CN1474830A

CN1474830A - 修饰的凝血因子viii

Info

Publication number: CN1474830A
Application number: CNA018191495A
Authority: CN
Inventors: Js; J·S·洛拉
Original assignee: AMORY UNIV
Current assignee: AMORY UNIV; Emory University
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2004-02-11
Anticipated expiration: 2021-09-19
Also published as: CA2422902A1; PL366199A1; KR100638184B1; WO2002024723A9; EP1319016A4; KR20030033074A; AU2001292861A1; JP2004525608A; EP1319016A1; HUP0301179A2; MXPA03002256A; HUP0301179A3; WO2002024723A1; RU2003107100A; US6770744B2; US20020182670A1; PL206105B1; CN1205221C

Abstract

人凝血因子VIII的特定氨基酸基因座与用凝血因子VIII治疗后的血友病患者的抑制性抗体反应。公开了修饰的凝血因子VIII，其中通过在一个或多个特定的基因座位取代改变氨基酸序列。修饰的凝血因子VIII用于血友病，用于避免或预防抑制性抗体的作用。

Description

修饰的凝血因子VIII

对相关申请的交叉参考

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请号60/236,460，(2000年9月29日提交)和60/234,047(2000年9月19日提交)的优先权，这些专利都在此引入以供参考，与本文公开内容一致。

联邦研究支持的认可

政府对导致本发明的研究通过国立卫生研究院基金编号F01-HL46215给予过部分资助，因而美国政府对本发明具有权利。

发明领域

本发明一般涉及具有氨基酸取代的修饰哺乳动物凝血因子VIII，这些取代与从其衍生的蛋白质或其它凝血因子VIII制备物，例如人凝血因子VIII相比，减少了免疫原性和/或抗原性。

发明背景

血液凝结从血小板粘附到损伤区域受伤血管的伤口壁上开始。然后，在一系列酶调控的级联反应中，可溶性纤维蛋白原分子被凝血酶转变成不溶性的纤维束，而固定血小板形成血栓。在级联反应的每一个步骤中都有一个蛋白前体转化成的蛋白酶，切割此系列中的下一个蛋白前体。在大多数步骤中需要辅助因子。

凝血因子VIII作为无活性前体在血液中循环，和von Willebrand因子非共价紧密结合。凝血因子VIII受凝血酶或Xa因子蛋白水解而活化，从而使它与vonWillebrand因子分离，并在级联反应中激活其促凝血功能。蛋白凝血因子VIIIa的活化形式是一种辅助因子，该因子能增强凝血因子IXa对凝血因子X活化催化效率达几个数量级。

具有凝血因子VIII缺陷或未用凝血因子VIII治疗就具有抗凝血因子VIII抗体的人，会患失控性内出血，从而可能导致一系列严重症状，从关节炎直到早逝。严重血友病病人(在美国大约为10,000)，可用输入人凝血因子VIII来治疗，如果以足够多的次数和浓度施用该因子可恢复血液正常凝血能力。凝血因子VIII的经典定义，实际上是指存在于正常血浆中的能够纠正血友病A型患者的血浆凝血缺陷的物质。

在血友病病人治疗中，抑制凝血因子VIII活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)的产生是一种严重并发症。对凝血因子治疗性输入的反应中，有大约20％血友病A型患者产生了自身抗体。在以前未治疗过的、患有血友病A型的病人中产生了抑制性抗体，该抑制性抗体通常在治疗一年中产生。另外，使凝血因子VIII失活的自身抗体偶尔也可在以前凝血因子VIII水平正常的人体内产生。凝血因子VIII(fVIII)的抑制抗体(抑制剂)在A型血友病患者中在输入fVIII后作为自身抗体，或在非血友病患者中作为自身抗体产生(Hoyer，L.W.和D.Scandella，1994“凝血因子VIII抑制剂：结构和在自身抗体和A型血友病患者中和功能”，Semin.Hematol.31：1-5)。针对A1-A2-B-ap-A3-CI-C2 fVIII分子中A2、ap-A3和C2结构域中的表位的抗体负责大多数抑制剂血浆中的所有抗凝血活性(Prescott，R.等，1997“A型血友病患者中的抑制抗体应答比大多数具有fVIII自身抗体的非血友病患者复杂得多”，Blood 89：3663-3671；Barrow，R.T.等，2000，“用多取代杂交人/猪凝血因子VIII分子使凝血因子VIII的抗原性降低制备复杂的抑制性血浆”，Blood 95：557-561)。单链人fVIII中的18-kDa C2结构域，残基Ser2173-Tyr2332含有磷脂膜结合位点，是起到正常fvIII促凝血功能必需的。人C2-特异性抗-fVIII抗体抑制该作用(Arai，M.等，1989，“通过人抗体抑制凝血因子VIII的分子基础-与凝血因子VIII轻链结合的抗体防止磷脂与凝血因子VIII作用”，J.Clin.Invest.83：1978-1984)。与此一致的是，磷脂保护fVIII不被fVIII抑制剂灭活(Arai等，见上；Barrowcliffe，T.W.等，1983，“与磷脂的结合保护凝血因子VIII不被人抗体灭活”，J.Lab.Clin.Med.101：34-43)。C2结构域还含有部分von Willebrand因子(vWf)结合位点(Saeko，E.L.等，1994，“凝血因子C2结构域与von Willebrand因子结合的作用”，J.Biol.Chem.269：11601-11605；Saenko，E.L.和Scandella，D.，1997，“凝血因子VIII轻链酸性区域和C2结构域合起来形成von Willebrand因子的高亲和力结合位点”，J.Biol.Chem.272：18007-18014)。一些抑制剂可通过干涉该作用起作用(Shina，M.等，1995，“人抗-C2结构域抑制剂等位抗体对凝血因子VIII与von Willebrand因子的共同抑制作用”，Br.J.Haematol.91：714-721；Saenko，E.L.等，1996，“凝血酶切割的凝血因子VIII通过单克隆和人抗体从von Willebrand因子上缓慢释放是凝血因子VIII抑制的新机制”，J.Biol.Chem.271：27424-27431；Gilles，J.G.等，1999，“一些凝血因子VIII(FVIII)抑制剂识别仅在FVIII-vWf复合物上递呈的FVIII表位”，Thromb.Haemost.82：40-45)。

如果抑制抗体的滴度足够低，病人可通过增加凝血因子VIII的剂量进行治疗。然而，往往抑制抗体的滴度很高，以致于不能被(大量输入)凝血因子VIII所克服。另一治疗方案是在正常止血时，用凝血因子IX复合制剂(例如，KONYNE^，Proplex^)或重组人凝血因子VIIIa来绕过对凝血因子VIII的需要。另外，由于猪凝血因子VIII通常比人凝血因子VIII与抑制抗体的反应性要小得多，可使用部分纯化的猪凝血因子VIII制剂(HYATE：C^)。许多对人凝血因子VIII产生抗体的病人已成功的用猪凝血因子VIII治疗，并长时间耐受了这种治疗。然而，猪凝血因子VIII的施用不是一种完全的解决方法，因为一些病人在一次或多次输入后，会对猪凝血因子VIII产生抑制抗体。

商品化的人血浆衍生凝血因子VIII的几种不同纯度的制品可用于血友病A型的治疗。这些制品包括：从许多献血者的合并血液中提取的部分纯化的凝血因子VIII，它经过加热和洗涤剂灭活病毒处理，但含有显著水平的抗原性蛋白原；用单克隆抗体纯化的凝血因子VIII，具有更低水平的抗原性杂质和病毒污染；以及重组人凝血因子VIII，它的临床试验正在进行。不幸的是，人凝血因子VIII在生理浓度和pH时不稳定，在血液中以极低的浓度存在(0.2μg/ml血浆)，凝血活性比很低。人们对于病毒或其它血液携带的污染物危险的关注，限制了从猪血纯化的猪凝血因子VIII的使用。

血友病病人需要每天更新凝血因子VIII来防止出血和所导致的变形性血友病关节病。然而，由于分离和纯化的困难、免疫原性、以及必须排除AIDS和肝炎感染的危险等，因子VIII的供给一直不足，并在治疗使用中产生问题。使用重组人凝血因子VIII或部分纯化的猪凝血因子VIII也不能解决所有这些问题。

和常用的、商品可得的、血浆衍生凝血因子VIII有关的问题，激发了开发更好的凝血因子VIII制品的显著兴趣。需要以下更强的凝血因子VIII分子：每个分子能输送更多的凝血活性单位；在所选的pH和生理浓度下稳定的凝血因子VIII分子；更不易于导致抑制抗体产生的凝血因子VIII；在已产生抗人凝血因子VIII抗体的病人体内能避开免疫检测的凝血因子VIII分子。

Lollar的美国专利6,180,371描述了人凝血因子VIII的A2结构域的氨基酸取代，它改变得到的凝血因子VIII分子的抗原性。371专利没有公开或提示C2结构域中的具体氨基酸取代，这些氨基酸取代与野生型凝血因子VIII或相应的重组凝血因子VIII相比，减少抗原性或免疫原性。

Lollar的美国专利5,859,204公开了人凝血因子VIII的484-509区域内氨基酸特异置换的位点。更具体的，204专利描述了在相对于人蛋白质位点485、487、488、489、492、495、501或508具有氨基酸取代的修饰凝血因子VIII。204专利未公开或提示C2结构域中的具体氨基酸取代，这些氨基酸取代与野生型凝血因子VIII或相应的重组凝血因子VIII相比，减少抗原性或免疫原性。

Lollar等的美国专利5,888,974公开了通过分离和重组人和其它非人凝血因子VIII亚基或结构域杂交促凝血因子VIII。

Lollar等的美国专利5,744,466描述了在A2结构域具有氨基酸取代的杂交凝血因子VIII。

Lollar等美国专利5,633,060描述了杂交凝血因子VIII，含有非人和人重链和轻链亚基的组合。美国专利5,583,209描述了编码060专利中杂交凝血因子VIII的核酸。

美国专利5,364,771描述了含有人和猪重和轻链亚基组合的纯化杂交凝血因子VIII。还公开了用猪A2结构域交换人A2结构域的人凝血因子VIII。

美国专利6,180,371；5,888,974；5,859,204；5,744,446；5,663,060；5,583,209和5,364,771(都在此引入以供参考)未公开或提示C2结构域中的具体氨基酸取代，这些氨基酸取代与野生型凝血因子VIII或相应的重组凝血因子VIII相比，减少抗原性或免疫原性。尽管在全世界实验室进行了多年的广泛研究，似乎本文详述的对于凝血因子VIII C2结构域的发明在其它地方尚未有描述或提示。

Pratt等(1999，“1.5分辨率下的人凝血因子VIII的C2结构域结构”，Nature，402：439-442)报道了人凝血因子VIIIC2结构域在1.5分辨率的晶体结构。Pratt等报道了该结构部分解释了为什么凝血因子VIII C2区域的突变导致出血疾病。实际上，C2区域中的21个残基已有报道是A型血友病患者中有害点突变的位点。例如，已知V2223是发生点突变的位点，与出血疾病有关。因此，本领域技术人员不会预计V2223是取代的合适候选位点，以提供具有治疗活性的修饰凝血因子VIII。事实上，Shima等报道C2结合性抑制抗体影响凝血因子VIII与磷脂和von Willebrand因子的结合。因此，Pratt等教导，C2抑制抗体，即那些与A型血友病患者中的出血疾病相关的抑制剂，干涉C2结构域与磷脂及vonWillebrand因子的结合。该结论与其测定的M2199、F2200、L2251、L2252、V2223和R2220出现在蛋白-磷脂界面的结果联合起来，提示这些残基的突变将导致磷脂和/或von Willebrand因子结合的改变，以及出血疾病中的相关增加。这些研究不清楚哪些氨基酸残基和相应的取代将得到改良的凝血因子VIII分子。

出人意料的是，本发明的发明人发现凝血因子VIII C2结构域近来得到的X光结构中鉴定的3疏水足的突变减少了与抑制抗体的结合，提高了性能和/或减少了免疫原性。

因此，本发明的一个目的是提供一种凝血因子VIII，它能在凝血因子VIII缺陷或具有抗凝血因子VIII抑制抗体的病人体内纠治血友病。

本发明的另一个目的是提供治疗血友病的方法。

本发明还有一个目的是提供在所选pH和生理浓度下稳定的凝血因子VIII。

本发明还有另一个目的是提供比人凝血因子VIII具有更强凝血活性的凝血因子VIII。

发明简述

本发明一般涉及含有重组哺乳动物凝血因子VIII的组合物。本发明的组合物含有具有凝血活性的分离纯化的哺乳动物凝血因子VIII，其中重组凝血因子VIII在C2结构域具有氨基酸取代，该取代与衍生出它们的蛋白质或其它凝血因子VIII制备物相比降低了抗原性。还提供了编码本发明新组合物的DNA序列以及产生含有凝血因子VIII的新组合物的方法。治疗需要用凝血因子VIII治疗的病人的方法也在本发明的范围内。

本发明的第一个实施例提供了新组合物，它含有C2结构域有氨基酸取代的哺乳动物重组凝血因子VIII。该修饰的重组凝血因子VIII的C2结构域中的氨基酸取代与衍生出它们的蛋白质或其它可得的凝血因子VIII制备物相比，减少了抑制抗体的抗凝血活性。该实施例的新组合物具有凝血活性，并减少与抑制抗体的结合。优选参与fVIII与磷脂膜和/或抑制抗体结合的残基的取代。优选与人凝血因子VIII同源位置的取代包括但不限于Met2199、Phe2200、Val2223、Leu2251和Leu2252。该实施例的新组合物可以是一突变体、二突变体、三突变体或四突变体。本发明氨基酸取代的例子包括但不限于Met2199Ile、Phe2200Leu、Leu2252Phe、Met2199Ile/Phe2200Leu、Val2223Ala/Lys2227Glu、Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu，这些都是根据人凝血因子VIII编号***，其中氨基酸号1是成熟凝血因子VIII氨基末端的丙氨酸。优选重组的猪或人凝血因子VIII的取代。

本发明的第二个实施例提供了含有在C2结构域具有氨基酸取代的重组凝血因子VIII的新杂交凝血因子VIII组合物。该实施例的新组合物是通过制备在C2结构域具有氨基酸取代的杂交凝血因子VIII构建的。凝血因子VIII的其它结构域可衍生自各种哺乳动物，例如人、小鼠、猪、大鼠和犬等、该实施例的新组合物具有凝血活性，减少对抑制抗体的结合。可突变，提供该实施例的新组合物的氨基酸位置的例子包括但不限于Met2199、Phe2200、Val2223、Leu2251和Leu2252，它们都是参照人凝血因子VIII编号。本实施例中包含的C2结构域中的氨基酸取代的例子包括但不限于Met2199Ile、Phe2200Leu、Leu2252Phe、Met2199Ile/Phe2200Leu、Val2223Ala/Lys2227Glu、Met2199Ile/Phe2200Leu/-Val2223Ala/Lys2227Glu，所有都参照人凝血因子VIII编号。

本发明的另一个实施例提供了DNA序列，它们含有本发明新组合物的编码序列。本发明的另一个实施例提供了产生本发明新组合物的方法。

本发明还提供了减少凝血因子VIII分子的免疫原性的方法，和该方法产生的免疫原性减少的重组凝血因子VIII。特别是，描述了修饰的重组凝血因子VIII分子和产生C2结构域具有取代免疫原性降低的分子的方法。

还提供了治疗具有凝血因子VIII缺陷的病人的药物组合物和方法，包括施用重组凝血因子VIII和其杂交形式。

附图简述

图1.与磷脂结合有关的可能fVIII残基。显示了人(Vehar，G.A.等，见上，1984；Toole，J.J.等，1984，“编码人抗血友病因子的cDNA的分子克隆”，Nature312：342-347)、猪(Healey，J.F.等，1996，“猪凝血因子VIII的cDNA和衍生氨基酸序列”，Blood 88：4209-4214)、小鼠(Elder，B.等，1993，“小鼠凝血因子VIII cDNA的序列”，Genomics 16：374-379)和犬(Cameron，C.等，1998，“犬凝血因子VIII cDNA和5’旁侧序列”Thromb.Haemostas，79：317-322)fVIII的C2结构域序列的排列对比。人fVIII中的推测磷脂结合残基(Pratt，K.P.等，1999，“人凝血因子VIII C2结构域1.5分辨率的结构”，Nature 402：439-442)和同源残基的排列序列下划线，用黑体表示。

图2.人fVIII C2结构域中的突变位点。A.显示推测涉及磷脂膜结合的疏水残基和Lys2227，4个推定带正电的结合残基之一的带状图(Pratt，K.P.等，1999，“1.5分辨率下人凝血因子VIII的C2结构域的结构”，Nature 402：439-442)。在该研究中对Met2199、Phe2200、Val2223、Lys2227和Leu2252进行了突变。在人、猪、小鼠和犬fVIII中保守的Leu2251不突变。B.旋转的空间填充模型，如从膜向上看到的。

图3.病人多克隆抗-fVIII抗体的Bethsda滴度。在A型血友病血浆中稀释重组fVIII，如“材料和方法”所述测定抗体AA、AJ、HR、LK和RvR的Bethsda滴度。显示的是用非线性平方回归分析确定的平均值和标准偏差。C2D1是Met2199Ile/Phe2200Leu双突变。C2 D2是Val2223Ala/Lys2227Glu双突变。C2 Q是Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu四突变。HP20是无B结构域的杂交人/猪fVIII分子，含有人A1、A2、ap-A3和C1结构域以及猪C2结构域。突变体和HB之间的差异的置信水平在99.9％水平标为“**”，在99％水平标为“*”。NS是不显著。

图4.病人单克隆抗体BO2C11的Bethsda滴度。缩写和注释如图3的图例说明所述。

图5.小鼠单克隆抗体NMC VIII-5的Bethesda滴度。缩写和注释如图3的图例说明所述。

发明详述

本发明一般涉及含有重组哺乳动物凝血因子VIII的组合物。本发明的组合物含有具有凝血活性的分离重组的哺乳动物凝血因子VIII。惊人的是，发现凝血因子VIII C2结构域中，在近来得到的X光结构中识别的三个疏水足中的突变，与衍生出突变的蛋白质和/或其它凝血因子VIII制备物相比，减少了突变物与抑制抗体的结合。因此，本发明的新组合物含有在C2结构域具有氨基酸取代的重组凝血因子VIII，该取代与衍生出取代的蛋白质相比，减少了抗原性。另外，本发明还提供了在C2结构域具有氨基酸取代的重组凝血因子VIII，它与其它凝血因子VIII制备物相比，减少了抗原性。本发明相关的实施例提供了治疗需要凝血因子VIII治疗的病人的方法，产生本发明新重组凝血因子VIII组合物的方法，含有新重组凝血因子VIII蛋白质的编码序列的DNA序列，和含有新凝血因子VIII蛋白质的药物组合物。

本发明还提供了活性重组杂交凝血因子VIII分子或其片段、编码这些杂交物的核酸序列，制备和分离它们的方法，和确定它们的特征的方法。这些杂交物含有人/动物、动物/动物或其它杂交凝血因子VIII分子，还在C2结构域具有至少一种特定的氨基酸序列，包括用一个物种的凝血因子VIII的一个或多个独特氨基酸取代其它物种的凝血因子VIII的相应氨基酸序列(或氨基酸)；或在C2结构域含有至少一种序列，包括用与凝血因子VIII没有已知序列同一性的一个或多个氨基酸取代人、动物或杂交凝血因子VIII中的特定氨基酸序列。得到的重组杂交凝血因子VIII与人或猪凝血因子VIII相比，对凝血因子VIII抑制抗体免疫反应性降低或消失。

“对应的”核酸或氨基酸或两者的序列，如本文所用，是存在于凝血因子VIII或其片段中任一位点上的序列，和其它动物的凝血因子VIII分子一位点的序列有相同结构和/或功能，虽然核酸或氨基酸编号可能不相同。和另一凝血因子VIII序列“对应”的DNA序列和这样的序列实质上相对应，并能和指定SEQ ID NO的序列在严格条件下杂交。和另一凝血因子VIII序列“对应”的DNA序列还包括导致凝血因子VIII或其片段表达的序列，以及除非基因密码子的冗余，能与指定SEQID NO杂交的序列。

“独特的”氨基酸残基或序列，如本文所用，指在一种动物凝血因子VIII分子中，和其它动物的凝血因子VIII分子中的同源残基或序列不同的氨基酸序列或残基。

“比活性”，如本文所用，指能纠正人凝血因子VIII缺陷血浆的凝血缺陷的活性。比活性通过标准试验中每毫克总凝血因子VIII蛋白的凝血活性单位来衡量，其中将人凝血因子VIII缺陷血浆的凝血时间和正常人血浆的作比较。一单位凝血因子VIII活性等于一毫升正常人血浆中存在的活性。在该试验中，血块形成的时间越短，被测定的凝血因子VIII的活性越大。猪凝血因子VIII在人凝血因子试验中具有凝血活性。

“表达”意味着发生的一组过程，通过其利用遗传信息获得产物。编码猪凝血因子VIII的氨基酸序列的DNA可以在哺乳动物宿主细胞中“表达”，获得修饰的凝血因子VIII蛋白。材料、基因结构、宿主细胞和允许给定的DNA序列发生表达的条件是本领域熟知的，并可操纵，影响表达的时间和量，以及表达蛋白在胞内或胞外的位置。例如，通过在编码猪凝血因子VIII的DNA5’末端加上信号肽(常规上5’末端是编码蛋白质的NH₂的末端)DNA，使表达的蛋白从宿主细胞，内部输出到培养基中。提供编码信号肽的DNA与编码猪凝血因子VIII的DNA相联合是有利的，因为表达的凝血因子VIII被运出细胞，简化了纯化过程。优选的信号肽是哺乳动物凝血因子VIII信号肽。

人凝血因子VIII cDNA核苷酸和预计的氨基酸序列分别显示于SEQ ID Nos：1和2。合成的凝血因子VIII大约为300kDa的单链蛋白，具有确定“结构域”序列NH₂-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH的内部序列同源性。在凝血因子VIII分子中，“结构域”，如本文中所用，是由内部氨基酸序列相同性和凝血酶蛋白水解切割的位点所界定的一段连续氨基酸序列。除非另有指定，当该序列和人氨基酸序列(SEQ IDNO：2)排比对齐时，凝血因子VIII结构域包括以下氨基酸残基：A1，残基Alal-Arg372；A2，残基Ser373-Arg740；B，残基Ser741-Arg1648；A3，残基Ser1690-Ile2032；C1，残基Arg2033-Asn2172；C2，残基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括残基Ser1690-Tyr2332。剩余区段，残基Glu1649-Arg1689，常被称为凝血因子VIII轻链活化肽。凝血因子VIII被凝血酶或凝血因子Xa水解而活化，它们使凝血因子VIII与von Willebrand因子分离，形成凝血因子VIIIa，它具有促凝血功能。凝血因子VIIIa的生物功能是增强凝血因子IXa对因子X活化的催化效率达几个数量级。凝血酶所活化的凝血因子VIIIa是一种160kDa的A1/A2/A3-C1-C2异质性三聚体，即与因子IXa和因子X在血小板或单核细胞表面形成的一种复合物。本文所用的“部分结构域”是形成某结构域一部分的一段连续氨基酸序列。

人或动物凝血因子VIII的“亚基”，如本文所用，是该蛋白的重链或轻链。凝血因子VIII重链含有3个结构域，A1，A2，和B。凝血因子VIII轻链也含有3个结构域，A3，C1和C2。

术语“表位”、“抗原性位点”和“抗原决定簇”，如本文所用是同义的，定义为被抗体特异性识别的人或动物凝血因子VIII或其片段的一部分。它可由任一编号的氨基酸残基组成，而且依赖于该蛋白的一级、二级、或三级结构。

术语“免疫原性位点”，如本文所用，定义为人或动物凝血因子VIII、或其片段中的一个区域，当用常规方法例如免疫试验(例如本文所述的ELISA或Bethesda试验)测定时，它在人或动物中能特异性诱导产生抗凝血因子VIII、或其片段的抗体。它可由任一编号的氨基酸残基组成，而且它依赖于蛋白的一级、二级、和三级结构。在一些实施例中，杂交或杂交的等价凝血因子VIII或其片段在动物或人中不具免疫原性或比人或猪的凝血因子VIII免疫原性低。

“凝血因子VIII缺陷”。如本文所用，包括产生有缺陷的凝血因子VIII，或凝血因子VIII产生不足或不产生，或抑制抗体部分或完全抑制了凝血因子VIII等引起的凝血活性缺陷。血友病A型是一类由X-连锁基因中的缺陷和其编码的凝血因子VIII蛋白的缺失或缺陷造成的凝血因子VIII缺陷。

本文所用的术语“诊断实验”包括以一些方式，利用抗原-抗体相互作用来检测和/或定量存在于测试样品中的特定抗体量，帮助选择药物治疗。有许多这类试验是本领域技术人员知道的。本文所用的完整或部分的人、猪或修饰的猪因子VIII DNA或其片段和其表达的蛋白质，可以取代其它已知实验中的相应试剂，从而可用改变的实验来检测和/或定量抗凝血因子VIII的抗体。使用这些试剂、凝血因子VIII DNA或其片段或其表达的蛋白质，能够改进检测人或动物凝血因子VIII抗体的已知试验。这些实验包括但不限于ELISA、免疫扩散实验和免疫印迹。进行任一这些实验的合适的方法是本领域技术人员已知的。本文所用的包括蛋白质的至少一种表位的凝血因子VIII或其片段可用作诊断试剂。可使用人、猪或修饰的猪凝血因子VIII或其片段的其它实验的例子包括Bethsda试验和抗凝血试验。

术语“编码蛋白质，例如猪凝血因子VIII的DNA”意味着一种多脱氧核酸，其核苷酸序列对于宿主细胞来说，根据已知的遗传密码的关系含有蛋白质，例如猪凝血因子VIII的氨基酸序列的编码信息。

编码人或动物的凝血因子VIII或修饰的凝血因子VIII的DNA的“表达产物”是通过在合适的宿主细胞中表达所提到的DNA获得的产物，包括特征：所提到的DNA编码的蛋白质的翻译前后的修饰，包括但不限于糖基化、蛋白酶解切割等。本领域已知可产生这些修饰并可能有某些差别，这取决于宿主细胞类型和其它因素，并可导致产物的分子同工型，保留促凝血活性。见例如Lind，P.等，Eur.J.Biochem.232：1927(1995)，在此引入以供参考。

“表达载体”是一种DNA元件，通常是环形结构，具有在理想的宿主细胞中自主复制，或整合到宿主细胞基因组中，并具有一些熟知的特征，允许在正确的位点和以正确取向***载体序列的编码DNA表达。这些特征可以包括但不限于一个或多个指导编码的DNA转录起始的启动子序列，和其它的DNA元件，例如增强子、聚腺苷酸位点等，全部都是本领域熟知的。术语“表达载体”用于指在其序列中***了要表达的DNA编码序列的载体，和必要的表达控制元件，和一个***位点，可以起到表达任何***该位点的编码DNA的载体，所有都是本领域熟知的。因此例如，缺乏启动子的载体可以通过***与编码DNA连结的启动子变成表达载体。

凝血因子VIII中减少抑制抗体结合的突变的发现

近来，报道了人fVIII C2结构域的1.5 X光结构(Pratt，K.P.等，1999，“1.5分辨率下的人凝血因子VIII的C2结构域结构”，Nature，402：439-442)。该结构的检测揭示了三个接触溶剂的疏水“足”，由Met2199/Phe2200、Val2223和Leu2251/Leu2252组成。带正电的残基环，包括Arg2213、Arg2220、Lys2227和Lys2249围绕这些残基。该基序提示膜结合包括疏水足***膜双层，通过与带负电的磷脂静电作用稳定。

大多数fVIII抑制抗体与猪的fVIII有弱交叉反应。该观察导致用一系列在人fVIII C2结构域中包含猪取代基的构建体，对C2表位的主要决定簇作图，确定在残基Glu2181-Val2243(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701-3709)。在本发明中，猪、小鼠或犬fVIII中与人fVIII的Met2199、Phe2200、Val2223、Lys2227和/或Leu2252同源的残基用作建立一系列重组fVIII分子的基础。观察到与Met2199、Phe2200和Leu2252处突变有关的抗原性的显著减少，表明这些残基参与fVIII与磷脂膜的结合，而且常参与同抑制抗体结合。

图1显示了人、猪、小鼠和犬fVIII C2结构域的排列对比。5个推测的疏水磷脂结合残基中的4个，有一个物种与人fVIII不同：Met2199→Ile(猪)、Phe2200→Leu(犬)、Val2223→Ala(犬)和Leu2252→Phe(小鼠)。在4种推测的碱性残基中只有一种不同，Lys2227→Glu(猪)。因此，在无B结构域的人fVIII中制造了Met2199Ile、Phe2200Leu、Val2223Ala、Leu2252Phe和Lys2227Glu单突变体。另外，制造了两个双突变体Met2199Ile/Phe2200Leu(称为C2 D1)和Val2223Ala/Leu2252Phe(C2 D2)，和四突变Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Leu2252Phe(C2 Q)。图2显示了fVIII的X光结构中突变残基的位置。Met2199/Phe2200和Leu22251/Leu2252从两个β-发夹环上突出。Val2223从邻近的环突出，靠近Lys2227。

突变体在无血清培养的幼仓鼠肾衍生的细胞系中稳定表达，然后部分纯化。根据ELISA试验的杂交物的比凝血活力相当于或高于“材料和方法”中所述的HB的活力，表明适合抗原性研究。用“材料和方法”中所述的Bethesda试验测定突变体与C2特异性fVIII抑制抗体的作用。结果与无B结构域fVIII(HB-)和杂交人/猪fVIII分子、HP20(用整个猪C2结构域取代的人的分子)比较(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制性表位的主要决定簇”，Blood 92：3701)。

大多数fVIII抑制抗体是针对C2结构域内和外的表位的多克隆IgG群(Prescott，R.等，见上，1997；Fulcher，C.A.等，1985，“人凝血因子VIII抑制剂表位定位于两个多肽片段”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7728-7732)。然而，一些抑制抗体是C2-特异性的，并且用于评估C2结构域中的非人序列取代的作用(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701)。在这些研究中实验使用来自5个病人AA、AJ、HR、LK、RvR的C2-特异性多克隆抑制抗体(图3)。均观察到由于Met2199、Phe2200、和/或Leu2252突变导致的抗原性减少，虽然各抑制剂所识别的残基不同。惊人的是，常常在Bethsda滴度中有显著增加，特别是用Val2223Ala突变体。双突变体Met2199Ile/Phe2200Leu显示对所有5种抗体抗原性都低，与Met2199Ile和/或Phe2200Leu的抗原性总是被减少的事实一致。反常的是，双突变体Val2223Ala/Lys2227Glu显示针对全部5种多克隆抗体的抗原性减少，甚至在三种情况下(AA、AJ和HR)，对应的各突变显示未变或提高的抗原性。四突变体Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu的抗原性相当于或低于一或二突变体。HP20的抗原性是所有突变体最低的。除了在该研究中不突变的Met2199、Phe2200、leu2252外的这些抗原性残基的存在一致。

图4和5分别显示了抗体BO2C11(Jacquemin，M.G.等，1998，“凝血因子VIII灭活的机制和动力学：用衍生自A型血友病病人的IgG4单克隆抗体和抑制剂的研究”，Blood 92：496-506)和NMC VII-5(Shima，M.，D.等，1993，“识别C2结构域的凝血因子VIII中和性单克隆抗体和人抑制性同种抗体抑制凝血因子VIII与von Willebrand因子和磷酯酰丝氨酸的结合”，Thromb.Haemost 69：240-246)对HB和突变fVIII分子的Bethsda滴度。BO2C11是一种衍生自A型血友病抑制病人转化的B细胞的C2-特异性人IgG4κ单克隆抗体。这是迄今克隆到的唯一一种C2-特异性人抗体。BO2C11和NMC VIII-5都识别fVIII的C2结构域，并抑制fVIII与vWF和磷脂的结合。NMC VIII-5可与人多克隆抑制抗体竞争与fVIII的结合。用BO2C11和NMC VIII-5的结果与使用多克隆抗体HR获得的结果是相似的(图3)。在所有三种抗体中，Phe2200是抗原性的，而Val2223和Lys2227似乎减少抗原性。

Met2199、Phe2200和/或Leu2252的突变与所测试的7种抗体大多数中的抗原性低下有关(表1)，常常是显著的(图3-5)。这与Met2199/Phe2200和Leu2251/Leu2252环参与膜结合的假设一致。即使所有7种抑制抗体都识别M2199/Phe2200环，但Met2199和Phe2200的突变的效果常常是不同的。例如，Met2199Ile显示抗原性下降，而Phe2200Leu显示对抗体AJ的抗原性上升，而对于BO2C11正相反。因此AJ和BO2C11的氨基酸特异性是不同的，虽然都识别Met2199/Phe2200环。

先前，用一系列重组人/猪杂交fVIII分子作图显示了C2表位的主要决定簇，位于以残基Glu2181-Val2243为边界的区段中(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701-3709)。Met2199/Phe2200环包含在该区域中。该分析既不包含也不排除Leu2251/Leu2252环，因为猪fVIII也在残基2251和2252含有亮氨酸。整个猪C2结构域取代入人fVIII，产生称为HP20的分子，它与本研究中所作的多个更有限的取代的抗原性更低有关(图3-5)。这表明在Met2199/Phe2200和Leu2251/Leu2252环外还有与C2抑制抗体结合有关的残基。

近来，报道了在不存在磷脂下，凝血因子V C2结构域的两种构型的X光结构(Macedo-Ribeiro，S.等，1999“人凝血因子V膜结合C2结构域的晶体结构”，Nature 420：434-439)。作者提出了一种磷脂膜结合模型，涉及在26和27位(人凝血因子VC2结构域编号)含有色氨酸的环，与fVIII中的Met2199和Phe2200同源。存在大量证据支持该环与磷脂膜结合有关。一种封闭凝血因子V与PS结合的抑制性单克隆抗体HV-1作图与该环结合(Kim，S.W.等，2000，“用丙氨酸扫描诱变在人凝血因子C2结构域中鉴定功能上重要的氨基酸残基”Biochemistry39：1951-1958；Ortel，T.L.等，1994“用重组嵌合体在凝血因子V的第二C型结构域中定位功能上重要的表位”，J.Biol.Chem.269：15898-15905；Ortel，T.L.等，1998，“抑制性抗凝血因子V抗体与凝血因子V C2结构域结合，与出血性表现有关”，Blood 91：4188-4196)。用丙氨酸取代凝血因子Va中相当于Trp26和Trp27的残基和与PS的结合下降，凝血活性丧失有关(Kim，S.W.等，2000，“用丙氨酸扫描诱变在人凝血因子C2结构域中鉴定功能上重要的氨基酸残基”Biochemistry 39：1951-1958)。

另外，含有与fVIII的Leu2251同源的Leu79的环和含有残基Asn41-Asn51的环也被提出，由于靠近Trp26/Trp27环，参与磷脂膜结合(Macedo-Ribeiro，S.等，1999“人凝血因子V膜结合C2结构域的晶体结构”，Nature 420：434-439)。与Asn41-Asn51环同源的fVIII区段，His2076-Asn2082，没有被提出是磷脂膜结合位点(Pratt，K.P.，1999，“1.5分辨率下的人凝血因子VIII的C2结构域结构”，Nature，402：439-442)。相反，凝血因子V中与fVIII的Val2223环同源的环未被提出参与磷脂膜结合。在该研究中。将Val2223Ala和Lys2227Glu突变与抗原性增加联系(表1)。因此，这些结果不支持这些残基参与膜结合的假说。然而，可能它们确实和磷脂结合，但不常作为抑制性抗体的目标。

两种凝血因子VC2结构具有不同的构型，称为“开放”和“闭合”构型，与Trp26和Trp27在磷脂膜结合位点的主要运动有关。有人提出这些状态被认为是分别开关磷脂膜结合状态(Macedo-Ribeiro，S.，见上，1999)。由于Val2223和Lys2227残基稳定了fVIII中与低亲和性膜和抗体结合有关的“闭合”构型状态，与其有关的抗原性可能下降。Val2223Ala和Lys2227Glu突变松弛了该状态，然后导致高亲核性抗体结合。另外，Val2223和Lys2227可简单的干扰涉及与其它fVIII残基(例如Met2199、Phe2200等)的高亲和力接触的抗原-抗体锁-钥匙相互作用。

与多克隆抑制抗体比较，人C2-特异性单克隆抗体BO2C11是重要的，因为在多克隆抑制抗体的分析中会有异源性混淆。BO2C11的功能特征与小鼠单克隆抗体NMC VIII-5相似。两种抗体都抑制VIII与PS和vWF的结合，并促进fVIII-vWF复合物分离(Jacquemin，M.G.等，1998，“凝血因子VIII灭活的机制和动力学：用衍生自A型血友病病人的IgG4单克隆抗体和抑制剂的研究”，Blood 92：496-506；Shima，M.，D.等，1993，“识别C2结构域的凝血因子VIII中和性单克隆抗体和人抑制剂等位抗体抑制凝血因子VIII与yon Willebrand因子和磷酯酰丝氨酸的结合”，Thromb.Haemost 69：240-246)。这些结果标示，Phe2200而不是Met2199，是两种抗体识别的表位的一个重要部分(图4和5)。然而，NMC VIII-5识别Leu2252，而B02C11不识别。Val2223和Lys2227都减少与两种抗体的抗原性。因此，B02C11和NMC VIII-5似乎识别重叠而不相同的表位。

从由于接触巴斯德法热消毒的fVIII产品，CPS-A，引起抑制剂“流行病”的A型血友病病人获得RvR抗体(Sawamoto，Y.等，“C2结构域限制先前不用抑制剂治疗的A型血友病病人的巴斯德法热消毒产品凝血因子VIII CPS-P产生的抑制性抗体的表位特异性”，Thromb.Haemostas，79：62-68)。在1990和1991，在荷兰和比利时，几个先前不用抑制剂治疗的病人在接触该产品后迅速产生了C2-特异性抗体。RvR抗体封闭VIII与PS和vWF的结合(Sawamoto，Y.等，见上，1998)。RvR表位定位于大多数C2抑制抗体识别的fVIII C2结构域的N末端，Glu2181-Val2243区(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIIIC2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701-3709)。该研究中的高分辨率作图表明RvR是一种典型的C2抑制抗体，主要识别Met2199/Phe2200和Leu2251/Leu2252环。因此，与CPS-A有关的免疫原性似乎是由于正常免疫优势表位的免疫识别，而非产生新表位。

方法的一般描述

美国专利5,364,771描述了发现具有凝血活性的杂交人/猪凝血因子VIII，其中人或猪的凝血因子VIII分子元件取代其它物种的凝血因子VIII的对应元件。美国专利5,663,0060描述了促凝血杂交人/动物和杂交等价的凝血因子VIII分子，其中一种物种的凝血因子VIII分子的元件取代其它物种的凝血因子VIII分子的对应元件。

由于目前的信息表示，B结构域没有抑制性表位，对凝血因子VIII功能没有已知作用，在一些实施例中，用任何本文所述的方法制备的活性杂交物或杂交等价凝血因子VIII分子或其片段中，B结构域完全或部分缺失(“B(-)凝血因子VIII”)。

如Toole，J.J.等(1984)Nature 312：342-347(GeneticsInstitute)；Gitschier，J.等(1984)Nature 312：326-330(GenenTech)；Wood，W.I.等(1984)Nature 312：330-337(Genentech)；Vehar，G.A.等(1984)Nature312：337-342(Genentech)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；美国专利号4,757,006，所报道分离人凝血因子VIII，并在哺乳动物细胞中表达，从cDNA推导氨基酸序列。美国专利号4,965,199，(Capon等)公开了用于在哺乳动物宿主细胞中产生凝血因子VIII并纯化人凝血因子VIII的重组DNA方法。已报道了在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞和BHKC(乳仓鼠肾细胞)中人凝血因子VIII的表达。修饰人凝血因子VIII除去部分或所有的B结构域(美国专利号4,868,112)，并尝试了用人凝血因子V的B结构域替代凝血因子VIII的B结构域(美国专利号5,004,803)。编码人凝血因子VIII的cDNA序列和预计的氨基酸序列分别显示于SEQID NO：1和2。在SEQ ID NO：1中，编码区始于核苷酸位置208，三联体GCC是SEQID NO：2给出的成熟蛋白质的氨基酸号1(Ala)的密码子。

从血浆中分离并纯化了猪凝血因子VIII[Fass，D.N.等(1982)Blood59：594]。与N-末端轻链序列部分对应的猪凝血因子VIII的部分氨基酸序列，和血浆铜蓝蛋白及凝血因子V具有同源性，由Church等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6934所述。TooleJ.J.等(1984)Nature312：342-347描述了猪凝血因子VIII的4个氨基酸片段的N-末端的部分测序，但关于它们在凝血因子VIII分子中的位置未作特征分析。猪凝血因子VIII的B结构域和部分A2结构域的氨基酸序列见Toole，J.J.等(1986)Proc.Natl.Acad Sci，USA 83：5939-5942报道。编码猪凝血因子VIII整个A2结构域的cDNA序列和预测的氨基酸序列，以及具有所有结构域、所有亚基、和特异性氨基酸序列被取代的杂交人/猪凝血因子VIII公开于1994年11月15日公告的美国专利号5,364,771(题为“杂交的人/猪凝血因子VIII”)和1993年10月14日出版的WO93/20093中。编码和成熟的人凝血因子VIII的残基373-740(如SEQ ID NO：1中所示)，相应猪凝血因子VIII A2结构域的cDNA序列，以及预测的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO：3和4中。最近，1994年5月26日出版的WO 94/11503中报道了猪凝血因子VIII缺乏开始的198个氨基酸的A1结构域部分和A2结构域的核苷酸和对应的氨基酸序列。Lollar等最后获得了整个编码猪凝血因子VIII，包括完整的A1结构域、活化肽、A3、C1和C2结构域的完整核苷酸序列以及编码的氨基酸序列，如1999年1月12日公开的美国专利5,859,204和1997年12月31日出版的WO 97/49725所公开的，两者在此引入以供参考。

从血浆中分离的猪和人凝血因子VIII都为二亚基蛋白质。该二亚基，即重链和轻链，通过非共价键结合，该键需要钙或其它二价金属离子。凝血因子VIII重链含有3个结构域，A1，A2，和B，它们共价连接。凝血因子VIII的轻链也含有3个结构域，命名为A3，C1，和C2。B结构域生物学功能不知道，故可通过蛋白水解或通过重组DNA技术方法从分子中除去，而不显著改变凝血因子VIII的任一可测定参数。人重组凝血因子VIII和血浆衍生的凝血因子VIII有相似的结构和功能，虽然除非在哺乳动物细胞中表达，否则不会糖基化。

人和猪的已活化凝血因子VIII(“凝血因子VIIIa”)由于重链在A1和A2结构域之间切开，具有3个亚基。这个结构被命名为A1/A2/A3-C1-C2。人凝血因子VIIIa在能稳定猪凝血因子VIIIa的条件下不稳定，可能是因为人凝血因子VIIIaA2亚基的较弱联合。人和猪凝血因子VIIIa的A2亚基的解离(丢失)和凝血因子VIIIa分子活性的丧失相关联。Yakhycev，A.等(1997)Blood 90：增刊1，摘要#126，报道了A2结构域与低密度脂蛋白受体相关的蛋白质结合，提示这种结合介导的细胞摄入A2起到下调凝血因子VIII活性的作用。

“无B结构域的凝血因子VIII”的表达通过加入B结构域增强。报道了加入这些称为“SQ”的B结构域部分报道导致理想的表达[Lind，P.等(1995)见上]。“SQ”构建物缺乏全部人B结构域，除了B结构域N-末端的5个氨基酸和B结构域C末端的9个氨基酸。

可通过标准试验，例如，无血浆凝血因子VIII试验，一级凝血试验，和采用纯化的重组人凝血因子VIII作为标准的酶联免疫吸附试验，测定已纯化和修饰的凝血因子VIII或其片段的免疫反应性和凝血活性。

根据熟练技术人员的偏爱和判断，可用其它载体包括质粒和真核病毒载体在真核细胞中表达重组基因构建物(见，例如，Sambrook等，16章)。可用其它载体和表达***，包括细菌，酵母菌，和昆虫细胞***，但因为糖基化的不同或缺少，不是优选的。

可在各种常用于培养和重组哺乳动物蛋白表达的细胞中表达重组杂交凝血因子VIII蛋白。特别是，已发现许多的啮齿类细胞系是表达大型蛋白的特别有用的宿主。优选的细胞系，可得自美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，包括乳仓鼠肾细胞，和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，它们可用常规程序和培养基培养。

猪凝血因子VIII更强的凝血活性的基础，看来是由于人凝血因子VIIIa的A2亚基比猪凝血因子VIIIa的猪A2亚基更快的自发解离。A2亚基的解离导致活性的丧失[Lollar，P.等(1990)生物化学杂志 265：1688-1692；Lollar，P.等(1992)生物化学杂志 267：23652-23657；Fay，P.J.等(1992)生物化学杂志 267：13246-13250]。

具有减弱的免疫反应性的凝血因子VIII：

根据已知的凝血因子VIII的结构-功能关系，已确定了与抑制凝血因子VIII凝血活性的抗体(“抑制剂”或“抑制性抗体”)具有免疫反应性的表位特征。推测抑制性抗体可能是通过破坏与凝血因子VIII结构域结构有关的大分子相互反应，或破坏它与von Willebrand因子，凝血酶，凝血因子Xa，凝血因子Ixa，或凝血因子X结合而产生效果。然而，大多数抗人凝血因子VIII抑制性抗体是通过与位于凝血因子VIII的40kDa A2结构域或20kDa C2结构域的表位结合而起作用，导致破坏和这些结构域有关的特异性功能，如Fulcher等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA 82：7728-7732；和Scandella等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 85：6152-6156所述。除了A2和C2表位，可能在凝血因子VIII轻链的A3或C1结构域中有第三个表位，参见Scandella等(1993)Blood82：1767-1775。该假定的第三表位的意义未知，但看来它在凝血因子VIII中占据了表位反应性的一个微小部分。

抗-A2抗体阻断了凝血因子X活化，如Lollar等(1994)L.Cli.Invest.93：2497-2504所示。Ware等(1992)Blood Coagul.Fibrinolysis 3：703-716描述了先前用缺失诱变进行的作图研究，将A2表位定位于40kDa A2结构域NH₂-末端20kDa区域内。竞争性免疫放射试验表明A2抑制性抗体识别一个共有表位或紧密成簇表位，如Scandella等(1992)Throm.Haemostas 67：665-671所述，以及如美国专利5,859,204中所显示的。

可在临床试验中，在人体中测试修饰的凝血因子VIII分子减弱的抗原性和/或免疫原性。在一类试验中，设计成测试凝血因子VIII是否与抑制抗体起免疫反应，对约25个具有凝血因子VIII缺陷，并具有抑制治疗性人凝血因子VIII的凝血活性的抗体的病人，施用凝血因子VIII，优选通过静脉灌注。动物或修饰的动物凝血因子VIII的剂量是5到50单位/公斤体重，优选10-50单位/公斤，最优选为40单位/公斤体重。在每次给药后约1个小时，在一步凝血试验中测定血样中凝血因子VIII的回收。在灌注约5小时后再次取样，测定回收。样品的总回收和凝血因子VIII的消失速率可以预测抗体滴度和抑制活性。如果抗体滴度高，凝血因子VIII的回收通常不能测定。将回收结果与用血浆衍生的人凝血因子VIII、重组人凝血因子VIII、血浆衍生的猪凝血因子VIII和其它常用的凝血因子VIII的治疗形式或凝血因子VIII替代品治疗的病人的回收结果比较。

在鉴定了临床上重要的表位后，可表达具有与血浆衍生的猪凝血因子VIII比较，当在体外测试时对于广泛调查抑制抗体血浆时，具有较低或相等的交叉反应性的重组凝血因子VIII。可以进行表位区域中的其它诱变，来减少交叉反应性。降低交叉反应性虽然理想，但不一定能产生可能比现有的血浆衍生的猪凝血因子浓缩物有利的产品，现有的猪凝血因子浓缩物可能产生副作用，由于污染了猪蛋白质或污染了感染因子，例如病毒或朊病毒。而重组的或修饰的猪凝血因子VIII分子将不含外源猪蛋白。

诊断试验

凝血因子VIII cDNA和/或由它表达的蛋白，可全部或部分作为诊断试剂用于检测抗人或动物凝血因子VIII的抑制性抗体，或检测基质(包括例如，凝血因子VIII缺陷的病人血清和体液样品)中抗修饰的动物凝血因子VIII的抑制性抗体。这些抗体试验包括例如ELISA试验，免疫印迹法，放射性免疫试验，免疫扩散试验，和凝血因子VIII生物活性试验(例如，用凝血试验)。制备这些试剂的技术和使用它们的方法为本领域熟练技术人员公知。例如，检测病人血清样品中抑制性抗体的免疫试验可包括使测试样品和足量的要测试的凝血因子VIII反应，要测试凝血因子VIII是抗原性的，可以与样品中的抑制抗体形成可检测的复合物。

核酸和氨基酸探针可根据修饰的凝血因子VIII cDNA或蛋白分子或其片段的序列来制备。在一些实施例中，这些探针可用商业可得的染料或酶，荧光，化学发光，或放射性标记物标记。氨基酸探针可用于，例如，筛选受到怀疑的血清或其它体液中存在的抗人，动物，或人/动物杂交凝血因子VIII的抑制抗体。可定量测定病人中的抑制抗体水平，和健康对照比较，并可用来，例如，确定凝血因子VIII缺陷的病人是否能用动物或修饰的动物凝血因子VIII治疗。cDNA探针可用于，例如，筛选DNA文库的研究目的。

重组凝血因子VIII的制备

可使用真核蛋白表达***制备重组凝血因子VIII。一般用含有缺陷的基因和要表达的重组DNA的载体，转化所需基因有缺陷的真核细胞系。可用电穿孔或病毒传递等技术实现转化。用于产生蛋白的细胞系应与感兴趣的蛋白质相容，能连续表达感兴趣的蛋白质，并且能在有利于感兴趣蛋白质纯化的培养基上生长，以及本领域技术人员已知的因素。这些技术的例子公开于欧洲专利申请0 302 968 A2和美国专利号5,149,637，都在此引入以供参考。

重组凝血因子VIII的检定

可在至少两类临床试验中，在人体中测试重组凝血因子VIII分子是否抗原性和/或免疫原性降低。在一类试验中，设计为测试重组的或重组的杂交凝血因子VIII是否与抑制抗体具有免疫反应性，对有凝血因子VIII缺陷，并有抗凝血因子VIII抗体(其抑制了治疗性人或猪凝血因子VIII的凝血活性)的25个病人施用凝血因子VIII，优选通过静脉灌注。重组或重组的杂交凝血因子VIII的剂量是5到50单位/公斤体重，优选10-50单位/公斤，最优选为40单位/公斤体重。在每次给药后约1个小时，在一步凝血试验中测定血样中凝血因子VIII的回收。在灌注约5小时后再次取样，测定回收。样品的总回收和凝血因子VIII的消失速率可以预测抗体滴度和抑制活性。如果抗体滴度高，凝血因子VIII的回收通常不能测定。将回收结果与用血浆衍生的人凝血因子VIII、重组人凝血因子VIII、血浆衍生的猪凝血因子VIII和其它常用的凝血因子的治疗形式或凝血因子替代品治疗的病人的回收结果比较。

在第二类临床试验中，如上一段所述，对约100个先前未治疗的、没有产生凝血因子VIII抗体的血友病病人施用重组或重组杂交凝血因子VIII，设计用于测定重组或重组杂交凝血因子VIII是否具有免疫原性，即病人是否会产生抑制性抗体。每2周进行一次治疗，共进行6个月到1年。在该时间段的1-3月间隔，采血并进行Bethsda试验或其它抗体试验，以确定抑制性抗体的存在。在每次灌注以后，如上所述也可进行回收试验。将结果与接受血浆衍生的人凝血因子VIII、重组人凝血因子VIII、猪凝血因子VIII或其它常用的凝血因子VIII的治疗形式或凝血因子VIII取代物的血友病患者比较。

药物组合物

含有重组或重组杂交凝血因子VIII的药物组合物，单用或和合适的医药学上稳定的化合物，传递载体，以及/或运输载体合用，参照已知方法，如Reminton’s药物科学，(E.W.Martin著)所述制备。

在一优选例中，用于静脉注射的优选运输或传递载体是生理盐水或磷酸盐缓冲液。

在另一优选例中，合适的稳定化合物，传递载体，和运输载体，包括但不限于其它人或动物蛋白质例如清蛋白。

磷脂载体和脂质体悬液也优选为药物学上可接受的运输或传递载体。这些载体可按照本领域技术人员已知的方法制备，而且可以含有例如磷脂酰丝氨酸/-磷脂酰胆碱或其它磷脂或去污剂组合物，因为凝血因子VIII和带负电的磷脂膜结合，它们一起向表面传递负电荷。脂质体可通过将合适的脂质，(例如硬脂酸磷脂酰乙醇胺，硬脂酸磷脂酰胆碱，花生酸磷脂酰胆碱，和胆固醇)溶于无机溶剂，然后蒸发，在容器表面留下一薄层干燥脂来制备。然后在容器中加入杂交凝血因子VIII的水溶液。用手旋摇容器，以从容器壁上释放脂材料，分散脂聚集物，从而形成脂质体悬液。

重组或重组杂交凝血因子VIII可和其它合适的稳定化合物，传递载体，以及/或运输载体合用，包括维他命K依赖性凝结因子，组织凝血因子，和vonWillebrand因子(vWF)或vWF的片段(其含有凝血因子VIII结合位点)，以及多糖例如蔗糖。

重组或重组杂交凝血因子VIII可用基因治疗法传递，可用人凝血因子VIII传递的相同方法，使用的传递工具有例如逆转录病毒载体。该方法包括将凝血因子VIII cDNA掺入人细胞，细胞被直接移植入凝血因子VIII缺陷病人，或置于可植入装置中(可让凝血因子VIII渗透通过，但细胞不能通过)，然后移植。优选方法是逆转录病毒介导的基因转移。在该方法中，一外源基因(例如凝血因子VIIIcDNA)被克隆入修饰的逆转录病毒的基因组中。该基因用病毒机制***宿主细胞的基因组中，在其中通过细胞表达。逆转录病毒载体经过修饰，因而不会产生病毒，防止了宿主受病毒感染。该类型治疗的一般原理为本领域技术人员公知，在文献中已有综述[例如，Kohn，D.B.等(1989)Transfusion 29：812-820]。

重组或重组杂交凝血因子VIII可与vWf结合储藏，以增加该杂交分子的半衰期和储藏寿命。另外，冻干凝血因子VIII可改进存在vWF时活性分子的产量。可采用商品供应商储***和动物凝血因子VIII的现有方法来储藏杂交凝血因子VIII。这些方法包括：(1)以部分纯化状态冻干凝血因子VIII(作为凝血因子VIII“浓缩液”，无须进一步纯化注射)；(2)用Zimmerman方法免疫亲和纯化凝血因子VIII并在存在稳定凝血因子VIII的清蛋白时冻干；(3)在存在清蛋白时冻干重组凝血因子VIII。

另外，杂交凝血因子VIII于4℃时在0.6M Nacl，20mM MES，和5mMCaCl₂，pH6.0中无限稳定，而且可冰冻储藏于这些缓冲液中，融化时活性损失最小。

治疗方法

重组或重组杂交凝血因子VIII可用于治疗有或无抑制性抗体的血友病病人，以及由于产生抑制性抗体而患获得性凝血因子VIII缺陷的病人由于凝血因子VIII缺陷引起的失控性出血(例如，关节内，颅内，或胃肠出血)。这些活性材料优选静脉内施用。

另外，重组或重组杂交凝血因子VIII可通过移植基因工程改造的细胞来产生杂交物或通过植入含这种细胞的装置(如上所述)施用。

在一优选例中，重组或重组杂交凝血因子VIII的药物学组合物单独或和稳定剂，传递载体，以及/或运载体合用，静脉注射入病人体内，按照注射人或动物凝血因子VIII所用的相同程序。

必须给予需要治疗的病人的重组或重组杂交凝血因子VIII组合物的治疗剂量视凝血因子VIII缺陷的严重程度而变化。通常，剂量水平在频率，持续时间，以及单位上，与每个病人出血症状的严重程度和持续时间保持一致。因此，杂交凝血因子VIII包含于药物学上可接受的载体，传递载体，或稳定剂中，以足够量传递给病人，如标准凝血试验测定的那样，给予治疗有效量的杂交物停止了出血。

凝血因子VIII在经典上定义为存在于正常血浆中的能纠正患血友病A个体的血浆中凝血缺陷的物质。纯化或部分纯化形式的凝血因子VIII体外凝血活性是用于计算给病人注射的凝血因子VIII剂量，和病人血浆恢复了活性和纠正了内出血缺陷的可靠指标。在新凝血因子VIII分子体外标准试验和它们在狗注射模型中或在病人中的表现之间尚没有报道过差异，这是按照Lusher，J.M.等328 NewEngl.J.Med. 328：453-459；Pittman，D.D.等(1992)Blood 79：389-397；以及Brinkhous等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. 82：8752-8755的报道。

通常，通过施用重组或重组杂交凝血因子VIII使病人达到的理想血浆凝血因子VIII水平在正常的30-100％范围内。在施用重组或重组杂交凝血因子VIII的优选模式中，组合物静脉给药的优选剂量范围5到50单位/公斤体重，更优选范围10-50单位/公斤体重，最优选剂量为20-40单位/公斤体重；间隔频率范围是8到24小时(患严重血友病病人)；治疗持续天数是从1到10天，或直到出血症状被解决。见，例如，Roberts，H.R.，和M.R.Jones，″血友病和相关病症-凝血酶原(凝血因子II，凝血因子V，和凝血因子VII到XII)的先天缺陷，″Ch.153，1453-1474，1460，于 hematology Williams，W.J.，等编。(1990)。具有抑制抗体的病人可能需要更多的重组或重组杂交凝血因子VIII，或因为它比人凝血因子VIII更高的比活性或减弱的抗体反应性或免疫原性，病人可能需要较少的重组或重组杂交凝血因子VIII。如在用人或血浆衍生的猪凝血因子VIII治疗中，重组或重组杂交凝血因子VIII量用一级凝血因子VIII凝血试验来确定，而且在所选定实例中，体外恢复情况可通过测定注射后病人血浆中的凝血因子VIII来确定。可以理解，对于任一特定的个体，具体的剂量方案应按照个体需要和施用或监控组合物者的职业医师的判断，根据时间而调整，而且本文上述的浓度范围仅是举例说明，并不限制权利要求所述的组合物的范围或实施。

治疗可按需要采用一次静脉施用组合物，或定期或一段时间持续施用。另外，重组或重组杂交凝血因子VIII可用脂质体在不同的时间间隔以一剂或数剂皮下或口腔内施用。

重组或重组杂交凝血因子VIII也可用来治疗产生抗人凝血因子VIII抗体的血友病病人因凝血因子VIII缺陷而引起的失控性出血。在这种情况下，不需要比单独用人或动物凝血因子VIII更高的凝血活性。假如活性不被病人血浆中的抗体中和，凝血活性比人凝血因子VIII差的(亦即小于3,000单位/毫克)将会有用。

重组或重组杂交凝血因子VIII分子和其分离，定性，制备，和使用的方法总的如上所述，参考下列非限制性实施例将会更好被理解。

实施例

材料-柠檬酸化的A型血友病血浆和合并的正常人血浆(FACT)购自GeorgeKing Biomedical，Inc.(Overland Park，KS)。肝素-Sepharose购自Sigma ChemicalCo.(St.Louis，MO)。胎牛血清、遗传霉素、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基和AIM-V培养基购自Life Technologies Inc.(Gaithersburg，MD)。Pfu DNA聚合酶和质粒pBlueScript II KS-购自Stratagene(La Jolla，CA)。小鼠抗人fVIII单克隆抗体ESH4和ESH8购自American Diagnostica(Greenwich，CT)。小鼠fVIIIC2特异性抑制性单克隆抗体NMC VIII-5获自Dr.Midori Shima，Nara MedicalCollege，Japan。人fVIII C2-特异性IgG4κ单克隆抗体，BO2C11是血友病患者转化的B细胞系克隆得到的，如前所述制备(Jacquemin，M.G.等，1998，“凝血因子VIII灭活的机制和动力学：用衍生自A型血友病病人的IgG4单克隆抗体和抑制剂的研究”，Blood 92：496-506)。来自5个抑制性病人的柠檬酸化人血浆AA、AJ、HR、LK和RvR获自Dr.Dorothea Scandella。它们不经进一步纯化(HR、RvR和AJ)或作为IgG制备物(LK和AA)使用。抑制剂IgG如上所述制备(Scandella，D.L.等，1992，“含有A2结构域的可溶性重组凝血因子VIII片段与一些免疫印迹不能检测的人抗凝血因子VIII抗体结合”，Thromb.Haemastas.67：665-671)。HR、LK、AA和RvR抗体中的抑制剂用抗体中和实验(Prescott，R.等，1997，“抑制性抗体应答在A型血友病病人中，比具有fVIII自身抗体的大多数非血友病病人中更复杂”，Blood 89：3663-3671)判断对C2结构域的特异性。用一组重组杂交人/猪fVIII分子鉴定AJ是C2特异性的(Barrow，R.T.等，2000，“用多取代杂交人/猪凝血因子VIII分子使凝血因子VIII的抗原性降低为复杂的免疫血浆”，Blood 95：557-561)。无清蛋白的重组全长fVIII来自Hyland-Immuno Division ofBaxtor Healthcare(Deerfield，IL)。合成的寡核苷酸购自Life TechnologiesInc.(Gaithersburg，MD)。限制性酶购自New England Biolabs(Beverly，MA)或Promega(madison，WI)。衍生自幼仓鼠肾细胞的细胞系获自Dr.R.T.A.Macgillivray(Funk，W.D.等，1990，“在培养的细胞中人血清转铁蛋白的氨基末端半个分子的表达和重组蛋白特征确定”，Biochemistry 29：1654-1660)。如前所述(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701-3709)制备含有在终止密码子3’两个碱基处的NotI位点和氨苄青霉素和遗传霉素抗性基因的无B结构域fVIII表达载体，称为HB-/ReNeo。HSQ/ReNeo，一种含有14个氨基酸区段，SerPheSerGlnAsnProProValLeuLysArgHisGlnArg，取代人fVIII中的B结构域的人无B结构域的fVIII分子(Lind，P.等，1995，“B结构域缺失的重组凝血因子VIII分子的新形式。构建和生物化学特征确定”，Eur.J.Biochem.232：19-27)是通过用HB-/ReNeo作为模板，基本如前对于相应的猪分子所述(Healey，J.F.等，1998，“残基Glu2181-Val2243含有人凝血因子VIII C2结构域中抑制表位的主要决定簇”，Blood 92：3701-3709)，重叠剪切延伸(SOE)诱变(Horton，R.M.等，1993，“重叠延伸的基因剪切”，Methods Enzymol.217：270-279)构建的。如前所述制备了HP20，一个含有人A1、A2、ap-A3和C1结构域和猪C2结构域的无B结构域的杂交人/猪fVIII分子(Healey，J.F.见上，1998)。

用Qiagen质粒Max试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)纯化质粒DNA。用PfuDNA聚合酶，使用杂交OmniGene热循环仪进行PCR反应。凝胶纯化PCR产物，用乙醇沉淀，并用T4-DNA连接酶(快速DNA连接试剂盒，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)连接入质粒DNA。用含有***物的质粒转化大肠杆菌EpicureanXL1-Blue细胞。用Applied Biosystems(Foster City，CA)373a自动化DNA测序仪和PRISM染料终止子试剂盒通过双脱氧测序确定PCR产生的新颖fVIII DNA序列。

实施例1：fVIII突变体cDNA的构建

通过SOE诱变，在HSQ密码子中制造突变，产生下列蛋白质：Met2199Ile(人到猪)，ATG到ATC；Phe2200Leu(人到犬)，TTT到TTG；Val2223Ala(人到犬)，GTG到GCC；Lys2227Glu(人到猪)，AAA到GAG；Leu2252Phe(人到小鼠)，CTT到TTC；Met2199Ile/Phe2200Leu，ATG到ATC和TTT到TTG；Val2223Ala/Lys2227Glu，GTG到GCC和AAA到GAG；Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu，ATG到ATC，TTT到TTT，GTG到GCC，和AAA到GAG。

HSQ/ReNeo在PCR反应中用作模板。第一次PCR反应使用人C1引物，SEQ IDNO：3，5’-GTG GAT TCA TCT GGG ATA AAA CAC-3′，称作H3763+，对应于HSQ序列中的核苷酸3763-3786，作为有义引物。下列引物作为反义引物：Met2199Ile，SEQ ID NO：4，5′-AGG AGA CCA GGT GGC AAA GAT ATT GGT AAA GTA GGATGA-3′，Phe2200Leu，SEQ ID NO：5，5′-TGA AGG AGA CCA GGT GGC CAA CATATT GGT AAA GTA GGA-3′，Val2223Ala，SEQ ID NO：6，5′-CCA CTC TTT TGGATT ATT GGC CTG AGG TCT CCA GGC ATT-3′，Lys2227Glu，SEQ ID NO：7，5′-GTC CAC TTG CAG CCA CTC CTC TGG ATT ATT CAC CTG AGG-3′，Leu2252Phe，SEQ ID NO：8，5′-CTT CAC ATA CAT GCT GGT GAA CAG AGA TTTTAC TCC CTG-3′，Met2199Ile/Phe2200Leu，SEQ ID NO：9，5′-AGG AGA CCA GGTGGC CAA GAT ATT GGT AAA GTA GGA TGA-3′，和Val2223Ala/Lys2227Glu，SEQ ID NO：10，5′-CAC TTG CAG CCA CTC CTC TGG ATT ATT GGC CTG AGGTCT CCA GGC-3′。

第二次PCR反应用ReNeo引物，SEQ ID NO：11，5′-AGT TTT TCT ACA ACAGAG GAA GTG-3′，称作RE1110-，它在C2结构域的3′，作为反义引物。下列引物用作有义引物：Met2199Ile，SEQ ID NO：12，5′-TCA TCC TAC TTT ACC AATATC TTT GCC ACC TGG TCT CCT-3′，Phe2200Leu，SEQ ID NO：13，5′-TCC TACTTT ACC AAT ATG TTG GCC ACC TGG TCT CCT TCA-3′，Val2223Ala，SEQ IDNO：14，5′-AAT GCC TGG AGA CCT CAG GCC AAT AAT CCA AAA GAG TGG-3′，Lys2227Glu，SEQ ID NO：15，5′-CCT CAG GTG AAT AAT CCA GAG GAG TGGCTG CAA GTG GAC-3′，Leu2252Phe，SEQ ID NO：16，5′-CAG GGA GTA AAA TCTCTG TTC ACC AGC ATG TAT GTG AAG-3′，Met2199Ile/Phe2200Leu，SEQ IDNO：17，5′-TCA TCC TAC TTT ACC AAT ATC TTG GCC ACC TGG TCT CCT-31.和Val2223Ala/Lys2227Glu，SEQ ID NO：18，5′-GCC TGG AGA CCT CAG GCC AATAAT CCA GAG GAG TGG CTG CAA GTG-3′。

SOE反应用PCR反应获得的片段作为模板，H3763+和RE1110作为引物。用SwaI和Not I产生SOE产物和HSQ/ReNeo连接片段。

如下构建了Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu cDNA。将Met2199Ile/Phe2200Leu移入pBluescript II KS-中，用Bsu 36I消化。Val2223Ala/Lys2227Glu也用Bsu 36I消化，连接合适的片段。将得到的Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu cDNA通过用SwaI和NotI消化引入ReNeo。

实施例2：重组fVIII分子的表达

将转染的细胞系维持在含有10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagles培养基F12中。胎牛血清在使用前56℃热灭活1小时。ReNeo中的突变cDNA稳定转染入BHK细胞，筛选遗传霉素抗性，换到无血清、AIM-V培养基中用于表达，用肝素-琼脂糖层析，如前所述(Healey，J.F.等，见上，1998)部分纯化。

实施例3：FVIII和fvIII抑制抗体试验

用一阶段凝血试验(Bowie，E.J.W.和C.A.Owen，1984，“出血疾病的临床和实验室诊断”，Disorders of Hemostasis，O.D.Ratnoff和C.D.Forbes编，Grune& Stratton，Inc.Orlando，FL43-72)测定重组fVIII蛋白质的活性。一单位fVIII定义为1毫升正常柠檬酸化的人血浆中的活性。通过改良Bethesda试验(Kasper，C.K.等，1975，“凝血因子VIII抑制抗体的更均一测量”，Thromb.Diath.Haemorrh.34：869-872)如下测定FVIII抑制抗体滴度。重组fVIII以每毫升最终浓度0.8-1.2加到A型血友病血浆中，和不同浓度的抑制抗体37℃保温2小时。为了确定定义Bethsda单位的50％抑制点，制备抑制抗体的稀释物，产生跨越至少35-65％范围的剩余活性。在一些情况下，进行重复稀释，其中使用平均数。进行平均10次稀释，以确定各Bethesda滴度。剩余活性百分数对抑制抗体稀释度倒数的对数值的半对数图似乎在所有情况下都是线性的。用Marquardt算法(SigmaPlot 5.0，SPSS，Inc.)通过非线性递归拟合数据，根据等式：

％剩余活性＝m(logx-logx₅₀)+50

其中拟合参数x₅₀是产生50％抑制的稀释度倒数，拟合参数m是半对数线的斜率，独立变量x是抑制剂样品的稀释度倒数。62个Bethesda试验的估计的标准误差(回归线数据点的平均偏差)是10.0±4.0(平均±1SD)，表明该试验固有的精确度较低。

Bethesda滴度等于x₅₀ ^-1。通过将Bethsda滴度与x₅₀变化的系数相乘，计算Bethsda滴度的标准偏差(SD)的估计值。用Student的t试验比较fVIII突变物和HB-的Bethesda滴度。用ESH4作为捕获抗体，生物素化ESH8作为检测抗体，如前所述(Lubin，I.M.等，1994“凝血因子VIII中主要抑制剂表位的消除”，J.Biol.Chem.269：8639-8641)通过夹层ELISA确定部分纯化的制备物中分VIII的质量浓度。用全长的重组fVIII作为标准，对于fVIII的全长和无B结构域形式之间质量差异矫正值。偏差的平均系数是9.0％。用ELISA所确定的浓度除凝血活性计算fVIII分子的比活力。获得了下列值(单位/毫克)：HB-，7800；Met2199Ile，12800；Phe2200Leu，10200；Val2223Ala，19600；Lys2227Glu，36，200；Leu2252Phe，10100；Met2199Ile/Phe2200Leu，10000；Val2223Ala/Lys2227Glu，33200；Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu，14200。一些突变体的表观比活力高于HB-。这可能是由于突变体与HB-比较，结合捕获或检测抗体的能力减少的相对少一些，导致fVIII质量的低估和比活力高估。

表1 FVIII C2突变体与人FVIII相比对C2特异性抑制性抗体的抗原性

		抗原性^a
		抗原性^a		突变体	较低	相等	较高
Met2199Ile	4/7	0/7	3/7	突变体	较低	相等	较高
Met2199Ile	4/7	0/7	3/7	Phe2200Leu	4/7	2/7	1/7
Val2223Ala	0/7	2/7	5/7	Phe2200Leu	4/7	2/7	1/7
Val2223Ala	0/7	2/7	5/7	Lys2227Glu	2/7	1/7	4/7
Leu2252Phe	4/7	3/7	0/7	Lys2227Glu	2/7	1/7	4/7
Leu2252Phe	4/7	3/7	0/7	Met2199Ile/Phe2200Leu	6/7	1/7	0/7
Val2223Ala/Lys2227Glu	4/7	1/7	2/7	Met2199Ile/Phe2200Leu	6/7	1/7	0/7
Val2223Ala/Lys2227Glu	4/7	1/7	2/7	Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu	7/7	0/7	0/7
HP20	7/7	0/7	0/7	Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu	7/7	0/7	0/7

^a99％置信水平时有显著差异。

序列表<110>埃默里大学(Emory University)<120>修饰的凝血因子VIII<130>75-00 WO<140>PCT/US01/29431<141>2001-09-19<150>US 60/234,047<151>2000-09-19<150>US 60/236,460<151>2000-09-29<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9009<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(208)..(7203)<400>1cagtgggtaa gttccttaaa tgctctgcaa agaaattggg acttttcatt aaatcagaaa 60ttttactttt ttcccctcct gggagctaaa gatattttag agaagaatta accttttgct 120tctccagttg aacatttgta gcaataagtc atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt 180ctgtgccttt tgcgattctg ctttagt gcc acc aga aga tac tac ctg ggt gca 234

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala

1 5gtg gaa ctg tca tgg gac tat atg caa agt gat ctc ggt gag ctg cct 282Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro10 15 20 25gtg gac gca aga ttt cct cct aga gtg cca aaa tct ttt cca ttc aac 330Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn

30 35 40acc tca gtc gtg tac aaa aag act ctg ttt gta gaa ttc acg gtt cac 378Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His

45 50 55ctt ttc aac atc gct aag cca agg cca ccc tgg atg ggt ctg cta ggt 426Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly

60 65 70cct acc atc cag gct gag gtt tat gat aca gtg gtc att aca ctt aag 474Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys

75 80 85aac atg gct tcc cat cct gtc agt ctt cat gct gtt ggt gta tcc tac 522Asn Met Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr90 95 100 105tgg aaa gct tct gag gga gct gaa tat gat gat cag acc agt caa agg 570Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg

110 115 120gag aaa gaa gat gat aaa gtc ttc cct ggt gga agc cat aca tat gtc 618Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val

125 130 135tgg cag gtc ctg aaa gag aat ggt cca atg gcc tct gac cca ctg tgc 666Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys

140 145 150ctt acc tac tca tat ctt tct cat gtg gac ctg gta aaa gac ttg aat 714Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn

155 160 165tca ggc ctc att gga gcc cta cta gta tgt aga gaa ggg agt ctg gcc 762Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala170 175 180 185aag gaa aag aca cag acc ttg cac aaa ttt ata cta ctt ttt gct gta 810Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val

190 195 200ttt gat gaa ggg aaa agt tgg cac tca gaa aca aag aac tcc ttg atg 858Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met

205 210 215cag gat agg gat gct gca tct gct cgg gcc tgg cct aaa atg cac aca 906Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr

220 225 230gtc aat ggt tat gta aac agg tct ctg cca ggt ctg att gga tgc cac 954Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His

235 240 245agg aaa tca gtc tat tgg cat gtg att gga atg ggc acc act cct gaa 1002Arg Lys Ser Val Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu250 255 260 265gtg cac tca ata ttc ctc gaa ggt cac aca ttt ctt gtg agg aac cat 1050Val His Ser Ile Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His

270 275 280cgc cag gcg tcc ttg gaa atc tcg cca ata act ttc ctt act gct caa 1098Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln

285 290 295aca ctc ttg atg gac ctt gga cag ttt cta ctg ttt tgt cat atc tct 1146Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser

300 305 310tcc cac caa cat gat ggc atg gaa gct tat gtc aaa gta gac agc tgt 1194Ser His Gln His Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys

315 320 325cca gag gaa ccc caa cta cga atg aaa aat aat gaa gaa gcg gaa gac 1242Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp330 335 340 345tat gat gat gat ctt act gat tct gaa atg gat gtg gtc agg ttt gat 1290Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp

350 355 360gat gac aac tct cct tcc ttt atc caa att cgc tca gtt gcc aag aag 1338Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys

365 370 375cat cct aaa act tgg gta cat tac att gct gct gaa gag gag gac tgg 1386His Pro Lys Thr Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp

380 385 390gac tat gct ccc tta gtc ctc gcc ccc gat gac aga agt tat aaa agt 1434Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser

395 400 405caa tat ttg aac aat ggc cct cag cgg att ggt agg aag tac aaa aaa 1482Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys410 415 420 425gtc cga ttt atg gca tac aca gat gaa acc ttt aag act cgt gaa gct 1530Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala

430 435 440att cag cat gaa tca gga atc ttg gga cct tta ctt tat ggg gaa gtt 1578Ile Gln His Glu Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val

445 450 455gga gac aca ctg ttg att ata ttt aag aat caa gca agc aga cca tat 1626Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr

460 465 470aac atc tac cct cac gga atc act gat gtc cgt cct ttg tat tca agg 1674Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg

475 480 485aga tta cca aaa ggt gta aaa cat ttg aag gat ttt cca att ctg cca 1722Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro490 495 500 505gga gaa ata ttc aaa tat aaa tgg aca gtg act gta gaa gat ggg cca 1770Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro

510 515 520act aaa tca gat cct cgg tgc ctg acc cgc tat tac tct agt ttc gtt 1818Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val

525 530 535aat atg gag aga gat cta gct tca gga ctc att ggc cct ctc ctc atc 1866Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile

540 545 550tgc tac aaa gaa tct gta gat caa aga gga aac cag ata atg tca gac 1914Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp

555 560 565aag agg aat gtc atc ctg ttt tct gta ttt gat gag aac cga agc tgg 1962Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp570 575 580 585tac ctc aca gag aat ata caa cgc ttt ctc ccc aat cca gct gga gtg 2010Tyr Leu Thr Glu ASn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val

590 595 600cag ctt gag gat cca gag ttc caa gcc tcc aac atc atg cac agc atc 2058Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile

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620 625 630gtg gca tac tgg tac att cta agc att gga gca cag act gac ttc ctt 2154Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu

635 640 645tct gtc ttc ttc tct gga tat acc ttc aaa cac aaa atg gtc tat gaa 2202Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu650 655 660 665gac aca ctc acc cta ttc cca ttc tca gga gaa act gtc ttc atg tcg 2250Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser

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685 690 695cgg aac aga ggc atg acc gcc tta ctg aag gtt tct agt tgt gac aag 2346Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys

700 705 710aac act ggt gat tat tac gag gac agt tat gaa gat att tca gca tac 2394Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr

715 720 725ttg ctg agt aaa aac aat gcc att gaa cca aga agc ttc tcc cag aat 2442Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn730 735 740 745tca aga cac cct agc act agg caa aag caa ttt aat gcc acc aca att 2490Ser Arg His Pro Ser Thr Arg Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile

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765 770 775cct atg cct aaa ata caa aat gtc tcc tct agt gat ttg ttg atg ctc 2586Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu

780 785 790ttg cga cag agt cct act cca cat ggg cta tcc tta tct gat ctc caa 2634Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln

795 800 805gaa gcc aaa tat gag act ttt tct gat gat cca tca cct gga gca ata 2682Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile810 815 820 825gac agt aat aac agc ctg tct gaa atg aca cac ttc agg cca cag ctc 2730Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu

830 835 840cat cac agt ggg gac atg gta ttt acc cct gag tca ggc ctc caa tta 2778His His Ser Gly Asp Met Val Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu

845 850 855aga tta aat gag aaa ctg ggg aca act gca gca aca gag ttg aag aaa 2826Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys

860 865 870ctt gat ttc aaa gtt tct agt aca tca aat aat ctg att tca aca att 2874Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile875 880 885cca tca gac aat ttg gca gca ggt act gat aat aca agt tcc tta gga 2922Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly890 895 900 905ccc cca agt atg cca gtt cat tat gat agt caa tta gat acc act cta 2970Pro Pro Ser Met Pro Val His Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu

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925 930 935ttg agt gaa gaa aat aat gat tca aag ttg tta gaa tca ggt tta atg 3066Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met

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1005 1010 1015cca tca tta tta att gag aat agt cca tca gtc tgg caa aat ata tta 3306Pro Ser Leu Leu Ile Glu Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu

1020 1025 1030gaa agt gac act gag ttt aaa aaa gtg aca cct ttg att cat gac aga 3354Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg

1035 1040 1045atg ctt atg gac aaa aat gct aca gct ttg agg cta aat cat atg tca 3402Met Leu Met Asp Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser1050 1055 1060 1065aat aaa act act tca tca aaa aac atg gaa atg gtc caa cag aaa aaa 3450Asn Lys Thr Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys

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1085 1090 1095aag atg cta ttc ttg cca gaa tca gca agg tgg ata caa agg act cat 3546Lys Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His

1100 1105 1110gga aag aac tct ctg aac tct ggg caa ggc ccc agt cca aag caa tta 3594Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln Leu

1115 1120 1125gta tcc tta gga cca gaa aaa tct gtg gaa ggt cag aat ttc ttg tct 3642Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe Leu Ser1130 1135 1140 1145gag aaa aac aaa gtg gta gta gga aag ggt gaa ttt aca aag gac gta 3690Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr Lys Asp Val

1150 1155 1160gga ctc aaa gag atg gtt ttt cca agc agc aga aac cta ttt ctt act 3738Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn Leu Phe Leu Thr

1165 1170 1175aac ttg gat aat tta cat gaa aat aat aca cac aat caa gaa aaa aaa 3786Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys

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1230 1235 1240ggg gca tat gct cca gta ctt caa gat ttt agg tca tta aat gat tca 3978Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser

1245 1250 1255aca aat aga aca aag aaa cac aca gct cat ttc tca aaa aaa ggg gag 4026Thr Asn Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu

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1275 1280 1285aaa tat gca tgc acc aca agg ata tct cct aat aca agc cag cag aat 4122Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn1290 1295 1300 1305ttt gtc acg caa cgt agt aag aga gct ttg aaa caa ttc aga ctc cca 4170Phe Val Thr Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro

1310 1315 1320cta gaa gaa aca gaa ctt gaa aaa agg ata att gtg gat gac acc tca 4218Leu Glu Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser

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1390 1395 1400ata tat ctg acc agg gtc cta ttc caa gac aac tct tct cat ctt cca 4458Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser Ser His Leu Pro

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1435 1440 1445ttg gag atg act ggt gat caa aga gag gtt ggc tcc ctg ggg aca agt 4602Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser1450 1455 1460 1465gcc aca aat tca gtc aca tac aag aaa gtt gag aac act gtt ctc ccg 4650Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro

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1500 1505 1510tct cct ggc cat ctg gat ctc gtg gaa ggg agc ctt ctt cag gga aca 4794Ser Pro Gly His Leu Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr

1515 1520 1525gag gga gcg att aag tgg aat gaa gca aac aga cct gga aaa gtt ccc 4842Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro1530 1535 1540 1545ttt ctg aga gta gca aca gaa agc tct gca aag act ccc tcc aag cta 4890Phe Leu Arg Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu

1550 1555 1560ttg gat cct ctt gct tgg gat aac cac tat ggt act cag ata cca aaa 4938Leu Asp Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys

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1675 1680 1685agc ttt caa aag aaa aca cga cac tat ttt att gct gca gtg gag agg 5322Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg1690 1695 1700 1705ctc tgg gat tat ggg atg agt agc tcc cca cat gtt cta aga aac agg 5370Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg

1710 1715 1720gct cag agt ggc agt gtc cct cag ttc aag aaa gtt gtt ttc cag gaa 5418Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu

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1740 1745 1750gaa cat ttg gga ctc ctg ggg cca tat ata aga gca gaa gtt gaa gat 5514Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp

1755 1760 1765aat atc atg gta act ttc aga aat cag gcc tct cgt ccc tat tcc ttc 5562Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe1770 1775 1780 1785tat tct agc ctt att tct tat gag gaa gat cag agg caa gga gca gaa 5610Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu

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1835 1840 1845ggc ctg att gga ccc ctt ctg gtc tgc cac act aac aca ctg aac cct 5802Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro1850 1855 1860 1865gct cat ggg aga caa gtg aca gta cag gaa ttt gct ctg ttt ttc acc 5850Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr

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1995 2000 2005atg agc aca ctt ttt ctg gtg tac agc aat aag tgt cag act ccc ctg 6282Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu2010 2015 2020 2025gga atg gct tct gga cac att aga gat ttt cag att aca gct tca gga 6330Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly

2030 2035 2040caa tat gga cag tgg gcc cca aag ctg gcc aga ctt cat tat tcc gga 6378Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly

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2075 2080 2085cgt cag aag ttc tcc agc ctc tac atc tct cag ttt atc atc atg tat 6522Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr2090 2095 2100 2105agt ctt gat ggg aag aag tgg cag act tat cga gga aat tcc act gga 6570Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly

2110 2115 2120acc tta atg gtc ttc ttt ggc aat gtg gat tca tct ggg ata aaa cac 6618Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His

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2155 2160 2165gat tta aat agt tgc agc atg cca ttg gga atg gag agt aaa gca ata 6762Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile2170 2175 2180 2185tca gat gca cag att act gct tca tcc tac ttt acc aat atg ttt gcc 6810Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala

2190 2195 2200acc tgg tct cct tca aaa gct cga ctt cac ctc caa ggg agg agt aat 6858Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn

2205 2210 2215gcc tgg aga cct cag gtg aat aat cca aaa gag tgg ctg caa gtg gac 6906Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp

2220 2225 2230ttc cag aag aca atg aaa gtc aca gga gta act act cag gga gta aaa 6954Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys

2235 2240 2245tct ctg ctt acc agc atg tat gtg aag gag ttc ctc atc tcc agc agt 7002Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Set Set Ser2250 2255 2260 2265caa gat ggc cat cag tgg act ctc ttt ttt cag aat ggc aaa gta aag 7050Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys

2270 2275 2280gtt ttt cag gga aat caa gac tcc ttc aca cct gtg gtg aac tct cta 7098Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu

2285 2290 2295gac cca ccg tta ctg act cgc tac ctt cga att cac ccc cag agt tgg 7146Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp

2300 2305 2310gtg cac cag att gcc ctg agg atg gag gtt ctg ggc tgc gag gca cag 7194Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln

2315 2320 2325gac ctc tac tgagggtggc cactgcagca cctgccactg ccgtcacctc 7243Asp Leu Tyr2330tccctcctca gctccagggc agtgtccctc cctggcttgc cttctacctt tgtgctaaat 7303cctagcagac actgccttga agcctcctga attaactatc atcagtcctg catttctttg 7363gtggggggcc aggagggtgc atccaattta acttaactct tacctatttt ctgcagctgc 7423tcccagatta ctccttcctt ccaatataac taggcaaaaa gaagtgagga gaaacctgca 7483tgaaagcatt cttccctgaa aagttaggcc tctcagagtc accacttcct ctgttgtaga 7543aaaactatgt gatgaaactt tgaaaaagat atttatgatg ttaacatttc aggttaagcc 7603tcatacgttt aaaataaaac tctcagttgt ttattatcct gatcaagcat ggaacaaagc 7663atgtttcagg atcagatcaa tacaatcttg gagtcaaaag gcaaatcatt tggacaatct 7723gcaaaatgga gagaatacaa taactactac agtaaagtct gtttctgctt ccttacacat 7783agatataatt atgttattta gtcattatga ggggcacatt cttatctcca aaactagcat 7843tcttaaactg agaattatag atggggttca agaatcccta agtcccctga aattatataa 7903ggcattctgt ataaatgcaa atgtgcattt ttctgacgag tgtccataga tataaagcca 7963ttggtcttaa ttctgaccaa taaaaaaata agtcaggagg atgcaattgt tgaaagcttt 8023gaaataaaat aacatgtctt cttgaaattt gtgatggcca agaaagaaaa tgatgatgac 8083attaggcttc taaaggacat acatttaata tttctgtgga aatatgagga aaatccatgg 8143ttatctgaga taggagatac aaactttgta attctaataa tgcactcagt ttactctctc 8203cctctactaa tttcctgctg aaaataacac aacaaaaatg taacagggga aattatatac 8263cgtgactgaa aactagagtc ctacttacat agttgaaata tcaaggaggt cagaagaaaa 8323ttggactggt gaaaacagaa aaaacactcc agtctgccat atcaccacac aataggatcc 8383cccttcttgc cctccacccc cataagattg tgaagggttt actgctcctt ccatctgcct 8443gcaccccttc actatgacta cacagaactc tcctgatagt aaagggggct ggaggcaagg 8503ataagttata gagcagttgg aggaagcatc caaagactgc aacccagggc aaatggaaaa 8563caggagatcc taatatgaaa gaaaaatgga tcccaatctg agaaaaggca aaagaatggc 8623tacttttttc tatgctggag tattttctaa taatcctgct tgacccttat ctgacctctt 8683tggaaactat aacatagctg tcacagtata gtcacaatcc acaaatgatg caggtgcaaa 8743tggtttatag ccctgtgaag ttcttaaagt ttagaggcta acttacagaa atgaataagt 8803tgttttgttt tatagcccgg tagaggagtt aaccccaaag gtgatatggt tttatttcct 8863gttatgttta acttgataat cttattttgg cattcttttc ccattgacta tatacatctc 8923tatttctcaa atgttcatgg aactagctct tttattttcc tgctggtttc ttcagtaatg 8983agttaaataa aacattgaca cataca 9009<210>2<211>2332<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr1 5 10 15Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

20 25 30Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

35 40 45Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

50 55 60Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val65 70 75 80Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser145 150 155 160His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg225 230 235 240Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met305 310 315 320Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

325 330 335Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

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355 360 365Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

370 375 380Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu385 390 395 400Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

405 410 415Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr

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435 440 445Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile

450 455 460Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile465 470 475 480Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

485 490 495His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys

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515 520 525Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

530 535 540Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp545 550 555 560Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe

565 570 575Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln

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835 840 845Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly

850 855 860Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser865 870 875 880Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala

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930 935 940Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp945 950 955 960Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys

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1010 1015 1020Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu Phe Lys1025 1030 1035 1040Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp Lys Asn Ala

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1170 1175 1180Asn Asn Thr His Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys1185 1190 1195 1200Lys Glu Thr Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr

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1250 1255 1260Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu Gly Leu1265 1270 1275 1280Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr Arg

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1315 1320 1325Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr Gln Trp Ser Lys Asn Met

1330 1335 1340Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys1345 1350 1355 1360Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg

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1380 1385 1390Val Ser Ser Phe Pro Ser Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu

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1410 1415 1420Asp Ser Gly Val Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys1425 1430 1435 1440Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln

1445 1450 1455Arg Glu Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr

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1490 1495 1500Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu Asp Leu1505 1510 1515 1520Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile Lys Trp Asn

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1555 1560 1565Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu Glu Trp Lys Ser Gln Glu

1570 1575 1580Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser1585 1590 1595 1600Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly

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1650 1655 1660Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr1665 1670 1675 1680Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg

1685 1690 1695His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser

1700 1705 1710Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro

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1730 1735 1740Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly1745 1750 1755 1760Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg

1765 1770 1775Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr

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1795 1800 1805Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His Met Ala

1810 1815 1820Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp1825 1830 1835 1840Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu

1845 1850 1855Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr

1860 1865 1870Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser

1875 1880 1885Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn

1890 1895 1900Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala1905 1910 1915 1920Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln

1925 1930 1935Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn

1940 1945 1950Ile His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys

1955 1960 1965Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu

1970 1975 1980Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys1985 1990 1995 2000Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val

2005 2010 2015Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile

2020 2025 2030Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

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2050 2055 2060Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile2065 2070 2075 2080Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu

2085 2090 2095Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp

2100 2105 2110Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly

2115 2120 2125Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile

2130 2135 2140Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser2145 2150 2155 2160Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met

2165 2170 2175Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala

2180 2185 2190Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala

2195 2200 2205Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn

2210 2215 2220Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val2225 2230 2235 2240Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr

2245 2250 2255Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr

2260 2265 2270Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

2275 2280 2285Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg

2290 2295 2300Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg2305 2310 2315 2320Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

2325 2330<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>3gtggattcat ctgggataaa acac 24<210>4<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>4aggagaccag gtggcaaaga tattggtaaa gtaggatga 39<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>5tgaaggagac caggtggcca acatattggt aaagtagga 39<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>6ccactctttt ggattattgg cctgaggtct ccaggcatt 39<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>7gtccacttgc agccactcct ctggattatt cacctgagg 39<210>8<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>8cttcacatac atgctggtga acagagattt tactccctg 39<210>9<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>9aggagaccag gtggccaaga tattggtaaa gtaggatga 39<210>10<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>10cacttgcagc cactcctctg gattattggc ctgaggtctc caggc 45<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>11agtttttcta caacagagga a 21<210>12<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>12tcatcctact ttaccaatat ctttgccacc tggtctcct 39<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>13tcctacttta ccaatatgtt ggccacctgg tctccttca 39<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>14aatgcctgga gacctcaggc caataatcca aaagagtgg 39<210>15<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>15cctcaggtga ataatccaga ggagtggctg caagtggac 39<210>16<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>16cagggagtaa aatctctgtt caccagcatg tatgtgaag 39<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>17tcatcctact ttaccaatat cttggccacc tggtctcct 39<210>18<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>18gcctggagac ctcaggccaa taatccagag gagtggctgc aagtg 45

Claims

1.一种修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII在选自2199、2200、2223、2227和2252的一个或多个位置上含有氨基酸取代。

2.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII缺乏B结构域。

3.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代甲硫氨酸2199的异亮氨酸。

4.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代苯丙氨酸2200的亮氨酸。

5.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代亮氨酸2252的苯丙氨酸。

6.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代甲硫氨酸2199的异亮氨酸和取代苯丙氨酸2200的亮氨酸。

7.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代缬氨酸2223的丙氨酸和取代赖氨酸2227的谷氨酰胺。

8.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有取代甲硫氨酸2199的异亮氨酸、取代苯丙氨酸2200的亮氨酸、取代缬氨酸2223的丙氨酸和取代赖氨酸2227的谷氨酰胺。

9.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与相应的人蛋白相比，抗原性下降。

10.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与相应的人蛋白相比，免疫原性下降。

11.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与相应的人蛋白相比，免疫原性下降，抗原性下降。

12.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII具有大于约2,000单位/毫克的比活力。

13.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII具有大于约3,000单位/毫克的比活力。

14.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII具有大于约5,000单位/毫克的比活力。

15.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII具有大于约10,000单位/毫克的比活力。

16.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII是单突变体。

17.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII是双突变体。

18.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII是三突变体。

19.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII是四突变体。

20.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与人凝血因子VIII相比，对至少一种C2特异性抑制性抗体的抗原性下降。

21.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与人凝血因子VIII或全长重组凝血因子VIII相比，对单克隆抗体B02011的Bethesda滴度上升或下降。

22.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与人凝血因子VIII或全长重组凝血因子VIII相比，对单克隆抗体NMC VIII-S的Bethesda滴度上升或下降。

23.如权利要求1所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与人凝血因子VIII或重组人凝血因子VIII相比，对至少一种抑制性抗体制备物的Bethesda滴度上升或下降。

24.一种修饰的凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII含有用非人凝血因子VIII氨基酸取代对应的人凝血因子VIII氨基酸的至少一个氨基酸取代。

25.如权利要求24所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，至少一个非人凝血因子VIII氨基酸取代是非人哺乳动物的氨基酸。

26.如权利要求25所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，所述非人哺乳动物是猪、犬和/或小鼠。

27.如权利要求25所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与衍生出它的凝血因子VIII分子或其它凝血因子VIII制备物相比，具有凝血活性和改良的抗原性。

28.如权利要求25所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，所述氨基酸取代不是丙氨酸。

29.如权利要求25所述的修饰的人凝血因子VIII，其特征在于，该凝血因子VIII与衍生出它的凝血因子VIII分子或其它凝血因子VIII制备物相比，免疫原性下降。

30.一种修饰凝血因子VIII，从而使其与抑制性抗体的反应性减少，而保留促凝血活性的方法，其特征在于，该方法包括用减少免疫反应性的氨基酸取代2199、2200、2223、2227和2252位至少一个位点的天然存在的氨基酸。

31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2199位。

32.如权利要求30所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2200位。

33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2223位。

34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2227位。

35.如权利要求30所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2252位。

36.如权利要求30所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是单突变体。

37.如权利要求30所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是双突变体。

38.如权利要求30所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是三突变体。

39.如权利要求30所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是四突变体。

40.一种修饰凝血因子VIII，从而使其抗原性下降，而保留促凝血活性的方法，其特征在于，该方法包括用减少免疫反应性的氨基酸取代2199、2200、2223、2227和2252位至少一个位点的天然存在的氨基酸。

41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2199位。

42.如权利要求40所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2200位。

43.如权利要求40所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2223位。

44.如权利要求40所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2227位。

45.如权利要求40所述的方法，其特征在于，至少一个取代的氨基酸在2252位。

46.如权利要求40所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是单突变体。

47.如权利要求40所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是双突变体。

48.如权利要求40所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是三突变体。

49.如权利要求40所述的方法，其特征在于，该修饰的凝血因子VIII是四突变体。