PT2200642E - Formulações de vacinas meningocócicas - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES DE VACINAS MENINGOCÓCICAS"

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção pertence ao campo da formulação de vacinas meningocócicas.

ARTE ANTECEDENTE Várias vacinas contra o serogrupo B de Neisseria meningitidis ("Men-B") estão atualmente a ser investigadas, mas partilham uma caracteristica comum.

Os produtos da vesícula da membrana externa (OMV) produzidos por Novartis (MENZB™), pelo Instituto Finlay (VA-MENGOC-BC™) , pelo Instituto Norueguês de Saúde Pública (MENBVACT™) e pelo Instituto de Vacinas da Holanda (HEXAMEN™ e NONAMEN™) todos incluem um adjuvante de hidróxido de alumínio. A "vacina universal para o serogrupo B meningocócico" referida por Novartis na referência 1 também inclui um adjuvante de hidróxido de alumínio, tal como já o incluía a vacina OMV bivalente recentemente referida na referência 2.

REVELAÇÃO DA INVENÇÃO

Ao desenvolver a vacina Novartis Men-B, os inventores verificaram que uma imunogenicidade ótima requer a presença de um adjuvante. Além disso, verificaram que a adsorção ao hidróxido de alumínio providencia uma boa estabilidade de armazenamento para os antígenos da vacina. Porém, para evitar a necessidade de usar sais de alumínio foram procuradas alternativas. 0 uso de adjuvantes sem ser de alumínio para vacinas Men-B é já conhecido. Por exemplo, a referência 3 descreve o uso da emulsão óleo-em-água MF59 como um adjuvante para vesículas Men-B, e a referência 4 descreve o uso de oligonucleotídeos imunoestimulatórios e/ou MF59 como adjuvantes. Apesar dos resultados da imunogenicidade com 2 MF59 serem excelentes, e a investigação continuada demonstrar que este adjuvante pode aumentar a cobertura de estirpes de uma vacina Men-B quando comparada com hidróxido de alumínio, estudos adicionais têm demonstrado inesperadamente que os imunogénios Men-B com adjuvantes de emulsões óleo-em-água apresentam uma baixa estabilidade a longo prazo. Assim, é um objeto da invenção providenciar formas de melhorar a estabilidade do armazenamento de vacinas Men-B quando usando adjuvantes de emulsão óleo-em-água .

Experiências prévias com emulsões óleo-em-água provêem da área das vacinas contra a gripe. 0 produto FLUAD™ inclui a emulsão MF59, e é distribuído num formato líquido pré-misturado num recipiente único (a abordagem "um frasco"). Esta formulação pré-misturada é a formulação que se sabe agora que oferece uma baixa estabilidade às vacinas Men-B.

Em alternativa à formulação "um frasco" com vacinas de emulsão óleo-em-água, uma abordagem "dois frascos" foi usada para a gripe (por exemplo, ver referência 5) , para HSV (por exemplo, referência 6) e para o VIH (por exemplo, referência 7) , na qual a vacina e emulsão são distribuídas juntas, ambas em formato líquido, para mistura extemporânea no momento do uso.

De acordo com a presente invenção, uma abordagem diferente é seguida para vacinas Men-B, usando uma formulação dupla de (i) um adjuvante de emulsão óleo-em-água e (ii) um componente imunogénico Men-B sob forma liofilizada. Os antígenos Men-B liofilizados podem ser reconstituídos na forma líquida com adjuvante no momento do uso, prontos para administração a um paciente. Verificou-se que esta formulação proporciona excelentes resultados tanto em termos de estabilidade como de imunogenicidade.

Os inventores observaram, ainda, que o componente liofilizado pode reter eficácia quando um ou mais sacarídeos conjugados dos serogrupos A, C, W135 e/ou Y 3 (Men-A, -C, -W135 e -Y) de N. meningitidis é incluído. A combinação de antígenos para imunizar contra múltiplos serogrupos meningocócicos, incluindo o serogrupo B, usando um único componente liofilizado é particularmente vantajosa.

Assim, a invenção providencia um kit compreendendo: (i) um primeiro recipiente que contém um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo-em-água; e (ii) um segundo recipiente que contém uma composição antigénica liofilizada compreendendo um imunogénio para despoletar uma resposta imune contra o serogrupo B de N. meningitidis. A composição antigénica liofilizada pode, ainda, compreender um sacarídeo capsular conjugado de um ou mais dos serogrupos A, C, W135 e/ou Y de N. meningitidis. A invenção também providencia um método para preparar uma composição imunogénica, compreendendo uma etapa de mistura de: (i) um adjuvante compreendendo uma emulsão óleo-em-água; e (ii) uma composição antigénica liofilizada compreendendo um imunogénio para despoletar uma resposta imune contra o serogrupo B de N. meningitidis. A composição antigénica liofilizada pode, ainda, compreender um sacarídeo capsular conjugado de um ou mais dos serogrupos A, C, W135 e/ou Y de N. meningitidis. A composição antigénica liofilizada A invenção usa uma composição antigénica liofilizada que inclui um imunogénio para despoletar uma resposta imune contra Men-B. Pode opcionalmente incluir um sacarídeo capsular conjugado de um ou mais dos Men-A, Men-C, Men-W135 e/ou Men-Y. 0 imunogénio Men-B pode compreender vesículas membranares de uma bactéria Men-B e/ou proteínas recombinantes Men-B e/ou lipoligossacarídeos Men-B (LOS). A liofilização dos OMV's de Men-B é conhecida na arte [8], mas estes OMV's foram subsequentemente administrados juntos com um adjuvante de fosfato de alumínio. Assim, o 4 problema da estabilidade do antígeno quando combinado com um adjuvante de emulsão óleo-em-água não foi reportado. Do mesmo modo, a liofilização de antígenos meningocócicos conjugados é conhecida, incluindo reconstituição subsequente com MF59 [9], mas não em combinação com qualquer antígeno Men-B.

Componentes Men-B compreendendo vesículas

Vesículas para uso como componentes da vacina Men-B incluem qualquer vesícula proteolipossómica obtida interrompendo uma membrana exterior bacteriana para formar vesículas daí que incluem componentes de proteína da membrana exterior. Assim, o termo inclui OMV's (por vezes referidas como "blebs"), microvesículas (MV's [10]) e "OMV's nativas" ("NOMV's" [11]). MV' s e NOMV's são vesículas da membrana que ocorrem naturalmente que se formam espontâneamente durante o crescimento bacteriano e são libertadas em meio de cultura. MV' s podem ser obtidas cultivando Neisseria num caldo de meio de cultura, separando todas as células das MV' s mais pequenas no caldo de meio de cultura (por exemplo, por filtração ou por centrifugação a baixa velocidade para tornar apenas as células em pequenas bolas e não as vesículas mais pequenas), e depois coletar as MV's do meio deficiente em células (por exemplo, por filtração, por precipitação diferencial ou agregação de MV's, por centrifugação a alta velocidade para tornar as MV' s em pequenas bolas) . Estirpes para uso na produção de MV's podem geralmente ser selecionadas com base na quantidade de MV's produzida em cultura, por exemplo, as referências 12 e 13 descrevem Neisseria com alta produção de MV. OMV's são preparadas artificialmente a partir de bactérias, e podem ser preparadas usando tratamento com detergente (por exemplo, com deoxicolato), ou por meios não detergentes (por exemplo, ver referência 14). Métodos para obter preparações de OMV adequadas são revelados, por 5 exemplo, nas referências citadas aqui. Técnicas para formar OMV' s incluem tratar bactérias com um detergente de sal de ácido bilico (por exemplo, sais de ácido litocólico, ácido quenodeoxicólico, ácido ursodeoxicólico, ácido deoxicólico, ácido eólico, ácido ursocólico, etc., com deoxicolato de sódio [15 e 16] sendo preferidos para tratar Neisseria) a um pH suficientemente alto para não precipitar o detergente [17]. Outras técnicas podem ser realizadas substancialmente na ausência de detergente [14] usando técnicas tal como sonicação, homogeneização, microfluidização, cavitação, choque osmótico, trituração, cafeteira de êmbolo, mistura, etc. Métodos usando nenhum ou pouco detergente podem reter antigenos úteis tais como NspA [14]. Assim, um método pode usar um tampão de extração de OMV com cerca de 0,5% de deoxicolato ou mais baixo por exemplo, cerca de 0,2%, cerca de 0,1 %, <0,05% ou zero.

Um processo útil para a preparação de OMV está descrito na referência 18 e envolve ultrafiltração em OMV's grosseiros, em vez de centrifugação a alta velocidade. O processo pode envolver uma etapa de ultracentrifugação após a ocorrência da ultrafiltração.

Vesículas podem ser preparadas a partir de qualquer estirpe Men-B para uso com a invenção. Podem ser de qualquer serotipo (por exemplo, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.), qualquer serosubtipo, e qualquer imunotipo (por exemplo, Ll; L2; L3; L3,3,7; L10; etc.). Os meningococos podem ser de qualquer linhagem adequada, incluindo linhagens hiperinvasivas e hipervirulentas, por exemplo, qualquer das seguintes sete linhagens hipervirulentas: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV-1; complexo ET-5; complexo ET-37; grupo A4; linhagem 3. Estas linhagens foram definidas por electroforese enzimática multilocus (MLEE), mas também foi usada tipagem de sequências multilocus (MLST) para classificar os meningococos [referência 19] por exemplo, o complexo ET-37 é o complexo ST-11 por MLST, o 6 complexo ET-5 é ST-32 (ET-5), a linhagem 3 é ST-41/44, etc. As vesículas podem ser preparadas a partir de estirpes com um dos seguintes subtipos: P1.2; Pl.2,5; P1.4; P1.5; Pl.5,2; PI.5,c; P1.5c,10; Pl.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; PI.15; PI.9,15; Pl.12,13; P1.13; P1.14; Pl.21,16; Pl.22,14.

Vesículas usadas com a invenção podem ser preparadas a partir de estirpes Men-B de tipo selvagem ou a partir de estirpes mutantes. Por exemplo, a referência 20 revela preparações de vesículas obtidas a partir de N. meningitidis com um gene fur modificado. A referência 27 demonstra que a expressão de nspA deveria ser regulada positivamente com porA e cps desativados concomitantes. Mutantes desativados adicionais de N. meningitidis para produção de OMV são revelados nas referências 27 a 29. A referência 21 revela vesículas nas quais fHBP é regulado positivamente. A referência 22 revela a contrução de vesículas a partir de estirpes modificadas para expressar seis subtipos PorA diferentes. Mutantes de Neisseria com níveis baixos de endotoxina, conseguidos por desativação de enzimas envolvidas na biossíntese de LPS, também podem ser usados [33, 24]. Estes ou outros mutantes podem todos ser usados com a invenção.

Assim, uma estirpe Men-B usada com a invenção pode, nalgumas modalidades, expressar mais do que um subtipo PorA. Estirpes PorA hexavalentes e nonavalentes foram previamente construídas. A estirpe pode expressar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 de subtipos PorA: Pl.7,16; Pl.5-1,2-2; Pl.19,15-1; Pl.5-2,10; Pl.12-1,13; Pl.7-2,4; Pl.22,14; Pl.7-1,1 e/ou Pl.18-1,3,6. Noutras modalidades, uma estirpe pode ter sido regulada negativamente para expressão de PorA por exemplo, na qual a quantidade de PorA foi reduzida de, pelo menos, 30% (por exemplo, ^30%, >40%, ^50%, ^60%, >10%, >80%, >90%, >95%, etc.), ou mesmo desativada, em relação aos níveis do tipo selvagem (por exemplo, em relação à estirpe H44/76, como revelado na referência 30). 7

Nalgumas modalidades uma estirpe Men-B pode sobre-expressar (em relação à estirpe de tipo selvagem correspondente) certas proteínas. Por exemplo, estirpes podem sobre-expressar NspA, proteína 287 [45], fHBP [21],

TbpA e/ou TbpB [25], Cu, Zn superóxido dismutase [25], etc.

Nalgumas modalidades uma estirpe Men-B pode incluir uma ou mais das mutações de desativação e/ou de sobre- expressão reveladas nas referências 26 a 29. Genes preferidos para regulação para baixo e/ou desativação incluem: ( a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, , SiaD, TbpA, e/ou TbpB [26] ; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, r LbpA , LbpB , LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF , SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [27]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, e/ou TbpB [28]; e (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB,

OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, e/ou SynC [29].

Onde uma estirpe mutante é usada, nalgumas modalidades, pode ter uma ou mais, ou todas, das seguintes características: (i) LgtB e/ou GalE regulada negativamente ou desativada para truncar o LOS meningocócico; (ii) TbpA regulado positivamente; (iii) Hsf regulado positivamente; (iv) Omp85 regulado positivamente; (v) LbpA regulado positivamente; (vi) NspA regulado positivamente; (vii) PorA desativado; (viii) FrpB regulado para baixo ou desativado; (ix) Opa regulada negativamente ou desativada; (x) Opc regulada negativamente ou desativada; (xii) complexo de gene cps deletado. Um LOS truncado pode ser um que não inclui um epítopo de sialil-lacto-N-neotetraose, por exemplo, pode ser um LOS deficiente em galactose. 0 LOS pode não ter cadeia a.

Se o LOS está presente numa vesícula então é possível tratar a vesícula de maneira a ligar o seu LOS e componentes da proteína (conjugação "intra-bleb" [29]). A invenção pode ser usada com misturas de vesículas de estirpes diferentes. Por exemplo, a referência 30 revela uma vacina compreendendo composições de vesículas meningocócicas multivalentes, compreendendo uma primeira vesícula derivada de uma estirpe meningocócica com um serosubtipo prevalente num país de uso, e uma segunda vesícula derivada de uma estirpe gue não precisa de ter uma prevalência do serosubtipo num país de uso. A referência 31 também revela combinações úteis de vesículas diferentes. Uma combinação de vesículas de estirpes em cada dos imunotipos L2 e L3 pode ser usada nalgumas modalidades.

Antígenos baseados em vesículas podem ser preparados a partir de serogrupos além do Men-B (por exemplo, a referência 17 revela um processo para Men-A). A invenção pode, em conformidade, ser usada com serogrupos preparados de vesículas além do Men-B (por exemplo, A, C, W135 e/ou Y). 0 principal foco é, contudo, no Men-B.

Componentes Men-B compreendendo proteínas recombinantes

As proteínas recombinantes também foram reportadas para uso como imunogenes de vacinas contra Men-B. Por exemplo, vários antígenos são reportados nas referências 32 a 40. Tais antígenos podem ser usados isolados ou em combinações. Onde múltiplas proteínas purificadas são combinadas então é útil usar uma mistura de 10 ou menos (por exemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antígenos purificados.

Uma combinação particularmente útil de antígenos é revelada nas referências 1 e 40, e, por isso, uma composição pode incluir 1, 2, 3, 4 ou 5 de: (1) uma proteína "NadA"; (2) uma proteína "fHBP", conhecida anteriormente como "741"; (3) uma proteína "936"; (4) uma proteína "953"; e (5) uma proteína "287". Outras combinações possíveis de antígeno podem compreender uma proteína de ligação a transferina (por exemplo, TbpA e/ou TbpB) e um antígeno Hsf. Outros antígenos purificados 9 possíveis incluem proteínas compreendendo uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ. ID N.° 650 da referência 32; SEQ. ID N.° 879 da referência 32; SEQ. ID N.° 884 da referência 32; SEQ. ID N.° 4 da referência 33; SEQ. ID N.° 598 da referência 34; SEQ. ID N.° 818 da referência 34; SEQ. ID N.° 864 da referência 34; SEQ. ID N.° 866 da referência 34; SEQ. ID N.° 1196 da referência 34; SEQ. ID N.° 1272 da referência 34; SEQ. ID N.° 1274 da referência 34; SEQ. ID N.° 1640 da referência 34; SEQ. ID N.° 1788 da referência 34; SEQ. ID N.° 2288 da referência 34; SEQ. ID N.° 2466 da referência 34; SEQ. ID N.° 2554 da referência 34; SEQ. ID N.° 2576 da referência 34; SEQ. ID N.° 2606 da referência 34; SEQ. ID N.° 2608 da referência 34; SEQ. ID N.° 2616 da referência 34; SEQ. ID N.° 2668 da referência 34; SEQ. ID N.° 2780 da referência 34; SEQ. ID N.° 2932 da referência 34; SEQ. ID N.° 2958 da referência 34; SEQ. ID N.° 2970 da referência 34; SEQ. ID N.° 2988 da referência 34, ou um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos que: (a) tem 50% ou mais de identidade (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com ditas sequências; e/ou (b) compreende um fragmento de, pelo menos, n aminoácidos consecutivos de ditas sequências, em que n é 7 ou mais (por exemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 ou mais). Fragmentos preferidos para (b) compreendem um epítopo da sequência relevante. Mais de um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6) destes polipeptídeos podem ser incluídos. O antígeno fHBP cai em três variantes distintas [39] . Um componente Men-B da invenção pode incluir uma única variante de fHBP, mas incluirá utilmente um fHBP de cada de duas ou todas as três variantes. Assim, pode incluir uma combinação de dois ou três fHBP's purificados diferentes, selecionados a partir de: (a) uma primeira proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, a% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 1 10 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, x aminoácidos contíguos da SEQ. ID N.° 1; (b) uma segunda proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, b% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 2 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, y aminoácidos contíguos da SEQ. ID N.° 2; e/ou (c) uma terceira proteína, compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem, pelo menos, c% de identidade da sequência com a SEQ. ID N.° 3 e/ou compreendendo uma sequência de aminoácidos que consiste num fragmento de, pelo menos, z aminoácidos contíguos da SEQ. ID N.° 3. O valor de a é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99, 5, ou mais. O valor de b é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99, 5, ou mais. O valor de c é, pelo menos, 85 por exemplo, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99, 5, ou mais. Os valores de a, b e c não estão intrinsecamente relacionados uns com os outros. 0 valor de x é, pelo menos, 7 por exemplo, 8, 9, 10 1-1 \—1 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 , 60, 70, 80, 90, 100 120, 140 , 160, 180, 200 , 225, 250) . 0 valor de y é, pelo meno s, 7 por ex< emplo , 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, OO \—1 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 r 120, 1 40, 160, 180, 2 00, 225, 250) . 0 valor de z é, pelo menos, 7 por exemplo, 3 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40 L 45, 50 07 O O CO O 90, 100, 120, 140 , 160, 180, 200, 22 5, 250) . Os valores de x, y e z não estão intrinsecamente relacionados uns com os outros.

Nalgumas modalidades, proteína(s) fHBP serão lipidadas, por exemplo, numa cisteína N-terminal. Noutras 11 modalidades, não serão lipidadas.

Uma composição útil baseada em proteínas purificadas compreende uma mistura de: (i) um primeiro polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 4; (ii) um primeiro polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 5 ou SEQ. ID N.° 7; e (iii) um primeiro polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos SEQ. ID N.° 6. Ver referências 1 e 40.

Componentes Men-B compreendendo LOS

Vacinas meningocócicas baseadas em lipoligossacarídeos foram descritas. O LOS pode ser usado sozinho ou conjugado com um veículo. Quando é conjugado, a conjugação pode ser através de uma porção do lípido A no LOS ou através de qualquer outro grupo adequado, por exemplo, os seus resíduos KDO. Se o grupo lípido A do LOS está ausente então é essencial a existência de tal ligação alternativa. O LOS pode ser de qualquer imunotipo, por exemplo, L2, L3, L7, etc.

Em vez de usar LOS nativo, é preferido usar uma forma modificada. Estas modificações podem ser conseguidas quimicamente, mas é mais conveniente desativar as enzimas em Men-B responsáveis por certas adições biossintéticas. Por exemplo, LOS pode ser modificado para remover, pelo menos, o terminal Gal da unidade nativa de lacto-N- neotetraose, e esta modificação pode ser conseguida desativando uma ou mais das enzimas relevantes. As enzimas responsáveis por adicionar os dois terminais monossacarídeos num LOS nativo (ácido siálico e galactose) podem ser desativadas, quer para eliminar apenas o terminal Sia ou para eliminar o dissacarídeo Sia-Gal. Desativar o gene lgtB, por exemplo, remove SiaGal. Uma desativação do gene galE também providencia um LOS modificado útil. Um gene da transferase do lípido A gordo pode ser desativado [41] .

Pelo menos, um ácido gordo primário ligado a oxigénio 12 pode ser removido de LOS [42] . LOS com um número reduzido de cadeias acilo secundárias por molécula de LOS também pode ser usado [43]. 0 LOS pode não ter cadeia a. 0 LOS pode compreender GlcNAc-Hep2fosfoetanolamina-KD02-Lípido A [44] .

Componentes Men-B mistos A invenção pode usar vesículas, polipeptídeos purificados ou LOS como o antígeno Men-B. Também pode usar combinações destes três antígenos, por exemplo, (i) vesículas + polipeptídeos purificados; (ii) vesículas + LOS; (iii) polipept ídeos purificados + LOS; ou (iv) vesículas + polipeptídeos purificados + LOS. Estas combinações podem ser feitas preparando os componentes individuais separadamente e depois misturando-os. Por exemplo, a referência 45 revela a adição de proteínas purificadas a vesículas para providencar uma composição com maior eficácia.

Serogrupos A, C, W135 e Y

Vacinas monovalentes conjugadas contra o serogrupo C foram aprovadas para uso humano, e incluem MENJUGATE™, MENINGITEC™ e NEISVAC-C™. Misturas dos conjugados dos serogrupos A+C são conhecidas [46,47] e misturas dos conjugados dos serogrupos A+C+W135+Y têm sido reportadas [48-51] e foram aprovadas em 2005 como o produto aquoso MENACTRA™. O componente liofilizado usado com a invenção pode incluir um ou mais conjugados de sacarídeos capsulares de 1, 2, 3, ou 4 dos serogrupos A, C, W135 e Y meningocócicos, por exemplo, A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, A+W135+Y, A+C+W135+Y, etc. Componentes incluindo sacarídeos dos quatro serogrupos A, C, W135 e Y são preferidos. O sacarídeo capsular do serogrupo A meningocócico é um homopolímero de N-acetil-D-manosamina-l-fosfato ligado em (oí1->6) , com O-acetilação parcial nas posições C3 e C4. 13

Acetilação na posição C-3 pode ser 70-95%. As condições usadas para purificar o sacarideo podem resultar na de-0-acetilação (por exemplo, sob condições básicas), mas é útil reter OAc nesta posição C-3. Nalgumas modalidades, pelo menos, 50% (por exemplo, pelo menos, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) dos resíduos de manosamina nos sacarídeos do serogrupo A são O-acetilados na posição C-3. Grupos acetilo podem ser substituídos com grupos bloqueadores para prevenir a hidrólise [52], e tais sacarídeos modificados ainda são sacarídeos do serogrupo A dentro do significado da invenção. O sacarideo capsular do serogrupo C é um homopolímero de ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico, ou "NeuNAc") ligado em (a 2^9). A estrutura do sacarideo é escrita como -*9)-Neu p NAc 7/8 OAc-(oí2^. A maioria das estirpes do serogrupo C têm grupos O-acetilo em C-7 e/ou C-8 dos resíduos de acido siálico, mas cerca de 15% dos isolados clínicos carecem destes grupos O-acetilo [53,54]. A presença ou ausência de grupos OAc gera epítopos únicos, e a especificidade da ligação do anticorpo ao sacarideo pode afetar a sua atividade bactericida contra estirpes 0-acetiladas (0Ac+) e de-O-acetiladas (OAc-) [55-57]. Sacarídeos do serogrupo C usados com a invenção podem ser preparados tanto a partir de estirpes 0Ac+ como OAc-. Vacinas Men-C conjugadas licenciadas incluem ambos sacarídeos OAc- (NEISVAC-C™) e OAc+ (MENJUGATE™ e MENINGITEC™). Nalgumas modalidades, estirpes para produção de conjugados do serogrupo C são estirpes OAc+, por exemplo, do serotipo 16, serosubtipo P1.7a,l, etc.. Assim, estirpes OAc+ C:16:P1.7a,l podem ser usadas. Estirpes OAc+ em serosubtipo Pl.l são também úteis, tal como a estirpe Cll. O sacarideo do serogrupo W135 é um polímero de unidades dissacarídicas ácido siálico-galactose. Tal como o sacarideo do serogrupo C, tem O-acetilação variável, mas 14 nas posições 7 e 9 do ácido siálico [58] . A estrutura é escrita como: -4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-a-(2-6)-D-Gal-a-(1-. 0 sacarídeo do serogrupo Y é semelhante ao sacarideo do serogrupo W135, exceto que a unidade de repetição do dissacarideo inclui glicose em vez de galactose. Como o serogrupo W135, tem O-acetilação variável nas posições 7 e 9 do ácido siálico [58] . A estrutura do serogrupo Y é escrita como: ->4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -a- (2->6) -D-Glc-a- (l->.

Os sacarídeos usados de acordo com a invenção podem ser O-acetilados como descrito anteriormente (por exemplo, com o mesmo padrão de O-acetilação observado nos sacarídeos capsulares nativos), ou podem ser parcial ou totalmente de-O-acetilados em uma ou mais posições dos anéis do sacarídeo, ou podem estar hiper-O-acetilados em relação aos sacarídeos capsulares nativos.

Os grupos sacarídeos em conjugados podem compreender sacarídeos inteiros como preparados a partir de meningococos, e/ou podem compreender fragmentos de sacarídeos inteiros, isto é, os sacarídeos podem ser mais curtos do que os sacarídeos capsulares nativos observados nas bactérias. Os sacarídeos podem, assim, ser despolimerizados, com a despolimerização a ocorrer durante ou após a purificação do sacarídeo mas antes da conjugação. A despolimerização reduz o comprimento da cadeia dos sacarídeos. Um método de despolimerização envolve o uso de peróxido de hidrogénio [48]. 0 peróxido de hidrogénio é adicionado a um sacarídeo (por exemplo, para proporcionar uma concentração final de H202 de 1%) , a mistura é depois incubada (por exemplo, a cerca de 55°C) até ser conseguida uma redução do comprimento da cadeia desejada. Outro método de despolimerização envolve hidrólise dos ácidos [49]. Outros métodos de despolimerização são conhecidos na arte. Os sacarídeos usados para preparar conjugados para uso de acordo com a invenção podem ser alcançáveis por qualquer destes métodos de despolimerização. A despolimerização pode 15 ser usada de maneira a providenciar um comprimento de cadeia ótimo para imunogenicidade e/ou reduzir o comprimento de cadeia para uma gestão fisica dos sacarideos. Nalgumas modalidades, os sacarideos têm o seguinte intervalo de graus médios de polimerização (Dp): A=10-20; C=12-22; W135=15-25; Y=15-25. Em termos de peso molecular, em vez de Dp, intervalos úteis são, para todos os serogrupos: <100kDa; 5kDa-75kDa; 7kDa-50kDa; 8kDa-35kDa; 12kDa-25kDa; 15kDa-22kDa.

Nalgumas modalidades, o peso molecular médio para os sacarideos de cada um dos serogrupos A, C, W135 e Y meningocócicos pode ser mais de 50kDa por exemplo, >75kDa, úlOOkDa, únokDa, ^120kDa, ^130kDa, etc. [59], e até mesmo 1500kDa, em particular como determinado por MALLS. Por exemplo: um sacarideo Men-A pode estar no intervalo 50-500kDa, por exemplo, 60-80kDa; um sacarideo Men-C pode estar no intervalo 100-210kDa; um sacarideo Men-W135 pode estar no intervalo 60-190kDa, por exemplo, 120-140kDa; e/ou um sacarideo Men-Y pode estar no intervalo 60-190kDa, por exemplo, 150-160kDa. A massa do sacarideo meningocócco por serogrupo na vacina reconstituída será normalmente entre 1 pg e 20 pg por exemplo, entre 2 e 10 pg por serogrupo, ou cerca de 4 pg ou cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg. Onde conjugados de mais de um serogrupo são incluídos então podem estar presentes em massas substancialmente iguais, por exemplo, a massa de cada sacarideo do serogrupo está dentro +10% um do outro. Em alternativa a uma razão igual, pode ser usada o dobro da massa do sacarideo do serogrupo A. Assim, uma vacina pode incluir 10 pg de sacarideo Men-A e 5 pg de cada um dos sacarideos Men-C, W135 e Y.

Proteínas transportadoras preferidas são toxinas bacterianas, tais como toxinas diftérica ou tetânica, ou toxóides ou mutantes dos mesmos. Estas são normalmente usadas em vacinas conjugadas. O mutante da toxina diftérica 16 CRM197 é particularmente preferido [60]. Outras proteínas transportadoras adequadas incluem o complexo de proteína da membrana exterior de N. meningitidis [61], péptidos sintéticos [62,63], proteínas de choque térmico [64,65], proteínas da tosse convulsa [66,67], citocinas [68], linfocinas [68], hormonas [68], fatores de crescimento [68], proteínas artificiais compreendendo múltiplos epítopos de célula T CD4+ de vários antígenos derivados de patógenos [69] tais como N19 [70], proteína D de H. influenzae [71-73], pneumolisina [74] ou os seus derivados não tóxicos [75], proteína de superfície de pneumococo PspA [76], proteínas captadoras de ferro [77], toxina A ou B de C. difficile [78], exoproteína A recombinante de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) [79], etc.. Uma única proteína transportadora pode transportar sacarídeos de múltiplos serogrupos diferentes [80], mas esta organização não é preferida. Onde o componente liofilizado inclui conjugados de mais de um serogrupo meningocócico então os vários conjugados podem usar proteínas transportadoras diferentes (por exemplo, um serogrupo em CRMi97, outro em toxóide tetânico) ou podem usar a mesma proteína transportadora (por exemplo, sacarídeos de dois serogrupos separadamente conjugados com CRM197 e depois combinados).

Conjugados com uma razão sacarídeo:proteína (p/p) de entre 1:5 (isto é, com excesso de proteína) e 5:1 (isto é, com excesso de sacarídeo) podem ser usados, por exemplo, razões entre 1:2 e 5:1 e razões entre 1:1,25 e 1:2,5. Como descrito na referência 81, conjugados de serogrupos meningocócicos diferentes numa mistura podem ter diferentes razões de sacarídeo:proteína, por exemplo, uma pode ter uma razão de entre 1:2 e 1:5, enquanto outra pode ter uma razão entre 5:1 e 1:1,99.

Sacarídeos e conjugados com as mesmas características reveladas na referência 82 são úteis. A molécula transportadora pode ser conjugada 17 covalentemente com o sacarídeo meningocócico diretamente ou através de um linker. Vários linkers são conhecidos, por exemplo, um linker de ácido adípico, que pode ser formado unindo um grupo -NH2 livre (por exemplo, introduzido num sacarídeo por aminação) com um ácido adípico (usando, por exemplo, ativação diimida), e depois acoplando uma proteína ao intermediário sacarídeo-ácido adípico resultante [83, 84]. Outro tipo preferido de ligação é um linker carbonilo, que pode ser formado por reação de um grupo hidroxilo livre de um sacarídeo com CDI [85, 86] seguido de reação com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Outros linkers incluem β-propionamido [87], nitrofenil-etilamina [88], haletos de haloacilo [89], ligações glicosídicas [90], ácido 6-aminocapróico [91], N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) [92], ácido adípico dihidrazida ADH [93], grupos C4 a Ci2 [94], etc. A condensação da carbodiimida também pode ser usada [95].

Como descrito na referência 96, uma mistura pode incluir um conjugado com ligação direta sacarídeo/proteína e outro conjugado com ligação através de um linker. Esta organização aplica-se particularmente quando usando conjugados de sacarídeo de serogrupos meningocócicos diferentes, por exemplo, sacarídeos Men-A e Men-C podem ser conjugados através de um linker, enquanto sacarídeos Men-W135 e Men-Y podem ser conjugados diretamente a uma proteína transportadora.

Onde a composição inclui um ou mais dos conjugados Men-A, C, W e/ou Y, nalgumas modalidades, pode ser vantajoso incluir também um conjugado Hib (ver abaixo). Onde a composição inclui um sacarídeo de mais do que um serogrupo meningocócico, existe uma massa média de sacarídeo por serogrupo. Se foram usadas massas substancialmente iguais de cada serogrupo então a massa média será a mesma que cada massa individual; Onde massas não iguais são usadas então a média diferirá, por exemplo, 18 com uma quantidade de 10:5:5:5 pg para uma mistura Men-ACWY, a massa média é 6,25 pg por serogrupo. Se um sacarideo Hib é também incluido então, nalgumas modalidades, a sua massa será substancialmente a mesma que a massa média do sacarideo meningocócico por serogrupo. Nalgumas modalidades, a massa do sacarideo Hib será superior (por exemplo, pelo menos, l,5x) à massa média do sacarideo meningocócico por serogrupo. Nalgumas modalidades, a massa do sacarideo Hib será inferior (por exemplo, pelo menos, l,5x) à massa média do sacarideo meningocócico por serogrupo [97]. O adjuvante de emulsão óleo-em-água Vários adjuvantes de emulsão óleo-em-água são conhecidos, e tipicamente incluem, pelo menos, um óleo e pelo menos, um tensoativo, sendo o óleo (s) e tensoativo(s) biodegradáveis (metabolizáveis) e biocompatíveis. As goticulas de óleo na emulsão são geralmente menos de 5 pm em diâmetro, e podem mesmo ter um diâmetro sub-micrónico, com estes tamanhos pequenos a serem atingidos com um microfluidificador para providenciar emulsões estáveis. As goticulas com um tamanho inferior a 220 nm são preferidas uma vez que podem ser sujeitas a esterilização por filtração. A invenção pode ser usada com óleos tais como aqueles obtidos a partir de uma fonte animal (tal como peixe) ou vegetal. Fontes de óleos vegetais incluem nozes, sementes e grãos. Óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de coco, e óleo de azeitona, os mais vulgarmente disponíveis, exemplificam os óleos de nozes. O óleo de jojoba pode ser usado, por exemplo, obtido a partir do feijão de jojoba. Óleos de sementes incluem óleo de açafrão, óleo do caroço de algodão, óleo de semente de girassol, óleo de semente de sésamo e afins. No grupo dos grãos, o óleo de milho é o que está disponível mais facilmente, mas o óleo de outros grãos de cereais tais como trigo, aveias, centeio, arroz, teff, 19 triticale e afins também podem ser usados. Ésteres de ácido gordo carbono 6-10 de glicerol e 1,2-propanediol, embora não ocorram naturalmente em óleos de sementes, podem ser preparados por hidrólise, separação e esterificação dos materiais apropriados a partir dos óleos de sementes e nozes. Gorduras e óleos do leite de mamífero são metabolizáveis e podem, por isso, ser usados na prática desta invenção. Os procedimentos para separação, purificação, saponificação e outros meios necessários para obter óleos puros a partir de fontes animais são bem conhecidos na arte. A maioria dos peixes contém óleos metabolizáveis que podem ser facilmente recuperados. Por exemplo, óleo de fígado de bacalhau, óleos de fígado de tubarão, e óleo de baleia tal como espermacete exemplificam vários dos óleos de peixe que podem ser usados aqui. Um número de óleos de cadeia ramificada são sintetizados bioquimicamente em unidades com 5 carbonos de isopreno e são geralmente referidas como terpenóides. O óleo de fígado de tubarão contém terpenóides ramificados, não saturados conhecidos como esqualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que é particularmente preferido aqui. O esqualano, o análogo saturado do esqualeno também é um óleo preferido. Os óleos de peixe, incluindo esqualano e esqualeno, estão facilmente disponíveis a partir de fontes comerciais ou podem ser obtidos por métodos conhecidos na arte. Outros óleos preferidos são os tocoferóis. Misturas de óleos podem ser usadas. Onde a composição inclui um tocoferol, qualquer dos tocoferóis α, β, γ, δ, ε ou ξ pode ser usado, mas os a-tocoferóis são preferidos. O tocoferol pode tomar várias formas por exemplo, sais e/ou isómeros diferentes. Os sais incluem sais orgânicos, tais como succinato, acetato, nicotinato, etc. D-a-tocoferol e DL-a-tocoferol podem ambos ser usados. Um α-tocoferol preferido é DL-a-tocoferol, e o sal preferido deste tocoferol é o succinato. 20

Tensoativos podem ser classificados pelo seu "HLB" (equilíbrio hidrófilo-lipófilo) . Tensoativos preferidos da invenção têm um HLB de, pelo menos, 10, preferencialmente pelo menos, 15, e mais preferencialmente pelo menos, 16. A invenção pode ser usada com tensoativos incluindo, mas não limitados a: tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitan (referidos vulgarmente por Tweens), especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), e/ou óxido de butileno (BO), vendidos sob o nome comercial DOWFAX™, tal como copolímeros lineares em bloco EO/PO; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etoxi repetidos (oxi-1,2-etanediil), sendo octoxinol-9 (Triton X-100, ou toctilfenoxipolietoxietanol) de particular interesse; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos, tais como fosfatidilcolina (lecitina); éteres gordo de polioxietileno derivados dos álcoois laurilo, cetilo, estearilo e oleilo (conhecidos como tensoativos Brij), tais como éter de trietileneglicol monolauril (Brij 30); e ésteres de sorbitan (conhecidos vulgarmente como SPAN's), tais como trioleato de sorbitan (Span 85) e monolaurato de sorbitan. Tensoativos preferidos para inclusão na emulsão são Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitan), Span 85 (trioleato de sorbitan), lecitina e Triton X-100.

Misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas Tween 80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietileno sorbitan tal como monooleato de polioxietileno sorbitan (Tween 80) e um octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) também é adequada. Outra combinação útil compreende laureth-9 mais um éster de polioxietileno sorbitan e/ou um octoxinol.

Quantidades preferidas de tensoativos (% por peso) são: ésteres de polioxietileno sorbitan (tal como Tween 80) 0,01 a 1%, em particular cerca de 0,1%; octil- ou 21 nonilfenoxi polioxietanóis (tal como Triton X-100, ou outros detergentes da série Triton) 0,001 a 0,1 %, em particular 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) 0,1 a 20 %, preferencialmente 0,1 a 10 % e em particular 0,1 a 1 % ou cerca de 0,5%.

Adjuvantes de emulsão óleo-em-água específicos úteis com a invenção incluem, mas não se limitam a: • Uma emulsão de esqualeno sub-micrónica, Tween 80, e Span 85. A composição da emulsão por volume pode ser cerca de 5% esqualeno, cerca de 0,5% polissorbato 80 e cerca de 0,5% Span 85. Em termos de peso, estas razões tornam-se 4,3% esqualeno, 0,5% polissorbato 80 e 0,48% Span 85. Este adjuvante é conhecido como "MF59" [98-100], como descrito em mais detalhe no capítulo 10 da referência 101 e capítulo 12 da referência 102. A emulsão MF59 pode incluir iões de citrato por exemplo, 10 mM de tampão de citrato de sódio. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e Tween 80. A emulsão pode incluir solução salina tamponada com fosfato. Também pode incluir Span 85 (por exemplo, a 1%) e/ou lecitina. Estas emulsões podem ter desde 2 a 10% esqualeno, desde 2 a 10% tocoferol e desde 0,3 a 3% Tween 80, e a razão em peso de esqualeno:tocoferol é preferencialmente ^1 já que esta providencia uma emulsão mais estável. Esqualeno e Tween 80 podem estar presentes a uma razão em volume de cerca de 5:2. Uma tal emulsão pode ser feita dissolvendo Tween 80 em PBS para proporcionar uma solução a 2%, misturando depois 90 ml desta solução com uma mistura de (5 g de DL-a-tocoferol e 5 ml esqualeno), depois microfluidizando a mistura. A emulsão resultante pode ter gotículas de óleo sub-micrónicas, por exemplo, com um diâmetro médio de entre 100 e 250 nm, preferencialmente cerca de 180 nm. • Uma emulsão de esqualeno, um tocoferol, e um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100). A emulsão pode também incluir um 3d-MPL. A emulsão pode conter um tampão fosfato. 22 • Uma emulsão compreendendo um polissorbato (por exemplo, polissorbato 80), um detergente Triton (por exemplo, Triton X-100) e um tocoferol (por exemplo, um a-tocoferol succinato). A emulsão pode incluir estes três componentes a uma razão de massa de cerca de 75:11:10 (por exemplo, 750 yg/ml polissorbate 80, 110 yg/ml Triton X-100 e 100 yg/ml α-tocoferol succinato), e estas concentrações devem incluir qualquer contribuição destes componentes de antigenos. A emulsão também pode incluir esqualeno. A emulsão também pode incluir um 3d-MPL. A fase aquosa pode conter um tampão fosfato. • Uma emulsão de esqualano, polissorbato 80 e poloxâmero 401 ("Pluronic™ L121") . A emulsão pode ser formulada numa solução salina tamponada com fosfato, com pH 7,4. Esta emulsão é um veiculo de entrega útil para dipéptidos muramilo, e tem sido usada com treonil-MDP no adjuvante "SAF-1" [103] (0,05-1% Thr-MDP, 5% esqualano, 2,5% Pluronic L121 e 0,2% polissorbato 80). Também pode ser usada sem Thr-MDP, como no adjuvante "AF" [104] (5% esqualano, 1,25% Pluronic L121 e 0,2% polissorbato 80). A microfluidização é preferida. • Uma emulsão compreendendo esqualeno, um solvente aquoso, um tensoativo não iónico hidrofilico de éter de polioxietileno alquilo (por exemplo, éter de polioxietileno (12) cetostearilo) e um tensoativo hidrofóbico não iónico (por exemplo, um éster de sorbitan ou éster manido, tal como monoleato de sorbitan ou "Span 80") . A emulsão é preferencialmente termorreversivel e/ou tem, pelo menos, 90% das goticulas de óleo (por volume) com um tamanho inferior a 200 nm [105] . A emulsão também pode incluir um ou mais de: alditol; um agente crioprotetor (por exemplo, um açúcar, tal como dodecilmaltosida e/ou sacarose); e/ou um alquilpoliglicosideo. Tais emulsões podem ser liofilizadas. • Uma emulsão contendo entre 0,5-50% de um óleo, 0,1-10% de 23 um fosfolípido, e 0,05-5% de um tensoativo não iónico. Como descrito na referência 106, componentes preferidos de fosfolípido são fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina e cardiolipina. Tamanhos sub-micrónicos de gotículas são vantajosos. • Uma emulsão óleo-em-água sub-micrónica de um óleo não metabolizável (tal como óleo mineral leve) e pelo menos, um tensoativo (tal como lecitina, Tween 80 ou Span 80). Também podem ser incluídos aditivos, tal como saponina QuilA, colesterol, um conjugado de saponinalipófilo (tal como GPI-0100, descrito na referência 107, produzido pela adição de amina alifática a desacilsaponina através do grupo carboxilo do ácido glucurónico), brometo de dimetiidioctadecilamonia e/ou N,N-dioctadecil-N,N-bis (2-hidroxietil)propanediamina. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool gordo etoxilado lipofílico não iónico, e um tensoativo hidrofílico não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero em bloco polioxietileno-polioxipropileno) [108]. • Uma emulsão compreendendo um óleo mineral, um álcool gordo etoxilado hidrofílico não iónico, e um tensoativo lipofílico não iónico (por exemplo, um álcool gordo etoxilado e/ou copolímero em bloco polioxietileno-polioxipropileno) [108]. • Uma emulsão na qual uma saponina (por exemplo, QuilA ou QS21) e um esterol (por exemplo, um colesterol) estão associados como micelos helicoidais [109].

Emulsões óleo-em-água podem ser usadas como adjuvantes elas próprias, ou como veículos para compostos imunoestimulatórios adicionais por exemplo, oligonucleotídeos imunoestimulatórios, 3d-MPL, etc. 3dMPL (também conhecido como 3 lípido A monofosforilo de-O-acilado ou lípido A 3-0-desacil-4'-monofosforilo) é um 24 adjuvante no qual a posição 3 do terminal glucosamina redutor em lípido A monofosforilo foi de-acilado. 3dMPL foi preparado a partir de um mutante sem heptose de Salmonella minnesota, e é quimicamente semelhante ao lípido A mas falta-lhe um grupo fosforilo lábil em ácido e um grupo acilo lábil em base. A preparação de 3dMPL foi originalmente descrita na referência 110.

Reconstituição e acondicionamento

Componentes do antígeno liofilizado da invenção serão, basicamente, reconstituídos com um componente líquido para proporcionar material adequado para administração a um paciente. A reconstituição ocorrerá tipicamente no momento do uso. Assim, um antígeno e um adjuvante de emulsão óleo-em-água podem ser mantidos separadamente num kit de vacina acondicionado ou distribuído, pronto para formulação final no momento do uso.

Num kit contendo dois recipientes, um incluirá o líquido para reconstituição e o segundo recipiente incluirá o material liofilizado. O segundo recipiente será normalmente hermeticamente selado. O líquido será normalmente introduzido no segundo recipiente através de uma primeira agulha, reconstituindo assim o material liofilizado numa forma líquida. O líquido será depois retirado, normalmente para uma seringa, para administração a um paciente. Esta etapa de retirada pode ser através de uma primeira agulha, mas será frequentemente através de uma segunda agulha. A agulha usada para a retirada pode ser a mesma agulha que é depois usada para a injeção no paciente, ou pode ser diferente. O segundo recipiente será tipicamente um frasco. Uma emulsão óleo-em-água para reconstituir o material liofilizado pode também estar localizada num frasco, mas em alternativa, pode estar localizada numa seringa. Uma organização adicional tem o primeiro e segundo recipientes em câmaras separadas numa seringa com duas câmaras de 25 maneira que, quando atua, o material liquido é introduzido do primeiro recipiente num segundo recipiente. Os materiais misturados e reconstituídos podem então sair da seringa sob a forma liquida. Contudo, em todos os casos os materiais liofilizado e liquido são mantidos separados até estarem prontos para serem misturados. óleo-em-água será líquida, nalgumas usar um adjuvante A liofilização de é revelada, por

Apesar de que uma emulsão normalmente usada na sua forma modalidades da invenção é possível liofilizado de emulsão óleo-em-água. adjuvantes da emulsão desta maneira exemplo, nas referências 105 e 111. Estas emulsões deidratadas serão ainda reconstituídas na forma líquida no momento do uso, por exemplo, usando um veículo aquoso. O adjuvante liofilizado e componentes do antígeno liofilizado podem ser componentes separados do kit, mas nalgumas modalidades podem estar misturados (quer pré ou pós liofilização) na forma liofilizada. Assim, nalgumas modalidades, a invenção providencia a composição compreendendo uma mistura de uma emulsão óleo-em-água liofilizada e uma composição antigénica liofilizada compreendendo um imunogénio para despoletar uma resposta imune contra o serogrupo B de Neisseria meningitidis. Esta composição liofilizada misturada pode ser misturada com um veículo aquoso para proporcionar numa etapa de reconstituição uma composição Men-B com um adjuvante de emulsão óleo-em-água.

Assim, um kit pode compreender, por exemplo, dois frascos, uma seringa previamente preenchida e um frasco, etc. Uma seringa incluirá geralmente uma dose única da composição, enquanto um frasco pode incluir uma dose única ou doses múltiplas. Para formas com doses múltiplas, portanto, os frascos são preferidos a seringas previamente preenchidas. Líquidos e/ou materiais liofilizados adicionais também 26 podem ser adicionados antes da administração a um paciente.

Um recipiente para um componente liofilizado pode ter uma tampa (por exemplo, um Luer lock) adaptado de maneira que uma seringa previamente preenchida pode ser insertada na tampa, os conteúdos da seringa podem ser expelidos para o frasco para reconstituir o material liofilizado contido, e os conteúdos do frasco podem ser de novo removidos para a seringa. Após a remoção da seringa do frasco, a agulha pode então ser anexada e a vacina pode ser administrada a um paciente. A tampa pode estar localizada dentro de um selo ou cobertura, de maneira que o selo ou cobertura tem de ser removido antes do acesso à tampa.

Onde um componente é acondicionado num frasco, este é preferencialmente feito de um vidro ou material plástico. 0 frasco é preferencialmente esterilizado antes do material lhe ser adicionado. Para evitar problemas com pacientes sensíveis ao latex, os frascos podem ser selados com uma tampa livre de latex. 0 frasco pode incluir uma única dose da vacina, ou pode incluir mais do que uma dose (um frasco "multidose") por exemplo, 10 doses. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.

Onde a vacina é acondicionada numa seringa, a seringa pode ter uma agulha anexada a ela, ou pode não ter agulha. Uma agulha separada pode ser fornecida com a seringa para união e uso. Agulhas de segurança são preferidas. Agulhas de calibre 23 de 2,54 cm, de calibre 25 de 2,54 cm e de calibre 25 de 12,7/20,3 cm são típicas. As seringas podem ser providenciadas com rótulos despegáveis nos quais o número do lote e a data de validade dos contéudos pode ser impressa, paa facilitar a manutenção dos registos. O êmbolo na seringa preferencialmente tem um travão que previne o êmbolo de ser acidentalmente removido durante a aspiração.

Onde um recipiente de vidro (por exemplo, uma seringa ou um frasco) é usado, então é preferido usar um recipiente feito de vidro borossilicato em vez de vidro de soda-cal. 27

As vacinas são normalmente administradas a pacientes em doses de 0,5 ml, o volume do liquido no primeiro recipiente será adequado para proporcionar um volume de dosagem após a reconstituição de, pelo menos, 0,5 ml por exemplo, 0,6 ml, contando com volume de desperdício.

Por razões de estabilidade, o componente liofilizado da invenção pode incluir um estabilizador tal como lactose, sacarose e/ou manitol, bem como misturas dos mesmos, por exemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas de sacarose/manitol, etc. Usar a mistura de sacarose /manitol pode acelerar o processo de secagem. Um componente liofilizado também pode incluir cloreto de sódio. Componentes solúveis no material liofilizado serão retidos na composição após reconstituição, e só as vacinas líquidas finais podem, assim, conter lactose e/ou sacarose.

Uma composição pode incluir um agente protector de temperatura, como descrito na referência 112. Exemplos incluem glicerina, propilenoglicol, e/ou polietilenoglicol (PEG) . PEG' s adequados podem ter um peso molecular médio que oscila entre 200-20,000 Da. Numa modalidade preferida, o polietilenoglicol pode ter um peso molecular médio de cerca de 300 Da ("PEG-300").

Composições farmacêuticas

Materiais da invenção serão usados, basicamente, para preparar composições farmacêuticas para administração a um paciente. Estas incluirão tipicamente um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma discussão exaustiva sobre veículos farmaceuticamente aceitáveis está disponível na referência 113.

Volumes de dosagem eficazes podem ser estabelecidos de forma rotineira, mas uma dose humana típica da composição tem um volume de cerca de 0,5 ml, por exemplo, para injeção intramuscular. A vacina RIVM basada em OMV foi administrada num volume de 0,5 ml [114] por injeção intramuscular à coxa ou na parte superior do braço. MeNZB™ é administrado a 0,5 28 ml por injeção intramuscular à coxa anterolateral ou à região deltoide do braço. Doses semelhantes podem ser usadas para outras vias de entrega, por exemplo, uma vacina intranasal baseada em OMV pois a atomização pode ter um volume de cerca de 100 μΐ ou cerca de 130 μΐ por vaporização, com quatro vaporizações administradas para proporcionar uma dose total de cerca de 0,5 ml. O pH de uma composição após reconstituição é preferencialmente entre 6 e 8, e mais preferencialmente entre 6,5 e 7,5 (por exemplo, cerca de 7). O pH da vacina RIVM baseada em OMV é 7,4 [115], e um pH <7,5 é preferido para composições. A vacina RIVM baseada em OMV mantém o pH usando um tampão 10 mM Tris/HCl, e pode ser mantido um pH estável em composições pelo uso de um tampão, por exemplo, um tampão Tris, um tampão citrato, um tampão fosfato, ou um tampão histidina. Assim, as composições incluirão geralmente um tampão. Os componentes do tampão estarão localizados no componente liquido e/ou no componente liofilizado, conforme apropriado, para proporcionar a organização pós-reconstituição final como desejada. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirogénios. Composições podem ser isotónicas com respeito aos humanos.

Composições para administração a pacientes são imunogénicas, e são mais preferencialmente composições de vacina. As vacinas, de acordo com a invenção, podem ser tanto profiláticas (isto é, para prevenir a infeção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a infeção), mas serão tipicamente profiláticas. Composições imunogénicas usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz de antígeno(s), bem como quaisquer outros componentes, conforme necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz", entende-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, seja em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz para tratamento ou 29 prevenção. Esta quantidade varia dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, da idade, do grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (por exemplo, primata não humano, primata, etc.), da capacidade do sistema imune do indivíduo para sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da formulação da vacina, da avaliação da situação médica feita pelo do médico que a está a tratar, e outros fatores relevantes. É esperado que a quantidade caia num espectro relativamente amplo que possa ser determinado através de ensaios rotineiros. 0 conteúdo em antígeno das composições será geralmente expresso em termos da quantidade de proteína por dose. Uma dose de cerca de 0,9 mg de proteína por ml é típica para vacinas intranasais baseadas em OMV.

Os meningococos afetam várias áreas do corpo e por isso as composições podem ser preparadas em várias formas líquidas. Por exemplo, as composições podem ser preparadas como injetáveis, quer como soluções ou suspensões. A composição pode ser preparada para administração pulmonar, por exemplo, por um inalador, usando uma vaporização suficiente. A composição pode ser preparada para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como um vaporizador ou gotas. Os injetáveis para administração intramuscular são típicos.

Composições podem incluir um antimicrobiano, particularmente quando acondicionadas no formato de doses múltiplas. Antimicrobianos tais como tiomersal e 2-fenoxietanol são vulgarmente encontrados em vacinas, mas é preferido usar quer um conservante livre de mercúrio ou não usar um conservante de todo.

Um componente liofilizado da invenção e/ou um adjuvante de emulsão óleo-em-água co-acondicionado podem ser substancialmente livres de sais de alumínio. Esta organização permite que uma composição reconstituída da invenção possa ser substancialmente livre de sais de 30 alumínio .

Composições podem compreender detergente, por exemplo, um Tween (polissorbato), tal como Tween 80. Detergentes estão geralmente presentes em níveis baixos, por exemplo, <0,01%.

Composições podem incluir detergente residual (por exemplo, deoxicolato) da preparação do OMV. A quantidade de detergente residual é preferencialmente inferior a 0,4 pg (mais preferencialmente inferior a 0,2 pg) para cada pg de proteína Men-B.

Composições podem incluir LOS dos meningococos. A quantidade de LOS é preferencialmente inferior a 0,12 pg (mais preferencialmente inferior a 0,05 pg) para cada pg de proteína.

Composições podem incluir sais de sódio (por exemplo, cloreto de sódio) para proporcionar tonicidade. Uma concentração de 10±2 mg/ml NaCl é típica, por exemplo, cerca de 9 mg/ml. Métodos de tratamento A invenção pode ser usada num método para despoletar uma resposta imune num mamífero, compreendendo administrar uma composição farmacêutica líquida da invenção ao mamífero. A resposta imune é preferencialmente protetora e preferencialmente envolve anticorpos. O método pode despoletar uma resposta de reforço num paciente que foi previamente imunizado contra N. meningitidis. Regimes primários/de reforço subcutâneos e intranasais para OMV' s são revelados na referência 116. O mamífero é preferencialmente um humano. Onde a vacina é para uso profilático, o humano é preferencialmente uma criança (por exemplo, uma criancinha ou criança que já gatinha) ou um adolescente; Onde a vacina é para uso terapêutico, o humano é preferencialmente um adulto. Uma vacina intencionada para crianças também pode ser administrada a adultos, por exemplo, para avaliar a 31 segurança, dosagem, imunogenicidade, etc.

Estes usos e métodos são preferencialmente para prevenção e/ou tratamento de uma doença causada por N. meningitides, por exemplo, meningite bacteriana (ou, mais especificamente, meningocócica), ou septicémia.

Uma maneira de verificar a eficácia do tratamento terapêutico envolve monitorizar a infeção por Neisseria após administração da composição. Uma maneira de verificar a eficácia do tratamento profilático envolve monitorizar as respostas imunes contra os antigenos após administração da composição. A imunogenicidade das composições pode ser determinada administrando-as para testar sujeitos (por exemplo, crianças entre 12-16 meses de idade, ou modelos animais [117]) e depois determinar parâmetros padrão incluindo anticorpos bactericidas do soro (SBA) e títulos de ELISA (GMT). Estas respostas imunes serão geralmente determinadas por volta das 4 semanas após administração da composição, e comparadas com valores determinados antes da administração da composição. Um aumento da SBA de, pelo menos, 4 vezes ou 8 vezes é preferido. Onde mais do que uma dose da composição é administrada, pode ser realizada mais do que uma determinação pós-administração.

Em geral, as composições são capazes de induzir respostas de anticorpo bactericida no soro após serem administradas a um sujeito. Estas respostas são convenientemente medidas em ratinhos e são um indicador padrão da eficácia da vacina. A atividade bactericida no soro (SBA) mede a morte bacteriana mediada pelo complemento, e pode ser testada usando complemento humano ou de cria de coelho. Os padrões da OMS (Organização Mundial da Saúde) requerem que uma vacina induza, pelo menos, um aumento de 4 vezes na SBA em mais de 90% dos recetores. MeNZB™ provoca um aumento de 4 vezes na SBA 4-6 semanas após a administração da terceira dose.

Composições preferidas podem conferir um título de 32 anticorpo num paciente sujeito humano que é superior ao critério para seroproteção para uma percentagem aceitável de sujeitos. Os antigenos com um título de anticorpo associado acima do qual um hospedeiro é considerado seroconvertido contra o antígeno são bem conhecidos, e tais títulos são publicados por organizações tais como a OMS. Preferencialmente mais de 80% de uma amostra de sujeitos estatisticamente significativa é seroconvertida, mais preferencialmente mais de 90%, ainda mais preferencialmente mais de 93% e mais preferencialmente 96-100%.

As composições serão geralmente administradas diretamente a um paciente. A entrega direta pode ser conseguida por injeção parenteral (por exemplo, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, ou ao espaço intersticial de um tecido), ou por outra qualquer via adequada. A invenção pode ser usada para despoletar imunidade sistémica e/ou mucosal. A administração intramuscular na coxa ou na parte superior do braço é preferida. A injeção pode ser dada através de uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas a injeção sem agulha pode, em alternativa, ser usada. Uma dose intramuscular típica é 0,5 ml. A dosagem de tratamento pode ser um regime de dose única ou um regime de doses múltiplas. As doses múltiplas podem ser usadas num regime de imunização primária e/ou num regime de imunização de reforço. Um regime de dose primário pode ser seguido de um regime de dose de reforço. Intervalos de tempo adequados entre doses primárias (por exemplo, entre 4-16 semanas), e entre doses primárias e de reforço, podem ser determinados de forma rotineira. A vacina RIVM baseada em OMV foi testada usando um regime primário de 3 ou 4 doses, com vacinação aos 0, 2 e 8 ou 0, 1, 2 e 8 meses. MeNZB™ é administrado como três doses em intervalos de seis semanas.

As composições podem ser usadas para induzir respostas 33 de anticorpo bactericidas contra mais do que uma linhagem hipervirulenta de meningococos. Em particular, podem preferencialmente induzir respostas bactericidas contra duas ou três das seguintes três linhagens hipervirulentas: (i) grupo A4; (ii) complexo ET5; e (iii) linhagem 3. Podem, além disso, induzir respostas de anticorpo bactericidas contra uma ou mais das linhagens hipervirulentas do subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 ou complexo ET-37, e contra outras linhagens, por exemplo, linhagens hiperinvasivas. Isto não significa necessariamente que a composição pode induzir anticorpos bactericidas contra cada e toda estirpe de meningococos dentro destas linhagens hipervirulentas, por exemplo, em vez disso, para um qualquer grupo determinado de quatro ou mais estirpes de meningococos dentro de uma linhagem hipervirulenta particular, os anticorpos induzidos pela composição são bactericidas contra, pelo menos, 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais) do grupo. Grupos preferidos de estirpes incluirão estirpes isoladas em, pelo menos, quatro dos seguintes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR, e CU. O soro tem, preferencialmente, um título bactericida de, pelo menos, 1024 (por exemplo, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 ou superior, preferencialmente pelo menos, 214) por exemplo, o soro é capaz de matar, pelo menos, 50% das bactérias teste de uma estirpe particular quando diluído 1/1024 .

Composições úteis podem induzir respostas bactericidas contra as seguintes estirpes do serogrupo B meningocócico: (i) do grupo A4, estirpe 961-5945 (B:2b:PI.21.16) e/ou estirpe G2136 (B:-); (ii) do complexo ET-5, estirpe MC58 (B:15:PI.7,16b) e/ou estirpe 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) da linhagem 3, estirpe 394/98 (B:4:P1.4) e/ou estirpe BZ198 (B:NT:-). As composições mais preferidas podem induzir respostas bactericida contra as estirpes 961-5945, 44/76 e 394/98. 34

As estirpes 961-5945 e G2136 são ambas estirpes de referência de Neisseria MLST [ID 638 e 1002 na referência 118]. A estirpe MC58 está amplamente disponível (por exemplo, ATCC BAA-335) e foi a estirpe sequenciada na referência 119. A estirpe 44/76 tem sido amplamente usada e caracterizada (por exemplo, referência 120) e é uma das estirpes de referência de Neisseria MLST [ID 237 na referência 118; linha 32 do Quadro 2 na referência 19] . A estirpe 394/98 foi isolada originalmente na Nova Zelândia em 1998, e têm-se publicado vários estudos usando esta estirpe (por exemplo, referências 121 e 122) . A estirpe BZ198 é outra estirpe de referência de MLST (ID 409 na referência 118; linha 41 no Quadro 2 na referência 19). Componentes antigénicos adicionais

Da mesma maneira que contêm antígenos de N. meningitidis, as composições podem incluir antígenos de patógenos adicionais. Por exemplo, a composição pode compreender um ou mais dos seguintes antígenos adicionais: - um antígeno de Streptococcus pneumoniae, tal como um sacarídeo (tipicamente conjugado) - um antígeno do vírus da hepatite B, tal como o antígeno de superfície HBsAg. - um antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina pertussis (PT) e hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente também em combinação com pertactina e/ou aglutinogénios 2 e 3. - um antígeno diftérico, tal como um toxóide diftérico. - um antígeno tetânico, tal como um toxóide tetânico.

- um antígeno de sacarídeo de Haemophilus influenzae B (Hib), tipicamente conjugado. - antígenos do vírus da poliomielite desativados.

Estes antígenos adicionais podem ser incluídos sob a forma líquida no mesmo recipiente que a emulsão óleo-em-água, sob a forma liofilizada no mesmo recipiente que o antígeno Men-B liofilizado, ou num terceiro recipiente 35 (seja na forma liofilizada ou, normalmente, na forma líquida).

Onde um antígeno diftérico é incluído na composição é também preferido incluir antígeno tetânico e antígenos de pertussis. 0 mesmo modo, onde um antígeno tetânico é incluído é também preferido que se incluam antígenos diftérico e de pertussis. Do mesmo modo, onde um antígeno de pertussis é incluído é também preferido que se incluam antígenos tetânico e diftérico. Combinações de DTP são, assim, preferidas.

Se um sacarídeo Hib é incluído (tipicamente como um conjugado), o grupo sacarídeo pode ser um polissacarídeo (por exemplo, fosfato de polirribosilribitol (PRP) inteiro como purificado das bactérias), mas é também possível fragmentar o sacarídeo purificado para fazer oligossacarídeos (por exemplo, MW desde ~1 a ~5 kDa) por exemplo, por hidrólise. A concentração do conjugado Hib numa vacina reconstituída estará normalmente no intervalo entre 0,5 pg e 50 pg, por exemplo, entre 1-20 pg, entre 10-15 pg, entre 12-16 pg, etc. A quantidade pode ser cerca de 15 g, ou cerca de 12,5 pg nalgumas modalidades. Uma massa inferior a 5 pg pode ser adequada [123] por exemplo, no intervalo 1-5 pg, 2-4 pg, ou cerca de 2,5 pg. Como descrito previamente, em combinações que incluem sacarídeo Hib e sacarídeos meningocócicos, a dose do primeiro pode ser selecionada com base na dose do último (em particular, com múltiplos serogrupos meningocócicos, a sua massa média). Características adicionais dos conjugados Hib são como reveladas previamente para os conjugados meningocócicos, incluindo a escolha de uma proteína transportadora (por exemplo, CRM197 ou toxóide tetânico), ligações, razões, etc.

Se um antígeno de S. pneumoniae é incluído, este pode ser um polipeptídeo ou um sacarídeo. Sacarídeos capsulares conjugados são particularmente úteis para imunizar contra 36 pneumococos. 0 sacarídeo pode ser um polissacarídeo com o tamanho alcançado durante a purificação do sacarídeo das bactérias, ou pode ser um oligossacarídeo conseguido por fragmentação de tal polissacarídeo. No produto PREVNAR™ heptavalente, por exemplo, seis dos sacarídeos são apresentados como polissacarídeos intactos enquanto um (o serotipo 18C) é apresentado como um oligossacarídeo. Uma composição pode incluir um sacarídeo capsular de um ou mais dos seguintes serotipos pneumocócicos: 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e/ou 33F. Uma composição pode incluir múltiplos serotipos, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais serotipos. Combinações de conjugados heptavalentes, nonavalentes, decavalentes, 11-valentes e 13-valentes são já conhecidas na arte, tal como o é uma combinação não conjugada 23-valente. Por exemplo, uma combinação decavalente pode incluir sacarídeo de serotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Uma combinação 11-valente pode, ainda, incluir sacarídeo de serotipo 3. Uma combinação 12-valente pode adicionar à mistura decavalente: serotipos 6A e 19A; 6A e 22F; 19A e 22F; 6A e 15B; 19A e 15B; r 22F e 15B; Uma combinação 13-valente pode adicionar à mistura 11-valente: serotipos 19A e 22F; 8 e 12F; 8 e 15B; 8 e 19A; 8 e 22F; 12F e 15B; 12F e 19A; 12F e 22F; 15B e 19A; 15B e 22F. etc. Características adicionais de conjugados pneumocócicos são como revelado anteriormente para os conjugados meningocócicos, incluindo a escolha da proteína transportadora (por exemplo, CRM197 ou toxóide tetânico), ligações, razões, etc. Onde uma composição inclui mais de um conjugado, cada conjugado pode usar a mesma proteína transportadora ou uma proteína transportadora diferente. A referência 124 descreve vantagens potenciais quando se usam proteínas transportadoras diferentes em vacinas conjugadas 37 pneumocócicas multivalentes.

Geral 0 termo "compreendendo" abrange "incluindo" bem como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y. 0 termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, xlO%. A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra dois traços analíticos sobrepostos para uma composição da invenção. As linhas são uma composição pré-liofilização e pós-reconstituição. Em essência, apenas uma linha é visível porque ambas são intimamente semelhantes. A Figura 2 mostra dois traços analíticos sobrepostos para uma composição armazenada a 4°C e uma composição armazenada a 37°C. Ao contrário da Figura 1, as duas linhas são visíveis. A Figura 3 mostra uma análise SDS-PAGE das várias formulações. As 10 pistas, da esquerda para a direita, mostram: (1) marcador MW; (2)-(4) antígenos líquidos a 100 yg/ml, 50 yg/ml e 25 yg/ml; (5) antígenos em mistura de 2% manitol e 3% sacarose, antes da liofilização; (6) como pista (5) , mas após liofilização e reconstituição com wfi; (7) como pista (5), mas após liofilização e reconstituição com MF59; (8) para (10) como pistas (5) a (7), mas em 5% sacarose.

MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO Inclusão de adjuvante em vacina Men-B 38 A avaliação pré-clínica inicial da vacina Novartis Men-B indicou que uma resposta imune ótima requeria a presença de um adjuvante de hidróxido de alumínio. Mesmo na presença deste adjuvante, contudo, a cobertura da estirpe era incompleta. Por exemplo, enquanto 100% das estirpes ST32 e ST8 testadas foram mortas por soros obtidas da vacina, este número desceu para os 65% para estirpes ST11. Em contraste, o uso da emulsão MF59 como adjuvante providenciou 100% de cobertura para todas as estirpes ST32, ST8 e ST11. Experiências adicionais confirmaram a superioridade da MF59. A mesma superioridade foi observada quando sacarídeos capsulares conjugados dos serogrupos A, C, W135 e Y foram adicionados à vacina Men-B. A imunogenicidade conseguida por esta vacina A-B-C-W-Y foi superior usando MF59 do que quando usando hidróxido de alumínio, tanto em termos de títulos bactericidas como de cobertura de estirpe.

Assim, a MF59 providencia uma eficácia imunogénica aumentada quando comparada com o adjuvante de hidróxido de alumínio. Quando a estabilidade disto foi testada, contudo, verificou-se que os antígenos Men-B começavam a degradar-se após aproximadamente 12 semanas mesmo quando armazenados a 4°C. Quando armazenados a temperaturas superiores então a degradação era evidente tão somente após as primeiras 2 semanas, com degradação completa após os 6 meses. A análise usando o Agilent 3100 Bioanalyzer ou cromatografia de exclusão por tamanho confirmaram a degradação. Em contraste, os antígenos permaneceram estáveis quando adsorvidos ao hidróxido de alumínio.

Uma estabilidade reduzida foi também observada para sacarídeos capsulares conjugados de serogrupos não B na MF59. O nível de ácido siálico livre (um componente nos sacarídeos capsulares de Men-C, Men-W135 e Men-Y) aumentou gradualmente numa formulação com adjuvante de MF59 armazenada a 4°C, atingindo cerca de 15% após 6 meses. A 39 temperaturas mais elevadas, contudo, o nível livre atingiu 50% após cerca de 10 semanas e 100% (isto é, a degradação total) em 6 meses.

Assim, a imunogenicidade aumentada atingida por MF59 faz-se à custa da estibilidade do armazenamento. Foram desenvolvidos trabalhos para verificar se uma formulação estável poderia ser conseguida usando MF59 e/ou sem requerer a adsorção a um adjuvante de hidróxido de alumínio.

Liofilização Men-B

Numa tentativa de atingir o objetivo da estabilidade, os antígenos Men-B foram liofilizados. Após reconstituição, foi confirmado que a sua eficácia foi retida. Além disso, a estabilidade foi observada para misturas de antígenos Men-B com sacarídeos capsulares conjugados de cada dos serogrupos A, C, W135 e Y.

Por exemplo, a Figura 1 mostra dois traços analíticos sobrepostos, com os picos correspondendo às posições de eluição das proteínas Men-B. Os traços são quase idênticos, não revelando alterações fisico-químicas substanciais. Em contraste, a Figura 2 mostra dois traços sobrepostos da mesma composição armazenada quer a 4°C ou 37 °C, e as alterações são facilmente visíveis. Outras técnicas analíticas confirmaram a ausência de quaisquer alterações detetáveis pré e pós liofilização. A integridade dos antígenos Men-B individuais foi, aparentemente, conservada mesmo após 6 meses de armazenamento pós liofilização a 4°C.

As composições foram liofilizadas na presença de 4,5% manitol e 1,5% sacarose.

Assim, a estabilidade a longo prazo dos antígenos meningocócicos pode ser atingida sem necessidade da adsorção a um sal de alumínio. Assim, a liofilização permite o uso dos antígenos em combinação com uma emulsão óleo-em-água, providenciando desse modo a eficácia e cobertura de estirpe aumentada que foram demonstradas para 40 estes adjuvantes enquanto evita os problemas associados de estabilidade.

Formulações adicionais

Em trabalho desenvolvido adicionalmente para uma apresentação liofilizada da vacina Men-B, foram preparadas duas formulações da vacina da proteína recombinante. Ambas usaram sacarose como estabilizador da liofilização, mas uma incluiu adicionalmente manitol. A osmolaridade é 300 mOsmU e pH é 7,0. Cada frasco inclui material suficiente para uma dose humana com um excesso de 40% (70 pg de cada proteína recombinante, 15 mg PBS, e quer 14 mg manitol ou 21 mg manitol + 35 mg sacarose), e será reconstituído com 700 μΐ de água da MF59 (ou, para comparação, com wfi).

Os níveis de humidade foram medidos imediatamente após a liofilização e depois durante um mês a temperaturas baixas ou elevadas. O conteúdo húmido permaneceu constante a cerca de 1,1%.

Uma comparação dos traços RP-HPLC antes da liofilização e após reconstituição mostraram que as proteínas em ambas formulações permanecem estáveis após a liofilização mesmo durante 1 mês a 37°C. SDS-PAGE (Figura 3) e western blots também mostraram que as três proteínas eram estáveis após o processo de liofilização, sem qualquer evidência de degradação ou agregação após reconstituição quer com MF59 ou wfi tanto a 4°C como a 37°C. A análise Experion deu o mesmo resultado. A cromatografia de exclusão por tamanho mostrou que a liofilização causou um pequeno aumento na agregação, mas a quantidade do agregado não aumentou depois disso, mesmo após 3 meses a 37°C ou 6 meses a 4 0 C .

Estudos de imunogenicidade

Foram usados ratinhos num estudo de imunogenicidade para avaliar o efeito da liofilização na potência da vacina. Formulações liofilizadas foram reconstituídas com MF59 e os títulos foram comparados contra os mesmos 41 antígenos na forma líquida e misturados extemporâneamente com MF 5 9 (como numa abordagem "dois frascos") . As formulações induziram títulos semelhantes.

Para estudar a estabilidade a um prazo mais longo foram armazenadas duas preparações de antígeno liofilizado (uma liofilizada com sacarose, a outra com sacarose +manitol) a 4°C e as suas imunogenicidades foram testadas após 3 e 6 meses de armazenamento. Os antígenos armazenados foram reconstituídos com MF59 (também armazenada a 4°C com os antígenos) e usada rapidamente para imunização. Para comparação, antígenos aquosos e MF59 preparados de fresco foram também misturados e testados em paralelo.

Os resultados do ELISA de dois estudos realizados em separado indicaram que as formulações liofilizadas, quando reconstituídas com MF59, induziram títulos de anticorpo semelhantes (GMT) aos induzidos pela formulação preparada de fresco. 0 mesmo foi observado quando as respostas de anticorpo foram avaliadas por SBA, por exemplo, um título da SBA de 32768 foi observado no tempo zero com sacarose -antígeno liofilizado e foi observado ainda após 6 meses de armazenamento. Assim, os antígenos Men-B permanecem ativos após liofilização e armazenamento.

Em estudos adicionais as preparações liofilizadas foram armazenadas quer a 4°C ou 37 °C e a imunogenicidade foi depois avaliada. Mesmo depois de 1 mês de armazenamento a 37°C os antígenos liofilizados não mostraram perda da atividade da SBA.

Estabilidade do tamanho da emulsão misturada com antígenos Men-B liofilizados 0 tamanho das gotículas de óleo de uma emulsão MF59 foi medido durante um período de 24 horas a 4°C e 25°C, quer como emulsão isolada, ou misturada com antígenos Men-B liofilizados, ou misturada com um antígeno controlo. Os tamanhos das gotículas (nm) foram como se segue: 42

Temperatura (°C) : 25 4 Tempo (horas): 0 3 5 24 0 24 MF59 isolada 171 169 172 168 172 170 MF59 + Ag controlo 173 170 167 172 169 172 MF59 + Men-B lio 169 168 176 170 173 171

Assim, o tamanho da partícula da emulsão na presença dos antlgenos Men-B liofilizado é estável durante 24 horas a 4°C ou 25°C e é essencialmente o mesmo que o da emulsão isolada.

Será entendido que a invenção foi descrita a título de exemplo apenas e podem ser feitas modificações.

REFERÊNCIAS

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> NOVARTIS AG

<120> FORMULAÇÕES DE VACINA MENINGOCÓCICA

<130> P051966WO <140> PCT/IB2008/_ <141> 2008-10-17 <150> US-60/999,590 <151> 2007-10-19 <160> 7 <170> SeqWin99, versão 1.02

<210> 1 <211> 248 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4 0 0> 1 48

Vai Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly 1 5 Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu 20 Vai Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys 35 MO Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu 50 55 Lys Vai Ser Arg Phe Asp Phe Ile L5 70 Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu ã5 Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gin Thr 100 Ser Gly Lys net Vai Ala Lys Arg 115 120 Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys 130 135 Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser ms 150 Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys 1L5 Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Vai IfiO Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Vai Π5 200 Gin Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser 210 215 Gin Glu Vai Ala Gly Ser Ala Glu 225 230 His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gin 2M5

Leu Ala 10 Asp Ala Leu Thr Ala 15 Pro Gin 25 Ser Leu Thr Leu Asp 30 Gin Ser Leu Ala Ala Gin Gly M5 Ala Glu Lys Asn Thr Gly Lys LO Leu Lys Asn Asp Arg Gin Ile 75 Glu Vai Asp Gly Gin 30 Phe Gin 10 Vai Tyr Lys Gin Ser 'IS His Glu 105 Gin Ile Gin Asp Ser 110 Glu His Gin Phe Arg Ile Gly 125 Asp Ile Ala Leu Pro Glu Gly mo Gly Arg Ala Thr Asp Asp Ala 155 Gly Gly Lys Leu Thr 1L0 Gin Gly 170 Asn Gly Lys Ile Glu 175 His Asp 135 Leu Ala Ala Ala Asp Π0 Ile Lys Ile Ser Gly Ser Vai 205 Leu Tyr Asn Leu Gly Ile Phe 220 Gly Gly Lys Ala Vai Lys Thr 235 Vai Asn Gly Ile Arg 2M0

<210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis 49 <400> 2

Vai 1 Ala Ala Asp Ile 5 Gly Ala Gly Leu Ala 10 Asp Ala Leu Thr Ala 15 Pro |_eu Asp His Lys ED Asp Lys Ser Leu Gin S5 Ser Leu Thr Leu Asp 30 Gin Ser Vai Arg Lys 35 Asn Glu Lys Leu Lys 40 Leu Ala Ala Gin Gly 45 Ala Glu Lys Th r Tyr 50 Gly Asn Gly Asp Ser 55 Leu Asn Thr Gly Lys bO Leu Lys Asn Asp 1 KJ S Vai Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gin Ile Glu Vai Asp Gly Gin uy 3 bS 70 75 50 Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gin Ile Tyr Lys Gin Asp His 55 10 T5 Ser Ala Vai Vai Ala Leu Gin Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys 100 105 110 Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gin Arg Ser Phe Leu Vai Ser Gly Leu Gly 115 ISO 1S5 Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gin Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr 130 135 140 His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr 145 150 155 lbO Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gin Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu lb5 170 175 Lys Thr Pro Glu Gin Asn Vai Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala iao 155 Π0 Asp Glu Lys Ser His Ala Vai Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Π5 EDO EQS Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gin E10 EIS ΞΞ0 Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Vai Lys Ile Gly Glu Lys Vai His Glu EES Ξ30 S3S Ξ40 Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gin

E4S

<210> 3 <211> 250 <212> PRT <213> Ne isseria meningitidis 50 <400> 3

Vai Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro 1 S 10 15 Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser 20 25 30 Ile Pro Gin Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gin Gly Ala Glu Lys 35 MO 45 Th r Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu £0 55 bO Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Vai Gin Lys Ile Glu Vai ys 70 75 50 As p Gly Gin Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gin Ile Tyr Lys 55 10 15 Gin Asn His Ser Ala Vai Vai Ala Leu Gin Ile Glu Lys Ile Asn Asn 100 105 110 Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gin Arg Ser Phe Leu Vai Ser 11S 130 125 Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gin Leu Pro Gly Gly Lys 130 135 mo Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg 145 150 155 IbO Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gin Gly Tyr Gly Arg Ile lb5 170 175 Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gin Asn Vai Glu Leu Ala Ala Ala Glu ιβα 155 110 Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Vai Ile Leu Gly Asp Thr Arg 115 200 205 Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp 510 215 220 Arg Ala Gin Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Vai Lys Ile Gly Glu Lys 225 230 235 240 Vai His GlU Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gin 245 250 <210> 4 <211> 644

<212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 4 51

Het Ala Ser Pro Âsp Vai Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala 15 10 15

Ala Pro Vai Vai Ser Glu Lys 61u Thr 61u Ala Lys Glu Asp Ala Pro 50 55 30

Gin Ala Gly Ser Gin Gly Gin Gly Ala Pro Ser Ala Gin Gly Gly Gin 35 MO MS

Asp flet Ala Ala Vai Ser Glu Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala 50 55 LO

Ala Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gin Asn Asp Het

L5 70 75 fiO

Pro Gin Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn Hís Thr Pro 35 10 15

Ala Ser Asn Het Pro Ala Gly Asn Plet Glu Asn Gin Ala Pro Asp Ala 100 105 110

Gly Glu Ser Glu Gin Pro Ala Asn Gin Pro Asp Het Ala Asn Thr Ala 115 150 155 52

Asp Gly M et Gin Gly Asp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Gly 13D 135 140 Asn Thr Ala Ala Gin Gly Thr Asn Gin Ala Glu Asn Asn Gin Thr Ala IMS ISO 155 IbO Gly Ser Gin Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn 175 Ser lbS 170 Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn Val Gly Asn Ser Val Val Ile Asp 160 165 140 Gly Pro Ser Gin Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser Cys 11S 200 205 Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gin Leu Lys Ser Glu Phe BID 215 220 Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly 255 230 235 24D Lys Asn Asp Gly Lys Asn Asp Lys Phe Vai Gly Leu Val Ala Asp Ser 245 250 255 Vai Gin Met Lys Gly Ile Asn Gin Tyr Ile Ile Phe Tyr Lys Pro Lys EbO 2b 5 270 Pró Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser 275 260 265 Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Val Asn Gin Ala Asp Thr Leu 240 245 300 Ile Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly Asn Ile 305 310 315 320 Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys 325 330 335 Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gin Gly Glu Pro ser Lys 340 345 350 Gly Glu riet Leu Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Gly Glu Val Leu His 355 3bO 3b5 Phe His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Ser Pro Ser Arg Gly Arg Phe Ala 370 375 360 Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly Ile Ile Asp ser 365 34D 345 400 Gly Asp Gly Leu His Met Gly Thr Gin Lys Phe Lys Ala Ala 11 e Asp 405 410 415 Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Gly Gly Asp Val 450 425 430 Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lys Tyr H3S 440 445 Ser Tyr Ar g Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val Phe Ala 450 455 4b0 Gly Lys Lys Glu Gin Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys m>5 470 475 460 Val Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile Asp His Phe Asn 465 440 445 53

Thr Ser Thr Asn Vai Gly Gly Phe 500 Phe Asp Gin Ala Lys Arg Asp Gly 515 520 Ala Asn Leu Gin Ser Gly Ser Gin 530 535 Ala Asp Ile Phe Asp Ala Ala Gin 545 550 Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys 5b5 Leu Thr Met His Gly Lys Thr Ala SflO Phe Asn Cys Tyr Gin Ser Pro Het 5^5 bOO Asp Phe Ser Thr Thr Ile Asp Arg blO blS Vai Asn Vai Gly Met Thr Lys Ser b25 b30 Ala Ala Lys Gin

Tyr 505 Gly Leu Thr Gly Ser 510 Vai Glu Lys Ile Asp Ile Thr 525 Ile Pro Vai His Phe Thr Asp 540 His Leu Lys Ser Tyr Pro Asp 555 Ile Arg Phe Vai Ser 5b0 Lys Leu 570 Vai Ser Vai Asp Gly 575 Asn Pro 5fl5 Vai Lys Leu Lys Ala 510 Glu Lys Ala Lys Thr Glu Vai bOS Cys Gly Gly Thr Lys Trp Gly b20 Vai Asp Tyr Leu Vai Arg Ile b3S Asp Ile Gin Ile Glu b40

<210> 5 <211> 434 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <4Ο0> 5 54 fie t 1 Vai Ser Ala Vai s 11 e Gly Ser Vai Asp Arg Arg 20 Thr Thr Gly Ala Leu Arg XI é 61 u Thr Thr Ala Arg 35 40 Thr Lys Gly Tyr Thr Pr o Gin Ile 50 55 Leu Leu Leu Leu Gly Gin Vai Ala hS 70 Gly Gin Ile Ala Arg Ser 61 u Gin fiS 11 e Thr Vai Ala Ser Leu Pro Arg 100 Thr Trp Asn Thr Ser Lys Vai Arg 115 120 Ala Thr Gin Ala Arg Vai Lys Ile 130 135 Vai tlet Gly lie Leu Thr Pro Glu 145 150 Vai Ser Thr Thr Vai Gly Vai Gin lb5 Tyr Vai Gin Arg Gly Ser G1 y Gly

Ala Ala 10 Vai Gly Ala Lys Ser 15 Ala Gin 25 Thr Asp Asp Asn Vai 30 Nefc Ala Ser Tyr Leu Arg Gin 45 Asn Asn Gin Ser Vai Vai Gly b0 Tyr Asn Arg His Thr Glu Gly 75 Glu Lys Gin Phe Vai SOI Ala Ala RO Glu Gly Vai Tyr Asn 45 Tyr Thr 105 Ala Gly Asp Ile Ala 110 Gly Asp Ala Thr Leu Leu Gly 125 Ile Ser Pro Vai Thr Tyr Gly 140 Asn vai Thr Tyr Glu Gin Ala 155 Gin Ile Thr Gin Lys IbO Lys Vai 170 Ile Thr Leu Tyr Gin 175 Asn Gly Gly Vai Ala Ala Asp Ile Gly 55 ISO IflS 150

Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 155 200 205 Gly Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Vai Arg Lys Asn Glu Lys 210 215 220 Leu Lys Leu Ala Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp 225 230 235 24D Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Vai Ser Arg Phe Asp 245 250 255 Phe Ile Arg Gin Ile Glu Vai Asp Gly Gin Leu Ile Thr Leu Glu Ser 2b0 2b5 270 Gly Glu Phe Gin Vai Tyr Lys Gin Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 275 2fl0 255 Gin Th r Glu Gin Ile Gin Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Het Vai Ala 250 255 300 Lys Arg Gin Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe 305 310 315 320 Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe 325 330 335 Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala 340 345 350 Ala Lys Gin Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu 355 3L0 3b5 Asn Vai Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His 370 375 3fi0 Ala Vai Ile Ser Gly Ser Vai Leu Tyr Asn Gin Ala Glu Lys Gly Ser 3Ô5 350 355 400 Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gin Glu Vai Ala Gly Ser 405 410 415 Ala Glu Vai Lys Thr Vai Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala 420 425 430

Lys Gin

10> 6 <211> 327 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 6 56

Ais 1 Thr Asn Asp Asp 5 Asp Vai Lys Lys Ala 10 Ala Thr Vai Ala Ile 15 Alá Ala Ala Tyr Asn 20 Asn Gly Gin Glu Ile 25 Asn Gly Phe Lys Ala 30 Gly Glu Thr He Tyr is Asp Ile Asp Glu Asp AO Gly Thr Ile Thr Lys m Lys Asp Ala Thr Ala 50 Ala Asp Vai Glu Ala 55 Asp Asp Phe Lys Gly LO Leu Gly Leu Lys Lys Vai Vai Thr Asn Leu Thr Lys Thr Vai Asn Glu Asn Lys Gin Asn hS 70 75 ÔO Vai Asp Ala Lys Vai ÔS Lys Ala Ala Glu ser 10 Glu Xle Glu Lys Leu 15 Thr Thr Lys Leu Ala 100 Asp Thr Asp Ala Ala 105 Leu Ala Asp Thr Asp 110 Ala Ala Leu Asp Ala 115 Thr Thr Asn Ala Leu 120 Asn Lys Leu Gly Glu 125 Asn Ile Thr Thr Phe 130 Ala Glu Glu Thr Lys 135 Thr Asn Ile Vai Lys mo íle Asp Glu Lys Leu MS Glu Ala Vai Ala Ásp 150 Thr Vai Asp Lys His m. Ala Glu Ala Phe Asn 1L0 Á5p Ile Ala Asp Ser 1LS Leu Asp Glu Thr Asn 170: Lys Ala Asp Glu 175 Ala Vai Lys Thr Ala ÍBÍ Asn Glu Ala Lys Gin IBS Thr Ala Glu Glu Thr Í1D Lys Gin Asn Vai Asp lis: Ale Lys Vai Lys Ala asd Ala Glu Tl#: Ala Ala 205 Gly Lys Ala Glu Ala 310 Ala Ala Gly Thr Ala SIS aso Thr Ala Asp 220 Lys Ala Glu Ala Vai 225 Ala Ala Lysí Vai Thr 230 Asp Ile L ys Ala Asp 235 Ile Ala Thr Asn Lys 240 Asp Ásn Ile Ala lys tm Lys Ala Asn Ser Ala 250 Asp Vai Tyr Thr Arg 255 GlU Glu Ser Asp Ser 2LQ Lys Phe Vai Arg Ile 215 Asp Gly Leu Asn Ala 270 Thr Thr Glu Lys Léu 275 Asp Thr Arg Leu Ala 2ÕO Ser Ala Glu Ly$ Ser 2ô5 Ile Ala Asp His Asp 210 Thr Ar 9 Leu Asn Gly 215 Leu Asp Lys Thr Vai 300 Ser Asp Leu Arg Lys 305 Phe Glu (Siri Thr Pr© Arg Tyr Gin Asn 325 Gly 310 Vai Leu Gly Ala Glu Gin Ala 315 Ala Leu Ser Gly Leu 320 57

<210> 7 <211> 434 <212> PRT <213> Neisseria meningitidis <400> 7

Met Vai Ser Ala Vai Ile Gly Ser 1 S

Vai Asp Arg Arg Thr Thr Gly Ala 20

Leu Arg Ile Glu Thr Thr Ala Arg 35 40

Thr Lys Gly Tyr Thr Pro Gin Ile 50 £5

Leu Leu Leu Leu Gly Gin Vai Ala

Ala Ala Vai Gly Ala Lys Ser Ala 10 15

Gin Thr Asp Asp Asn Vai llet Ala 25 30

Ser Tyr Leu Arg Gin Asn Asn Gin 45

Ser Vai Vai Gly Tyr Asp Arg His LO

Thr Glu Gly Glu Lys Gin Phe Vai 58 b5 70 75 80

Gly Gin Ile Ala Arg Ser Glu Gin Ala Ala Glu Gly Val Tyr Asn Tyr 85 50 55 Ile Thr Vai Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala Gly Asp Ile Ala Gly Asp 100 105 110 Thr Trp Asn Thr Ser Lys Vai Arg A13 Thr Leu Leu Gly Ile Ser Pro 115 120 125 Ala Thr Arg Ala Arg Vai Lys Ile Val Thr Tyr Gly Asn Val Thr Tyr 130 135 140 Vai Met Gly Ile Leu Thr Pro Glu Glu Gin Ala Gin Ile Thr Gin Lys HS 150 155 Ib.O Vai Ser Thr Thr Vai Gly Vai Gin Lys Val Ile Thr Leu Tyr Gin Asn lb5 170 175 Tyr Vai Gin Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly 180 185 150 Ala Gly leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys 155 200 205 Gly Leu Gin Ser Leu Thr Leu Asp Gin Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys 210 215 220 Leu Lys Leu Ala Ala Gin Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp 225 230 235 240 Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp 245 250 255 Phe Ile Arg Gin Ile Glu Vai Asp Gly Gin Leu Ile Thr Leu Glu Ser 2b 0 2b 5 270 Gly Glu Phe Gin Vai Tyr Lys Gin Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe 275 280 285 Gin Thr Glu Gin Ile Gin Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala 250 255 300 Lys Arg Gin Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe 305 310 315 320 Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe 325 330 335 Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala 3M0 345 350 Ala Lys Gin Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu LeU 355 3b0 3b5 Asn Vai Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His 370 375 38D Ala Vai Ile Ser Gly Ser Vai Leu Tyr Asn Gin Ala Glu Lys Gly Ser 385 350 355 400 Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gin Glu Val Ala Gly Ser 405 410 415 Ala Glu Vai Lys Thr Vai Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala 420 425 - 430

Lys Gin 59

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

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Claims (7)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um kit compreendendo: (i) um primeiro recipiente contendo um adjuvante e compreendendo uma emulsão óleo-em-água; e (ii) um segundo recipiente contendo uma composição antigénica liofilizada compreendendo um imunogénio para despoletar uma resposta imune contra o serogrupo B de Neisseria meningitidis.

2. 0 kit da reivindicação 1, em que a composição antigénica liofilizada no segundo recipiente compreende ainda um sacarideo capsular conjugado de um ou mais dos serogrupos A, C, W135 e/ou Y de N. meningitidis.

3. 0 kit da reivindicação 2, em que a composição antigénica liofilizada está substancialmente livre de sais de alumínio.

4. 0 kit de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a composição antigénica liofilizada e/ou o adjuvante da emulsão está/estão substancialmente livres de sais de alumínio.

5. 0 kit de qualquer reivindicação precedente, em que a composição antigénica liofilizada compreende vesículas membranares de uma estirpe do serogrupo B de N. meningitidis.

6. 0 kit de qualquer composição antigénica recombinantes de uma meningitidis. reivindicação precedente, em que a liofilizada compreende proteínas estirpe do serogrupo B de N.

7. 0 kit de qualquer reivindicação precedente, em que a composição antigénica liofilizada compreende um lipoligosacarídeo de uma estirpe do serogrupo B de N. meningitidis.