, Ca. - elevada contra rato,), alfa-actina do músculo liso (SMA; 1:400; Sigma), citoqueratina 18 (CKI 8; 1:400; Sigma), fator de von Willebrand (VWWF; 1:200; Sigma), e CD34 (CD34 humano classe Ill; 1:100; DAKOCytomation, Carpinteria, Ca.). Além disso, os marcadores seguintes foram testados nas células derivadas do cordão umbilical de passagem 11: GROalfa anti-humano - PE (1: 100; Becton Dic- kinson, Franklin Lakes, N. J.), GCP-2 anti-humano (1:100; Santa Cruz Biote- ch, Santa Cruz, Ca.), receptor de LDL oxidado anti-humano 1 (ox-LDL RI; 1:100; Santa Cruz Biotech), e NOGA-A anti-humano (1:100; Santa Cruz, Bio- tech).

As culturas foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e expostas a uma solução bloqueadora de proteína contendo : PBS, 4% (volume/volume) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, Ca.), e 0,3% (volume/volume) de Triton (Triton X-100; Sigma, St. Louis, Mo.) duran- E: te 30 minutos para acessar antígenos intracelulares. Onde o epítopo de inte- resse foi localizado na superfície celular (CD34, ox-LDL RI), o Triton X-100 foi omitido em todas as etapas do procedimento para impedir a perda de epí- topo. Além disso, nos exemplos onde o anticorpo primário foi elevado contra cabra (GCP-2, ox-LDL RI, NOGO-A), 3% (volume/volume) de soro de burro foi usado em vez de soro de cabra ao longo do processo. Os anticorpos pri- múários, diluídos em solução bloqueadora, foram em seguida aplicados às culturas durante um período de 1 hora em temperatura ambiente. As solu- ções de anticorpo primário foram removidas e as culturas foram lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de anticorpo secundário (1 hora em temperatura ambiente) contendo bloqueio juntamente com IgG de cabra an- tirrato - Texas Red (1:250; Molecular Probes, Eugene, Or.) e/ou IgG de ca- bra anticoelho - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes) ou IgG de burro antica- bra - FITC (1: 150, Santa Cruz Biotech). As culturas foram em seguida lava- dase10 micromolares de DAPI (Molecular Probes) aplicados durante 10 minutos para visualizar os númcleos das moléculas. Após o imunomanchamento, a fluorescência foi visualizada u-

sando um filtro de fluorescência apropriado em um microscópio epi- fluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, N.Y.). Em todo caso, si- nal de fluorescência representado por manchamento positivo acima do man- chamento de controle onde todo o procedimento delineado acima foi seguido coma exceção de aplicação de uma solução de anticorpo primário (nenhum 1º de controle). Imagens representativas foram capturadas usando uma câ- mera de vídeo a cores digital e o soffware ImagePro (Media Cybernetics, Carisbad, Ca.). Para amostras triplamente manchadas, cada imagem foi to- mada usando apenas um filtro de admissão uma vez.

As montagens em ca- —madas foram em seguida preparadas usando o software Adobe Photoshop

(Adobe, San Jose, Ca.). As células aderentes em frascos foram lavadas em solução sali- na tamponada por fosfato (PBS) (Gibco, Carlsbad, Ca.) e desprendidas com á Tripsina/EDTA (Gibco, Carisbad, Ca.). As células foram colhidas, centrifuga- das,e novamente suspensas em 3% (volume/volume) FBS em PBS em uma : concentração de células de 1x10º/mililitro.

Alíquotas de cem microlitros fo- ram liberadas para tubos cônicos.

As células manchadas para antígenos intracelulares foram permeabilizadas com Perm/tampão de lavagem (BD Pharmingen, San Diego, Ca.). O anticorpo foi adicionado às alíquotas de acordo com especificações do fabricante, e as células foram incubadas du- rante 30 minutos no escuro a 4ºC.

Após a incubação, as células foram lava- das com PBS e centrifugadas para remover anticorpo em excesso.

As célu- las requerendo um anticorpo secundário foram novamente suspensas em 100 microlitros de 3% de FBS.

O anticorpo secundário foi adicionado de a- cordocom especificação do fabricante, e as células foram incubadas no es- curo durante 30 minutos a 4ºC.

Após a incubação, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover anticorpo secundário em excesso.

As células lavadas foram novamente suspensas em 0,5 mililitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo.

Os seguintes anticorpos foram usados: receptor de LDL oxidado 1 (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, Ma.), capa de IgG1 de rato, (P-4685 e M-5284; Sigma), e IgG de burro contra cabra (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.). Análise de citometria de fluxo foi realizada com FACScalibur (Becton Dickinson San Jose, Ca.).

Os resultados de PCR em tempo real para genes de "assinatura” selecionados realizado em cDNA de células derivadas de cordão umbilical — humano, fibroblastos adultos ou neonatais, e células-troncos mesenquimato- sas (MSCs) indicam que tanto a expressão de reticulon quanto de receptor de LDL oxidado foram superiores em células derivadas do umbigo quando comparado com outras células. Os dados obtidos de PCR em tempo real foram analisados pelo método de AACT e expressos em uma escala loga- rítmica. Nenhuma diferença significante em níveis de expressão de ligante CXC 3 e GCP-2 foi encontrada entre células de pós-parto e controles. Os resultados de PCR em tempo real foram confirmados por PCR convencional.

O sequenciamento de produtos de PCR também validou estas observações.

É Nenhuma diferença significante no nível de expressão de ligante CXC 3 foi encontrada entre células de pós-parto e controles usando iniciadores de |i- gante CXC 3 de PCR convencional listados na Tabela 11-1.

A expressão da citocina, IL-8 em células derivadas do cordão umbilical foi elevada em células derivadas de cordão umbilical privadas de soro e cultivadas em meio de cultura. Todos os dados de PCR em tempo real foram validados com PCR convencional e por sequenciamento de pro- dutos de PCR.

Após o cultivo em meio livre de soro, os meios condicionados fo- ram examinados quanto à presença de IL-8. As quantidades maiores de IL-8 foram detectadas em meios nos quais as células umbilicais foram cultivadas (Tabela 11-2). Nenhum IL-8 foi detectado em meio no qual fibroblastos dér- micos humanos foram desenvolvidos. Tabela 11-2: expressão de proteína IL-8 medida por ELISA Frobiastos humanos ND [ssisto Tde Placenta ND | sia 2 de Place IND

BME) lulas derivadas de umbigo e derivadas de placenta bem como fibroblastos de pele humana.

Os valores apresentados aqui são picograma/milhão de células, n=2, sem.

ND: Não detectado As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem O foram sondadas quanto à produção de proteínas selecionadas por análise imunocitoquímica.

Imediatamente após o isolamento (passagem 0), as célu- las foram fixadas com 4% de paraformaldeído e expostas a anticorpos por seis proteínas: fator de von Willebrand, CD34, citoqueratina 18, desmina, alfa-actina do músculo liso, e vimentina.

As células derivadas do cordão um- f bilical eram positivas para alfa-actina do músculo liso e vimentina, com o õ padrão de manchamento consistente através da passagem 11. A produção de GROalfa, GCP-2, receptor de LDL oxidado 1 e —reticulon (NOGO-A) em células derivadas do cordão umbilical na passagem 11 foi investigada por imunocitoquímica.

As células derivadas do cordão um- bilical eram GCP-2 positivas, porém a produção de GRO alfa não foi detec- tada por este método.

Além disso, as células eram NOGO-A positivas.

A conformidade entre níveis de expressão de gene medidos por microdisposição e PCR (tanto em tempo real quanto convencional) foi esta- belecida para quatro genes: receptor de LDL oxidado 1, renina, reticulon, e IL-8. A expressão destes genes foi diferencialmente regulada no nível de MRNA em células derivadas do cordão umbilical, com Ii-8 também diferen- cialmente regulada no nível de proteína.

A expressão diferencial de GCP-2 e ligante CXC 3 não foi confirmada no nível de MRNA.

Embora este resultado não sustente dados originalmente do experimento de microdisposição, este pode ser devido a uma diferença na sensibilidade das metodologias.

As células derivadas do cordão umbilical humano na passagem O foram sondadas quanto à expressão de alfa-actina do músculo liso e vi- mentina, e eram positivas para ambas.

O padrão de manchamento foi pre-

servado através da passagem 11.

Em conclusão, os dados de MRNA completos pelo menos parci- almente verificam os dados obtidos a partir do experimentos de microdispo- sição.

EXEMPLO12 Caracterização Imuno-histoquímica e Fenótipos Celulares Os fenótipos de células encontradas dentro do cordão umbilical humano foram analisados por imuno-histoquímica.

O tecido do cordão umbilical humano foi colhido e a imersão fi- xadaemd4% (peso/volume) de paraformaldeído durante a noite a 4ºC. A i- muno-histoquímica foi realizada usando anticorpos direcionados contra os seguintes epítopos (veja Tabela 12-1): vimentina (1:500; Sigma, St. Louis, Mo.), desmina (1: 150, elevada contra coelho; Sigma; ou 1:300, elevada con- E tra rato; Chemicon, Temecula, Ca.), alfa-actina do músculo liso (SMA; 1:400; Sigma), citoqueratina 18 (CKI 8; 1:400; Sigma), fator de von Willebrand (vWF; 1:200; Sigma), e CD34 (CD34 humano classe III; 1: 100; DAKOCyto- mation, Carpinteria, Ca.). Além disso, os marcadores seguintes foram testa- dos: GROalfa-PE anti-humano (1:100; Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.), GCP-2 anti-humano (1:100; Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, Ca.), recep- tordeLDL oxidado anti-humano 1 (ox-LDL RI; 1: 100; Santa Cruz Biotech), e NOGO-A anti-humano (1: 100; Santa Cruz Biotech). Os espécimes foram aparados com um escalpelo e colocados dentro do composto de inclusão OCT (Tissue- Tek OCT; Sakura, Torrance, Ca.) em um banho de gelo seco contendo etanol. Os bloqueios congelados foram em seguida seccionados (10 mícrons de espessura) usando um criostato padrão (Leica Microsys- tems) e montados sobre lâminas de vidro para manchamento.

A imuno-histoquímica foi realizada similarmente aos estudos an- teriores (por exemplo, Messina, e outro, Exper. Neurol, 2003; 184: 816-829). As secções de tecido foram lavadas com solução salina tamponada por fos- fato (PBS) e expostas a uma solução bloqueadora de proteína contendo PBS, 4% (volume/volume) de soro de cabra (Chemicon, Temecula, Ca.), e 0,3% (volume/volume) de Triton (Triton X-100; Sigma) durante 1 hora para acessar antígenos intracelulares. Nos exemplos onde epítopo de interesse pode ser localizado sobre a superfície celular (CD34, ox-LDL RI), Triton foi omitido em todas as etapas do procedimento para impedir a perda de epíto- po. Além disso, nos exemplos onde o anticorpo primário foi elevado contra cabra(GCP-2, ox-LDL RI, NOGO-A), 3% (volume/volume) de soro de burro foi usado em vez de soro de cabra ao longo do procedimento. Os anticorpos primários, diluídos em solução bloqueadora, foram em seguida aplicados às seções durante um período de 4 horas em temperatura ambiente. As solu- ções de anticorpo primário foram removidas, e as culturas lavadas com PBS antes da aplicação de soluções de anticorpo secundário (1 hora em tempe- ratura ambiente) contendo bloqueio juntamente com IgG-T exas Red de ca- bra antirrato (1:250; Molecular Probes, Eugene, Or.) e/ou IgG-Alexa 488 de cabra anticoelho (1:250; Molecular Probes) ou IgG-FITC de burro anticabra (1:150; Santa Cruz Biotech). As culturas foram lavadas, e 10 micromolares de DAPI (Molecular Probes) foram aplicados durante 10 minutos para visua- lizar os núcleos das células.

Após o imunomanchamento, a fluorescência foi visualizada u- sando o filtto de fluorescência apropriado em um microscópio epi- fluorescente invertido Olympus (Olympus, Melville, N.Y.). O manchamento positivo foi representado por sinal de fluorescência acima do manchamento de controle. As imagens representativas foram capturadas usando uma câ- mera de vídeo a cores digital e o software ImagePro (Media Cybernetics, Carisbad, Ca.). Para as amostras triplamente manchadas, cada imagem foi tomada usando apenas um filtro de admissão uma vez. As montagens em camadas foram em seguida preparadas usando o software Adobe Photo- shop (Adobe, San Jose, Ca.).

Tabela 12-1: Sumário de Anticorpos Primários Usados Anticorpo Concentração Vendor Vimentina 1 500 Sigma, St. Louis, MO Desmina (rb) 1 150 Sigma Desmina (m) 1 300 Chemicon, Temecula, CA

Anticorpo Concentração Vendor Alfa-actina do músculo 1 400 Sigma liso (SMA) Citoquerati- (CK18) 1:400 Sigma na 18 Fator de von Willebrand — 1:200 Sigma (WWF) CD34 Il 1 100 DakoCytomation, Carpinteria,

CA GROalfa-PE 1 100 BD, Franklin Lakes, NJ GCP-2 1 100 Santa Cruz Biotech Ox-LDL RI 1 100 Santa Cruz Biotech NOGO-A 1 100 Santa Cruz Biotech Os marcadores vimentina, desmina, SMA, CKI 8, uWF, e CD34 ! foram expressos em um subgrupo das células encontradas dentro do cordão à: umbilical (dados não mostrados). Em particular, as expressões de vWWF e CD34 eram restritas aos vasos sanguíneos contidos dentro do cordão. As células CD34+ eram nas camadas mais internas (lado do lúmen). A expres- são de vimentina era encontrada por toda a matriz e vasos sanguíneos do cordão. A SMA era limitada à matriz e paredes externas da artéria e veia, porém não contidas dentro dos próprios vasos. A CK18 e a desmina eram observadas dentro dos vasos apenas, a desmina sendo restrita às camadas intermediárias e externas. Nove destes marcadores foram observados dentro do cordão umbilical! (dados não mostrados). A vimentina, desmina, alfa-actina do músculo liso, citoqueratina 18, fator de von Willebrand, e CD 34 são expressos em células dentro do cordão umbilical humano. Com base nos estudos de caracterização in vitro mostrando que apenas vimentina e alfa-actina do músculo liso são expres- sas, os dados sugerem que o processo atual de isolamento de célula deriva- da do cordão umbilical colhe uma subpopulação de células ou que as células isoladas mudam a expressão de marcadores para expressar vimentina e —alfa-actina do músculo liso.

EXEMPLO 13 Secreção de Fatores Tróficos por Células A secreção de selecionada de fatores tróficos de células deriva- das do umbigo foi medida.

Os fatores foram selecionados, os quais têm ati- vidade angiogênica tal como fator de crescimento de hepatócito (HGF) (Ro- sen e outro, Ciba Found.

Symp., 1997; 212:215-26), proteína quimiotática de monócito 1 (MCP-I) (Salcedo e outro, Sangue, 2000; 96;34-40), interleucina- 8 QL-S) (Li e outro, J. immunol., 2003; 170:3369-76), fator de crescimento de ceratinocita (KGF), fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fatorde crescimento endotelial vascular (VEGF) (Hughes e outro, Ann.

Tho- rac.

Surg., 2004; 77:812-8), inibidor de tecido de matriz metaloproteinase 1 (TIMP1), angiopoietina 2 (ANG2), fator de crescimento derivado de plaque- tas (PDGFbb), trombopoietina (TPO), factor de crescimento epidérmico de p ligação de heparina (HB- EGF), fator derivado do estroma 1 alfa (SDF-1 al- fa)), atividade neurotrófica/neuroprotetora (fator neurotrófico derivado do cé- f rebro (BDNF) (Cheng e outro, Dev.

Biol, 2003; 258;319-33), interleucina-6 (IL-6), proteína-2 quimiotática derivada de granulócito (GCP-2), fator trans- formador do desenvolvimento beta2 (TGFbeta2)), ou atividade de quimiocina (proteína inflamatória de macrófagos 1 alfa (MIP1 alfa), proteína inflamatória de macrófagos | beta (MIP1ibeta), quimioatraente-1 de monócito (MCP-1), Rantes (regulado em ativação, célula T normal expressa e secretada), 1309, timo e quimiocina regulada em ativação (TARC), Eotaxina, quimiocina deri- vada de macrófagos (MDC), e IL-8. As células derivadas de cordão umbilical, bem como fibroblastos humanos derivados de prepúcio neonatal humano, foram cultivadas em meio de cultura em frascos T75 revestidos por gelatina.

As células foram criopre- servadas na passagem 11 e armazenadas em nitrogênio líquido.

Após des- congelamento, o meio de cultura foi adicionado às células, seguido por transferência para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugação das célulasa150xg durante 5 minutos.

O pélete de células foi novamente sus- penso em meio de cultura de 4 mililitros, e as células foram contadas.

As células foram semeadas em 5.000 células/cm? em frascos T75, cada con-

tendo 15 mililitros de meio de cultura, e cultivadas durante 24 horas. O meio foi permutado para um meio livre de soro (baixo teor de glicose (Gibco), 0,1% (peso/volume) de albumina de soro bovina (Sigma), penicilina (50 uni- dades/mililitro) e estreptomicina (50 microgramas/mililitro, Gibco)) durante 8 horas. O meio livre de soro condicionado foi coletado no final da incubação por centrifugação a 14.000 xg durante 5 minutos e armazenados a -20ºC. Para estimular o número de células em cada frasco, as células foram lavadas com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e despren- didas usando 2 mililitros de tripsina/EDTA (Gibco). A atividade de tripsina foi inibida pela adição de 8 mililitros de meio de cultura. As células foram centri- fugadas a 150 xg durante 5 minutos. O sobrenadante foi removido, e as cé- lulas foram novamente suspensas em 1 mililitro de meio de crescimento. O número de célula foi estimado com um hemocitômetro.

| As células foram cultivadas a 37ºC em 5% de dióxido de carbo- noe oxigênio atmosférico. A quantidade de MCP-I, IL-6, VEGF, SDF-1 alfa, ii GCP-2, IL-8, e T]GF-beta2 produzida por cda amostra de célula foi determi- nado por ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Mn.). Todos os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do fabricante. Os valores apresen- tados são picogramas por mililitro por milhão de células (n=2, sem).

As quimiocinas (MIP1 alfa, MiPlbeta, MCP-l, Rantes, 1309, TARC, Eotaxina, MDC, IL8), BDNF, e fatores angiogênicas (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMPI, ANG2, PDGFbb, TPO, HB-EGF foram medidos usando Searchlight Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc.). As Proteome Ar- rays são ELISAs sanduíche multiplexados para a medição quantitativa de duasa dezesseis proteínas por cavidade. As disposições são produzidas manchando-se um padrão de 2 x 2, 3 x 3, ou 4 x 4 de quatro a dezesseis anticorpos de captura diferentes em cada cavidade de uma placa de 96 ca- vidades. Seguindo um procedimento de ELISA sanduíche, a placa inteira é imageada para capturer o sinal quimioluminescente gerado em cada mancha dentrode cada cavidade da placa. O sinal gerado em cada mancha é pro- porcional à quantidade de proteína alvo no padrão original amostra.

MCP-I e IL-6 foram secretadas por por células derivadas do um-

bigo e fibroblastos dérmicos (Tabela 13-1). SDF-1alfa e GCP-2 foram secre- tadas por fibroblastos. GCP-2 e IL-8 foram secretadas por células derivadas do umbigo. TGF-beta2 não foi detectada de qualquer tipo de célula por ELI- SA.

Tabela 13-1: Resultados de ELISA: Detecção de Fatores Tróficos [e Ts Tv [sore [eor2 | ne T Tere | aan fm fon fara for rm fo o Umbilical — [1150+74 |4234+289 160+11 |2058+145 azar fm pente po po fe ls Po Umbilical — [2794+84 |1356+43 2184+98 [2369+23 es OA [O OO Chave: ND: Não detectado ., =/- sem Ensaio de SearchLight Multiplexed ELISA. TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIPIbeta, MCP1, RANTES, 1309, TARC, MDC, . e IL-8 foram secretados de PPDCs derivadas de umbigo (Tabelas 13-2 e 13- 3) Nenhum Ang2, VEGF, ou PDGFbb foi detectado.

f Tabela 13-2: Resultados de ensaio de SearchLight Multiplexed ELISA [er Tanes[PnGAa] Teo TKer] nor | For Tvecr fassar[ son] re ficas fo fio — fasos Tso fio wo Tere fis Jo | [ur armas fio fio izsoo ss Teses fizs7 fo Jos Tres7| [oa Jfetasoo fno fio ias fo f1os6 fos fio js sses] Chave: hFB (fibroblastos humanos), U1 (PPDC derivada de umbigo (022803)), U3 (PPDC derivada de umbigo (07 1003)). ND: Não detectado. Tabela 13-3: Resultados de ensaio de SearchLight Multiplexed ELISA [| TuPaTMmPS ] mori | raNTES | 1309 | TARC Teo] voc [ne | lnFe fo o fss no No jon no no hlooss | [o no ao fresaa fio fes fire Tio ras stesoo [55 fio sa forsz fas me fera fio as Trostsa| Chave: hFB (fibroblastos humanos), U1 (PPDC derivada de umbigo (022803)), U3 (PPDC derivada de umbigo (07 1003)). ND: Não detectado.

As células derivadas do umbigo secretaram vários fatores trófi- cos. Alguns destes fatores tróficos, tais como HGF, bFGF, MCP-I e IL-8, a- presentam papéis importantes em angiogênese. Outros fatores tróficos, tais como BDNF e IL-6, têm papéis importantes na regeneração ou proteção neural. EXEMPLO 14 Imunologia /n vitro As linhagens de células de cordão umbilical eram avaliadas in vi- tro quanto às suas características imunológicas em um esforço para prever a resposta imunológica, se existir, estas células elicitariam em transplante in vivo. As linhagens de células de cordão umbilical foram ensaiadas por cito- metria de fluxo para a expressão de HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86,eB7-H2. Estas proteínas são expressas por células apresentadoras de antígeno (APC) e são requeridas para a estimulação direta de células CD4* T naive (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5º edição (2003) Saunders, Filadélfia, p. 171). As linhagens de células foram Ê também analisadas por citometria de fluxo para a expressão de HLA-G (Ab- bas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5º edição (2003) Saun- ' ders, Filadélfia, p. 171), CD178 (Coumans, e outro, Journal of Immunological Methods, 1999; 224, 185-196), e PD-L2 (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5º edição (2003) Saunders, Filadélfia, p. 171; Brown, e outros, The Journal of Immunology, 2003; 170, 1257-1266). A expressão destas proteínas por células residindo em tecidos placentais é pensada para mediar o estado imunoprivilegiado de tecidos placentais no útero. Para pre- ver a extensão a qual as linhagens de células derivadas de umbigo de pós- parto elicitaram uma resposta imune in vivo, as linhagens de células foram testadas em uma reação de linfócito misturada unidirecional (MLR).

As células foram cultivadas em meio de cultura (DMEM - com baixo teor de glicose (Gibco, Carlsbad, Ca.), 15% (volume/volume) de soro bovino fetal (FBS); (Hyclone, Logan, Ut.), 0,001% (volume/volume) betamer- captoetanol (Sigma, St. Louis, Mo.), 50 unidades/mililitro de penicilina, 50 microgramas/mililitro de estreptomicina (Gibco, Carisbad, Ca.) até a conflu- ênciaem frascos T75 (Corning, Corning, N.Y.) revestidos com % de gelatina (Sigma, St. Louis, Mo.).

As células foram lavadas em solução salina tamponada por fos-

fato (PBS) (Gibco, Carisbad, Ca.) e desprendidas com Tripsina/EDTA (Gib- co, Carisbad, Ca.). As células foram colhidas, centrifugadas, e novamente suspensas em 3% (volume/volume) de FBS em PBS em uma concentração de células de 1x10” por mililitro.

O anticorpo (Tabela 14-1) foi adicionado a cem microlitros de suspensão celular de acordo com as especificações do fabricante e incubado no escuro durante 30 minutos a 4ºC.

Após a incuba- ção, as células foram lavadas com PBS e centrifugadas para remover anti- corpos não ligados.

As células foram novamente suspensas em quinhentos microlitros de PBS e analisadas por citometria de fluxo usando um instru- —mentoFACS calibur (Becton Dickinson, San Jose, Ca.). Tabela 14-1: Anticorpos [raDRORDa — fenrRaminsen an Diego.

Ca) Jssssse — É | - Jess — eprnamingen (San Diego, Ca) [assess — | dongo Os frasconetes criopreservados de células derivadas de cordão umbilical de passagem 10 rotuladas como linhagens de células A foram em- baladas em gelo seco e enviadas para CTBR (Senneville, Quebec) para conduzir a reação de linfócito misturada usando CTBR SOP no.

CAC-031. As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram coletadas de múltiplos doadores voluntários machos e fêmeas.

A PBMC alogênica es- timuladora (doador), PBMC autóloga, e linhagens de células derivadas do tecido do cordão umbilical foram tratadas como mitomicina C.

As células es- timuladoras tratadas com mitomicina C e autólogas foram adicionadas às PBMCs respondedoras (receptoras) e cultivadas durante 4 dias.

Após a in-

cubação, a [ºH]timidina foi adicionada a cada amostra e cultivada durante 18 horas. Após a colheita das células, o DNA radiorrotulado foi extraído, e a incorporação de [H]-timidina foi medida usando um contador de scintilação.

O índice de estimulação para o doador alogênico (SIAD) foi cal- culadocomo a proliferação média do receptor mais doador alogênico tratado com mitomicina C dividida pela proliferação de referência do receptor. O in- dice de estimulação das células derivadas do cordão umbilical foi calculado como a proliferação média do receptor mais linhagem de célula derivada do tecido do cordão umbilical tratada por mitomicina dividida pela proliferação dereferência do receptor.

Seis doadores de sangue voluntários humanos foram analisados para identificar um único doador alogênico que apresentará uma resposta de proliferação robusta em uma reação de linfócito misturada com os outros Ê cinco doadores de sangue. Este doador foi selecionado como o doador de controle positivo alogênico. Os cinco doadores de sangue restantes foram , selecionados como receptores. O doador de controle positivo alogênico e as linhagens de células derivadas de cordão umbilical foram tratados por mito- micina e cultivados em uma reação de linfócito misturada com os receptores alogênicos individuais. As reações foram realizadas em triplicata usando du- as placas de cultura de célula com três receptores por placa (Tabela 14-2). O índice de estimulação médio variava de 6,5 (placa 1) a 9 (placa 2) e os controles positivos de doador alogênico variava de 42,75 (placa 1) a 70 (pla- ca 2) (Tabela 14-3).

Tabela 14-2: Dados de Reação de Linfócito Misturada — Linhagem de Célula A (Cordão Umbilical) DPM para Placa de Ensaio de Proliferação ID: Platel Número Sistema de Cultura Réplicas ev analítico 1 2 3 IM04- Linha de base de proliferação de 1074 406 39 623,7) 39007| 62,5 2478 receptor 672 510 1402 861,3] 475,19] 55,2 Controle de autoestimulação (célu- | | 43777 48391 38231] [43466,3/5087,12] 11,7 las autólogas tratadas por mitomíci- || 2914 5622 6109) | 4881,7/172136| 35,3 naC) Doador alogênico de MLR IM04- 2477 (tratado por mitomicina C) MLR com linhagem de célula (linha- gem tipo A tratada por mitomicina C) SI (doador) SI (linhagem de célula) E MS de IMO04- Linha de base de proliferação de 530 508 527/| 521,7 | 11%8| 23 2479 receptor 701 567 1111|| 793,0 |28343| 35,7 Controle de autoestimulação (célu- 25593 24732 22707||24344,0|148161| 6,1 las autólogas tratadas por mitomici- 50868 3932 1497||3505,0 183221) 52,3 naC) Doador alogênico de MLR IM04- 2477 (tratado por mitomicina C) . MLR com linhagem de célula (linha- gem tipo A tratada por mitomicina C) esmero 7 IMO4- Linha de base de proliferação de 1192 854 1330||1125,3|24490| 21,8 2480 receptor 2963 993 2197||2051,0|99308| 484 Controle de autoestimulação (célu- | | 25416 29721 23757 | |26298,0| 307827] 11,7 las autólogas tratadas por mitomici- | [| 2598 5076 3426|/3699,3/126239| 34,1 naC) Doador alogênico de MLR IM04- 2477 (tratado por mitomicina C) MLR com linhagem de célula (linha- gem tipo A tratada por mitomicina C) S! (doador) S! (inhagem de célula) a NE Linha de base de proliferação de receptor Controle de autoestimulação (célu- AIRE 695 451 555|| 567,0 [1224216 IM04- las autólogas O por mitomici- 738 1252 464|| 818,0 | 40004| 48,9 2481 " 13177 2488515444 | [17835,3|620952| 34,8 Doador alogênico de MLR IM04- e C já 2477 (tratado por mitomicina C) || 9995 3671 4674 || 4280,0 | 53495 | 12,5 MLR com linhagem de célula (linha- gem tipo A tratada por mitomicina C) Sitcosaon S tinegemes criar — [| ss TA

Placa ID: Placa 2 Número Sistema de Cultura Réplicas cv analítico 1 2 3 IMO4-2482 — |Linha de base de proliferação 432 533 274/| 4130 130,54 31,6 de receptor 1459 633 50 896,7 487,31 54,3 Controle de autoestimulação — || 24286 30823 31346|| 28818,3 | 393382 | 137 (células autólogas tratadas por | | 2762 1502 6723/| 3662,3 2724,46 74,4 mitomicina C) Doador alogênico de MLR 1M04-2477 (tratado por mito- micina C) MLR com linhagem de célula (linhagem tipo A tratada por mitomicina C) Sitdsado Si cinnagemes cia (o [Rs [TA IMO4-2477 — |Linha de base de proliferação 312 419 349 || 360,0 |54,34 123,50 (doador alo- [de receptor Controle de auto- 567 604 374 515,0 gênico) estimulação (células autólogas tratadas por mitomicina) Linhagem de |Linha de base de proliferação 5101 3735 2973 || 3936,3 1078,19 27,4 céluta tipo A |de receptor Controle de auto- || 1924 4570 2153 || 28823 | 1466,04 | 509 E estimulação (células autólogas (tratadas por mitomicina) Tabela 14-38: Índice de estimulação médio de células derivadas do cordão umbilical e um doador alogênico em uma reação de linfócito misturada com cinco receptores alogênicos individuais. [ata fue A Placa 1 (receptores 1-4) 42,75 [| ss | Pecazíemntor o [ro a Os histogramas de células derivadas do cordão umbilical anali- sadas por citometria de fluxo mostram a expressão negativa de HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86, e B7-H2, como observado por valor de fluorescência consistente com o controle de IgG, indicando que as linhagens de células derivadas de cordão umbilical carecem de moléculas de superfície celular requeridas para diretamente estimular as PBMCs halogênicas (por exemplo, células CD4* T). Os histogramas de células derivadas do cordão umbilical anali- sadas por citometria de fluxo mostram expressão negativa de PD-L2, como observado pelo valor de aumentado de fluorescência em relação ao controle de IgG, e expressão negativa de CD 178 e HLA-G, como observado por va- lor de fluorescência consistente com o controle de IgG.

Nas reações de linfócito misturadas conduzidas com linhagens de células derivadas de cordão umbilical, o índice de estimulação médio va- riaram de 6,5 a 9, e aquele dos controles positivos alogênicos variaram de 42,75 a 70. As linhagens de células derivadas de cordão umbilical eram ne- gativas para a expressão das proteínas estimulantes HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86, e B7-H2, quando medidas por citometria de fluxo.

As linhagens de células derivadas de cordão umbilical eram negativas para a expressão de proteínas imunomoduladoras HLA-G e CD 178 e positivas pa- ra a expressão de PD-L2, quando medidas por citometria de fluxo.

As PBMCs doadoras halogênicas continham células apresentadoras de antíge- Ê no expressando HLA-DP, DR, DO, CD80, CD86, e B7-H2, desse modo per- mitindo a estimulação de PBMCs alogênicas (por exemplo, células CD4* T naive). A ausência de moléculas de superfície de célula apresentadora de antígeno em células derivadas do cordão umbilical requeridas para a estimu- lação direta de PBMCs alogênicas (por exemplo, células naive CD4+ T) e a presença de PD-L2, uma proteína imunomoduladora, pode ser responsável pelo índice de estimulação apresentado por estas células em um MLR em comparação com controles alogênicos.

EXEMPLO 15 As funções de telomerase para sintetizar repetições de telômero que servem para proteger a integridade de cromossomos e prolongar o perí- odo de vida replicativo de células (Liu, K, e outro, PNAS, 1999: 96:5147- 5152). A telomerase consiste em dois componentes, padrão de RNA de te- lomerase (hTERT) e transcriptase reversa de telomerase (hTERT). A regula- ção de telomerase é determinada por transcrição de hTERT mas não hTERT.

Reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) para MBRNA de hTERT desse modo é um método aceito para determinar a atividade de telomerase de células.

Isolamento de Célula Os experimentos de PCR em tempo real foram realizados para determinar a produção de telomerase de células derivadas de tecido do cor- dão umbilical humanas.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical humano foram preparadas de acordo com os exemplos de 4 a 14 e os e- xemplos apresentados na Série de Pedido dos Estados Unidos nº 10/877,012 (o pedido '012). Geralmente, os cordões umbilicais obtidos de National Disease Research Interchange (Filadélfia, Pa.) após uma liberação normal eram lavados para remover sangue e resíduos e mecanicamente dissociados.

O tecido foi em seguida incubado com enzimas de digestão incluindo colagenase, dispase e hialuronidase em meio de cultura a 37ºC.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical humano foram cultivadas de acordo com os métodos apresentados nos exemplos do pedido '012. As cé- S lulas-troncos mesenquimatosas e fibroblastos de pele dérmica normal (cc- 2509 lot 9FO844) foram obtidos de Cambrex, Walkersville, Md.

Uma linha- Ê gem de célula de carcinoma (teratoma) embrional testicular humano pluripo- tente, células nTera-2 (NTERA- 2 cl.DI), (veja, Plaia e outro, Stem Cells, 2006; 24(3):531-546) foi adquirida de ATCC (Manassas, Va.) e foi cultivada de acordo com os métodos apresentados no pedido '012. Isolamento de RNA Total RNA foi extraído das células usando kit de RNeasyº (Qiagen, Valencia, Ca.). O RNA foi eluído com 50 microlitros de água tratada com DEPC e armazenado a -80ºC.

O RNA foi transcrito reverso usando hexâme- ros randômicos com os reagentes de transcrição reversa TagManº (Applied Biosystems, Foster City, Ca.) a 25ºC durante 10 minutos, 37ºC durante 60 minutos e 95ºC durante 10 minutos.

As amostras foram armazenadas a - 20ºC.

PCR em Tempo real A PCR foi realizada em amostras de DNA usando o Applied Bi- — osystems Assays- On-Demand"'"“ (também conhecido como TaqManº Gene Expression Assays) de acordo com as especificações do fabricante (Applied Biosystems). Este kit comercial é amplamente usado para ensaio para telo-

merase em células humanas.

Resumidamente, hTERT (gene de telomerase humano) (HsOO 162669) e GAPDH humano (um controle interno) foram misturados com cDNA e TaqgManº Universal PCR master mix usando um sistema de detecção de 7000 sequências com soffware ABI prism 7000 SDS (Applied Biosystems). As condições de ciclotérmico foram inicialmente 50ºC durante 2 minutos e 95ºC durante 10 minutos seguidos por 40 ciclos de 95ºC durante 15 segundos e 60ºC durante 1 minuto.

Os dados de PCR fo- ram analisados de acordo com as especificações do fabricante.

As células derivadas de tecido do cordão umbilical humano (ATCC acesso nº PTA-6067), fibroblastos, e células-troncos mesenquimato- sas foram ensaiadas para hTERT e RNA 18S.

Como mostrado na Tabela 15-1, hNTERT, e em consequência telomerase, não foi detectado em células derivadas de tecido do cordão umbilical humano.

S Tabela 15-1 EEEF esta | O suma mo E ao o Tm a ND-não detectado; + sinal detectado Células derivadas de tecido do cordão umbilical humano (Isolato 022803, ATCC acesso nº PTA-6067) e células nTera-2 foram ensaiadas e os resultados não mostraram nenhuma expressão da telomerase em dois gru- pos de células derivadas de tecido do cordão umbilical humano ao mesmo tempo em que a linhagem de célula de teratoma revelou alto nível de ex- pressão (Tabela 15-2). Tabela 15-2 [Fes] mer DO Te TO [Le ess fer Josa nomear | es [es [an eg en) ss persa O [Ee es es DOI Portanto, pode ser concluído que células derivadas de tecido umbilical humanas não expressam telomerase.

Claims

. . 114 . REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma população de células isoladas derivadas de teci- do do cordão umbilical, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de dor neuropática, em que a referida população de células é derivada do tecido do cordão umbilical humano subs- tancialmente livre de sangue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultura e é negativa para CD117.

2. Uso de uma população de células isoladas derivadas de teci- do do cordão umbilical, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de espasticidade neural, em que a refe- rida população de células é derivada do tecido do cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultura e é negativa para CD117.

3. Uso de células derivadas de tecido do cordão umbilical do pa- ciente, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um medicamento para o tratamento de dor neuropática, em que as referidas células são deri- vadas do tecido de cordão umbilical humano substancialmente livre de san- gue, são capazes de autorrenovação e expansão em cultura e são negativas para CD117.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as células derivadas de tecido do cordão umbilical não expressam hTERT ou telomerase.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbilicalnão expressam hTERT ou telomerase.

6. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbilical é administrada localmente a um sítio de tecido.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato dequea população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbi- lical é administrada proximal ou distal ao sítio de tecido pelo uso de um caté- ter, seringa, desvio, stent, microcatéter, bomba, implante com um dispositivo,

. . 2/4 : ou implante com um andaime.

8. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a população de células isoladas derivadas do tecido do cordão umbilical é administrada sistemicamente.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbi- lical é administrada intravenosamente, interperitonealmente, intra-arterial, ou por meio de seringas com agulhas ou catéteres com ou sem dispositivos de bomba.

10. Uso de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pe- lo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbilical compreende veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis selecionados do grupo que consiste em: solução salina, soluções tampão aquosas, solventes, composição de meio de dispersão e uma mistura dos mesmos.

11. Uso de acordo com a reivindicação 6 ou 8, caracterizado pe- lo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbilical compreende ainda um ou mais hidrogéis que são selecionados do grupo que consiste em: colágeno, atelocolágeno, fibrina, trombina-fibrina, e uma mistura dos mesmos.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a população de células isoladas derivadas de tecido do cordão umbilical compreende células que são geneticamente modi- ficadas para produzir produtos de gene terapeuticamente úteis ou para pro- duzir agentes para facilitar ou suportar formação ou crescimento de tecido neural.

13. Composição usada para tratar dor crônica, a referida compo- sição caracterizada pelo fato de que compreende veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e uma população de células derivadas de te- —cidodo cordão umbilical, em que a referida população de células é derivada do tecido do cordão umbilical humano substancialmente livre de sangue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultura e é negativa para CD117.

. 14. Composição usada para tratar dor neuropática, a referida composição caracterizada pelo fato de que compreende veículos e/ou dilu- entes farmaceuticamente aceitáveis e uma população de células derivadas de tecido do cordão umbilical, em que a referida população de células é de- —rivadado tecido do cordão umbilical humano substancialmente livre de san- gue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultura e é negativa para CD117.

15. Composição usada para tratar espasticidade, a referida composição caracterizada pelo fato de que compreende veículos e/ou dilu- entes farmaceuticamente aceitáveis e uma população de células derivadas de tecido do cordão umbilical, em que a referida população de células é de- rivada do tecido do cordão umbilical humano substancialmente livre de san- gue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultura e é negativa para CD117.

16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 15, caracterizada pelo fato de que os veículos e/ou diluentes far- maceuticamente aceitáveis são selecionados do grupo que consiste em: so- lução salina, soluções tampão aquosas, solventes, composição de meio de dispersão e uma mistura dos mesmos.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 15, a referida composição caracterizada pelo fato de que compre- ende ainda um ou mais hidrogéis selecionados do grupo que consiste em: colágeno, atelocolágeno, fibrina, trombina-fibrina, e uma mistura dos mes- mos.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 15, a referida composição caracterizada pelo fato de que compre- ende ainda uma população de células derivadas de um ou mais dos seguin- tes tecidos: tecido dérmico, tecido vascular, tecido conjuntivo, cartilagem, tecido adiposo, tecido muscular, tendões ou ligamentos.

S0

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 13 a 15, caracterizada pelo fato de que a referida população de células compreende células geneticamente modificadas que produzem produtos de |

. gene terapeuticamente úteis, produzem agentes para facilitar ou suportar a formação ou crescimento de tecido neural, ou produzem fatores para recru- tar células progenitoras para a área de dano neural.

20. Kit usado para tratar dor crônica, dor neuropática ou espasti- cidade, o referido kit caracterizado pelo fato de que compreende uma popu- lação de células derivadas de tecido do cordão umbilical, um veículo farma- ceuticamente aceitável e/ou diluente e um hidrogel, em que a referida popu- lação de células é derivada do tecido do cordão umbilical humano substan- cialmente livre de sangue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultu- raeé negativa para CD117.

21. Kit usado para tratar dor crônica, dor neuropática ou espasti- cidade, o referido kit caracterizado pelo fato de que compreende uma popu- lação de células huTC, um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitá- vel e um constructo de colágeno ou fibrina-trombina, em que a referida popu- lação de células é derivada do tecido do cordão umbilical humano substan- cialmente livre de sangue, é capaz de autorrenovação e expansão em cultu- ra e é negativa para CD117.

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