CN1582297A - 奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达 - Google Patents

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Abstract

连接两种或多种奈瑟球菌蛋白质从而使它们被翻译成一条多肽链。提供分子式为NH2－A－[－X－L－] n－B－COOH的杂合蛋白质，其中X是一种氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N－末端氨基酸序列，B是任选的C－末端氨基酸序列，n是大于1的整数。蛋白质中各n－X－部分的序列与其它－X－部分具有序列相同性，这种蛋白质是一种串联蛋白质。

Description

奈瑟球菌蛋白质的杂合和串联表达
所有本文所引用文献全部纳入本文供参考。
技术领域
本发明属于蛋白质表达领域。具体涉及奈瑟球菌(Neisseria)(如淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeaee)或优选脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis))的蛋白质表达。
背景技术
参考文献1和2揭示了参考文献3到6所述奈瑟球菌蛋白质表达的一种另和改进的方法。一个这种方法是生成“杂合性”蛋白质，此蛋白中两种或多种奈瑟球菌蛋白质表达为一条多肽链。此方法有两个优点。首先，自身表达可能不稳定或弱的蛋白质可通过加入适当的伴侣来协助克服其问题。第二，简化工业生产，因为仅需采用一次表达和纯化即可产生两种单独有用的蛋白质。
本发明的一个目标是进一步提供另一种和改进的奈瑟球菌蛋白质表达方法。
发明概述
杂合蛋白质
因此发明提供同时表达两种或多种(如3、4、5、6或更多)奈瑟球菌蛋白质的方法，其中连接所述两种或多种蛋白质从而使它们被翻译成一条多肽链。一般，本发明的杂合蛋白质可表示为公式NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中X是一条氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数。
n的值在2和x之间，x的值通常是3、4、5、6、7、8、9或10。n优选是2、3或4；更优选是2或3；最优选n＝2。
-X-部分
本发明有两种主要的杂合蛋白质组。这两组不互相排斥。
在第一组中，各-X-部分是：
(a)orf1、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列；
(b)与(a)的氨基酸序列有序列相同性的氨基酸序列；或
(c)含(a)的氨基酸序列片段的氨基酸序列
优选(a)的亚组是：orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。更优选的(a)的亚组是：orf46.1、287、741和961。图3显示优选的杂合蛋白质。
在第二组中，该杂合蛋白质包括第一个-X-部分(-Xa-)和第二个-X-部分(-Xb-)。-Xa-部分具有下列氨基酸序列之一：
(d)参考文献3所述的446个偶数序列编号SEQ IDs(即2、4、6…890、892)；
(e)参考文献4所述的45个偶数SEQ IDs(即2、4、6…88、90)；
(f)参考文献5所述的1674个偶数SEQ IDs 2-3020、偶数SEQ IDs 3040-3114和所有的SEQ IDs 3115-3241；
(g)参考文献7的2160个氨基酸序列，NMB0001到NMB2160；
(h)参考文献1或2所述的氨基酸序列。
-Xb-部分与-Xa-的关系如下：(i)-Xb-与-Xa-具有序列相同性和/或(j)-Xb-包括-Xa-的片段。
此第二种杂合性蛋白质例子包括的蛋白质中有两个或多个相同的-X-部分，或它们是同一蛋白质的变体，如同一蛋白质的两种多态，可表示为-Xa-Xb-；三种多态型，可表示为-Xa-Xb-Xc等。
-Xa-Xb-部分可以是从N-末端到C-末端的任一顺序。
-Xa-部分优选是orf1、orf4、orf25、orf40、off46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列。-Xa-部分更优选是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961和983。-Xa-部分最优选是：orf46.1、287、741或961氨基酸序列。
这些蛋白质中，各n-X-部分与其它各-X-部分具有序列相同性，此蛋白质称为“串联蛋白质”。优选n＝2的串联蛋白质。
(b)和(i)中的‘序列相同性’程度优选大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高直至100％)。这包括突变体、同源物、直向同源物、等位基因变体等(如参见参考文献8)。相同性优选通过MPSRCH程序(Oxford Molecular)中应用的Smith-Waterman同源性检索算法来确定，使用参数空格开放罚分(gap openpenalty)＝12和空格延伸罚分(gap extension penalty)＝1的相关空格检索。通常，将两个蛋白质间50％或更高的相同性视为功能相等的指征。
(c)和(j)中所指‘片段’应包括(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的氨基酸序列的至少m个连续氨基酸，取决于具体序列。m是7或更大(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更大)。
这些片段优选包含(a)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)氨基酸序列的抗原表位。优选的片段见参考文献9和10所述。
优选的(c)和(j)片段是C-和/或N-末端的截短物(如Δ1-287、Δ2-287等)。
优选的(b)、(c)和(j)序列删除了聚甘氨酸序列。已发现这样有助于表达[参考文献2]。聚甘氨酸序列可表示为(Gly)g，其中g≥3(如4、5、6、7、8、9或更大)。如果-X-部分包含其野生型中的聚甘氨酸序列，在本发明的杂合蛋白质中优选删除此序列。这可以通过破坏或去除(Gly)g，如通过缺失(如CGGGGS→CGGGS、CGGS、CGS或CS)、通过取代(如CGGGGS→CGXGGS、CGXXGS、CGXGXS等)和/或通过***(如CGGGGS→CGGXGGS、CGXGGGS等)而实现。优选缺失(Gly)g，缺失直至包含聚甘氨酸序列的蛋白质N-末端部分(如缺失SEQ ID 1中的残基1-32)本文称为‘ΔG’。删除聚甘氨酸序列具体用于蛋白质287、741、983和Tbp2(ΔG287、ΔG 741、ΔG 983和ΔG Tbp2-参考文献1和2)。
优选的(c)和(j)片段删除了整个蛋白质结构域。这具体用于蛋白质961、287和ORF46。一旦蛋白质在概念上分成结构域，(c)和(j)片段可删除一个或多个这些结构域(如287B、287C、287BC、ORF461-433、ORF46433-608、961c-参考文献2；本文图4和5)。
287蛋白质在概念上分成三个结构域，称为A、B和C(参见参考文献2的图5)。结构域B具有IgA蛋白酶的排列，结构域C具有转铁蛋白-结合蛋白的排列，结构域A显示与数据库序列无强排列。287的多态型排列见参考文献8所述。
ORF46在概念上分成两个结构域：种和血清型之间非常保守的第一结构域(氨基酸1-433：ORF46.1)和不很保守的第二结构域(氨基酸433-608)。优选缺失该第二结构域，留下ORF46.1。ORF46的多态型排列见参考文献8所述。
961蛋白质在概念上分成几个结构域(图4)。
如果-X-部分含有野生型的前导肽序列，可将它包含在本发明的杂合蛋白质中或删除。当删除此前导肽时，这是(c)和(j)中氨基酸序列的优选例子。在一个实施方案中，缺失此前导肽，除了位于杂合蛋白质N-末端的-X-部分，即保留X1的前导肽，但出去删去X2…Xn的前导肽。这相当于缺失所有前导肽并采用X1的前导肽作为部分-A-。
当n＝2时，-X-部分的优选配对是：ΔG287和230；ΔG287和936；ΔG287和741；961c和287；961c和230；961c和936；961cL和287；961cL和230；961cL和936；ORF46.1和936；ORF46.1和230；230和961；230和741；936和961；936和741。当n＝2时，串联蛋白质的-X-部分优选配对是：ΔG741和741；ΔG287和287。更具体的是，当n＝2时优选下列X1和X2的组合：
       X1      X2
    ΔG287      230
    ΔG287      936
    ΔG287      741
    ΔG287      961
    ΔG287      ORF46.1
    ΔG287      919
    ΔG287      953
    961c      287
    961c      230
    961c      936
    961c      741
    961c      983
    961c      ΔG983
    961c      ORF46.1
    961      ORF46.1
    961cL      287
    961cL      230
    961cL      936
    ORF46.1      936
    ORF46.1      230
    ORF46.1      741
    ORF46.1      ΔG741
    ORF46.1      983
    ORF46.1      ΔG983
    230      961
    230      741
    230      ΔG741
    936      961
    936      741
    936      ΔG741
    ΔG741      741
    ORF46.1      983
    ΔG741      ORF46.1
    X1        X2
    230      ΔG287
    936      ΔG287
    741      ΔG287
    961      ΔG287
    ORF46.1      ΔG287
    919      ΔG287
    953      ΔG287
    287      961c
    230      961c
    936      961c
    741      961c
    983      961c
    ΔG983      961c
    ORF46.1      961c
    ORF46.1      961
    287      961cL
    230      961cL
    936      961cL
    936      ORF46.1
    230      ORF46.1
    741      ORF46.1
    ΔG741      ORF46.1
    983      ORF46.1
    ΔG983      ORF46.1
    961      230
    741      230
    ΔG741      230
    961      936
    741      936
    ΔG741      936
    ΔG287      287
    983      ORF46.1
    ORF46.1      ΔG741
  ΔG741     983
  ΔG741     961
  ΔG741     961c
  ΔG983     ORF46.1
  ΔG983     961
  ΔG983     961c
    988   ΔG741
    961   ΔG741
    961c   ΔG741
    ORF46.1   ΔG983
    961   ΔG983
    961c   ΔG983
其中287以全长形式使用，优选287位于杂合蛋白质的C-末端；如果287要用于N-末端，优选使用287的ΔG形式。类似的，当741以全长形式使用时，优选位于杂合蛋白质的C-末端；如果它要用于N-末端，优选使用741的ΔG形式。
-L-部分
对于[-X-L-]的各n实例，接头氨基酸序列-L-可以存在或没有。例如，当n＝2时，杂合物可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。
接头氨基酸序列-L-通常较短(如20个或更少氨基酸即19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括能促进克隆的短肽序列、聚甘氨酸接头(即Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)和组氨酸尾(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它适合的接头氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID 27)，其中Gly-Ser二肽形成自BamHI限制性酶切位点从而有助于克隆和操作，Gly4四肽是典型的聚甘氨酸接头。
如果Xn+1是ΔG蛋白质且Ln是甘氨酸接头，这相当于不是ΔG蛋白质且没有Ln的Xn+1。
-A-部分
-A-是任选的N-末端氨基酸序列。它通常较短(如40个或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、1 5、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的前导序列，或者有利于克隆或纯化的短肽序列(如含有组氨酸尾即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它适合的N-末端氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。如果X1缺乏自身的N-末端甲硫氨酸，-A-可以是甲硫氨酸残基。
-B-部分
-B-是任选的C-末端氨基酸序列。它通常较短(如40个或更少氨基酸即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括指导蛋白质运输的序列、有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸尾即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。或提高蛋白质稳定性的序列。其它适当的C-末端氨基酸序列是本领域技术人员懂得的。
蛋白质的多态型形式
本发明可使用任何脑膜炎奈瑟球菌菌株的氨基酸序列。因此涉及的具体蛋白质(如‘287’或‘ORF46.1’)包括任何菌株的蛋白质。菌株间的序列变化包括在(b)、(c)、(i)和(j)中。
脑膜炎奈瑟球菌血清群B的参考序列包括：
 蛋白质 参考文献
 orf1 参考文献3，SEQ ID 650
 orf25 参考文献3，SEQ ID 684
 orf46 参考文献6，SEQ ID 1049
 NMB1343 参考文献7，NMB 1343
 233 参考文献5，SEQ ID 860
 292 参考文献5，SEQ ID 1220
 687 参考文献5，SEQ ID 2282
 741 参考文献5，SEQ ID 2536
 919 参考文献5，SEQ ID 3070
 953 参考文献5，SEQ ID 2918
 983 参考文献7，NMB 1969
 蛋白质 参考文献
 orf4 参考文献3，SEQ ID 218
 orf40 参考文献4，SEQ ID 4
 orf83 参考文献3，SEQ ID 314
 230 参考文献5，SEQ ID 830
 287 参考文献5，SEQ ID 3104
 594 参考文献5，SEQ ID 1862
 736 参考文献5，SEQ ID 2506
 907 参考文献5，SEQ ID 2732
 936 参考文献5，SEQ ID 2884
 961 参考文献5，SEQ ID 940
参考文献8揭示了蛋白质ORF4、ORF40、ORF46、225、235、287、519、726、919和953的多态型形式。961的多态形式见参考文献11和12所述。任何这些多态形式可用于本发明。
本文所列序列包括已鉴定的蛋白质741(SEQ IDs 1-22)和NMB 1343(SEQ IDs23-24)的多态形式。
血清群和菌株
本发明的优选蛋白质包括-X-部分，其具有脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的氨基酸序列。在本发明的单个蛋白质中，各个-X-部分可以来自一种或多种菌株。例如当n＝2时，X2可以来自与X1相同或不同的菌株。当n＝3时，菌株可以是(i)X1＝X2＝X3(ii)X1＝X2≠X3(iii)X1≠X2＝X3(iv)X1≠X2≠X3或(v)X1＝X3≠X2等。
在血清群B中，优选的-X-部分来自菌株2996、MC58、95N477或394/98。菌株95N477有时在本文中称为‘ET37’，这是其电泳形式。菌株394/98有时在本文中称为‘nz’，因为它是新西兰菌株。
当使用287的一种形式时，优选来自菌株2996或来自菌株394/98。
当使用741的一种形式时，优选来自血清群B的菌株MC58、2996、394/98或95N477，或者血清群C的菌株90/18311。
当使用961的一种形式时，优选来自菌株2996。
菌株以下标表示，如741 MC58是菌株MC58的蛋白质741。除非另有说明，本文所提及的蛋白质(如没有下标)来自脑膜炎奈瑟球菌菌株2996，它可作为‘参考’菌株。然而要理解的是本发明一般不受菌株的限制。如上所述，一般涉及的蛋白质(如‘287’或‘919’等)包括任何菌株的蛋白质。通常与2996有90％或更高的序列相同性(如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)。
蛋白质961的结构域为基础的表达
参考文献1和2揭示了蛋白质如何在概念上分成结构域且蛋白质如何以这些结构域的基础进行操作。本发明将此方法扩展应用于蛋白质961(也称为‘NadA’[11、12])。
在脑膜炎奈瑟球菌血清群B的菌株2996中，NadA有405个氨基酸。此蛋白质在概念上分成下列九个结构域(图4)：
 结构域名称  氨基酸 结构域名称  氨基酸
 961-1‘L’  1-23  961-6  269-286
 961-2  24-87  961-7  287-330
 961-3  88-143  961-8  331-350
 961-4  144-180  961-9  351-405
 961-5  181-268
此信息可用于定位其它961形式中的相同结构域
已用各种方法从菌株2996中的961缺失掉这些结构域(图5)。961的优选片段删除了些几个结构域如下的一个或多个：
-961-2到961-5(‘961a’)
-961-6到961-9(‘961b’)
-961-1到961-8(‘961cL’)
-961-2到961-8(‘961c’)
-961-2到961-6和结构域961-7的氨基酸287-325(‘961d’)
-961-2到961-8和结构域961-9的氨基酸351-383(‘961Δ1’)
-961-1到961-8和结构域961-9的氨基酸351-383(‘961Δ1L’)
-961-1到961-7和结构域961-8的氨基酸331-343(‘961cL-Δaro’)
961-1到961-6和结构域961-7的氨基酸287-315(‘961cL-Δcc’)
-961-1到961-5(‘961aL’)
-961-1到961-4(‘961aL-Δ1’)
-961-1到961-3(‘961aL-Δ2’)
-961-1到961-2(‘961aL-Δ3’)
这13个片段(和其一端或两端缺少1、2、3、4或5个氨基酸的亚片段)是优选的(c)和(j)片段，但它们也可自身表达，即不是本发明的杂合蛋白质形式。因此本发明提供含这些片段之一的蛋白质，此蛋白质不是全长961且不是参考文献1或2具体描述的蛋白质。此蛋白质可以是融合蛋白(如GST-融合或His-尾融合)
序列
本发明还提供具有SEQ IDs 1-24的氨基酸序列的蛋白质。也提供与这些蛋白质具有序列相同性的蛋白质和核酸。如上所述，‘序列相同性’程度优选大于50％(如60％、70％、80％、90％、95％、99％或更高)。
本发明还提供编码这些蛋白质的核酸。
此外，本发明提供优选在‘高严紧性’条件下(如65℃在0.1xSSC、0.5％SDS溶液中)可与此核酸杂交的核酸，
发明也提供编码本发明蛋白质的核酸。
还应理解的是本发明提供的核酸包含与上述序列互补的序列(如用于反义或探测目的)。
本发明的核酸当然可以许多方法制备(如通过化学合成，从基因组或cDNA文库，从生物体本身制备等)，并可采用各种形式(如单链、双链、载体、探针等)。
此外，术语“核酸”包括DNA和RNA以及它们的类似物，如含修饰主链的类似物和肽核酸(PNA)等。
混合物
本发明还提供一种组合物，该组合物包含两种或多种(即2、3、4、5、6或7)以下蛋白质：
(1)  287
(2)  741
(3)  ORF46.1
(4)  961
(5) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝953
(6) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝919
(7) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝961
此混合物可包含一种或两种下列蛋白质，与(10)到(7)的两种或多种或仅与(1)到(7)中的一种蛋白质组合：
(8) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝741
(9) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝936，X2＝741
当蛋白质287和741包括在此混合物中时(即在蛋白质1、2、5、6、7或8中)，它们可能是‘ΔG’形式。当包括蛋白质961时，优选‘961c’形式，其中没有N-末端前导序列和C-末端膜锚定序列。
优选的混合物包含下列三种蛋白质：
(1)  961c，优选961c2996(如本文的SEQ ID 31)；
(2) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n为2，-X1-是ΔG287(优选ΔG287NZ)，-X2-是缺乏前导肽的953(优选9532996)，-L1-是GSGGGG且-A-包括N-末端甲硫氨酸(如-A-是M或MA)(如本文的SEQ IDs 28和29)；
(3) NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝936(优选9362996)，X2＝ΔG741(优选ΔG741MC58)，L1＝GSGGGG(如本文的SEQ ID 30)。
此混合物也可包含脑膜炎奈瑟球菌的外膜囊泡。
异源宿主
当本发明的蛋白质在奈瑟球菌中表达时，本发明优选使用异源宿主。异源宿主可以是原核生物(如细菌)或真核生物细胞。优选大肠杆菌，但其它适当的宿主，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、伤寒沙门杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门杆菌(Salmonella typhimurium)、乳酰胺奈瑟菌(Neissria lactamica)、脊髓灰质炎奈瑟菌(Neissria cinerea)、分枝杆菌(Mycobacteria)(如结核分枝杆菌)、酵母等。
载体等
本发明提供(a)编码上述蛋白质的核酸(b)含有这些核酸序列的载体(c)含所述载体的宿主细胞(d)含本发明蛋白质或核酸的组合物，也许其适合用作免疫原性组合物(如疫苗)或用作诊断试剂(e)这些组合物作为药物(如疫苗)或作为诊断试剂的用途(f)这些组合物在生产(1)治疗或预防奈瑟球菌感染的药物(2)检测奈瑟球菌或抗奈瑟球菌抗体存在的诊断试剂，和/或(3)提高抗奈瑟球菌抗体的制剂的用途，以及(g)治疗病人的方法，包括给予病人治疗有效量的这些组合物。
实施本发明通常包括以下基本步骤：获得编码第一种蛋白质的第一种核酸；获得编码第二种蛋白质的第二种核酸；连接第一种和第二种核酸。可将所得核酸***表达载体中或可作为表达载体的一部分。
为改进溶解性，纯化杂合蛋白质时可包括本文所述重折叠技术。
免疫原性组合物和药物
本发明的组合物优选是免疫原性组合物，更优选疫苗组合物。该组合物的pH值优选在6和7之间。此pH值可通过采用缓冲液来维持该组合物可以是无菌的。
本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即治疗感染)，但一般是预防性的。
本发明也提供本发明的组合物作为药物用途。药物优选能提高哺乳动物免疫应答(即它是免疫原性组合物)，更优选是疫苗。
本发明也提供本发明组合物在生产能提高哺乳动物免疫应答的药物中的用途。药物优选是疫苗。
本发明也提供提高哺乳动物免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的本发明组合物的步骤。免疫应答优选是保护性的。此方法可提高加强的免疗应答。
哺乳动物优选是人。当此疫苗用于预防时，优选的人是儿童(如初学走路的孩子或婴儿)；当疫苗用于预防时，优选的人是成年人。针对儿童的疫苗也可给予成人，以例如评估安全性、剂量、免疫原性等。
这些用途和方法优选用于预防和/或治疗奈瑟球菌引起的疾病(如脑膜炎、败血病、淋病等)。优选预防和/或治疗细菌脑膜炎。
此组合物的其它成分
除上述成分外，本发明的组合物通常包含一种或多种‘药学上可接受的远载体’，包括自身不诱导接受此组合物的个体产生有害抗体的任何远载体。适当的远载体一般是大的代谢缓慢的大分子、如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、海藻糖(WO 00/56365)和脂类凝聚物(如油滴或脂质体)。这种远载体是本领域技术人员熟知的。此疫苗也可包含稀释液，如水、盐水、甘油等。此外，辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在。药学上可接受赋形剂的完整论述可获自《Remington药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)。
用作疫苗的免疫原性组合物包括免疫有效量的抗原以及任何其它需要的上述成分。‘免疫有效量’指将此剂量以单剂量或作为系列剂量的一部分给予个体，能有效地治疗或预防。此剂量的变化取决于待治疗个体的健康和身体情况、年龄、待治疗个体的分类(如非人灵长类动物、灵长类动物等)、个体免疫***合成抗体的能力、所需保护的程度、疫苗的配方、治疗医生对医疗情况的评估和其它相关因素。预期此剂量有相对宽的范围，可通过常规试验确定。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(如包括强化剂量)。此疫苗可结合其它免疫调节剂施用。
疫苗可结合其它免疫调节剂施用。
除(或取代)铝盐外，该组合物可包含其它佐剂。能提高该组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)水包油乳剂(含有或没有其它特定免疫刺激剂如胞壁酰肽(见下)或细菌细胞壁成分)，例如(a)MF59TM(WO90/14837；参考文献中的第10章)，含5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％Span 85(任选含MTP-PE)，用微流化剂制成亚微米颗粒、(b)SAF，含10％鲨烯、0.4％吐温80和5％pluronic-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流化成亚微米乳剂或旋涡混合产生较大颗粒大小的乳剂、(c)RibiTM佐剂***(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含2％鲨烯、O.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁成分，选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖dimycolate(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；(2)皂角苷佐剂，如可使用QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或它们所产生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合物)，ISCOMS可避免采用其它去污剂，如WO 00/07621；(3)弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)；(4)细胞因子，如白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO 99/44636)等)、干扰素(例如γ干扰)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3d MPL)，如GB-2220221、EP-A-0689454；(6)3d MPL与例如QS21和/或水包油乳剂的组合，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含CpG基序的寡核苷酸[Krieg Vaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr opin MolTher2001 3：15-24；Roman等，Nat.Med，1997，3，849-854；Weiner等，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis等，J.Immunol.，1998，160，870-876；Chu等，J.Exp.Med.，1997，186，1623-1631；Lipford等，Eur.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveanu等，Vaccine，1998，16.1216-1224，Krieg等，Nature，1995，374，546-549；Klinman等，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas等，J.Immunol.，1996157，1840-45；Cowdery等， J.Immunol，1996，156，4570-75；Halpern等Celllmmunol.，1996，167，72-78；Yamanoto等，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey等，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina等，J.Immunol.，1991，147，1759-1764；Yi等，J.Immunol.，1996，157，4918-4925；Yi等，J.Immunol.，1996，157，5394-5402；Yi等，J.Immunol.，1998，160，4755-4761；Yi等，J.Immunol.，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581]即含至少一个CG二核苷酸，5-甲基胞嘧啶可任选用于取代胞嘧啶；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯如WO99/52549；(9)结合辛氧基(octoxynol)的聚氧乙烯山梨糖酯类表面活性剂(如WO 01/21207)或结合至少一种其它非离子表面活性剂如辛氧基(octoxynol)聚氧乙烯烷基醚或酯的表面活性剂(如WO 01/21152)；(10)免疫刺激寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)和皂角苷如WO 00/62800；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒如WO 00/23105；(12)皂角苷和水包油乳剂如WO99/11241；(13)皂角苷(如QS21)+3dMPL+IL-12(任选类固醇)如WO98/57659；(14)作为免疫刺激剂能提高此组合物效果的其它物质。
胞壁酰肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-nor胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2(1’2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基(phosphoryloxy))-乙醇胺MTP-PE)等。
其它抗原
可包含在本发明组合物中的其它抗原包括：
-脑膜炎奈瑟球菌血清群B的外膜泡囊(OMV)制品，如见参考文献13、14、15、16、17等所述。
-脑膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献18中所述的血清群C的寡糖[同样参见参考文献19]或参考文献20的寡糖。
-肺炎链球菌的糖抗原
-幽门螺杆菌的蛋白质抗原，如CagA[如24]、VacA[如24]、NAP[如25]、HopX[如26]、HopY[如26]和/或尿素酶。
-甲肝病毒抗原，如灭活病毒[如27、28]。
-乙肝病毒抗原，如表面抗原和/或核心抗原[如28、29]。
-丙肝病毒抗原[如30]。
-百日咳杆菌(Bordetella pertussis)抗原，如百日咳杆菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，还任选与百日核毒素(pertactin)和/或凝集素2和3[如参考文献31和32]组合使用。
-白喉抗原，例如白喉类毒素[如参考文献33的第3章]，如CRM197突变体[如34]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[参考文献33的第4章]。
-流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenzae)的糖抗原[如19]。
-淋病奈瑟球菌抗原[如3、4、5]。
-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)抗原[如3、4、5]。
-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[如42]。
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的抗原[如43]。
-脊髓灰质炎病毒(polio)的抗原[如44、45]，例如IPV或OPV。
-狂犬病毒抗原[如46]，例如冻干的灭活病毒[如47、RabAvertTM]。
-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献33的第9、10和11章]。
-流感病毒抗原[如参考文献33的第19章]，例如血凝素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-卡它性莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[如48]。
-无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)蛋白质抗原[如49、50]。
-无乳链球菌糖抗原。
-化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)抗原[如50、51、52]。
-金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抗原[如53]。
该组合物可包括一种或多种这些其它抗原。
当采用糖类或碳水化合物抗原时，优选将其偶联于载体蛋白以提高免疫原性[如参考文献54到63]。优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉或破伤风类毒素。尤其优选CRM197白喉类毒素。其它适当的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[如参考文献64]、合成肽[如65、66]、热激蛋白[如67]、百日咳蛋白[如68、69]、流感嗜血杆菌的蛋白质D[如70]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[如71]等。当混合物包含血清群A和C的荚膜糖类时，MenA糖∶MenC糖的比例(w/w)优选大于1(如2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。可将脑膜炎奈瑟球菌不同血清群的糖类偶联于相同或不同的载体蛋白。
可利用任何适当的偶联反应，必要时可采用任何合适的接头。
必要时可使毒性蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方法[32]使百日毒素脱毒)。
当该组合物包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。类似的，当包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。类似的，当包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。
抗原优选与铝盐(如磷酸铝、氢氧化铝、羟基磷酸铝、正氢氧化铝、正磷酸铝、硫酸铝)混合铝盐可采用任何适当的形式(如凝胶，晶体，无定形等)。
此组合物中的抗原通常以各至少1μg/ml的浓度存在。一般，任何给定抗原的浓度应足够引起抗此抗原的免疫应答。
采用本发明组合物中的蛋白质抗原的另一种方法，可采用编码此抗原的核酸(如参考文献72到80)。因此本发明组合物的蛋白质成分可用编码此蛋白质的核酸取代(优选DNA，如以质粒形式)。
定义
术语“包括”指“包含”以及“由…组成”，如“包括”X的组合物可只由X组成或包含一些另外成分如X+Y。
涉及数值x的术语“约”指例如x±10％。
附图简述
图1显示蛋白质741的23种序列的排列。这些是SEQ IDs1到22加上MC58的序列。
图2显示淋菌(顶部；SEQ ID 25)和脑膜炎球菌(底部；SEQ ID 26)的NMB1343序列的排列。
图3显示本发明的杂合和串联蛋白质。
图4显示9612996中的9个结构域，图5显示如何操作这些结构域。
实施本发明的模式
杂合蛋白质-X1＝ΔG287
除了参考文献1和2所述外，构建了七个N-末端含有菌株2996的ΔG287的杂合蛋白质，还制备了八个287串联蛋白质(见下)。
   #    n      X1    L1        X2      L2
   1    2 ΔG287    -        230    (His)6
   2    2    -        936    (His)6
   3    2 -        741MC58    (His)6
   4    2    -        741ET37    (His)6
   5    2    -        74190/18311    (His)6
   6    2    -        74195N477    (His)6
   7    2   ΔG287nz    -        741MC58    (His)6
这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作为佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#3测得的滴定度如下：
 菌株(血清群)    2996(B)   MC58(B)   NGH38(B)    394/98(B)     44/76(B)   F6124(A)
 氢氧化铝     8192    32768     8192     ＞2048      16384     8192
 FCA    16384   262144     8192     ＞2048     ＞32768     8192
在用蛋白质#3和氢氧化铝的进一步实验中，特定了抗287和抗741抗体，各ELISA滴度超过984150，BCA滴度如下：
  2996(B)   MC58(B)  NGH38(b)  394/98(B)  44/76(B)  F6124(A)  BZ133(C)
   8000    65000    4000     4000    32000    8000   16000
用参考文献1和2所述蛋白质免疫后测定抗同源菌株抗体获得的结果如下：
n X1 L1 X2 L2       杀菌滴度        ELISA
  FCA   明矾   FCA 明矾
2 ΔG287394/98 -   961 (His)6   -   32768   - ＞109350
  919   32768   4096   4718 3678
  953   ＞32768   ＞16384   1900 6936
  741   16384   2048   232 862
2 ΔG2872996 -   961 (His)6   65536   32768   108627 ＞109350
  919   128000   32000   11851 2581
  953   65536   -   3834 -
  741   16384   8192   315 4645
杂合蛋白质-X1＝961c或961cL
除了参考文献1和2所述外，构建了八个在N-末端含有961c或961cL(即961c+前导肽)的杂合蛋白质：
   #    n   X1    L1    X2     L2
   1    2 961c    -    287      -
   2    2    -    287    (His)6
   3    2    -    230    (His)6
   4    2    -    936    (His)6
   5    2 961cL    -    287      -
   6    2    -    287    (His)6
   7    2    -    230    (His)6
   8    2    -    936    (His)6
这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3.3mg/ml明矾作为佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#8测得的滴定度如下：
菌株(血清群)   2996(B)    MC58(B)   394/98(B)  44/76(B)  F6124(A)
氢氧化铝   8192    8192   512  1024  ＜16
FCA   65536    16384   ＞2048  ＞2048  8192
用961c-741[参考文献1和2]免疫后获得的滴度如下：
菌株(血清群)   2996(B)   MC58(B)   394/98(B)    44/76(B)     F6124(A)    BZ133(C)
氢氧化铝   65536   32768   4096    ＞32768     16384    ＞2048
FCA   ＞16384   262144   4096    ＞16384     -    ＞2048
这些结果可通过将961c-741与ORF46.1或ΔG287-919混合来改进。
用参考文献1和2所述蛋白质免疫后测定抗同源菌株抗体获得的结果如下：
n X1 L1 X2 L2      杀菌滴度       ELISA
  FCA   明矾    FCA   明矾
2 961c -   ORF46.1 (His)6  32768   1024 ＞109350 ＞109350
    741 ＞16384   8192 ＞109350 ＞109350
    936 ＞32768   8192 ＞109350 ＞109350
杂合蛋白质-X1＝ORF46.1
除了参考文献1和2所述外，构建了两个在N-末端含有ORF46.1的杂合蛋白质：
   #    n      X1    L1    X2     L2
   1    2 ORF46.1    -    936   (His)6
   2    2    -    230   (His)6
这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验和ELISA测试抗同源菌株抗体。
用参考文献1和2所述蛋白质免疫后获得的结果如下：
 n      X1    L1     X2     L2        杀菌滴度          ELISA
    FCA   明矾    FCA    明矾
2 ORF46.1 -    961    (His)6     8192   8192   21558  ＞109350
   -    961c    (His)6     8192   128    9020    76545
杂合蛋白质-X1＝230
除了参考文献1和2所述外，构建了四个在N-末端含有230的杂合蛋白质：
   #    n    X1    L1     X2      L2
   1    2 230    -   ORF46.1    (His)6
   2    2    -     961    (His)6
   3    2    -     961c    (His)6
   4    2    -   741MC58    (His)6
杂合蛋白质-X1＝936
除了参考文献1和2所述外，构建了七个在N-末端含有936的杂合蛋白质：
# n X1 L1 X2 L2
   1    2 936    -     ORF46.1    (His)6
   2    2    -       961    (His)6
   3    2    -     741ET37    (His)6
   4    2    -     741MC58    (His)6
   5    2    -   74190/18311    (His)6
   6    2    -    74195N477    (His)6
   7    2    -       741    (His)6
这些蛋白质用弗氏完全佐剂(FCA)或3mg/ml明矾作佐剂用于免疫小鼠。所得血清用杀菌试验测试抗不同的奈瑟球菌菌株抗体。采用蛋白质#2测得的滴定度如下：
 菌株(血清群)  2996(B)  MC58(B)  394/98(B) 44/76(B)   F6124(A)
 氢氧化铝   16348   32768   1024   2048     ＜16
 FCA   65536   65536   ＞2048   8192  2048(36％)
采用蛋白质#4测得的滴定度如下：
 菌株(血清群)   2996(b)  MC58(B)   394/98(B)  44/76(B)  F6124(A)
 氢氧化铝    256 ＞262144    ＞2048   32768    8192
 FCA    1024 ＞262144    ＞2048  ＞32768  ＞32768
采用蛋白质#7测得的滴定度如下：
 菌株(血清群)  2996(B)   MC58(B)  394/98(B)  44/76(B)  F6124(A)  BZ133(C)
 氢氧化铝   256    13000   16000    32000    8000   16000
用参考文献1和2所述蛋白质免疫后测定抗同源菌株抗体获得的结果如下：
n X1 L1 X2 L2      杀菌滴度        EL-SA
  FCA   明矾   FCA   明矾
2 936 -   741 (His)6   1024   256   1466   5715
  936  ＞32768 ＞32768 ＞109350 ＞109350
杂合蛋白质的混合物
小鼠用氢氧化铝为佐剂的三种蛋白质免疫，单种或三种蛋白质的组合：(1)287NZ-953；(2)936-741；和(3)961c。混合物能诱导抗不同菌株的高杀菌滴度：
 2996(B)  MC58(B)   NGH38    394/98(B)    H44/76(B)   F6124(A)   BZ133(C)   C11(C)
  (1)  32000  16000   130000    16000    32000   8000   16000   8000
  (2)  256  131000   128    16000    32000   8000   16000   ＜4
  (3)  32000  8000   -    -    -   8000   -   32000
混合物  32000  32000   65000    16000    260000   65000   ＞65000   8000
  (X)  4000  4000   1000    1000    ＞4000   1000   4000   n.c.
                                                           ‘-’表示此菌株不含Nad A基因
(X)是蛋白质287和外膜泡囊的组合，用于比较
观察各个小鼠，该混合物诱导了高而恒定的杀菌滴度：
 #  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10
 2996  32768  16384  65536  32768  32768  65536  65536  32768  65536  8192
 MC58  65536  32768  65536  65536  65536  8192  65536  32768  32768  65536
 394/98  65536  4096  16384  4096  8192  4096  32768  16384  8192  16384
串联蛋白质
本发明的杂合蛋白质可表示为公式NH2-[-X-L-]n-COOH。其中-X-的所有n实例是相同的碱性蛋白质(相同或者不同菌株或种类的相同蛋白质)，此蛋白质称为“串联”蛋白质。
十二种具体串联蛋白质是：
   #    n         X1     L1        X2     L2
   1    2    ΔG741MC58   -    741MC58   (His)6
   2    2    ΔG2872996   (Gly)6    ΔG287394/98   (His)6
   3    2    ΔG2872996   -(Gly)6    ΔG2872996   (His)6
   4    2    ΔG287394/98   -(Gly)6    ΔG287394/98   (His)6
   5    2    ΔG287394/98   -(Gly)6    ΔG2872996   (His)6
   6    2    ΔG2872996   -(Gly)6    ΔG287394/98     -
   7    2    ΔG2872996   -(Gly)6    ΔG2872996     -
   8    2    ΔG287394/98   -(Gly)6    ΔG287394/98     -
   9    2    ΔG287394/98   -(Gly)6    ΔG2872996     -
   10    2    ΔG741MC58      -    741394/98   (His)6
   11    2    ΔG741MC58      -    74190/18311   (His)6
   12    2    ΔG741MC58      -    74195N477   (His)6
蛋白质#1到#5都已在大肠杆菌中以可溶形式表达。表达水平在0.24和0.50mg蛋白质/每升培养物之间。纯化这些串联蛋白质并与作为佐剂的磷酸铝混合。串联蛋白质#2、#4和#5易被磷酸铝吸附；串联蛋白质#1和#3吸附不完全。
等位基因变体-741
发现了741的22种多态性序列(SEQ IDs 1到22)。这些序列和MC58序列排列于图1中。
等位基因变体-NMB1343
对不同血清群脑膜炎球菌的42种菌株使用PCR，在24/42菌株中发现编码NMB1343蛋白的基因但在18/42菌株中无(表1)。测序10个NMB1343+菌株的NMB1343基因(表1，第3列)。所有10个菌株中此核酸序列(和氨基酸序列SEQ ID23；GenBank AAF41718)相同。
NMB1343也在2种淋病奈瑟球菌菌株(F62和SN4)中检测到。***的氨基酸序列是SEQ ID 24。脑膜炎球菌序列的排列是：
对应的核苷酸序列的排列示于图2中。这显示***序列在NMB1343基因5’区域有一个4聚体***，导致移码和随后失去5’甲硫氨酸残基。
结构域缺失-961
961不存在于脑膜炎奈瑟球菌血清群a的基因组序列[81]中，尽管周围区域在血清群A和B间保守(＞90％)。参考文献11和12揭示了961的多态型形式。发现此基因存在于91％的血清群B菌株中，属于高毒性谱系ET-5、ET-37和A4簇，但该基因在所有测试的谱系3菌株中缺乏。即使不属于高毒性谱系，大部分测试的血清群C菌株为阳性。对于含血清型2a和2b的血清群B菌株也同样如此。对于血清群A，属于亚群III的一菌株为阳性，而另两种属于亚群IV-1的菌株为阴性。淋病奈瑟菌中和乳酰胺奈瑟菌与脊髓灰质炎奈瑟球菌的共生种类中缺乏961。
图4和5显示蛋白质961中的结构域。
当蛋白质961的锚定区域(结构域9)缺失并在大肠杆菌中表达时，此蛋白质被输出到周质，分泌于培养物的上清中。
为进一步研究，在结构特征基础上(就961cΔaro突变体而言缺失芳香族残基，++ 和其它情况中缺失卷曲螺旋区)构建了缺失961 C-末端区域的突变体(961cL-Δaro、961cLΔcc、961aL、961aL-Δ1、961aL-Δ2、961aL-Δ3)。分析这些突变体表达和分泌入周质和培养物上清中的情况。在所有这些缺失突变体中，蛋白质大量产生、存在于周质组分中且释放到培养物上清中。
ΔG287-杂交菌株的杀菌活性
克隆了5个不同脑膜炎奈瑟球菌血清群B菌株的287并对其进行操作以去掉N-末端至聚甘氨酸区域末端并引入C-末端组氨酸尾。这产生了5种ΔG287蛋白质。这些蛋白质用FCA作佐剂用于产生小鼠免疫血清，随后测试了血清对所有5种血清群B菌株以及血清群A和C菌株的杀菌活性。杀菌滴度如下：
 蛋白质菌株                       测试血清抗诸菌株的杀菌活性
  2996   BZ232   MC58   1000   394/98  F6124   BZ133
  2996   16000    128   4096   4096   1024   8000   16000
  BZ232   ＞8000    256   2048   8000   2048   16000   8000
  MC58   ＞8000    64   ＞8000   8000   2048   8000   8000
  1000   ＞8000    64   4096   8000   1024   16000   16000
  394/98   ＞16000    128   16000   ＞2048   ＞16000   -   -
                                                   *抗同源菌株的滴度以粗体表示
重折叠
为改进一些杂合蛋白质的可溶蛋白质水平，采纳了参考文献2所述的另外重折叠方案。
包含体(IBs)的分离如下：
1.细胞(5mg湿重)用ultraturrax(1000rpm)4℃在25ml 0.1M Tris-HClpH7.1、1mM EDTA中匀浆。
2.每克细胞加入1.5ml溶菌酶，用ultraturrax简单混合，4℃孵育30分钟。
3.用超声波或高压匀浆(French press)破裂细胞。
4.为消化DNA，加入MgCl2到3mM终浓度和加DNA酶到10μg/ml终浓度，25℃孵育30分钟。
5.加入0.5体积的60mM EDTA、6％Triton X-100、1.5M NaCl pH7到溶液中，4℃孵育30分钟。
6. 4℃31000g(20,000rpm)离心10分钟沉降包含体。
7.用ultraturrax重悬浮沉淀于40ml 0.1M tris-HCl pH7、20mM EDTA中。
8.重复离心步骤6。
9.可使用包含体沉淀或-20℃冻存。
杂合蛋白质如下在大肠杆菌中表达：
       蛋白质  培养物体积(升)  烧瓶体积(升)   温度(℃)    最终的OD600  产生的包含体(w/w)
   ORF46.1-961-His      1     2    37     1.51    33.2％
   ORF46.1-961c-His      1     2    37     1.6    28.3％
   961c-ORF46.1His      1     2    37     1.18    23.5％
   orf46.1-741His      5     5    37     12.42    35.2％
溶解沉淀、重折叠、超滤、透析，随后纯化得到蛋白质：
ORF46.1-961-His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.1M Tris-HCl、1M L-精氨酸、2mM EDTApH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生130ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。
orf46.1-961c His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5M Tris-HCl、1M L-精氨酸、2mM EDTA pH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生150ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。
961c-orf46.1His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到1mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质和2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.1M Tris-HCl、0.5ML-精氨酸、2mM EDTApH8.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到5μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到10μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生150ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。
orf46.1-741His IBs溶解如下：将IB蛋白质重悬浮于4ml6M盐酸胍、1mMEDTA pH8.5缓冲液中到10mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠此蛋白质，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5M Tris-HCl、0.7M L-精氨酸、2mM EDTApH7.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到50μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度再孵育1小时，得到100μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生120ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L 0.1M Tris-HCl pH8.2缓冲液透析24小时。进行第二次透析，以10L 300mM NaCl、50mM磷酸钠pH8.0缓冲液透析24小时。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于进行His-尾纯化。
与参考文献2所述纯化的蛋白质相比，杀菌试验滴定度如下：
      蛋白质       参考文献2               重折叠后
  CFA  氢氧化铝  氢氧化铝    MF59   磷酸铝
  ORF46.1-961-His   8192    8192    32768    -     -
  ORF46.1-961c-His   8192    128    ＜64    8192     -
  961c-ORF46.1His   32768    1024    16384    -     -
  orf46.1-741His   ＜4    16    ＜4    256     -
当没有His-尾表达时(‘ORF46.1K’)，将类似过程用于ORF46.1以从IBs纯化此蛋白质：
    蛋白质  培养物体积(升)  烧瓶体积(升)    温度(℃)   最终的OD600   产生的包含体(w/w)
    ORF46.1K     5     5     37    13.7      29.4
将IB蛋白质重悬浮于4ml6M盐酸胍、1mM EDTA pH8.5缓冲液中到10mg/ml的蛋白质终浓度。为重折叠，取2ml溶解的蛋白质在400ml重折叠缓冲液(0.5MTris-HCl、0.7M L-精氨酸、2mM EDTA pH7.2)中稀释并15℃孵育1小时，得到50μg/ml浓度的蛋白质。随后，另加入2ml溶解的蛋白质并在相同温度下再孵育1小时，得到100μg/ml终浓度的蛋白质。该物质用300ml Amicon超滤装置(8400)超滤，在30kDa截留值的Amicon膜(YM30)上施加3巴压力，产生120ml的终体积。超滤后物质用12-14kDa截留值的再生纤维素管状(Cellusep-Step bio)膜以10L50mM磷酸钠、2mM EDTA pH7.2缓冲液透析12小时。以10L相同缓冲液进行第二次24小时透析。透析后物质在Beckman离心机转子JA25.5中以22000rpm 4℃离心45分钟。离心后分离的上清用于阳离子交换层析。纯化在AKTA探测器层析***(Amersham-Pharmacia Biotech)上进行，采用5ml HiTrap SP琼脂糖HP柱(Amersham-Pharmacia Biotech)。应用流速为1.5ml/每分钟。尾析柱用35ml 50mM磷酸钠缓冲液pH7.2洗涤。用50mM磷酸钠缓冲液pH7.2进行线性梯度(0-1M NaCl)洗脱。蛋白质洗脱在92mM和320mM NaCl的两个峰中。收集含各个峰的组分并分别命名为合并液1和合并液2。
与参考文献2所述纯化的蛋白质相比，用氢氧化铝作佐剂时杀菌试验滴度从＜4提到到1024。此重折叠蛋白质用磷酸铝作佐剂的滴度为2048。ELISA滴度如下：
      蛋白质         铝佐剂   Elisa(M7)   SBA(2996)
 Orf46.1k(合并液1)   氢氧化铝3.3mg/ml     1212     512
  磷酸铝0.6mg/ml     154     1024
 Orf46.1k(合并液2)   氢氧化铝3.3mg/ml     1085     1024
  磷酸铝0.6mg/ml     250     1024
应理解本发明仅通过实施例作了描述，可进行修改且同时使这些修改保持在本发明的范围和思路内。
                             表1
菌株              1343            序列               菌株分类
72/00              +                       ET5 B：15：P1.7，13，13a
30/00              +                       ET5 B：15：P1.7，16
39/99              +                       ET5 C：15：P1.7，16
95330              +                       ET5 B：4：P1.15
M4102              +                       ET5 nd
MC58(21)           +               +       ET5 B：15：P1.7，16b
BZ169(7)           +               +       ET5 B：NT：P1.16
BZ83(19)           +                       ET5 B：15：-.-
CU385              +               +       ET5 B：4：P1.15
2201731            +                       ET5 NG：4：P1.15
64/96              +               +       ET5 NG：15：P1.7，16(载体)
2201731           +                     ET5 B：4：P1.15(载体)
ISS1071           +                     nd B：15：P1.7，16(ET5？)
BZ198(2)          +         +           lin.3 B：8：P1.1
980-2543          +         +           lin.3 B：NT：P1.4
16060             +         +           其它B：4：P1.14(载体)
394-98            +                     nd B：4：P1.4(lin 3？)
ISS1106           +                     nd B：4：P1.4(lin 3？)
BZ133(10)         +         +           sub I B：NT：-.-
S3446             +         +           nd B：14：P1.23，14
ISS1001           +         +           nd B：14：P1.13
2411751           +                     其它NG：21：P1.16(载体)
1712741           +                     其它NG：15：-(载体)
66/96             +                     其它B：17：P1.15(载体)
961-5945          -                     A4
96217             -                     A4
312294            -                     A4
90/18311(24)      -                     ET37
93/4286(25)       -                     ET37
M986              -                     ET37
1000(5)           -                     其它
NGE28(13)         -                     其它载体
NGH38(14)         -                     其它载体
BZ232(18)         -                     其它
F6124(23)         -                     sub III A：-.-
C11               -                     C：-
NMB               -                     nd
8047              -                     nd
ISS759            -                     nd C：2b：P1.2
ISS1113           -                     nd C：2：P1.5
65/96             -                     nd 4：P1.14
2996(96)          -                     nd B：2b：P1.5，2
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81-Parkhill等，(2000)Nature 404：502-506.
序列表
SEQ ID 1-741来自菌株1000
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTTPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREDVHEIGIAGKQ
SEQID2-741来自菌株2201731(提前终止密码子)，通过可靠序列
MTRSKPVNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQ
DSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLK
SPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKA
SEQ ID 3-741来自菌株90/18311(不完全)
GLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEV
DGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFMQLPSGKAEYHGK
AFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLA
LFGDRAQEIAGSATVKIREKVHET
SEQ ID 4-741来自菌株L93/4286(不完全)
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLOSLMLDOSVRKNEKLKLAAOGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFD
FIRQIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDG
KAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTPEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEE
KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 5-741来自菌株2996
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKT
PEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 6-741来自菌株30/00
KDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEF
QVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKL
TYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAG
SAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 7-741来自菌株312294
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKT
PEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 8-741来自菌株39/99(不完全)
DKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQ
VYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLT
YTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGS
AEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 9-741来自菌株5/99
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 10-741来自菌株67/00
MTRSKPVNRTAFCCFSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQ
DPEHSGKMVAKRRFKIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLK
SPELNVELATAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID 11-741来自菌株BZ169
LQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAMKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIBVDGQLITLESGEFQVYK
QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTI
DFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEV
KTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 12-741来自菌株72/00
LQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYK
QSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTI
DFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEV
KTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 13-741来自菌株93/114
MTRSKPVNRTAFCCFSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQEQ
DPEHSGKMMVAKRRFKIGDIAGEHTSFDKLPKDVMATYRGTAFGSDDAGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLK
SPELNVELATAYIKPDEKHHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
SEQ ID 14-741来自菌株95N477
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 15-741来自菌株96217
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKT
PEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEDGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 16-741来自菌株BZ133
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQ
DSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLK
SPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 17-741来自菌株BZ232
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 18-741来自菌株C11
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 19-741来自菌株M1090
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPSGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 20-741来自菌株M1096
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTTPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQTITLASGEFQUTJQNHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 21-741来自菌株M198/172
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQ
DSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDASGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLK
SPELNVDLAASDIKPDKKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGQAQEVAGSAEVETANGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 22-741来自菌株NGH38
MTRSKPVNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEK
LKLAAQGAEKTYGMGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDDGQTITLSGEFQIYKQNHSAVVALQIEKIN
NPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKT
PEQNVELASAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ
SEQ ID 23-NMB1343来自十种脑膜炎球菌菌株
MGNFLYRGISCQQDEQNNGQLKPKGNKAEVAIRYDGKFKYDGKATHGPSVKNAVYAHQIETGLYDGCYIS
TTTDKEIAKKFATSSGIENGYIYVLNRDLFGQYSIFEYEVEHPENPNEKEVTIRAEDCGCIPEEVIIAKE
LIEIN
SEQ ID 24-NMB1343来自***
INNLWEISYLYRGISCQQDEQNNGQLKPKGNKAEVAIRYDGKFKYDGKATHGPSVKNAVYAHQIETDLYD
GCYISTTTDKEIAKKFATSSGIENGYIYVLNRDLFGQYSIFEYEVEHPENPDEKEVTIRAEDCGCIPEEV
IIAKELIEIN
SEQ ID 25-NMB1343核酸序列(***)
TCCGCCGCATTACCTTATAAAATAAAACATCCCTCTCAAGCAGTCTGATAATGTTTGGATTGCTTGAGAT
TGATGAGTGATGGTGTTAAATTCAAACTTTAAATTAATAACTTATGGGAAATTTCTTATTTATATAGAGG
CATTAGTTGCCAACAAGATGAGCAAAATAATGGACAGTTAAAACCTAAAGGTAATAAAGCTGAAGTTGCA
ATTCGTTATGATGGTAAGTTTAAATATGATGGTAAAGCTACACATGGTCCAAGTGTGAAGAATGCAGTTT
ACGCCCATCAAATTGAAACAGATCTATATGACGGATGTTATATATCTACGACAACAGACAAGGAAATTGC
CAAGAAATTTGCAACAAGCTCCGGCATCGAAAATGGCTATATATATGTTTTAAATAGAGATTTGTTTGGT
CAATATTCTATTTTTGAATATGAGGTTGAAGATCCAGAAAACCCAGATGAGAAGGAAGTAACAATCAGAG
CTGAAGATTGTGGCTGTATTCCTGAAGAAGTGATTATTGCTAAAGAGTTGATAGAAATTAACTAAGTTGA
AAGGTCAATATAATGGCTTTAGTTGAATTGAAAGTGCCCGACATTGGCGGACACGAAAATGTAGATATTA
TCGC
SEQ ID 26-NMB1343核酸序列(脑膜炎球菌)
TCCGCCGCATTACCTTATAAAATAAAACATCCCTCTCAAGCAGTCTGATAATGTTTGGATTGCTTGAGAT
TGATGAGTAATGGTGTTAAATTCAACCTTTAAATTAATAACTTATGGGAAATTTCTTATATAGAGGCATT
AGTTGCCAACAAGATGAGCAAAATAATGGACAGTTAAAACCTAAAGGTAATAAAGCTGAAGTTGCAATTC
GTTATGATGGTAAGTTTAAATATGATGGTAAAGCTACACATGGTCCAAGTGTGAAGAATGCAGTTTACGC
CCATCAAATTGAAACAGGTCTATATGACGGATGTTATATATCTACGACAACAGACAAGGAAATTGCCAAG
AAATTTGCAACAAGTTCCGGCATCGAAAATGGCTATATATATGTTTTAAATAGGGATTTGTTTGGTCAAT
ATTCTATTTTGAATATGAGGGTTGAACATCCAGAAAACCCAAATGAGAAGGAAGTAACAATCAGAGCTGA
AGATTGTGGCTGTATTCCTGAAGAAGTGATTATTGCTAAAGAGTTGATAGAAATTAACTAAGTTGAAAGG
TCAATATAATGGCTTTAGTTGAATTGAAAGTGCCCGACATTGGCGGACACGAAAATGTAGATATTATCGC
SEQ ID 27-接头
GSGGGG
SEQ ID 28-优选ΔG287-953杂交体
MASPDVKSADTLSKPAAPVVAEKETEVKEDAPQAGSQGQGAPSTQGSQDMAAVSAENTGNGGAATTDKPK
NEDEGPQNDMPQNSAESANQTGNNQPADSSDSAPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHC
KGDSCNGDNLLDEEAPSKSEFENLNESERIEKYKKDGKSDKFTNLVATAVQANGTNKYVIIYKDKSASSS
SARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALR
VQGEPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAI
DGNGFKGTWTENGGGDVSGRFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD GSGGGGATYKVDEYH
ANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPD
IRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLV
NVGMTKKSVRIDIQIEAAKQ
SEQ ID 29-ΔG287NZ-953杂交体
MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAOGGODMAAVSEENTGNGGAAATDKPK
NEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGG
ENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSG
NNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFR
RSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEP
SKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGF
KGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVPAGKKEQD GSGGGGATYKVDEYHANARF
AIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVS
TKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMT
KSVRIDIQIEAAKQ
SEQ ID 30-936-ΔG741杂交体
MKPKPHTVRTLIAAIFSLALSGCVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQ
TKGYTPQISVVGYNRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSK
VRATLLGISPATQARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR GSGGGGVA
ADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFI
RQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGR
ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEK
GSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
SEQ ID 31-961c
MATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTN
LTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTTAEETKTNIV
KIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAE
AAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRL
ASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

Claims (22)

1.一种具有以下分子式的杂合蛋白质：NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，
其特征在于，其中L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，X是：
(a)orf1、orf4、orf25、orf40、orf46.1、orf83、NMB1343、230、233、287、292、594、687、736、741、907、919、936、953、961或983氨基酸序列；
(b)与(a)的氨基酸序列具有序列相同性的氨基酸序列；或
(c)含有(a)的氨基酸序列片段的氨基酸序列
2.一种具有以下分子式的杂合蛋白质：NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，
其特征在于，其中X是一氨基酸序列，L是任选的接头氨基酸序列，A是任选的N-末端氨基酸序列，B是任选的C-末端氨基酸序列，n是大于1的整数，其中第一种X部分(-Xa-)具有下列氨基酸序列之一：
(a)参考文献3所述的446个偶数编号序列SEQ IDs(即2、4、6…890、892)；
(b)参考文献4所述的45个偶数编号序列SEQ IDs(即2、4、6…88、90)；
(c)参考文献5所述的1674个偶数编号序列SEQ IDs 2-3020、偶数编号序列SEQ IDs 3040-3114和所有的编号序列SEQ IDs 3115-3241；
(d)参考文献7的2160个氨基酸序列，NMB0001至NMB2160；
(e)参考文献1或2所述的氨基酸序列。
和第二种-X-部分(-Xb-)，其中-Xb-与-Xa-具有序列相同性，和/或-Xb-包括-Xa-的片段。
3.如权利要求1或2所述的杂合蛋白质，其中，n＝2。
4.如权利要求2所述的杂合蛋白质，其中，-Xa-是orf46.1、230、287、741、919、936、953、961或983氨基酸序列。
5.如权利要求2所述的杂合蛋白质，其中，X1…Xn都相互具有序列相同性。
6.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，n＝2，其中-X-部分是ΔG287和230；ΔG287和936；ΔG287和741；961c和287；961c和230；961c和936；961cL和287；961cL和230；961cL和936；ORF46.1和936；ORF46.1和230；230和961；230和741；936和961；936和741；ΔG741和741；或ΔG287和287。
7.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，L具有20个或较少的氨基酸。
8.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，L是一种聚甘氨酸接头。
9.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，A具有40个或较少的氨基酸。
10.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，B具有40个或较少的氨基酸。
11.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，-X-部分具有脑膜炎奈瑟球菌血清群B中发现的氨基酸序列。
12.如任何前述权利要求所述的杂合蛋白质，其中，至少一个-X-部分是961氨基酸序列，但该序列中缺失了一个或多个结构域。
13.一种蛋白质，其中，所述蛋白质含的氨基酸序列选自SEQ IDs 1至38。
14.一种核酸，其中，所述核酸编码任何前述权利要求的所述蛋白质。
15.一种组合物，其中，所述组合物包含任何前述权利要求所述的蛋白质或核酸。
16.一种组合物，其中，所述组合物包含两种或多种下列蛋白质：
(1)287
(2)741
(3)ORF46.1
(4)961
(5)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝953
(6)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝919
(7)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝961
(8)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝287，X2＝741
(9)NH2-A-[-X-L-]n-B-COOH，其中n＝2，X1＝936，X2＝741
17.如权利要求16所述的组合物，其中，所述组合物包含蛋白质(4)、(5)和(9)。
18.如权利要求17所述的组合物，其中，蛋白质(4)包含SEQ ID 31，蛋白质(5)包含SEQ ID 28或SEQ ID 29，蛋白质(9)包含SEQ ID 30。
19.如权利要求15到18中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括：
-脑膜炎奈瑟球菌蛋白质抗原；
-脑膜炎奈瑟球菌外膜泡囊(OMV)制品；
-脑膜炎奈瑟球菌糖抗原；
-肺炎链球菌糖抗原；
-甲肝、乙肝或丙肝病毒抗原；
-百日咳杆菌抗原；
-白喉抗原；
-破伤风抗原；
-幽门螺杆菌蛋白质抗原；
-流感嗜血杆菌糖抗原；
-淋病奈瑟球菌抗原；
-肺炎衣原体抗原；
-沙眼衣原体抗原；
-牙龈卟啉单胞菌的抗原；
-脊髓灰质炎病毒的抗原；
-狂犬病毒抗原；
-麻疹、流行性腮腺炎和/或风疹病毒抗原；
-流感病毒抗原；
-卡定性莫拉菌的抗原；
-无乳链球菌的抗原；
-化脓性链球菌的抗原；
-金黄色葡萄球菌的抗原。
20.如权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包括药学上可接受的载体。
21.如权利要求20所述的组合物，其中，所述组合物可用作药物。
22.一种治疗病人的方法，其中，所述方法包括给予病人治疗有效量的权利要求20所述的组合物。
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Free format text: FORMER NAME: CHIRON S.P.A.

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Address after: Italy Siena

Patentee after: Novartis Vaccines & Diagnostic

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Patentee before: Chiron S. P. A.

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Effective date of registration: 20170801

Address after: Belgium Sutter Rixon

Patentee after: Glazo Smithkline Beecham Biologicals S. A.

Address before: Italy Siena

Patentee before: Novartis Vaccines & Diagnostic

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Granted publication date: 20080528

Termination date: 20180906

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