KR20030033074A

KR20030033074A - 변형된 인자 ⅷ

Info

Publication number: KR20030033074A
Application number: KR10-2003-7003993A
Authority: KR
Inventors: 존 에스. 롤라
Original assignee: 에모리 유니버시티
Priority date: 2000-09-19
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2003-04-26
Also published as: CA2422902A1; CN1474830A; PL366199A1; KR100638184B1; WO2002024723A9; EP1319016A4; AU2001292861A1; JP2004525608A; EP1319016A1; HUP0301179A2; MXPA03002256A; HUP0301179A3; WO2002024723A1; RU2003107100A; US6770744B2; US20020182670A1; PL206105B1; CN1205221C

Abstract

인간 인자 Ⅷ이 특이 아미노산 좌들(loci)은 인자 Ⅷ로 치료된 후 혈우병 환자들의 억제 항체들과 상호 작용한다. 변형된 인자 Ⅷ은 아미노산 서열이 하나 이상의 특이 좌에서 치환에 의해 변경되는 곳에서 드러난다. 변형된 인자 Ⅷ은 억제 항체들의 작용을 회피하거나 방해하므로 혈우병 환자들에게 유용하다

Description

변형된 인자 Ⅷ{MODIFIED FACTOR Ⅷ}

응혈(blood clotting)은 혈소판이 손상(lesion) 부위에서 손상된 혈관의 잘린 벽(cut wall)에 부착할 때 시작한다. 다음에, 효소에 의해 조절된 반응의 일련의 과정(cascade)에 있어서, 가용성 피브리노겐(fibrinogen) 분자들은 효소 트롬빈(thrombin)에 의하여 혈소판을 혈전에 뭉쳐 놓는 피브린(fibrin)의 가용성 스트랜드(strands)로 변화된다. 일련의 과정의 각 단계에서, 단백질 전구체는 연속하여 다음 단백질 전구체를 분할하는 프로테아제(protease)로 변화된다. 공동인자들(co-factors)이 대부분의 단계에서 요구된다.

인자 Ⅷ은 혈액에서 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)에 단단히 그리고 비공유결합으로 결합된 비활성 전구체로서 순환한다. 인자 Ⅷ은 그것을 폰 빌레브란트 인자로부터 분리하고 일련의 과정에서 그것의 전구응고(procoagulant) 기능을 활성화시키는 트롬빈 또는 응혈 인자 Xa에 의하여 단백질 가수분해로 활성화된다. 그것의 활성형(active form)에 있어서, 단백질 인자 Ⅷa는 인자 Ⅹ 활성화를 위한 인자 Ⅸa의 촉매 효율을 몇몇 크기정도 만큼 증가시키는 공동인자(cofactor)이다.

인자 Ⅷ이 부족하거나 인자 Ⅷ에 대한 항체가 있고 인자 Ⅷ로 치료받지 않은 사람은 관절에서의 염증 반응부터 조기 사망에 이르는 심각한 증상을 일으킬 수 있는 억제되지 않는 내부 출혈을 겪는다. 미국에서 약 10,000명에 달하는 심한 혈우병 환자들은 충분한 회수와 농도로 투여된다면 혈액의 정상 응혈 능력을 회복시킬 수 있는, 인간 인자 Ⅷ의 주입으로 치료될 수 있다. 인자 Ⅷ의 일반적인 정의는 혈우병 A가 있는 개인들로부터 나온 혈장에서 응혈 결함을 고치는 정상 혈장에 있는 물질이다.

인자 Ⅷ의 활성을 억제하는 항체들("억제자" 또는 "억제 항체")의 발생은 혈우병 환자의 관리에 있어서 심각한 합병증이다. 자기항체들(autoantibody)는 인자 Ⅷ의 치료상 주입에 반응하여 혈우병 A 환자의 약 20%에서 발생한다. 억제자를 발생시키는 혈우병 A가 있는, 이전에 치료받지 않은 환자에게 있어서, 억제자는 치료의 1년 내에 보통 발생한다. 또한, 인자 Ⅷ을 불활성화시키는 자기항체는 이전에 정상 인자 Ⅷ 수준인 개인들에서 종종 발생한다. 인자 Ⅷ(fⅧ)에 대한 억제 항체들(억제자)은 fⅧ 주입 후에 혈우병 A 환자에서 동종항체(alloantibody)로서 또는 비혈우병환자에서 자기항체로서 발생한다(Hoyer, L.W. 및 D. Scandella, 1994, "인자 Ⅷ 억제자: 자기항체 및 혈우병 A 환자에 있어서 구조 및 기능",Semin.Hematol.31:1-5). A1-A2-B-ap-A3-C1-C2 fⅧ 분자 내 A2,ap-A3 및 C2 도메인(domain)에서 에피토프(epitope)에 대한 항체들은 대부분의 억제자 혈장에 있어서 모든 항응고 활성을 초래한다(Prescott, R. 등, 1997, "억제 항체 반응은 fⅧ 자기항체를 가진 비혈우병 환자에서 보다 혈우병 A 환자에서 더 복잡하다",Blood89:3663-3671; Barrow, R.T. 등, 2000, "다수-치환된 하이브리드 인간/돼지 인자 Ⅷ 분자들을 사용하는 복합 억제 혈장에 대한 인자 Ⅷ의 항원성의 감소",Blood95:5570-561). 단일 사슬(single chain) 인간 fⅧ에서 레지듀(residue) Ser2173 - Tyr2332로서 규정된 18-kDa C2 도메인은 fⅧ의 정상 전구응고 기능을 위하여 필요한 인지질 막-결합 자리(site)를 포함한다. 인간 C2-특이 항-fⅧ 항체는 이 상호 작용을 억제한다(Arai, M. 등, 1989, "인간 항체에 의한 인자-Ⅷ 억제의 분자 기초- 인자-Ⅷ 가벼운 사슬(light chain)에 결합하는 항체는 인지질로서 인자-Ⅷ의 상호작용을 막는다",J. Clin. Invest. 83:1978-1984). 이것과 일관되게, 인지질은 fⅧ를 fⅧ 억제자에 의한 불활성화로부터 보호한다(Arai 등, supra; Barrowcliffe, T.W. 등, 1983, "인지질에 결합하는 것은 인자 Ⅷ을 인간 항체에 의한 불활성화로부터 보호한다",J. Lab. Clin Med. 101:34-43). C2 도메인은 폰 빌레브란트 인자(vWf) 결합 자리의 부분을 또한 포함한다(Saenko, E.L. 등, 1994, "폰 빌레브란트 인자에 결합하는 인자의 C2 도메인에 대한 역할",J. Biol, Chem.269:11601-11605; Saenko, E.L. 및 Scandella, D., 1997, "인자 Ⅷ 가벼운 사슬의 산성 영역(acidic region) 및 C2 도메인은 폰 빌레브란트 인자에 대한 고 친화력 결합 자리를 함께 형성한다",J. Biol. Chem. 272:18007-18014). 일부 억제자는 이 상호작용을 방해함으로써 작용할 수 있다(Shima, M. 등, 1995, "폰 빌레브란트 인자에 결합하는 인자 Ⅷ에 대한 인간 항-C2 도메인 억제자 동종항체들의 공통 억제 효과",Br. J. Haematol. 91:714-721; Saenko, E.L. 등, 1996, "단클론 및 인간 항체에 의하여 폰 빌레브란트 인자로부터 트롬빈-분할된 인자 Ⅷ의 늦춰진 방출은 인자 Ⅷ 억제에 대한 새로운 메카니즘이다",J. Biol. Chem. 271:27424-27431; Gilles, J.G. 등, 1999, "일부 인자 Ⅷ(FⅧ) 억제자들는 FⅧ-vWf 복합체 상에만 존재하는 FⅧ 에피토프를 인식한다",Thromb. Haemost. 82:40-45).

억제자 역가(titer)가 충분히 낮을 경우, 인자 Ⅷ의 투약을 증가시킴으로써 환자들은 관리될 수 있다. 그러나, 종종 억제자 역가가 높아서 인자 Ⅷ으로 제압될 수 없다. 다른 전략은 인자 Ⅸ 복합체 제제(예컨대, KONYNE^R, Proplex^R) 또는 재조합 인간 인자 Ⅷa를 사용하여 정상 지혈 동안 인자 Ⅷ의 필요성을 우회하는 것이다. 또한, 돼지 인자 Ⅷ은 보통 인간 인자 Ⅷ보다 억제자와의 반응성 실질상 낮기 때문에, 부분적으로 정제된 돼지 인자 Ⅷ 제제(HYATE:C^R)이 사용된다. 인간 항체 Ⅷ에 대한 억제 항체가 발생된 많은 환자들은 돼지 인자 Ⅷ로 성공적으로 치료를 받아 왔고 장기간동안 그러한 치료를 계속 허용해 왔다. 그러나, 돼지 인자 Ⅷ의 투약은 1회 이상의 주입 후 돼지 인자 Ⅷ에 대하여 억제자가 발생할 수 있기 때문에 완전한 해결책이 아니다.

다양한 순도의 인간 혈장-유래(derived) 인자 Ⅷ의 일부 제제들은 혈우병 A의 치료를 위해 상업적으로 이용 가능하다. 이들은 바이러스에 대하여 열 및 세정제 처리되지만 상당한 수준의 항원 단백질; 낮은 수준의 항원 불순물 및 바이러스 오염물질을 가진 단클론 항체-정제된 인자 Ⅷ; 그리고 임상시험 중인 재조합 인간 인자 Ⅷ를 포함하는 많은 제공자들의 공동(pooled) 혈액으로부터 유래된, 부분적으로-정제된 인자 Ⅷ을 포함한다. 유감스럽게도, 인간 인자 Ⅷ은 생리적 농도 및 pH에서 불안정하고, 극히 낮은 농도로 혈액에 존재하며, 낮은 비(比)응혈 활성을 갖는다.

혈우병 환자는 출혈 및 그로 인한 변형 혈우병성 관절증을 예방하기 위해 인자 Ⅷ을 매일 교체할 필요가 있다. 그러나, 공급이 불충분해 왔고, 분리와 정제, 면역성, 그리고 AIDS 및 간염 감염성 위험의 제거 필요성에 있어서 어려움으로 인해 치료적 사용에 있어서 문제가 발생한다. 재조합 인간 인자 Ⅷ 또는 부분적으로 정제된 돼지 인자 Ⅷ의 사용이 모든 문제를 해결하지 못할 것이다.

일반적으로 사용되는, 상업적으로 이용 가능한, 혈장-유래 인자 Ⅷ과 관련된 문제는 더 좋은 인자 Ⅷ 생성물의 개발에 상당한 관심을 불러일으켰다. 더 많은 단위의 응혈 활성도가 선택된 pH 및 생리적 농도에서 안정한 인자 Ⅷ 분자; 억제 항체 생성시키는 경향이 적은 인자 Ⅷ 분자; 그리고 인간 인자 Ⅷ에 대한 항체가 이미 생성된 환자에서 면역 검출을 면한 인자 Ⅷ 분자; 당 전달될 수 있도록 보다 유력한 인자 Ⅷ 분자가 필요하다.

Lollar의 미국 특허 제6,180,371호는 결과로서 생성되는 인자 Ⅷ 분자들의 항원성을 변경하는 인간 인자 Ⅷ의 A2 도메인에서 아미노산 치환들을 설명한다. 상기 '371 특허는 야생형 인자 Ⅷ 또는 상응하는 재조합 인자 Ⅷ과 비교해서 항원성 또는 면역성을 감소시키는 C2 도메인에서 특이 아미노산 치환들을 개시하거나 시사하지 않는다.

Lollar의 미국 특허 제5,859,204호는 인간 인자 Ⅷ의 484-509 영역에서 아미노산의 자리 특이성 교체(site specific replacement)를 개시한다. 보다 상세하게, 상기 '204 특허는 인간 단백질과 관련된 위치 485, 487, 488, 489, 492, 495, 501 또는 508에서 아미노산 치환이 있는 변형된 인자 Ⅷ를 교사한다. 상기 '204 특허는 야생형 인자 Ⅷ 또는 상응하는 재조합 인자 Ⅷ과 비교해서 항원성 또는 면역성을 감소시키는 C2 도메인에서 특이 아미노산 치환들을 개시하거나 시사하지 않는다.

Lollar 등의 미국 특허 제5,888,974호는 인간 및 다른 비인간 인자 Ⅷ 서브유닛(subunit) 또는 도메인의 분리 및 재조합에 의하여 생성된 하이브리드 전구응고 인자 Ⅷ을 개시한다.

Lollar 등의 미국 특허 제5,744,446호는 A2 도메인에서 아미노산 치환들을 가진 하이브리드 인자 Ⅷ을 설명한다.

Lollar 등의 미국 특허 제5,663,060호는 비인간 및 인간 무거운 및 가벼운 사슬 서브유닛들의 조합으로 구성된 하이브리드 인자 Ⅷ을 설명한다. 미국 특허 제5,583,209호는 상기 '060 특허에 있어서 하이브리드 인자 Ⅷ 분자들을 인코드하는(incoding) 핵산을 설명한다.

미국 특허 제5,364,771호는 무거운 및 가벼운 서브유닛들의 인간 및 돼지 조합들로 구성된 정제된 하이브리드 인자 Ⅷ을 설명한다. 돼지 A2 도메인이 인간 A2 도메인과 바뀐 인간 인자 Ⅷ이 또한 개시된다.

미국 특허 제6,180,371호; 제5,888,974호; 제5,859,204호; 제5,744,446호; 제5,663,060호; 제5,583,209호; 그리고 제5,364,771호(모두 여기서 참조로서 통합된다)는 치환들을 개시하거나 야생형 인자 Ⅷ 또는 상응하는 재조합 인자 Ⅷ과 비교해서 항원성 또는 면역성을 감소시키는 C2 도메인에서 특이 아미노산 치환들을 시사하지 않는다. 세계 여기저기 실험실에서 수년간의 철저한 연구에도 불구하고, 여기서 상세히 설명된 인자 Ⅷ의 C2 도메인에 관한 발명은 다른 곳에서는 개시되거나 시사되지 않은 듯하다.

Pratt 등(1999, "1.5Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 구조",Nature402:439-442)은 1.5Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 결정 구조를 보고하였다. Pratt 등은 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 돌연변이가 출혈 장애로 이르는 이유를 상기 구조가 부분적으로 설명한다고 보고하였다. 사실, C2 도메인에서 21 레지듀들은 혈우병 A 환자에 있어서 유해한 점 돌연변이 자리로 보고되었다. 예컨대, V2223은 점 돌연변이가 발생하고 출혈 장애와 관련된 위치로 알려진다. 따라서, 당해 기술분야에 있어서 통상 기술 중 하나도 V2223이 치료적 활성을 위해 변형된 인자 Ⅷ를 제공하기 위한 치환에 적당한 후보임을 예상하지 못했을 것이다. 실제로, Shima 등은 C2 결합 항체 억제자들이 인지질 및 폰 빌레브란트 인자 결합에 관하여 인자 Ⅷ을 방해한다고 보고한다. 따라서, C2 억제자들, 즉, 혈우병 A를 가진 개인들에서 일부 출혈 장애와 관련된 것들은 C2 도메인이 인지질 및 폰 빌레브란트 인자에 결합하는 것을 방해한다고 Pratt 등에 의해 교사된다. M2199, F2200, L2251, L2252, V2223, 및 R2220이 단백질-인지질 경계에서 나타난다는 그들의 결정과 결합된 이 결론은 이들 레지듀의 돌연변이가 출혈 장애에 있어서 관련된 증가와 함께 변경된 인지질 및/또는 폰 빌레브란트 결합에 이르는 것을 시사한다. 아미노산 레지듀들 및 상응하는 치환들이 개선된 인자 Ⅷ 분자들로 이른다는 것은 이들 연구에서 분명하지 않다.

예상외로, 인자 Ⅷ의 C2 도메인에 대하여 최근 이용 가능한 x-레이 구조에서 확인된 3 소수성 피트(hydrophobic feet)에서 돌연변이들이 억제 항체에 결합을 감소시키고, 특성을 개선하고, 및/또는 면역성을 감소시킨다는 것이 인스턴트(instant) 발명의 발명자에 의해 발견되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 인자 Ⅷ이 부족하거나 인자 Ⅷ에 대한 억제자를 가지고 있는 환자에 있어서 혈우병을 고치는 인자 Ⅷ을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈우병 환자의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 선택된 pH 및 생리적 농도에서 안정한 인자 Ⅷ을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간 인자 Ⅷ보다 큰 응고 활성도를 가진 인자 Ⅷ을 제공하는 것이다.

관련된 출원들에 대한 상호참조

본 출원은 2000. 9.29.에 제출된 U.S. 가출원 60/236,460 및 2000. 9.19.에 제출된 60/234,047에 대하여 35 U.S.C. §119(e) 하 우선권을 주장하고, 양 출원들은 여기에 개시된 것과 모순되지 않는 정도까지 참조로서 통합된다.

연방 연구 지지(Federal Research Support)의 승인

본 발명은 적어도 일부분 계약 No. FO1-HL46215 하 미국국립보건연구원으로부터 자금 제공받아 만들어졌다. 따라서, U.S. 정부는 본 발명에 있어서 약간의 권리를 가질 수 있다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 변형된 포유류 인자 Ⅷ에 관한 것으로서, 상기 인자 Ⅷ은 그것이 유도되었던 단백질 또는 인간 인자 Ⅷ 같은 다른 인자 Ⅷ 제제들(preparations)과 비교해서 면역성(immunogenicity) 및/또는 항원성(antigenicity)을 감소시키는 아미노산 치환들을 가진다.

도1. 인지질 결합에 포함된 추정(putative) fⅧ 레지듀. 인간(Vehar, G.A. 등,supra, 1984; Toole, J.J. 등, 1984, "인간 항혈우병 인자를 인코드하는 cDNA의 분자 클로닝(cloning)",Nature312:342-347), 돼지(Healey, J.F. 등, 1996, "cDNA 및 돼지 인자 Ⅷ의 유래된 아미노산 서열",Blood88:4209-4214), 뮤린(murine)(Elder, B. 등, 뮤린 인자 Ⅷ cDNA의 서열",Genomics16:374-379) 및 개(Cameron, C. 등,"개 인자 Ⅷ cDNA 및 5' 인접 서열(flanking sequence)",Thromb.Haemostas. 79:317-322) fⅧ의 C2 도메인의 정렬(aligned) 서열이 도시된다. 인간 fⅧ(Pratt, K.P. 등, 1999, "1.5Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 구조",Nature402:439-442)에 있어서 제시된 인지질-결합 레지듀들 및 상동 레지듀들은 밑줄 쳐지고 볼드체로 나타난다.

도2. 인간 fⅧ C2 도메인에서 돌연변이된 자리. A. 인지질 막 결합에 포함되도록 제시된 소수성 레지듀와 4개의 추정 양-하전(positively-charged) 결합 레지듀(Pratt, K.P. 등, 1999, "1.5Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 구조",Nature402:439-442) 중 하나인 Lys2227을 나타내는 리본그림. Met2199, Phe2200, Val2223, Lys2227, 및 Leu2252 들은 이 연구에서 돌연변이 되었다. 인간, 돼지, 뮤린, 및 개 fⅧ에서 보존되는 Leu2251은 돌연변이 되지 않았다. B. 마치 막에서 보는 것처럼, 회전된 공간 채움 모형(space filling model).

도3. 환자 다클론성 항-fⅧ 항체들의 베데스다 역가(Bethesda titers). 재조합 fⅧ는 혈우병 A 혈장에 희석되었고 항체 AA, AJ, HR, LK, 및 RvR의 베데스다 역가는 "물질 및 방법"에 설명된 바와 같이 측정되었다. 비선형 최소제곱 회귀분석으로 측정된 평균 및 표준 편차가 나타난다. C2 D1은 Met2199Ile/Phe2200Leu 2중 돌연변이체다. C2 D2는 Val2223Ala/Lys2227Glu 2중 돌연변이체다. C2 Q는 Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu 4중 돌연변이체다. HP20은 인간 Al, A2,ap-A3, 및 C1 도메인과 돼지 C2 도메인을 포함하는, B-도메인 없는 하이브리드 인간/돼지 fⅧ 분자다. 돌연변이체들과 HB- 사이의 차이에 대한 신뢰수준은 99.9% 수준에서 "**" 그리고 99% 수준에서 "*"으로 표시된다. NS, 중요하지 않음.

도4. 환자 단클론(monoclonal) 항체 BO2C11의 베데스다 역가. 약자 및 표시법은 도3 범례에 설명된 것과 같다.

도5. 뮤린 단클론 항체 NMC Ⅷ-5의 베데스다 역가. 약자 및 표시법은 도3 범례에 설명된 것과 같다.

본 발명은 대체로 재조합 포유류 인자 Ⅷ을 포함하는 조성물들(compositions)에 관한 것이다. 본 발명의 조성물들은 응고 활성이 있는, 분리되고 정제된 재조합 포유류 인자 Ⅷ 분자들을 포함하고, 여기서 재조합 인자 Ⅷ은 그것들이 유도되는 단백질 및/또는 다른 인자 Ⅷ 제제들과 비교해서 항원성을 감소시키는 C2 도메인에서 아미노산 치환들을 가진다. 인자 Ⅷ를 포함하는 신규 조성물을 생산하는 방법뿐만 아니라 본 발명의 신규 조성물을 인코드하는 DNA 서열들(sequences)이 또한 제공된다. 인자 Ⅷ로 치료를 요하는 환자를 치료하는 방법 또한 본 발명의 범위 내에 있다.

본 발명의 제1 실시예는 C2 도메인에서 아미노산 치환이 있는 재조합 포유류 인자 Ⅷ을 포함하는 신규 조성물을 제공한다. 변형된 재조합 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 아미노산 치환(들)은 그것들이 유도되는 단백질들 또는 다른 이용 가능한 인자 Ⅷ 제제들과 비교해서 억제 항체의 응고 활성도를 감소시킨다. 이 실시예의 신규 조성물은 응고 활성 및 억제 항체에 감소된 결합을 가진다. fⅧ이 인지질 막 및/또는 억제 항체에 결합하는데 관여하는 레지듀에서 치환들은 바람직하다. 인간 인자 Ⅷ와 일치하는 위치에서 바람직한 치환들은 Met2199, Phe2200, Val2223, Leu2251, 그리고 Leu2252를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이 실시예의 신규 조성물들은 단일 돌연변이체(mutant), 2중 돌연변이체, 3중 돌연변이체, 또는 4중 돌연변이체일 수 있다. 본 발명의 아미노산 치환들의 예는 Met2199Ile, Phe2200Leu, Leu2252Phe, Met2199Ile/Phe2200Leu, Val2223Ala/Lys2227Glu, Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이들 모두는 인간 인자 Ⅷ 번호지정 시스템에 관련되고 여기서 아미노산 번호 1은 성숙 인자 Ⅷ의 아미노 말단 알라닌이다. 재조합 돼지 또는 인간 인자 Ⅷ에 있어서 치환들은 바람직하다.

본 발명의 제2 실시예는 C2 도메인에서 아미노산 치환(들)이 있는 재조합 인자 Ⅷ를 포함하는 신규 하이브리드 인자 Ⅷ 조성물들을 제공한다. 이 실시예의 신규 조성물들은 C2 도메인에서 아미노산 치환들이 있는 하이브리드 인자 Ⅷ을 조제하여 구성된다. 인자 Ⅷ의 다른 도메인들은 인간, 생쥐(mouse), 돼지, 쥐(rat), 그리고 개(canine) 등과 같은 다양한 포유동물에서 유래될 수 있다. 이 실시예의 신규 조성물은 응고 활성도 및 억제 항체에 감소된 결합을 가진다. 이 실시예의 신규 조성물을 제공하기 위해 돌연변이 될 수 있는 아미노산 위치의 예는 Met2199, Phe2200, Val2223, Leu2251, 그리고 Leu2252를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 이들 모두는 인간 인자 Ⅷ에 관련된다. 이 실시예에 포함되는 C2 도메인에서 아미노산 치환들의 예는 Met2199Ile, Phe2200Leu, Leu2252Phe, Met2199Ile/Phe2200Leu, Val2223Ala/Lys2227Glu, Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이들 모두는 인간 인자 Ⅷ에 관련된다.

본 발명의 다른 실시예는 본 발명의 신규 조성물에 대한 코딩(coding) 서열을 포함하는 DNA 서열을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시예는 본 발명의 신규 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 인자 Ⅷ 분자들의 면역성을 감소시키기 위한 방법과 상기 방법에 의하여 생산된 감소된 면역성을 가진 재조합 인자 Ⅷ를 또한 제공한다. 특히, 변형된 재조합 인자 Ⅷ 분자와 C2 도메인에서 치환들이 있는 감소된 면역성을 가진 그러한 분자들을 만드는 방법들이 설명된다.

제약 조성물들 그리고 재조합 인자 Ⅷ 및 그것의 하이브리드 이형(version)을 투여하는 것을 포함하는 인자 Ⅷ 결핍 환자를 치료하기 위한 방법이 또한 제공된다.

본 발명은 대체로 재조합 포유류 인자 Ⅷ를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 응고 활성이 있는, 분리되고 정제된 재조합 포유류 인자 Ⅷ 분자들을 포함한다. 최근 이용 가능한 x-레이 구조에서 확인된 3 소수성 피트에서, 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 돌연변이들은 그것들이 유도되는 단백질 또는 다른 인자 Ⅷ 제제들과 비교해서 돌연변이체들의 억제 항체의 결합을 감소시킨다는 것이 의외로 발견되었다. 따라서, 본 발명의 신규 조성물들은 그것들이 유도되는 단백질과 비교해서 항원성을 감소시키는 C2 도메인에서 아미노산 치환들이 있는 재조합 인자 Ⅷ를 포함한다. 또한, 본 발명은 다른 이용 가능한 인자 Ⅷ 제제들과 비교해서 항원성을 감소시키는 C2 도메인에서 아미노산 치환들이 있는 재조합 인자 Ⅷ를 제공한다. 본 발명의 관련 실시예들은 인자 Ⅷ 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법, 본 발명의 신규 재조합 인자 Ⅷ 조성물을 생산하는 방법, 신규 재조합 인자 Ⅷ 단백질의 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열, 그리고 신규 인자 Ⅷ 단백질을 포함하는 제약 조성물들을 제공한다.

본 발명은 활성 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ 분자들 또는 그것들의 단편들, 이들 하이브리드를 인코드하는 핵산 서열, 그것들을 조제하고 분리하는 방법, 그리고 그것들에 특성을 부여하는 방법들을 더 제공한다. 이들 하이브리드는 인간/동물, 동물/동물, 또는 다른 그러한 하이브리드 인자 Ⅷ 분자들을 포함하고, 다른 종의 인자 Ⅷ의 상응하는 아미노산 서열(또는 아미노산) 대신 치환된 한 종의 인자 Ⅷ의 하나 이상의 유일(unique) 아미노산을 포함하는 C2 도메인에서 적어도 하나의 특이 아미노산 서열을 더 포함하며; 또는 인간, 동물, 또는 하이브리드 인자 Ⅷ에 있어서 특이 아미노산 서열 대신 치환된 인자 Ⅷ에 대한 알려진 서열 동일성(identity)을 가지지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 C2 도메인에서 적어도 하나의 서열을 포함한다. 결과로서 생성되는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 인간 또는 돼지 인자 Ⅷ와 비교해서, 인자 Ⅷ 억제 항체들에 대한 면역 반응성이 감소되거나 없다.

여기서 사용된, "상응하는" 핵산 또는 아미노산 또는 어느 한쪽의 서열은, 핵산 또는 아미노산 번호가 동일하지 않을 지라도, 다른 종의 인자 Ⅷ 분자의 자리에서와 같은 구조 및/또는 기능을 갖는 인자 Ⅷ 분자 또는 그것의 단편(fragment)의 자리에 존재하는 것이다. 다른 인자 Ⅷ 서열에 "상응하는" DNA 서열은 그러한 서열에 실질상 상응하고, 엄격한 조건 하에서 지정된 SEQ ID NO.의 서열로 하이브리드를 만든다. 다른 인자 Ⅷ 서열에 "상응하는" DNA 서열은, 유전부호(genetic code)의 여분이 없다면, 인자 Ⅷ 또는 그것의 단편의 발현으로 귀착되는 서열을 또한 포함하고 지정된 SEQ ID NO.로 하이브리드를 만들 것이다.

여기서 사용된, "유일" 아미노산 레지듀 또는 서열은 다른 종의 인자 Ⅷ 분자에서 상동 레지듀 또는 서열과 다른 한 종의 인자 Ⅷ 분자에서 아미노산 서열 또는 레지듀를 말한다.

여기서 사용된, "비활성도(specific activity)"는 인간 인자 Ⅷ 결핍 혈장의 응고 결함을 고칠 활성도를 말한다. 비활성도는 인간 인자 Ⅷ 결핍 혈장의 응혈 시간이 정상 인간 혈장의 그것과 비교되는 표준 분석에서 밀리그램 총 인자 Ⅷ 단백질 당 응혈 활성도의 단위로 측정된다. 인자 Ⅷ 활성도의 한 단위는 정상 인간 혈장의 1 밀리미터에 존재하는 활성도이다. 상기 분석에서, 응혈 형성을 위한 시간이 짧을수록, 인자 Ⅷ의 활성도는 더 크게 분석된다. 돼지 인자 Ⅷ는 인간 인자 Ⅷ 분석에서 응고 활성도를 가진다.

"발현"은 유전 정보가 생성물을 산출하기 위해 이용되도록 하는 과정들의 세트를 말한다. 돼지 인자 Ⅷ의 아미노산 서열을 인코드하는 DNA는 변형된 인자 Ⅷ 단백질을 산출하기 위해 포유류 숙주 세포(host cell) 내에서 "발현"될 수 있다. 주어진 DNA 서열의 발현이 일어나도록 하는 물질, 유전 구조, 숙주 세포 및 조건들은 기술분야에서 잘 알려져 있고, 발현된 단백질의 내부 또는 외부 세포 위치뿐만 아니라 발현의 시간과 양에 영향을 미치도록 조작될 수 있다. 예컨대, 돼지 인자 Ⅷ을 인코드하는 DNA의 5' 종단(end)에서 신호 펩타이드(signal peptide)를 인코드하는 DNA를 포함시킴으로써(5' 종단은 통상, 단백질의 NH₂말단(terminus)을 인코드하는 종단임), 발현된 단백질은 숙주 세포의 내부로부터 배지로 전해지게 된다. 돼지 인자 Ⅷ 코딩 DNA와 공동으로 신호 펩타이드 코딩 DNA를 공급하는 것은 발현된 인자 Ⅷ이 정제 과정을 간단하게 하는 배지로 전해지기 때문에 유리하다. 바람직한 신호 펩타이드는 포유류 인자 Ⅷ 신호 펩타이드이다.

인간 인자 Ⅷ cDNA 뉴클레오티드(nucleotide) 및 예측 아미노산 서열은 SEQ ID NOs:1 및 2에서 각각 나타난다. 인자 Ⅷ은 "도메인" 서열 NH₂-Al-A2-B-A3-C1-C2-COOH를 한정하는 내부 서열 상동관계를 가지는 약 300 kDa 단일 사슬 단백질로서 합성된다. 인자 Ⅷ 분자에 있어서, 여기서 사용된 "도메인"은 내부 아미노산 서열 동일성 및 트롬빈에 의한 단백질 가수분해 분할(proteolytic cleavage) 자리에 의해 한정되는 아미노산들의 연속적인 사슬이다. 달리 특정되지 않는다면, 서열들이 인간 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)과 정렬될 때, 인자 Ⅷ 도메인은 다음 아미노산 레지듀를 포함한다: Al, 레지듀 Ala1-Arg372; A2, 레지듀 Ser373-Arg740; B, 레지듀 Ser741-Arg1648; A3, 레지듀 Ser1690-Ile2032; C1, 레지듀 Arg2033-Asn2172; C2, 레지듀 Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 서열은 레지듀 Ser1690-Tyr2332를 포함한다. 남은 분절(segment), 레지듀 Glu1649-Arg1689는 인자 Ⅷ 가벼운 사슬 활성화 펩타이드로서 일반적으로 참조된다. 인자 Ⅷ은 그것을 폰 빌레브란트 인자로부터 분리하고 전구응고 기능을 가진 인자 Ⅷa를 형성하는 트롬빈 또는 인자 Xa에 의하여 단백질 가수분해적으로 활성화된다. 인자 Ⅷa의 생물학적 기능은 인자 Ⅹ 활성화에 대하여 인자 Ⅸa의 촉매 효율을 몇몇 크기정도 만큼 증가시키는 것이다. 트롬빈-활성화된 인자 Ⅷa는 단구(monocyte) 또는 혈소판의 표면에서 인자 Ⅸa 및 인자 Ⅹ와 함께 복합체를 형성하는 160 kDa A1/A2/A3-Ca-C2 헤테로삼량체(heterotrimer)이다. 여기서 사용된 "부분 도메인"은 도메인의 부분을 형성하는 아미노산의 연속적인 서열이다.

여기서 사용된, 인간 또는 동물 인자 Ⅷ의 "서브유닛들"은 단백질의 무거운 및 가벼운 사슬들이다. 인자 Ⅷ의 무거운 사슬은 3개의 도메인, A1, A2 및 B를 포함한다. 인자 Ⅹ의 가벼운 사슬은 3개의 도메인, A3, C1 및 C2를 또한 포함한다.

여기서 사용된 용어 "에피토프", "항원 자리(antigenic site)" 및 "항원 결정소"는 동의어로 사용되고, 항체에 의하여 특이적으로 인식되는, 인간 또는 동물 인자 Ⅷ, 또는 그것들의 단편의 부분으로서 규정된다. 그것은 다수의 아미노산 레지듀로 구성될 수 있고, 그것은 단백질의 일차, 이차, 또는 삼차 구조에 종속할 수 있다.

여기서 사용된 용어 "면역성 자리"는 면역 측정법, 예컨대 여기서 설명된 ELISA 또는 베데스다 분석 같은 일정 프로토콜에 의하여 측정된 것처럼, 인간 또는 동물에 있어서 인자 Ⅷ 또는 단편에 대한 항체의 생산을 특이적으로 유도하는, 인간 또는 동물 인자 Ⅷ, 또는 그것들의 단편의 영역으로서 규정된다. 그것은 다수의 아미노산으로 구성될 수 있고, 그것은 단백질의 일차, 이차, 또는 삼차 구조에 종속할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 하이브리드 또는 하이브리드 등가 인자 Ⅷ 또는 그것들의 단편은 비면역성이거나 인간 또는 돼지 인자 Ⅷ 보다 동물 또는 인간에 있어서 저면역성이다.

여기서 사용된 "인자 Ⅷ 결핍"은 불완전한 인자 Ⅷ의 생산, 인자 Ⅷ의 부적절하거나 무 생산, 또는 억제자에 의한 인자 Ⅷ의 부분적 또는 전체 억제에 의하여 초래된 응혈 활성도에 있어서 결핍을 포함한다. 혈우병 A는 X-연관 유전자에 있어서 결함과 그것이 인코드하는 인자 Ⅷ 단백질의 부재 또는 결핍으로 기인한 인자 Ⅷ 결핍의 유형이다.

여기서 사용된 "진단 분석"은 일부 방법에 있어서 의학 치료의 선택을 돕기 위한 시험 샘플에 존재하는 특정 항체의 양을 검출 및/또는 측정하기 위하여 항원-항체 반응을 이용하는 분석을 포함한다. 당해 기술분야의 숙련된 사람들에게 알려진 많은 분석이 있다. 여기서 사용된, 인간, 돼지 또는 변형된 돼지 인자 Ⅷ DNA 또는 그것들의 단편 및 그것들로부터 발현된 단백질은, 전체 또는 부분적으로, 다른 알려진 분석에서 상응하는 시약들(reagents)을 대체할 수 있고, 그것에 의하여 변형된 분석은 인자 Ⅷ에 대한 항체를 검출 및/또는 측정하기 위해 사용될 수 있다. 인간 또는 동물 인자 Ⅷ에 대한 항체의 검출을 위한 알려진 분석의 변경을 허용하는 것은 이들 시약들, 인자 Ⅷ DNA 또는 그것의 단편 또는 그것으로부터 발현된 단백질의 사용이다. 그러한 분석은 ELISA, 면역확산 분석 및 면역블롯(immunoblot)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 여기서 사용된, 단백질의 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 인자 Ⅷ 또는 그것의 단편은 진단 시약으로서 사용될 수 있다. 인간, 돼지 또는 변형된 돼지 인자 Ⅷ 또는 그것들의 단편이 사용될 수 있는 다른 분석의 예들은 베데스다 분석 및 항응고 분석을 포함한다.

용어 "돼지 인자 Ⅷ과 같은, 단백질을 인코드하는 DNA"는 유전 코드의 알려진 관계에 따라서, 뉴클레오티드 서열이 단백질, 예컨대 돼지 인자 Ⅷ의 아미노산 서열에 대한 숙주 세포로 코딩 정보를 구체화하는폴리디옥시핵산(polydeoxynucleic acid)을 의미한다.

인간 또는 동물 인자 Ⅷ 또는 변형된 인자 Ⅷ를 인코드하는 DNA의 "발현 생성물"은 적당한 숙주 세포에서 관련(referenced) DNA의 발현으로부터 얻어진 생성물이고, 관련 DNA에 의하여 인코드된 단백질의 번역 전 또는 후 변형(modification)의 그러한 특징을 포함하며, 글라이코실화(glycosylation), 가수분해 분할 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전구응고 활성도를 유지하면서, 그러한 변형은 일어날 수 있고 숙주 세포의 유형 및 그 외 다른 인자에 따라서 다소 다를 수 있고, 산출물의 분자 아이소형(isoform)이 될 수 있음이 당해 기술분야에서 알려진다. 예컨대 여기서 참조로서 통합된 Lind, P. 등,Eur, J. Biochem.232:1927 (1995)를 참조하시오.

"발현 벡터(vector)"는 대개 원형 구조인 DNA 요소이고, 원하는 숙주 세포에서 자발적으로 복제하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 능력이 있으며, 또한 적당한 자리 및 적당한 방향에서 벡터 서열 내로 삽입된 코딩 DNA의 발현을 허용하는 어떤 잘 알려진 특징을 가진다. 그러한 특징은, 모두 당해 기술분야에서 잘 알려진, 코딩 DNA의 전사 개시를 지시하는 하나 이상의 프로모터(promoter) 서열과 인핸서(enhancer), 아데닐중합체형성 자리(polyadenylaton site) 등 같은 다른 DNA 요소들을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "발현 벡터"는, 당해 기술분야에서 모두 잘 알려진, 그것의 서열 내로 삽입되어 발현되는 DNA 코딩 서열을 가진 벡터, 그리고 삽입 자리로 삽입된 코딩 DNA을 발현시키는 데 소용될 수 있도록 삽입 자리와 관련하여 배열된 필수 발현 조절 요소를 가진 벡터를 표시하기 위해 사용된다. 따라서, 예컨대, 프로모터가 없는 벡터는 코딩 DNA와 결합된 프로모터의 삽입에 의하여 발현 벡터가 될 수 있다.

억제 항체들의 결합을 감소시키는 인자 Ⅷ에서 돌연변이들의 발견

근래, 인간 fⅧ C2 도메인의 1.5 Å X-레이 구조가 보고되었다(Pratt, K.P. 등, 1999, "1.5 Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 구조",Nature402:439-442). 이 구조의 조사는 Met2199/Phe2200, Val2223, 및 Leu2251/Leu2252으로 이루어진 3개의 용매-노출된(solvent-exposed) 소수성 "피트(feet)"를 밝혀냈다. Arg2213, Arg2220, Lys2227, 및 Lys2249를 포함하는 양하전된(positively charged) 레지듀들의 고리는 이들 레지듀들을 둘러싼다. 이 모티브는 막 결합이 소수성 피트를 막 이중층으로 삽입하여 이루어지고 음하전된(negatively charged) 인지질과 정전(electrostatic) 상호작용에 의하여 안정화됨을 시사한다.

대부분의 fⅧ 억제자들은 돼지 fⅧ과 불충분하게 교차 반응한다. 이 관찰을 통하여, 인간 fⅧ C2 영역에서 돼지 치환들을 포함한 일련의 구성체들을 사용하여 레지듀 Glu2181 - Val2243에 대한 C2 에피토프의 주요 결정소를 작도(mapping) 하였다(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 주요 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709). 본 발명에 있어서, 인간 fⅧ에서 레지듀 Met2199, Phe2200, Val2223, Lys2227, 및/또는 Leu2252와 일치하는 돼지, 뮤린, 개 fⅧ에서 레지듀들은 일련의 재조합 fⅧ 분자들을 만들기 위한 기초로서 사용되었다. 항원성에 있어서 상당한 감소는 Met2199,Phe2200, 및 Leu2252에서 돌연변이와 관련하여 관찰되었고, 이들 레지듀가 fⅧ을 인지질 막 및 종종 억제 항체들에 결합시키는데 관여함을 나타냈다.

도1은 인간, 돼지, 뮤린 및 개 fⅧ C2 도메인들의 정렬을 나타낸다.

5개의 제시된 소수성 인지질 결합 레지듀 중 4개에서 인간 fⅧ와 다른 한 종이 있다: Met2199 →Ile(돼지), Phe2200 →Leu(개), Val2223 →Ala (개), 및 Leu2252 →Phe(뮤린). 4개의 제시된 염기성(basic) 레지듀 중 단 하나에서 다른 종이 있다: Lys2227 →Glu (돼지). 따라서, 인간 B-도메인 없는 fⅧ에서 Met2199Ile, Phe2200Leu, Val2223Ala, Leu2252Phe, 및 Lys2227Glu 단일 돌연변이체들이 만들어졌다. 또한, 2개의 2중 돌연변이체, Met2199Ile/Phe2200Leu (C2 D1) 및 Val2223Ala/Leu2252Phe (C2 D2), 그리고 4중 돌연변이체, Met2219Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Leu2252Phe (C2 Q)들이 만들어졌다. fⅧ의 X-레이 구조에서 돌연변이된 레지듀들의 위치는 도2에 나타나 있다. Met2219/Phe2200 및 Leu2251/Lue2252는 2개의 β-헤어핀 고리에서 돌출한다. Val2223는 인접한 고리에서 돌출하고 Lys2227 가까이 있다.

새끼 햄스터 신장-유래 세포주(cell line)로부터의 무혈청 배지에서 돌연변이체들은 안정되게 발현된 후 부분적으로 정제되었다. ELISA 분석에 기초한 하이브리드들의 비응고 활성도는 "재료 및 방법"에서 설명된 것처럼 HB-의 그것과 같거나 컸으며, 그것들이 항원성 연구에 적합하다는 것을 나타냈다. 결과는 인간 B-도메인 없는 fⅧ(HB-) 및 전체 돼지 C2 도메인의 치환 이외에는 인간인 하이브리드 인간/돼지 fⅧ 분자, HP20과 비교되었다 (Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709).

대부분의 fⅧ 억제자들은 C2 도메인의 내부 및 외부에 있는 에피토프들에 대항한 다클론 IgG 집단이다(Prescott, R. 등,supra, 1997; Fulcher, C.A. 등 1985, "2개의 폴리펩타이드 단편에 대한 인간 인자 FⅧ 억제자 에피토프들의 위치 측정",Proc. Natl. Acad. Sci. USA82:7728-7732). 그러나, 일부 억제자는 C2-특이성이고 C2 도메인으로 비-인간 서열의 치환의 효과를 평가하는데 유용하다(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709). 5명의 환자로부터의 C2-특이 다클론 억제자들, AA, AJ, HR, LK, RvR(도3)가 이들 연구에 사용되었다. 개개의 억제자들이 그것들이 인식하는 레지듀에서 달라졌음에도 불구하고, Met2199, Phe2220, 및/또는 Leu2252에서 돌연변이로 기인한 항원성의 감소는 항상 관찰되었다. 놀랍게도, 베데스다 역가에서 상당한 증가가 있었고, Val2223Ala 돌연변이체에서 가장 현저하였다. 2중 돌연변이체 Met2199Ile/Phe2200Leu는 모든 5가지 항체에 대하여 저 항원성을 나타냈고, Met2199Ile 및/또는 Phe2200Leu의 항원성이 항상 감소되었다는 사실과 일관된다. 기이하게도, 세 경우에서(AA, AJ, 및 HR) 상응하는 개개의 돌연변이체들이 변화되지 않았거나 증가된 항원성을 나타냈음에도 불구하고, 2중 돌연변이체 Val2223Ala/Lys2227Glu는 모든 5가지 다클론 항체들에 대한 항원성에 있어서 감소를 나타냈다. 4중 돌연변이체 Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu의 항원성은 단일 또는 2중 돌연변이체들과 같거나 낮았다. HP20의 항원성은 모든 돌연변이체들 중 가장 낮았다. 이것은 본 연구에서 돌연변이 되지 않은 Met2199, Phe2200, 및 Lue2252에 더하여 항원 레지듀들의 존재와 일관된다.

HB- 및 돌연변이체 fⅧ 분자들에 대한 항체 BO2C11(Jacquemin, M.G. 등, 1998, "인자 Ⅷ 비활성화의 메카니즘 및 동역학: 억제자를 가진 혈우병 A 환자로부터 유래된 IgG4 단클론 항체에 관한 연구",Blood92:496-506) 및 NMC Ⅷ-5(Shima, M., D. 등, 1993, "단클론 항체를 중화하는 인자 Ⅷ과 C2 도메인에서 에피토프를 인식하는 인간 억제자 동종항체(alloantibody)는 폰 빌레브란트 인자 및 포스파티딜세린(phosphatidylserine)에 결합하는 인자 Ⅷ을 억제한다",Thromb, Haemost. 69:240-246)의 베데스다 역가는 도4 및 5에 각각 나타난다. BO2C11은 혈우병 A 억제자 환자의 변형된 B 세포에서 유래된 C2-특이 인간 IgG4_k단클론 항체이다. 그것은 지금까지 클론화된 유일한 C2-특이 인간 항체이다. BO2C11 및 NMC Ⅷ-5은 fⅧ의 C2 도메인을 인식하고 fⅧ이 vWf 및 인지질에 결합하는 것을 억제한다. NMC Ⅷ-5는 fⅧ에 인간 다클론 억제자들이 결합하는 것과 경합할 수 있다. BO2C11 및 NMC Ⅷ-5를 사용한 결과는 다클론 항체 HR을 사용하여 얻어진 것과 유사하였다(도3). 모든 3가지 항체에서, Phe2200은 항원성인 반면, Val2223 및 Lys2227은 항원성을 감소시키는 것으로 나타난다.

Met2199, Phe2200, 및/또는 Leu2252에서 돌연변이들는 시험된 7가지 항체들의 대부분에서 항원성 증가와 관련되었고(표1), 그것은 자주 표명되었다(도3-5).이것은 Met2199/Phe2200 및 Leu2251/Leu2252 고리가 막 결합에 관여한다는 가정과 일관된다. 모든 7가지 항체들이 Met2199/Phe2200 고리를 인식하였다고 하더라도, Met2199 및 Phe2209에서 돌연변이의 효과는 종종 달랐다. 예컨대, 항체 AJ에 대하여 Met2199Ile는 감소된 항원성을 나타냈고 Phe2200Leu는 증가된 항원성을 나타냈으나, BO2C11에 대해서는 정반대였다. 그러므로, AJ 및 BO2C11의 아미노산 특이성은, 양자 모두 Met2199/Phe2200 고리를 인식할지라도 변한다.

이전에, 일련의 재조합 하이브리드 인간/돼지 fⅧ 분자들은 레지듀 Glu2181 - Val2243(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181 - Val2242는 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 주요 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709)에 의하여 제한된(bounded) 분절에 대한 C2 에피토프(들)의 주요 결정소를 작도하는데 사용되었다. Met2199/Phe2200 고리는 이 영역 내에 포함된다. Leu2251/Lue2252 고리는, 돼지 fⅧ이 레지듀 2251 및 2252에서 류신(leucine)을 또한 포함하기 때문에, 이 분석에 의하여 포함되지도 제외되지도 않았다. 분자 지정된 HP20을 생성하는, 인간 fⅧ으로 전체 돼지 C2 도메인의 치환은 본 연구에서 만들어진 좀더 제한된 치환들보다 낮은 항원성과 관련된다(도3-5). 이것은 C2 억제자에 의한 결합에 기여하는 Met2199/Phe2200 및 Leu2251/Leu2252 고리 외부에 레지듀들이 있음을 나타낸다.

최근, 인지질 없이 인자 V C2 도메인의 2가지 입체구조(conformation)의 X-레이 구조가 보고되었다(Macedo-Ribeiro, S. 등, 1999, "인간 응고 인자 V의 막-결합 C2 도메인의 결정구조",Nature402:434-439). 저자는 fⅧ에서 Met2199 및Phe2200과 일치하는 위치 26 및 27에서(인간 인자 V C2 도메인 번호지정) 트립토판(tryptophan)을 포함하는 고리를 포함하는 인지질 막 결합에 관한 모델을 제시하였다. 인지질 막 결합에서 이 고리의 포함을 지지하는 상당한 양의 증거가 존재한다. 인자 V의 PS로 결합을 차단하는 억제 단클론 항체, HV-1은 이 고리에 대하여 작도한다(Kim, S.W. 등, 2000, "알라닌-스캐닝 변이발생(alanine-scanning mutagenesis)을 사용하여 인간 인자 V의 C2-도메인 내에서 기능적으로 중요한 아미노산 레지듀의 확인",Biochemistry39:1951-1958; Ortel, T.L. 등, 1994, "재조합 키메라(chimera)를 사용하여 응고 인자 V의 제2 C-형 도메인 내에서 기능적으로 중요한 에피토프의 위치 측정",J. Biol. Chem. 269:15898-15905; Ortel, T.L. 등, 1998, "억제 항-인자 V 항체들은 인자 V C2 도메인에 결합하고 출혈 징후와 관련된다",Blood91:4188-4196). 인자 Va에서 Trp26 및 Trp27에 상당하는 레지듀들 대신에 알라닌 치환은 PS에 감소된 결합 및 응고 활성도의 손실과 관련된다(Kim. S.W. 등,supra, 2000, "알라닌-스캐닝 변이발생을 이용하여 인간 인자 V의 C2-도메인 내에서 기능적으로 중요한 아미노산 레지듀의 확인",Biochemistry39:1951-1958).

또한, fⅧ에서 Leu2251과 일치하는 Leu79를 포함하는 고리와 레지듀 Asn41 - Asn51을 포함하는 고리는 Trp26/Trp27 고리와의 근접에 기초한 인지질 막 결합에 관여하도록 제시되었다(Macedo-Ribeiro, S. 등, 1999, "인간 응고 인자 V의 막-결합 C2 도메인의 결정구조",Nature402:434-439). Asn41 - Asn51 고리와 일치하는 fⅧ 분절, His2076 - Asn2082는 인지질 막-결합 자리로서 제시된 적이 없다(Pratt,K.P., 1999, "1.5Å 해상력에서 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인의 구조",Nature402:439-442). 거꾸로, 인자 fⅧ에서 Val2223 고리와 일치하는 인자 Ⅷ에서 고리는 인지질 막 결합에 관여하도록 제시되지 않았다. 본 연구에서, Val2223Ala 및 Lys2227Glu 돌연변이는 항원성에서 증가와 통상적으로 관련되었다(표1). 따라서, 이들 결과는 이들 레지듀들이 인지질 막 결합에 관여한다는 가설을 지지하지 않는다. 그러나, 그것들이 인지질을 결합하지만 억제 항체들에 의하여 빈번히 표적이 되지 않는 것이 가능하다.

2개의 인자 V C2 구조는 인지질 막 결합 자리에서 Trp26 및 Trp27의 주요 운동 관련되고 "개방" 및 "폐쇄"로 지정된, 별개의 입체구조를 가진다. 이들 상태는 인지질 막 결합 상태를 각각 온(on) 및 오프(off)로 전환하도록 제시된다(Macedo-Ribeiro S.,supra, 1999). Val2223 및 Lys2227과 관련된 항원성에서 감소는 이들 레지듀들이 저 친화 막 및 항체 결합과 관련된 fⅧ에서 "폐쇄" 입체구조 상태를 안정시키기는 이유에서 기인할 것이다. Val2223Ala 및 Lys2227Glu 돌연변이들에 의한 이 상태의 이완은 고 친화 항체 결합에 이를 것이다. 선택적으로, Val2223 및 Lys2227은 다른 fⅧ 레지듀들과 고 친화 접촉을 포함하는 항원-항체 락앤키(lock-and-key) 상호작용을 간단히 방해할 것이다.

인간 C2-특이 단클론 항체, BO2C11은 다클론 억제자들과 비교하는 것이 중요한데, 후자의 분석을 혼동할 수 있는 이질성 때문이다. BO2C11의 기능적 특성은 뮤린 단클론 항체 NMC Ⅷ-5와 유사하다. 두 항체들은 fⅧ가 PS 및 vWf에 결합하는 것을 억제하고 fⅧ - vWf 복합체의 해리를 촉진하다(Jacquemin, M.G. 등, 1998, "인자 Ⅷ 비활성화의 메카니즘 및 동역학: 억제자를 가진 혈우병 A 환자로부터 유래된 IgG4 단클론 항체에 관한 연구",Blood92:496-506; Shima, M. 등, 1993, "단클론 항체를 중화하는 인자 Ⅷ과 C2 도메인에서 에피토프를 인식하는 인간 억제자 동종항체는 폰 빌레브란트 인자 및 포스파티딜세린에 결합하는 인자 Ⅷ을 억제한다",Thromb, Haemost. 69:240-246). 이들 결과는 Met2199가 아닌 Phe2200이 두 항체들에 의하여 인식되는 에피토프의 중요한 부분임을 나타낸다(도4 및 도5). 그러나, NMC Ⅷ-5는 Leu2252를 인식하지만 BO2C11은 그렇지 않다. Val2223 및 Lys2227은 두 항체들에 관한 항원성을 감소시킨다. 따라서, BO2C11 및 NMC Ⅷ-5는 중첩(overlapping)을 인식하지만 동일한 에피토프들을 인식하지 않는 것으로 나타난다.

RvR 항체는 열 살균 fⅧ 생성물, CPS-A에 노출(exposure)로부터 생성된 억제자 "에피데믹(epidemic)"의 부분인 혈우병 A 환자로부터 얻어진다(Sawamoto, Y. 등, 1998, "억제자들 없이 미리 치료된 혈우병 A 환자에 있어서, 열 살균 생성물, 인자 Ⅷ CPS-P에 의하여 유래된 억제 항체들의 C2 도메인 제한 에피토프 특이성",Thromb. Haemostas. 79:62-68). 1990 및 1991년에, 억제자 없이 몇몇의 미리 치료된 환자들은 네델란드 및 벨기에에서 이 생성물에 노출 후 C2-특이 항체를 즉시 발생시켰다. RvR 항체들은 fⅧ가 PS 및 vWf에 결합하는 것을 방해한다(Sawamoto, Y. 등,supra, 1998). RvR 에피토프는 N-말단, 대부분의 C2 억제자들에 의해 인식된 fⅧ C2 도메인의 Glu2181 - Val2243 영역에 대하여 작도한다(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의주요 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709). 본 연구에서 고 해상력 작도는 RvR이 Met2199/Phe2200 및 Leu2251/Leu2252 고리를 처음으로(primarily) 인식하는 전형적인 C2 억제자임을 나타낸다. 따라서, CPS-A와 관련된 면역성은 네오에피토프(neoepitope)의 발생보다는 정상 면역우성(immunodominant) 에피토프의 향상된 면역 인식에 기인한 것으로 나타난다.

방법의 일반적 설명

미국 특허 제5,364,771호는 응고 활성이 있는 하이브리드 인간/돼지 인자 Ⅷ 분자들의 발견을 설명하였고, 여기서 인간 또는 돼지의 인자 Ⅷ 분자의 요소들(elements)은 다른 종의 인자 Ⅷ 분자의 상응하는 요소들 대신에 치환된다. 미국 특허 제5,663,060호는 전구응고 하이브리드 인간/동물 및 하이브리드 상당 인자 Ⅷ 분자들을 설명하고, 여기서 한 종의 인자 Ⅷ 분자의 요소들은 다른 종의 인자 Ⅷ 분자의 상응하는 요소들 대신에 치환된다.

현재의 정보는 B 도메인이 억제 에피토프를 가지지 않고 인자 Ⅷ 기능에 대한 알려진 효과가 없음을 나타내기 때문에, 일부 실시예에서 B 도메인은 여기서 설명된 방법들에 의하여 조제된 활성 하이브리드 또는 하이브리드 상당 인자 Ⅷ 분자들 또는 그것들의 단편들("B(-) 인자 Ⅷ")에서 전적으로 또는 부분적으로 삭제된다.

Toole, J.J. 등 (1984)Nature 312:342-347 (Genetics Institute); Gitschier, J. 등 (1984)Nature 312:326-330 (Genentech); Wood, W.I. 등 (1984)Nature 312:330-337 (Genentech); Vehar, G.A. 등 (1984)Nature 312:337-342 (Genentech); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; 미국 특허 제4,757,006호에 의하여 보고된 것처럼, 인간 인자 Ⅷ 유전자는 포유류 세포에서 분리되고 발현되었고, 아미노산 서열은 cDNA에서 유래하였다. Capon 등의 미국 특허 제4,965,199호는 포유류 숙주 세포에서 인자 Ⅷ을 생산하기 위한 재조합 DNA 방법과 인간 인자 Ⅷ의 정제를 개시한다. CHO(중국 햄스터 난자) 세포 및 BHKC(새끼 햄스터 신장 세포) 상에서 인간 인자 Ⅷ 발현이 보고되어 왔다. 인간 인자 Ⅷ은 B 도메인의 부분 또는 전부를 삭제하기 위해 변형되어 왔고(미국 특허 제4,868,112호), 인간 인자 Ⅷ B 도메인을 인간 인자 V B 도메인으로 교체하는 것이 시도되어 왔다(미국 특허 제5,004,803호). 인간 인자 Ⅷ을 인코드하는 cDNA 서열 및 예측 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs:1 및 2로 나타난다. SEQ ID NO:1에서, 코딩 영역은 뉴클레오티드 위치 208에서 시작하고, SEQ ID NO:2에서 주어진 것처럼 삼중자 GCC는 성숙 단백질의 아미노산 번호 1 (Ala)에 대한 코돈(codon)이다.

돼지 인자 Ⅷ은 혈장에서 분리되었다[Fass, D.N. 등 (1982)Blood 59:594]. 세룰로플라스민(ceruloplasmin)과 상동관계인 N-말단 가벼운 사슬 서열의 일부와 상응하는 돼지 인자 Ⅷ의 일부 아미노산 서열 및 응고 인자 Ⅴ가 Church 등 (1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6934에 의해 설명되었다. Toole, J.J. 등 (1984)Nature 312:342-347은 돼지 인자 Ⅷ의 4개의 아미노산 절편들의 N-말단 종말의 부분 서열을 설명하였지만 상기 절편들을 인자 Ⅷ 분자에서 그것들의 위치로서 기술하지는 않았다. B의 아미노산 서열 및 돼지 인자 Ⅷ의 A2 도메인의부분은 Toole,J.J. 등 (1986)Proc. Natl. Acad. Sci, USA 83:5939-5942에 의하여 보고되었다. 돼지 인자 Ⅷ의 완전한 A2 도메인을 인코드하는 cDNA 서열 및 예측 아미노산 서열 및 모든 도메인에 치환이 있는 하이브리드 인간/돼지 인자 Ⅷ, 모든 서브유닛, 그리고 특이 아미노산 서열들은 1994.11.15.자로 발행된 "하이브리드 인간/돼지 인자 Ⅷ"라는 명칭의 미국 특허 5,364,771, 그리고 1993.10.14.자로 공표된 WO 93/20093에 개시되었다. SEQ ID NO:1에서 나타난 것처럼, 성숙한 인간 인자 Ⅷ에서 레지듀 373-740에 상응하는 돼지 인자 Ⅷ의 A2 도메인을 인코드하는 cDNA 서열과 예측 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NOs:3과 4로 나타난다. 보다 최근에는, 뉴클레오티드 및 첫번째 198 아미노산이 결핍된 A1 도메인의 부분과 돼지 인자 Ⅷ의 A2 도메인의 상응하는 아미노산 서열들이 1994. 5.26.자로 공표된 WO 94/11503에서 보고되었다. 인코드된 아미노산 서열은 물론 완전한 A1 도메인, 활성화 펩타이드, A3, C1 및 C2 도메인을 포함하는, 돼지 인자 Ⅷ을 인코드하는 전체 뉴클레오티드 서열은 여기에 참조로서 통합되는 1999. 1.12.자로 발행된 미국 특허 제5,859,204호 및 1997.12.31.일자로 공표된 WO 97/49725에 개시된 바와 같이 Lollar에 의하여 결국 얻어졌다.

돼지 및 인간 인자 Ⅷ은 2개의 서브유닛 단백질로서 혈장에서 분리되었다. 무거운 사슬 및 가벼운 사슬로서 알려진 상기 서브유닛들은 칼슘 또는 다른 2가 금속 이온들을 요하는 비공유 결합에 의하여 서로 지탱된다. 인자 Ⅷ의 무거운 사슬은 공유결합으로 연결된 3개의 도메인, A1, A2 및 B를 포함한다. 인자 Ⅷ의 가벼운 사슬 또한 A3, C1 및 C2로 지정된 3개의 도메인을 포함한다. B 도메인은 알려진 생물학적 기능이 없으며, 단백질 가수분해적으로 또는 인자 Ⅷ의 어떤 측정 가능한 파라미터에서 현저한 변경 없이 재조합 DNA 기술 방법에 의하여 분자에서 제거되거나 부분적으로 제거될 수 있다. 인간 재조합 인자 Ⅷ는 포유류 세포에서 발현되지 않는다면 글리코실화되지 않을지라도, 혈장-유래 인자 Ⅷ과 유사한 구조 및 기능을 가진다.

인간 및 돼지 활성화된 인자 Ⅷ("인자 Ⅷa")은 A1과 A2 도메인 사이에서 무거운 사슬의 분열로 인한 3개의 서브유닛을 가진다. 이 구조는 A1/A2/A3-C1-C2로 지정된다. 인간 인자 Ⅷa는 돼지 인자 Ⅷa를 안정화시키는 조건 하에서는 적합하지 않은데 인간 인자 Ⅷa의 A2 서브유닛의 약한 연합(association) 때문일 것이다. 인간 및 돼지 인자 Ⅷa의 A2 서브유닛의 해리(dissociation)는 인자 Ⅷa 분자에 있어서 활성의 감소와 관련된다. Yakhyaev, A. 등 (1997)Blood90:Suppl. 1, Abstract #126은 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질에 의한 A2 도메인의 결합을 보고하였고, 그러한 결합에 의하여 조정된 A2의 세포 업테이크(uptake)는 저하-조절(down-regulate) 인자 Ⅷ 활성에 작용함을 시사하였다.

"B-도메인 없는 인자 Ⅷ"의 발현은 B-도메인의 부분들을 포함함으로써 증진된다. "SQ"로 지정된[Lind, P. 등 (1995)supra] B 도메인의 그러한 부분들의 포함은 순조로운 발현을 가져오는 것으로 보고되었다. "SQ" 구성체들은 B 도메인 N-말단의 5 아미노산 및 B 도메인 C-말단의 9 아미노산을 제외하고는 인간 B 도메인 모두가 없다.

정제되고 변형된 인자 Ⅷ 또는 그것의 단편은 예컨대, 혈장-없는(plasma-free) 인자 Ⅷ 분석, 1단(one-stage) 응혈 분석, 그리고 효소-연계 정제된 재조합 인간 인자 Ⅷ를 표준으로서 사용하는 면역 흡착제 분석을 포함하는 표준 분석에 의하여 면역 반응성 및 응고 활성에 대하여 분석될 수 있다.

혈장 및 진핵생물 바이러스 벡터들을 포함하는 다른 벡터들은 숙련된 당업자의 선택 및 판단에 따라 진핵생물 세포에서 재조합 유전자 구성체를 발현시키기 위하여 사용될 수 있다(예컨대, Sambrook 등, Chapter 16을 참조하시오). 박테리아, 효모(yeast) 및 곤충 세포 시스템을 포함하는 다른 벡터들과 발현 시스템이 사용될 수 있으나 글리코실화의 차이 또는 결핍으로 인하여 선호되지 않는다.

재조합 인자 Ⅷ 단백질은 배양 및 재조합 포유류 단백질 발현에 대하여 공통으로 사용되는 다양한 세포에서 발현될 수 있다. 특히, 다수의 설치동물 세포주들은 큰 단백질들의 발현에 대하여 특히 유용한 숙주임이 밝혀졌다. American Type Culture Collection, Rockville, MD로부터 이용 가능한 선호되는 세포주들은 통상 절차와 배지를 사용하여 배양된 새끼 햄스터 신장 세포들, 그리고 중국 햄스터 난소(CHO) 세포들을 포함한다.

돼지 인자 Ⅷ의 보다 큰 응고 활성도에 대한 근거는 돼지 인자 Ⅷa로부터의 돼지 A2 서브유닛보다 인간 인자 Ⅷa로부터의 인간 A2 서브유닛의 빠르고 자발적인 해리인 것으로 보인다. A2 서브유닛의 해리는 활성도를 감소시키게 된다, [Lollar, P. 등 (1990)J. Biol. Chem.265:1688-1692; Lollar, P. 등 (1992)J. Biol. Chem.267:23652-23657; Fay, P.J. 등 (1992)J. Biol. Chem.267:13246-13250].

면역 반응성이 감소된 인자 Ⅷ 분자들

인자 Ⅷ의 응고 활성을 억제하는 항체와("억제자" 또는 "억제 항체") 면역 반응성이 있는 에피토프들은 인자 Ⅷ에서 알려진 구조-기능 관계에 기초하여 특징 지워졌다. 아마도, 억제자들은 인자 Ⅷ의 도메인 구조와 관련된 어느 거대분자의 상호작용 또는 폰 빌레브란트 인자, 트롬빈, 인자 Xa, 인자 Ⅸa, 또는 인자 X와의 그것의 연합을 중단시킴으로써 작용할 수 있었다. 그러나, 인간 인자 Ⅷ에 대한 대부분의 억제 항체들은 Fulcher 등 (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7728-7723; 그리고 Scandella 등 (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6152-6156에 의하여 설명된 것처럼, 인자 Ⅷ의 40 kDa A2 도메인 또는 20 kDa C2 도메인에 위치한 에피토프들에 결합함으로써 작용하고, 이들 도메인들과 관련된 특이 기능을 중단시킨다. A2 및 C2 에프토프에 더하여, Scandella 등 (1993)Blood 82:1767-1775에 따라서, 인자 Ⅷ의 가벼운 사슬의 A3 또는 C1 도메인에 제3의 에피토프가 있을 수 있다. 이 추정되는 제3의 에피토프의 중요성은 알려지지 않았지만, 인자 Ⅷ에서 에피토프 반응성의 소부분에 대한 원인이 되는 것으로 나타난다.

Lollar 등 (1994)J. Clin. Invest.93:2497-2504에 나타난 것처럼, 항-A2 항체들은 인자 X 활성화를 방해한다. Ware 등 (1992)Blood Coagul. Fibrinolysis3:703-716에 설명된, 변이발생 삭제에 의한 이전의 작도 연구들은 A2 에피토프를 40 kDa A2 도메인의 NH₂-말단 종말의 20 kDa 영역 내부 쪽에 위치시켰다.Scandella 등 (1992)Throm. Haemostas.67:665-671에 의해 설명되고 미국 특허 제5,859,204에서 설명된 바와 같이, 경쟁 면역방사능측정 분석은 A2 억제자들이 공통(common) 에피토프 또는 좁게 밀집된 에피토프들을 인식하는 것으로 나타냈다.

변형된 인자 Ⅷ 분자들은 임상시험에 있어서 그것들의 감소된 항원성 및/또는 면역성에 대하여 인간에서 시험될 수 있다. 인자 Ⅷ이 억제 항체들과 면역 반응성이 있는지를 결정하기 위하여 디자인된 한 형태의 시험에 있어서, 인자 Ⅷ은 바람직하게는 정맥내 주입에 의하여 치료 인간 인자 Ⅷ의 응고 활성을 억제하는 항체를 가진 약 25명의 인자 Ⅷ 결핍 환자에 투여된다. 동물 또는 변형된 동물 인자 Ⅷ의 투여량은 5와 50 Units/kg체중 사이에 있고, 바람직하게는 10-50 Units/kg, 그리고 가장 바람직하게는 40 Unit/kg체중이다. 각자 투여 후 약 1시간, 혈액 샘플로부터 인자 Ⅷ의 회수(recovery)는 1단 응고 분석에서 측정된다. 샘플들은 주입 후 약 5시간 다시 취해지고, 회수가 측정된다. 샘플들로부터 인자 Ⅷ의 소실율 및 회수는 항체 역가 및 억제 활성도를 예측한다. 만일 항체 역가가 높으면, 인자 Ⅷ 회수는 일반적으로 측정될 수 없다. 회수 결과는 혈장-유래 인간 인자 Ⅷ, 재조합 인간 인자 Ⅷ, 혈장-유래 돼지 인자 Ⅷ, 그리고 다른 공통적으로 사용된 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅷ 치환들의 치료적 형태로 치료된 환자에 있어서 회수 결과와 비교된다.

임상적으로 중요한 에피토프들의 확인 후, 재조합 인자 Ⅷ 분자들은, 억제자 혈장의 폭넓은 검사와 대조하여in vitro시험될 때, 혈장-유래 돼지 인자 Ⅷ과 비교하여 작거다 같은 교차-반응성을 가지는 것으로 발현될 수 있다. 에피토프 영역에서 부가적인 변이발생이 교차-반응성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 감소된 교차-반응성은, 바람직할지라도, 존재하는 혈장-유래 돼지 인자 Ⅷ 농도보다 이점을 가질 수 있는 생성물을 생산하는데 필요하지 않고, 그것은 오염 돼지 단백질 또는 바이러스나 프리온(prion) 같은 오염 전염병원체로 인한 부작용을 생성할 수 있다. 재조합 돼지 또는 변형된 돼지 인자 Ⅷ 분자는 외래 돼지 단백질을 포함하지 않을 것이다.

진단 분석

인자 Ⅷ cDNA 및/또는 그것으로부터 발현된 단백질은, 전부 또는 부분적으로, 예컨대, 인자 Ⅷ 결핍 인간 환자의 혈청 및 체액의 샘플을 포함하는 기질에서 인간 또는 동물 인자 Ⅷ 또는 변형된 동물 Ⅷ에 대한 억제 항체의 검출을 위한 진단 시약으로서 분석에서 사용될 수 있다. 이들 항체 분석은 ELISA 분석, 면역블롯, 방사면역측정(radioimmunoassay), 면역확산 분석, 및 인자 Ⅷ 생물학적 활성도의 분석(예컨대, 응고 분석에 의한) 같은 분석을 포함한다. 이들 시약을 조제하기 위한 기술과 그것의 사용 방법은 당해 기술분야의 숙련된 자들에게 알려져 있다. 예컨대, 환자 혈청 샘플에서 억제 항체들을 검출하기 위한 면역분석은 검출 가능한 복합체가 정말로 항원인 시험 인자 Ⅷ의 샘플에서 억제 항체들로 형성될 수 있는지가 시험되도록 시험 샘플을 충분한 양의 인자 Ⅷ으로 반응시키는 것을 포함할 수 있다.

핵산 및 아미노산 프로브(probe)는 변형된 인자 Ⅷ cDNA 또는 단백질 분자또는 그것들의 단편의 서열에 기초하여 조제될 수 있다. 일부 실시예에서, 이것들은 상업적으로 이용 가능한 색소 또는 효소성, 형광성, 화학발광성, 또는 방사성 라벨(label)을 사용하여 식별될 수 있다. 아미노산 프로브는 예컨대, 인간, 동물 또는 하이브리드 인간/동물 인자 Ⅷ에 대한 억제자들의 존재가 추측되는 곳인 혈청 또는 다른 체액을 스크린하기(screen) 위해 사용될 수 있다. 억제자들의 수준은 환자에 있어서 양이 평가되고 건강한 대조구(healthy control)와 비교될 수 있고, 예컨대, 인자 Ⅷ 결핍 환자가 동물 또는 변형된 동물 인자 Ⅷ으로 치료될 수 있는지를 결정하기 위하여 사용될 수 있다. cDNA 프로브는 예컨대, DNA 라이브러리(library)를 스크린하는데 있어서 연구 목적으로 사용될 수 있다.

재조합 인자 Ⅷ의 조제

재조합 인자 Ⅷ는 진핵생물 단백질 발현 시스템의 사용을 통하여 생성될 수 있다. 일반적으로, 필수 유전자에서 부족한 진핵생물 세포주는 그것이 부족한 유전자를 포함하는 벡터, 그리고 발현시키고자 하는 재조합 DNA로써 변형된다. 변형은 전기천공(electroporation) 또는 바이러스 전달(viral delivery) 같은 기술에 의해 달성될 수 있다. 단백질을 생성하기 위해 선택된 세포주는 당업자에게 잘 알려진 다른 요인과 함께, 관심 단백질과 융화성이 있고, 관심 단백질의 계속적인 발현이 가능하고, 관심 단백질의 정제를 용이하게 하는 배지에서 성장할 수 있도록 선택된다. 그러한 기술의 실시예는 완전히 참조로서 통합되는 유럽 특허 출원 0 302 968 A2 및 미국 특허 제5,149,637호에 개시된다.

재조합 인자 Ⅷ 분자들의 시험

재조합 인자 Ⅷ 분자들은 적어도 두 형태의 임상시험에 있어서 그것들의 감소된 항원성 및/또는 면역성에 대하여 인간에서 시험될 수 있다. 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ이 억제 항체들과 면역 반응성이 있는지를 결정하기 위해 디자인된 시험의 한 형태에 있어서, 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은, 바람직하게는 정맥내 주입에 의하여, 치료적 인간 또는 돼지 인자 Ⅷ의 응고 활성도를 억제하는 인자 Ⅷ에 대한 항체를 가진 약 25명의 인자 Ⅷ 결핍 환자에 투여된다. 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ의 투여량은 5와 50 Units/kg체중 사이에 있고, 바람직하게는 10-50 Units/kg, 그리고 가장 바람직하게는 40 Unit/kg체중이다. 각자 투여 후 약 1시간, 혈액 샘플로부터 인자 Ⅷ의 회수는 1단 응고 분석에서 측정된다. 샘플들은 주입 후 약 5시간 다시 취해지고, 회수가 측정된다. 샘플들로부터 인자 Ⅷ의 소실율 및 회수는 항체 역가 및 억제 활성도를 예상한다. 만일 항체 역가가 높으면, 인자 Ⅷ 회수는 일반적으로 측정될 수 없다. 회수 결과는 혈장-유래 인간 인자 Ⅷ, 재조합 인간 인자 Ⅷ, 돼지 인자 Ⅷ, 그리고 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅷ 치환들의 다른 공통적으로 사용된 치료적 형태로 치료된 환자에 있어서 회수 결과와 비교된다.

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ이 면역성인지, 즉, 환자가 억제 항체를 발생시킬(develope) 것인지를 결정하기 위해 디자인된 임상시험의 두 번째 형태에 있어서, 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은, 선행 단락에서 설명된 것처럼, 항체 Ⅷ에 대한 항체를 발생시키지 않았고 미리 치료받지 않은 약 100명의 혈우병 환자에 투여된다. 치료는 6개월에서 1년의 기간에 걸쳐 약 매 2주마다 처치된다. 이 기간동안 1에서 3개월 간격으로, 혈액 샘플을 뽑고 억제 항체의 존재를 결정하기 위하여 베데스타 분석 또는 다른 항체 분석이 수행된다. 전술한 바와 같이, 각자 주입 후, 회수 분석이 또한 행하여 질 수 있다. 결과는 혈장-유래 인간 인자 Ⅷ, 재조합 인간 인자 Ⅷ, 돼지 인자 Ⅷ, 그리고 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅷ 치환의 다른 공통적으로 사용된 치료적 형태를 받는 환자와 비교된다.

제제의 조성물(Pharmaceutical Compositions)

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ을 포함하는 제제의 조성물은, 단독으로 또는 적당한 제제 안정화 화합물, 침투정(delivery vehicles), 및/또는 운반체(carrier vehicle)와 조합하여, E.W. Martin에 의한 Remington'sPharmaceutical Sciences에 설명된 것 같은 알려진 방법에 따라서 조제된다.

한 바람직한 실시예에서, 정맥내 주입을 위한 바람직한 운반체 또는 침투정은 생리적 염류(saline) 또는 인산 완충된 염류이다.

다른 바람직한 실시예에서, 적당한 안정화 화합물, 침투정, 및 운반체는 알부민(albumin) 같은 다른 인간 또는 동물 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

인지질 소포(vesicles) 또는 리포솜 현탁(liposomal suspensions)은 조제적으로 수용 가능한 운반체 또는 침투정으로서 또한 바람직하다. 이것들은 당업자에게 알려진 방법에 따라서 조제될 수 있고, 인자 Ⅷ이 음으로 하전된 인지질 막에 결합하기 때문에 예컨대, 협력하여 표면에 음전하를 주는 포스파티딜세린/포스파티딜콜린(phosphatidylcoholine) 또는 인지질의 다른 조성물 또는 세제를 포함할 수 있다. 후에 증발되는 무기 용매에 (스테아로일 포스파티딜 에탄올아민(stearoyl phosphatidyl ethanolamin), 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일(arachadoyl) 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤 같은) 적당한 지질(lipid)을 용해하여 리포솜들은 조제될 수 있고, 컨테이너(container)의 표면 위의 건조된 지질의 얇은 막(film)을 뒤에 남긴다. 다음에, 하이브리드 인자 Ⅷ의 수용액은 컨테이너로 도입된다. 그 다음에, 상기 컨테이너는 지질 물질을 컨테이너의 측면에서 떨어뜨리고 지질 응집체를 분산시키기 위하여 손으로 빙빙 돌려지고, 그리하여 리포솜 현탁을 형성한다.

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 비타민 K 의존 응혈 인자, 조직(tissue) 인자, 및 폰 빌레브란트 인자(wWf) 또는 인자 Ⅷ 결합 자리를 포함하는 wWf의 단편, 그리고 자당(sucrose) 같은 다당류를 포함하는, 다른 적당한 안정화 합성물, 침투정, 및/또는 운반체와 화합될 수 있다.

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ는, 리트로바이러스 벡터(retroviral vectors)와 같은 운반 수단을 사용하여, 인간 인자 Ⅷ이 전달될 수 있는 것과 같은 방식으로 유전자 치료에 의하여 또한 전달될 수 있다. 이 방법은 인자 Ⅷ 결핍 환자에 직접 이식되거나 인자 Ⅷ 분자에 투과성지만 세포에 불투과성이고 후에 이식되는 이식 가능한 장치에 놓이는 인간 세포 내에 인자 Ⅷ cDNA를 편입시키는 것으로 이루어진다. 바람직한 방법은 리트로바이러스-매개 유전자 전달일 것이다. 이방법에서, 외인 유전자(예컨대, 인자 Ⅷ cDNA)는 변형된 리트로바이러스의 게놈으로 클론된다. 유전자는 그것이 세포에 의하여 발현될 바이러스 기계(viral machinery)에 의하여 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된다. 리트로바이러스 벡터는 그것이 바이러스를 생성하지 않도록 변형되고, 숙주의 바이러스 감염을 방지한다. 이러한 형태의 치료에 대한 일반적 원칙은 당업자에게 알려지고 논문에서 시찰되었다(예컨대, Kohn, D.B. 등 [1989]Transfusion 29:812-820).

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 하이브리드 분자의 반감기 및 유통기한을 증가시키기 위해 vWf에 결합되어 저장될 수 있다. 또한, 인자 Ⅷ의 동결건조는 wWf의 존재 내에서 활성 분자들의 생산량을 증진할 수 있다. 상업적 공급자에 의해 사용되는 인간 및 동물 인자 Ⅷ의 저장을 위한 현행 방법은 하이브리드 인자 Ⅷ의 저장을 위하여 사용될 수 있다. 이들 방법은 (1) (더 이상의 정제 없이 주입되는 인자 Ⅷ "농축"으로서) 부분적으로 정제된 상태에서 인자 Ⅷ의 동결건조; (2) Zimmerman 방법에 의한 인자 Ⅷ의 면역친화(immunoaffinity)-정제 및 인자 Ⅷ을 안정화시키는 알부민의 존재 속에서 동결건조; (3) 알부민의 존재 내에서 재조합 인자 Ⅷ의 동결건조;를 포함한다.

또한, 하이브리드 인자 Ⅷ은 0.6M NaCl, 20mM MES, 및 5mM CaCl₂pH 6.0, 4℃에서 무기한으로 안정되었고 이들 버퍼(buffer)에서 냉동되어 보관되고 최소한의 활성도 손실로 해동될 수 있다.

치료 방법

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 억제 항체들이 있고 없는 혈우병 환자 그리고 억제 항체들의 발생으로 인한 획득 인자 Ⅷ 결핍 환자에 있어서 인자 Ⅷ 결핍으로 인한 억제되지 않은 출혈(예컨대, 관절 내, 두개 내, 또는 위장 내 출혈)을 치료하기 위해 사용된다. 활성 물질들은 정맥 내로 바람직하게 투여된다.

또한, 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 하이브리드를 생산하기 위해 유전학적으로 처리된 세포의 이식 또는 전술한 바와 같은 세포를 포함하는 장치의 이식에 의하여 투여될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 단독으로 또는 적당한 제제 안정화 화합물, 침투정(delivery vehicles), 및/또는 운반체(carrier vehicle)와 조합한 제제의 조성물은 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ을 포함하는 제제의 조성물은 인간 또는 동물 인자 Ⅷ의 주입을 위해 사용되는 것과 같은 절차에 따라서 정맥 내로 환자에 주입된다.

치료가 필요한 환자에게 투여되어야 하는 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ 조성물의 치료 투여량은 인자 Ⅷ 결핍의 경중도에 따라서 변할 것이다. 일반적으로 투여량 수준은 각각의 환자의 출혈 에피소드(episode)의 경중도 및 지속 기간에 맞게 회수, 지속 기간 및 단위에서 조절된다. 따라서, 하이브리드 인자 Ⅷ은 표준 응혈 분석에 의해 측정된 바와 같이 출혈을 멈추기 위한 치료상 효과적인 양의 하이브리드를 환자에게 전달하기에 충분한 양으로 조제적으로 수용 가능한 운반체, 침투정, 또는 안정제에 포함된다.

인자 Ⅷ은 혈우병 A가 있는 개인들부터 유래된 혈장에서 응혈 결함을 고치는 정상 혈장에 존재하는 물질로서 고전적으로 정의된다. 인자 Ⅷ의 정제된 그리고 부분적으로-정제된 형태의in vitro응혈 활성도는 인간 환자에 주입을 위한 인자 Ⅷ의 투여량을 계산하기 위하여 사용되고 환자 혈청으로부터 회복된 활성도 및in vivo출혈 결함의 수정의 신뢰성 있는 지표이다. 신규 인자 Ⅷ 분자들의in vitro표준 분석과 다음에 따른 개 주입 모델 또는 인간 환자에 있어서 그것들의 작용 사이의 불일치는 보고되지 않는다: Lusher, J.M. 등 328New Engl,J.Med. 328:453-459; Pittman, D.D. 등, (1992)Blood79:389-397; 및 Brinkhous 등 (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.82:8752-8755.

일반적으로, 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ의 투여를 통하여 환자 내에서 달성되어야 하는 희망 혈장 인자 Ⅷ 수준은 표준(normal)의 30-100%의 범위에 있다. 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ의 투여의 바람직한 방식에 있어서, 조성물은 약 5에서 50 units/kg체중의 범위의 바람직한 투여량으로, 보다 바람직하게는 10-50 units/kg체중의 범위에서, 가장 바람직하게는 20-40 units/kg체중의 투여량으로 정맥 내로 제공되고; 치료 일수의 지속기간은 1에서 10일 사이에 있거나 출혈 에피소드가 해결될 때까지이다. 예컨대, Roberts, H.R., 및 M.R. Jones, "혈우병 및 관련 상황 - 프로트롬빈의 선천적 결핍(인자 Ⅱ, 인자 V 및 인자 Ⅶ에서 XⅡ)", Ch. 153, 1453-1474, 1460,혈액학, Williams, W. J., 등, 발행 (1990)을 참조하시오. 억제자를 가진 환자들은 보다 많은 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ을 필요로 할 수 있거나, 인간 인자 Ⅷ보다 높은 그것의 비활성도또는 감소된 항체 반응성 또는 면역성 때문에 환자들은 보다 적은 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ을 필요로 할 수 있다. 인간 또는 돼지 인자 Ⅷ으로 치료하는데 있어서, 주입되는 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ의 양은 1단 인자 Ⅷ 응고 분석에 의해 한정되고, 선택된 경우에,in vivo회복은 주입 후 환자의 혈장에서 인자 Ⅷ를 측정함으로써 결정된다. 어떤 특별한 주제에 관하여, 비투여량 요법은 개개인의 필요 및 조성물의 투여를 집행하거나 관리하는 사람의 전문적인 판단에 따른 시간에 걸쳐 조절되어야 하는 것으로, 그리고 여기서 설명된 농도 범위는 단지 대표적인 것이고 청구되는 조성물의 범위나 실행을 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

치료는 조성물의 단일 정맥 내 투여 또는 연장된 기간의 시간에 걸친 주기적이거나 연속적인 투여의 형태를 취할 수 있다. 선택적으로, 재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ은 시간의 변화 간격으로 1회 또는 수회 용량에 있어서 리포솜과 함께 피하로 또는 경구로 투여될 수 있다.

인자 Ⅷ은 인간 인자 Ⅷ 대한 항체를 발생시킨 혈우병 환자에 있어서 인자 Ⅷ 결핍으로 인한 억제되지 않는 출혈을 치료하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, 단지 인간 또는 동물 인자 Ⅷ의 활성도보다 나은 응고 활성도는 필요하지 않다. 만일 그 활성도가 환자의 혈장에서 항체에 의해 중화되지 않는다면, 인간 인자 Ⅷ의 활성도보다 못한 응고 활성도(즉, 3,000 units/mg 미만)가 유용할 것이다.

재조합 또는 재조합 하이브리드 인자 Ⅷ 분자 및 상기 일반적으로 설명된 그것을 분리, 특성화, 만들고 사용하는 방법들은 다음 실시예들과 관련하여 보다 잘 이해될 것이다.

실시예

물질들- 구연산첨가 혈우병 A 혈장 및 정상 혼주 인간 혈장(FACT)은 George King Biomedical, Inc.(Overland Park, KS)에서 구입했다. 헤파린-세파로스(heparin-sepharos)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입했다. 소태아혈청(FBS), 제네티신(geneticin), 페니실린, 스트렙토마이신(streptomycin), DMEM/F12 배지 및 AIM-V 배지는 Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD)에서 구입했다.PfuDNA 중합효소 및 파지미드(phagemid) pBlueScrip Ⅱ KS^-는 Stratagene(La Jolla, CA)에서 구입했다. 뮤린 항-인간 fⅧ 단클론 항체 ESH4 및 ESH8은 American Diagnostica(Greenwich, CT)에서 구입했다. 뮤린 fⅧ C2-특이 억제 단클론 항체 NMC Ⅷ-5는 일본 나라 의과대학 Dr. Midori Shima로부터 입수했다. 혈우병 환자로부터의 변형된 B 세포주로부터 클론된 인간 fⅧ C2-특이 IgG4_k단클론 항체, BO2C11은 전술한 바와 같이 조제되었다(Jacquemin, M.G. 등, 1998, "인자 Ⅷ 비활성화의 메카니즘 및 동역학: 억제자를 가진 혈우병 A 환자로부터 유래된 IgG4 단클론 항체에 관한 연구",Blood92:496-506). 5명의 억제자 환자들로부터의 구연산첨가 인간 혈장들, AA, AJ, HR, LK 및 RvR은 Dr. Dorothea Scandella로부터 입수했다. 그것들은 더 이상의 정제없이사용되거나(HR, RvR 및 AJ) IgG 제제들로서 사용되었다(LK 및 AA). 억제자 IgG는 전술한 바와 같이 조제되었다(Scandella, D.,L. 등, 1992, "A2 도메인을 포함하는 용해성 재조합 인자 Ⅷ 단편은 면역블롯에 의해 검출되지 않는 일부 인간 항-인자 Ⅷ 항체들에 결합한다",Thromb. Haemostas. 67:665-671). HR, LK, AA 및 RvR 항체들에 있어서 억제자들은 항체 중화 분석에 의해 평가된 것처럼(Prescott, R. 등, 1997, "억제 항체 반응은 fⅧ 자기항체들을 가진 대부분의 비혈우병환자에서 보다 혈우병 A 환자에서 복잡하다",Blood89:3663-3671) C2 도메인에 대하여 특이적이였다. AJ는 재조합 하이브리드 인간/돼지 fⅧ 분자들의 패널(pannel)을 사용하는 C2-특이로서 한정되었다(Barrow, R.T. 등, 2000, "다수-치환된 하이브리드 인간/돼지 인자 Ⅷ 분자를 사용하는 복합 억제 혈장에 대한 인자 Ⅷ의 항원성의 감소",Blood95:557-561). 알부민-없는 재조합 전장(full-length) fⅧ는 Baxter Healthcare(Deerfield, IL)의 Hyland-Immuno Division로부터 입수되었다. 합성 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)는 Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD)에서 구입했다. 제한 효소들은 New England Biolabs(Beverly, MA) 또는 Promega(Madision, WI)에서 구입했다. 새끼 햄스터 신장 세포에서 유래된 A 세포주는 Dr. R.T.A. Macgillivray로부터 입수했다(Funk, W.D. 등, 1990, "배양 세포에서 인간 혈청 트란스페린(transferrin)의 아미노-말단 반(半)분자의 발현 및 재조합 단백질의 특성화",Biochemistry29:1654-1660). 제네티신 저항성 유전자들 및 암피실린(ampicillin) 및 정지 코돈에 대한NotI자리 2 염기 3'을 포함하는, HB-/ReNeo로 지정된, A B-도메인 없는 fⅧ 발현 벡터는 전술한 바와 같이조제되었다(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 주요 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709). 인간 fⅧ에서 B 도메인 대신에 14개의 아미노산 분절, SerPheSerGlnAsnProProValLeuLysArgHisGlnArg을 포함하는, 인간 B-도메인 없는 fⅧ 분자(Lind, P. 등, 1995, "B-도메인-삭제된 재조합 인자 Ⅷ 분자들의 새로운 형태. 구성 및 생화학적 특성화",Eur, J. Biochem. 232:19-27), HSQ/ReNeo는 상응하는 돼지 분자에 대해 전술된 바와 같이(Healey, J.F. 등, 1998, "레지듀 Glu2181-Val2243은 인간 인자 Ⅷ의 C2 도메인에서 억제 에피토프의 주요 결정소를 포함한다",Blood92:3701-3709), 주형(template)으로서 본래 HB-/ReNeo를 사용하는 중복 신장에 의한 스플라이싱(splicing-by-overlap extension)(SOE) 변이발생에 의하여 구성되었다(Horton, R.M. 등, 1993, "중복 신장에 의한 유전자 스플라이싱"Methods Enzymol. 217:270-279). 인간 A1, A2,ap-A3 및 C1 도메인들 그리고 돼지 C2 도메인을 포함하는 B-도메인 없는 하이브리드 인간/돼지 fⅧ 분자, HP20은 전술한 바와 같이 조제되었다(Healey, J.F.,supra, 1998).

플라스미드(plasmid) DNA는 Qiagen Plasmid Maxi Kit(Qiagen, Inc., Valencia, CA)를 사용하여 정제되었다. PCR 반응은PfuDNA 중합효소를 사용하는 Hybrid OmniGene 열사이클러(thermocyler)를 사용하여 행해졌다. PCR 생성물들은 젤(gel) 정제되었고, 에탄올로 침전되었고, T4 DNA 라이게이스(ligase)(Rapid DNA Ligation Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용하여 플라스미드 DNA로 연결되었다. 삽입물-포함하는 플라스미드들은E. coliEpicurean XL1-Blue세포들을 변형시키기 위해 사용되었다. PCR에 의하여 생성된 모든 신규 fⅧ DNA 서열들은 Applied Biosystems(Foster City, CA) 373a 자동 DNA 서열분석기 및 PRISM 색소 종료자 키트(dye terminator kit)를 사용하여 이디옥시(dideoxy) 서열분석에 의해 확인되었다.

실시예 1 : 돌연변이체 cDNA들의 구조

돌연변이는 다음 단백질을 생성하기 위해 SOE 변이발생에 의하여 HSQ 코돈에서 발생되었다: Met2199Ile(인간 to 돼지), ATG to ATC, Phe2200Leu(인간 to 개), TTT to TTG, Val2223Ala(인간 to 개), GTG to GCC, Lys2227Glu(인간 to 돼지), AAA to GAG, Lue2252Phe(인간 to 뮤린), CTT to TTC, Met2199Ile/Phe2200Leu, ATG to ATC 및 TTT to TTG, Val2223Ala/Lys2227Glu, GTG to GCC 및 AAA to GAG, Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu, ATG to ATC, TTT to TTT, GTG to GCC, 그리고 AAA to GAG.

HSQ/ReNeo는 PCR 반응에서 주형으로서 사용되었다. 제1 PCR 반응은 H3763+로 지정된, 인간 C1 시발체(primer), SEQ ID NO:3, 5'-GTG GAT TCA TCT GGG ATA AAA CAC-3'을 사용하였고, 센스(sense) 시발체로서, HSQ 서열에서 뉴클레오티드 3763-3786과 상응한다. 다음 시발체들은 안티센스(antisense) 시발체로서 사용되었다: Met2199Ile, SEQ ID NO:4, 5'-AGG AGA CCA GGT GGC AAA GAT ATT GGT AAA GTA GGA TGA-3', Phe2200Leu, SEQ ID NO:5, 5'-TGA AGG AGA CCA GGT GGC CAA CAT ATT GGT AAA GTA GGA-3', Val2223Ala, SEQ ID NO:6 5'-CCA CTC TTT TGG ATT ATT GGCCTG AGG TCT CCA GGC ATT-3', Lys2227Glu, SEQ ID NO:7, 5'-GTC CAC TTG CAG CCA CTC CTC TGG ATT ATT CAC CTG AGG-3', Leu2252Phe, SEQ ID NO:8, 5'-CTT CAC ATA CAT GCT GGT GAA CAG AGA TTT TAC TCC CTG-3', Met2199Ile/Phe2200Leu, SEQ ID NO:9, 5'-AGG AGA CCA GGT GGC CAA GAT ATT GGT AAA GTA GGA TGA-3', 및 Val2223Ala/Lys2227Glu, SEQ ID NO:10, 5'-CAC TTG CAG CCA CTC CTC TGG ATT ATT GGC CTG AGG TCT CCA GGC-3'.

제2 PCR 반응은 안티센스 시발체로서, C2 도메인에 대해 3'인, RE1110-로 지정된, ReNeo 시발체, SEQ ID NO:11, 5'-AGT TTT TCT ACA ACA GAG GAA GTG-3'을 사용하였다. 다음 시발체들은 센스 시발체들로서 사용되었다: Met2199Ile, SEQ ID NO:12, 5'-TCA TCC TAC TTT ACC AAT ATC TTT GCC ACC TGG TCT CCT-3', Phe2200Leu, SEQ ID NO:13, 5'-TCC TAC TTT ACC AAT ATG TTG GCC ACC TGG TCT CCT TCA-3', Val2223Ala, SEQ ID NO:14, 5'-AAT GCC TGG AGA CCT CAG GCC AAT AAT CCA AAA GAG TGG-3', Lys2227Glu, SEQ ID NO:15, 5'-CCT CAG GTG AAT AAT CCA GAG GAG TGG CTG CAA GTG GAC-3', Leu2252Phe, SEQ ID NO:16, 5'-CAG GGA GTA AAA TCT CTG TTC ACC AGC ATG TAT GTG AAG-3', Met2199Ile/Phe2200Leu, SEQ ID NO:17, 5'-TCA TCC TAC TTT ACC AAT ATC TTG GCC ACC TGG TCT CCT-3', Val2223Ala/Lys2227Glu, SEQ ID NO:18, 5'-GCC TGG AGA CCT CAG GCC AAT AAT CCA GAG GAG TGG CTG CAA GTG-3'.

SOE 반응은 주형으로서 PCR 반응으로부터의 절편들을 사용하였고 시발체로서 H3763+ 및 RE1110을 사용하였다. SOE 생성물 및 HSQ/ReNeo 연결 절편들은Swa I및Not I를 사용하여 생성되었다.

Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu cDNA는 다음과 같이 구성되었다. Met2199Ile/Phe2200Leu cDNA는 pBluescript Ⅱ KS- 내로 이동되었고Bsu36 I으로 증해되었다(digested). Val2223Ala/Lys2227Glu cDNA 또한Bsu36 I으로 증해되었고 적절한(appropriate) 단편들은 연결되었다. 결과로서 생성된 Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Gul cDNA는Swa I및Not I으로 증해(digestion)에 의하여 ReNeo 내로 이동되었다.

실시예 2 : 재조합 fⅧ 분자들의 발현

이입된(transfected) 세포주들은 10% 소태아혈청, 50 U/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신을 포함하는 Dulbecoo's 변형된 Eagle's 배지-F12에서 유지되었다. 소태아혈청은 사용 전 56℃에서 한시간 동안 열 불활성화되었다. ReNeo에서 돌연변이체 cDNA들은 BHK 세포 내로 안정되게 이입되었고, 제네티신 저항성을 위해 선발되었고, 발현을 위해 혈청-없는, AIM-V 배지로 교체되었고(switched), 전술한 바와 같이(Healey, J.F. 등,supra, 1998) 헤파린-세파로스 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제되었다.

실시예 3 : FⅧ 및 fⅧ 억제자 분석

재조합 fⅧ 단백질의 활성도는 1단 응혈 분석에 의해 측정되었다(Bowie, E.J.W. 및 C.A. Owen, 1984, "출혈 장애의 임상 및 검사실 진단",지혈 장애, O.D Ratnoff 및 C.D. Forbes, 발행인. Grune & Stratton, Inc., Orlando, FL 43-72).fⅧ의 한 유닛(unit)은 정상 구연산첨가 인간 혈장의 1 ml에서 활성도로서 규정된다. FⅧ 억제자 역가는 베데스다 분석의 변형에 의하여 다음과 같이 측정되었다(Kasper, C.K. 등, 1975, "인자 Ⅷ 억제자들의 보다 균일한 측정",Thromb. Diath, Haemorrh.34:869-872). 재조합 fⅧ은 ml 당 0.8-1.2 units의 최종 농도로 혈우병 A 혈청에 첨가되었고 37℃에서 2시간 동안 억제자의 농도를 바꾸면서 배양되었다. 베데스다 유닛을 한정하는 50% 억제점(inhibition point)을 결정하기 위해, 적어도 35%에서 65% 범위에 걸치는 레지듀 활성도를 산출한 억제자의 희석(dilution)이 만들어졌다. 일부 경우에 있어서, 반복된 희석이 만들어졌고, 그 경우에 평균이 사용되었다. 10 희석의 평균은 각각의 베데스다 역가를 결정하기 위해 만들어졌다. 퍼센트 레지듀 활성도의 반(半)대수 플롯(plots) 대 억제자 희석의 역수의 로그는 모든 경우에서 선형으로 나타났다. 데이터는 다음 방정식에 Marquardt 알고리즘(SigmaPlot 5.0, SPSS, Inc.)을 사용하여 비선형 회귀에 의해 맞춰졌다.

% 레지듀 활성도 = m (log x - log x₅₀) + 50

여기서 맞춰진 파라미터 x₅₀은 50% 억제를 생성하는 상호(reciprocal) 희석이고, 맞춰진 파라미터 m은 반로그선(semi-log line)의 기울기이고 독립 변수 x는 억제자 샘플의 상호 희석이다. 62 베데스다 분석에 대한 평가의 표준 오차(회귀선으로부터 데이터 점들의 평균 편차)는 10.0±4.0(평균±1 SD)이고, 분석에서 고유 성질인 비교적 낮은 정도(精度)를 나타냈다.

베데스다 역가는 x₅₀ ^-1과 같다. 베데스다 역가의 표준 오차(SD)의 평가는 베데스다 역가에 x₅₀의 변분의 계수를 곱하여 계산되었다. fⅧ 돌연변이체들 및 HB-의 베데스다 역가는 Student'st시험에 의해 비교되었다. 부분적으로 정제된 제제들에 있어서 fⅧ의 질량 농도는 전술한 바와 같이 포착 항체로서 ESH4를 사용하고 검출 항체로서 바이오티닐레이티드(biotinylated) ESH8을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 결정되었다(Lubin, I.M. et al, 1994, "인자 Ⅷ에서 주요 억제자 에피토프의 제거",J. Biol. Chem.269:8639-8641). 전장 재조합 fⅧ은 표준으로서 사용되었고 값들(values)은 fⅧ의 전장과 B-도메인 없는 형태 사이의 질량에 있어서의 차이에 대하여 수정되었다. 샘플들은 4중으로 분석되었다. 변분의 평균 계수는 9.0%이였다. fⅧ 분자들의 비(比)활성도는 ELSA에 의해 결정된 것처럼 응고 활성도를 농도로 나누어 계산되었다. 다음 값들이 얻어졌다(mg 당 유닛): HB-, 7,800; Met2199Ile, 12,800; Phe2200Leu, 10,200; Val2223Ala, 19,600; Lys2227Glu, 36,200; Leu2252Phe, 10,100; Met2199Ile/Phe2200Leu, 10,000; Val2223Ala/Lys2227Glu, 33,200; Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu, 14,200. 일부 돌연변이체들의 외견 비활성도는 HB-보다 높다. 이것은 HB-와 비교해서 포착 또는 탐지 항체를 결합하는 돌연변이체들의 상대적으로 적게 감소된 능력으로 인한 것일 수 있고, fⅧ 질량의 과소 평가 및 비활성도의 과대 평가에 이를 수 있다.

표 1

인간 FⅧ과 비교하여 C2-특이 억제 항체들에 대한 FⅧ C2 돌연변이체들의 항원성

		항원성 ^a
돌연변이체	적음	같음	많음
Met2199Ile	4/7	0/7	3/7
Phe2200Leu	4/7	2/7	1/7
Val2223Ala	0/7	2/7	5/7
Lys2227Glu	2/7	1/7	4/7
Leu2252Phe	4/7	3/7	0/7
Met2199Ile/Phe2200Leu	6/7	1/7	0/7
Val2223Ala/Lys2227Glu	4/7	1/7	2/7
Met2199Ile/Phe2200Leu/Val2223Ala/Lys2227Glu	7/7	0/7	0/7
HP20	7/7	0/7	0/7

^a99% 신뢰 수준에서 상당한 차이

Claims

2199, 2200, 2223, 2227 및 2252로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 B-도메인이 없는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 메티오닌 2199 대신에 치환된 아이소류신을 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 페닐알라닌 2200 대신에 치환된 류신을 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 류신 2252 대신에 치환된 페닐알라닌을 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 메티오닌 2199 대신에 치환된 아이소류신 및 페닐알라닌 2200 대신에 치환된 류신을 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 발린 2223 대신에 치환된 알라닌 및 라이신 2227 대신에 치환된 글루타메이트를 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인간 인자는 메티오닌 2199 대신에 치환된 아이소류신, 페닐알라닌 2200 대신에 치환된 류신, 발린 2223 대신에 치환된 알라닌 및 라이신 2227 대신에 치환된 글루타메이트를 포함하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 상응하는 인간 단백질과 비교해서 감소된 항원성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 상응하는 인간 단백질과 비교해서 감소된 면역성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 상응하는 인간 단백질과 비교해서 감소된 면역성 및 감소된 항원성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 밀리그램당 약 2,000 units 보다 큰 비활성도를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 밀리그램당 약 3,000 units 보다 큰 비활성도를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 밀리그램당 약 5,000 units 보다 큰 비활성도를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 밀리그램당 약 10,000 units 보다 큰 비활성도를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 단일 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 2중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 3중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 4중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 인간 인자 Ⅷ과 비교해서 적어도 하나의 C2-특이 억제 항체에 대하여 보다 낮은 항원성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 인간 인자 Ⅷ 또는 전장 재조합 인자 Ⅷ과 비교해서 단클론 항체 BO2C11의 증가되거나 감소된 베데스다 역가를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 인간 인자 Ⅷ 또는 전장 재조합 인자 Ⅷ과 비교해서 단클론 항체 NMC Ⅷ-5의 증가되거나 감소된 베데스다 역가를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
제1항에 있어서, 상기 변형된 인자는 인간 인자 Ⅷ 또는 재조합 인간 인자 Ⅷ과 비교해서 적어도 하나의 억제 항체 제제에 대하여 증가되거나 감소된 베데스다 역가를 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인간 인자 Ⅷ.
상응하는 인간 인자 Ⅷ 아미노산 대신에 비-인간 인자 Ⅷ 아미노산의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 변형된 인자 Ⅷ.
제24항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비-인간 인자 Ⅷ 아미노산 치환은 비-인간 포유동물로부터인 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ.
제25항에 있어서, 상기 비-인간 포유동물은 돼지, 개 및/또는 뮤린인 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ.
제25항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 그것이 유도되었던 인자 Ⅷ 분자 또는 다른 인자 Ⅷ 제제들과 비교해서 응고 활성 및 개선된 항원성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ.
제25항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 알라닌이 아닌 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ.
제25항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 그것이 유도되었던 인자 Ⅷ 분자 또는 다른 인자 Ⅷ 분자들과 비교해서 감소된 면역성을 가지는 것을 특징으로 하는 변형된 인자 Ⅷ.
억제 항체에 대한 반응성이 감소되고 전구응고 활성이 유지되도록 위치 2199, 2200, 2223, 2227 및 2252 중 적어도 하나에서 자연 발생 아미노산 대신에 면역 반응성 환원(reducing) 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2199인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2200인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2223인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2227인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2252인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 단일 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 2중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 3중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 4중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
항원성이 감소되고 전구응고 활성이 유지되도록 위치 2199, 2200, 2223, 2227 및 2252 중 적어도 하나에서 자연 발생 아미노산 대신에 면역-반응성 환원 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2199인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2200인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2223인 것을특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2227인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 치환된 아미노산은 위치 2252인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 단일 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 2중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 3중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 변형된 인자 Ⅷ은 4중 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 인자 Ⅷ을 변형하는 방법.