CN1388243A - 一株酿酒酵母工程菌及其生产酒精和麦角固醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母工程菌ZHJM－1CGMCC № 0578以及一种用该酿酒酵母工程菌同时高产酒精和麦角固醇的方法,包括以下步骤:1．将酿酒酵母工程菌ZHJM－1接种于总还原糖浓度为30%－60%,含0.1－0.5%硫酸铵,0.1%磷酸,pH为4.5－7.0的发酵培养基中,在28－40℃条件下培养35－60小时;2．将得到的发酵液进行过滤,分别收集上清液及滤渣(其中80%以上为酵母细胞);3．自上清液中蒸馏获得酒精,自酵母细胞中提取麦角固醇。
Description
本发明涉及酵母菌及其应用，特别是涉及一株酿酒酵母工程菌及利用该菌生产酒精和麦角固醇的方法。
酒精(又称乙醇)在人们的日常生活及生产中具有重要作用。由于它燃烧时释放到环境中的污染物较汽油要少得多，用乙醇来补充或替代汽油可减轻国家对石油的依赖。它可直接用作燃料，也可以不同浓度与汽油混合使用。美国环保局的资料表明，汽油里掺入10％的乙醇可减少25％-30％一氧化碳排放量。若按此比例配制复合性燃料酒精，我国每年约需酒精500万吨，市场是巨大的。燃料酒精开发研究作为国家“十.五”重大攻关项目已经全面启动，降低酒精的发酵生产成本是问题的关键。目前，国内外发酵生产酒精主要存在以下几个问题：1、产品单一，其主产品只有酒精，发酵后的酵母菌细胞通常作饲料蛋白用，致使酒精生产成本偏高，综合开发利用率较低，既增加了成本，又污染环境。2、发酵成熟醪的酒精浓度较低(一般在9-12％左右)，严重限制了酒精单产的增加，同时耗费大量的酒精蒸馏提取等能源和费用。3、发酵强度不高，发酵周期长，一般需要60-90小时。4、使用的酒精酵母正常发酵温度范围窄，一般在28-33℃，使得酒精生产受季节温度影响较大，发酵温度控制费用较大。
本发明的目的是提供一株能够同时生产酒精和麦角固醇的酿酒酵母工程菌。
本发明的酿酒酵母工程菌ZHJM-1 CGMCC № 0578已于2001年05月16日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(其简称为CGMCC)，保藏编号为CGMCC № 0578。
酿酒酵母工程菌ZHJM-1的构建过程是：依据不同酵母菌种的生理生化特性，分别筛选生产酒精的酒精酵母菌种2.558(Saccharomyces cerevisiae 2.558，可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心买到)和细胞麦角固醇含量高的面包酵母菌种2.403(Saccharomyces cerevisiae 2.403，可以在中国普通微生物菌种保藏管理中心买到)，对上述菌种进行生孢培养、单倍体分离，经紫外线和亚硝基胍诱变筛选具有不同交配型及不同遗传标记的单倍体突变菌株(2.558-12 a his和2.403-8αtrp)；
将分离到的高产酒精的酵母菌单倍体突变菌株与细胞麦角固醇含量高的酵母菌单倍体突变菌株进行杂交；
在YNB基本培养基上筛选得到高产酒精和麦角固醇的酵母工程菌ZHJM-1。
本发明的另一个目的是提供一种利用上述酿酒酵母工程菌ZHJM-1同时高产酒精和麦角固醇的方法。为实现这一目的，本发明采取以下设计方案：一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，包括以下步骤：
1)将上述酿酒酵母工程菌ZHJM-1接种于总还原糖浓度为30％-60％，含0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，pH为4.5-7.0的发酵培养基中，在28-40℃条件下培养35-60小时；
2)将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣；
3)自上清液中蒸馏获得酒精，自滤渣中提取麦角固醇。
在上述过程中，所述菌种的接种量为10％-40％，其中优选的是20％-30％，最优选的是25％。
所述培养基的还原糖为玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液或糖蜜。
所述在28-40℃条件下培养35-60小时，是指首先搅拌培养15-30小时，然后静止培养20-30小时。
为了使发酵的效果更好，所述接种的酿酒酵母工程菌ZHJM-1在接种之前，应将斜面培养的菌种活化，培养为液体菌种，液体菌种经过至少三级液体种子培养后，接种到发酵培养基中。所述的斜面菌种是将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于总糖含量为2-35％的麦芽汁固体斜面或YEPD固体斜面上，在28-40℃条件下培养20-72小时后，放入4℃冰箱保存。所述液体菌种是将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为8-35％的麦芽汁或YEPD液体培养基的三角瓶中，于28-40℃搅拌培养14-20小时，即为液体菌种。所述至少三级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按5-30％的接种量接入装有250毫升，总糖含量8-35％的糖化液的三角瓶中，于28-40℃搅拌培养14-20小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按5-30％的接种量接入装有300升，总糖含量为10-35％的糖化液的种子培养罐，在28-40℃条件下搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物；所述三级液体种子培养：是将二级种子培养液按10-30％的接种量接入装有3000升，总糖含量为10-35％的糖化液的种子培养罐，在28-40℃条件下搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物。
本发明的酿酒酵母工程菌ZHJM-1，具有耐高温、耐高渗透压、耐高浓度酒精、酵母细胞的麦角固醇含量高等特性。发酵成熟醪的酒精浓度达13％(v/v)以上，酵母细胞的麦角固醇含量达细胞干重的2％以上。这样，通过一次发酵即可生产酒精和麦角固醇两个产品。
本发明使用的发酵底物是普通的麦芽汁、淀粉糖化液或糖蜜等，只需调节其还原糖总含量，适当添加硫酸铵和磷酸，即可进行正常生产，方法简单，成本低廉。
本发明发酵周期短，正常发酵的温度范围较宽，该方法对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒精发酵厂的设备和条件均可生产，生产投资较少。
用本发明的方法生产的酒精和麦角固醇与单独发酵生产的这两种产品在质量上无任何差异。本发明的方法实用性强，操作简便，易于推广。由于一次发酵同时获得两个产品，所以投资少、见效快、效益高，具有很强的市场竞争力。
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1、
利用酿酒酵母工程菌ZHJM-1发酵生产酒精和麦角固醇，步骤如下：
1、斜面菌种：将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于含有总糖含量为3％的麦芽汁固体斜面上，在30℃条件下培养70小时后，放入4℃冰箱保存；
2、液体菌种：将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升，总糖含量为10％的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于30℃搅拌条件下培养20小时，即为液体菌种；
3、一级液体种子培养：将液体菌种按8％的接种量接入装有250毫升，总糖含量10％的玉米淀粉糖化液三角瓶中，于30℃搅拌条件下培养19小时，得到一级液体种子培养物；
4、二级液体种子培养：将一级种子培养液按8％的接种量接入装有300升总糖含量为15％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在30℃搅拌条件下，培养19小时，得到二级液体种子培养物；
5、三级液体种子培养：将二级种子培养液按15％的接种量接入装有3000升总糖含量为15％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在30℃搅拌条件下，培养19小时，得到三级液体种子培养物。
6、发酵培养基的制备
培养基是总还原糖浓度为35％的玉米淀粉糖化液，添加0.15％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为5；
7、发酵罐发酵：将三级种子培养液按15％的接种量接入装有2000升上一步配制的总糖含量为35％的玉米淀粉糖化液培养基中，在30℃条件下搅拌培养28小时，然后静止培养28小时；
8、按常规方法将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣(滤渣中80％
以上为酵母细胞)；
9、按工业生产中的常规方法自上清液中蒸馏获得酒精，自酵母菌细胞中提取麦角固醇。
实施例2
本实施例的步骤与实施例1相同，只是对培养基配方、培养条件做了适当调整，其步骤如下：
1、斜面菌种：将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于含有总糖含量为10％的YEPD固体斜面上，在35℃条件下培养50小时后，放入4℃冰箱保存；
2、液体菌种：将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升，总糖含量为20％的YEPD液体培养基的三角瓶中，于35℃搅拌条件下培养18小时，即为液体菌种；
3、一级液体种子培养：将液体菌种按18％的接种量接入装有250毫升，总糖含量18％的大米淀粉糖化液三角瓶中，于35℃搅拌条件下培养18小时，得到一级液体种子培养物；
4、二级液体种子培养：将一级种子培养液按8％的接种量接入装有300升总糖含量为20％的大米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养18小时，得到二级液体种子培养物；
5、三级液体种子培养：将二级种子培养液按15％的接种量接入装有3000升总糖含量为20％的大米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养18小时，得到三级液体种子培养物。
6、发酵培养基：
培养基是总还原糖浓度为45％的大米淀粉糖化液，添加0.25％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为6；
7、发酵罐发酵：将三级种子培养液按20％的接种量接入装有2000升上一步配制的总糖含量为45％的玉米淀粉糖化液培养基中，在30℃条件下搅拌培养22小时，然后静止培养25小时；
8、按常规方法将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣(滤渣中80％；
以上为酵母细胞)；
9、按工业生产中的常规方法自上清液中蒸馏获得酒精，自酵母菌细胞中提取麦角固醇。
实施例3
利用酿酒酵母ZHJM-1发酵生产酒精和麦角固醇，步骤如下：
1、斜面菌种：将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于含有总糖含量为20％的YEPD固体斜面上，在40℃条件下培养22小时后，放入4℃冰箱保存；
2、液体菌种：将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升，总糖含量为33％的YEPD液体培养基的三角瓶中，于30℃搅拌条件下培养14小时，即为液体菌种；
3、一级液体种子培养：将液体菌种按28％的接种量接入装有250毫升，总糖含量32％的大米淀粉糖化液三角瓶中，于38℃搅拌条件下培养14小时，得到一级液体种子培养物；
4、二级液体种子培养：将一级种子培养液按8％的接种量接入装有300升总糖含量为20％的大米淀粉糖化液种子培养罐，在38℃搅拌条件下，培养14小时，得到二级液体种子培养物；
5、三级液体种子培养：将二级种子培养液按15％的接种量接入装有3000升总糖含量为20％的大米淀粉糖化液种子培养罐，在38℃搅拌条件下，培养14小时，得到三级液体种子培养物。
6、四级液体种子培养：将三级种子培养液按15％的接种量接入装有30000升总糖含量为20％的大米淀粉糖化液种子培养罐，在38℃搅拌条件下，培养14小时，得到四级液体种子培养物。
7、发酵培养基：
培养基是总还原糖浓度为52％的甘薯淀粉糖化液，添加0.35％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为4.5；
8、发酵罐发酵：将四级种子培养液按25％的接种量接入装有2000升上一步配制的总糖含量为52％的甘薯淀粉糖化液培养基中，在35℃条件下搅拌培养15小时，然后静止培养20小时；
9、按常规方法将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣(滤渣中80％
以上为酵母细胞)；
10、按工业生产中的常规方法自上清液中蒸馏获得酒精，自酵母菌细胞中提取
麦角固醇。
实施例4
利用酿酒酵母工程菌ZHJM-1发酵生产酒精和麦角固醇，步骤如下：
1、斜面菌种：将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于含有总糖含量为35％的麦芽汁固体斜面上，在32℃条件下培养30小时后，放入4℃冰箱保存；
2、液体菌种：将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1斜面菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升，总糖含量为35％的麦芽汁液体培养基的三角瓶中，于35℃搅拌条件下培养20小时，即为液体菌种；
3、一级液体种子培养：将液体菌种按20％的接种量接入装有250毫升，总糖含量20％的玉米淀粉糖化液三角瓶中，于35℃搅拌条件下培养19小时，得到一级液体种子培养物；
4、二级液体种子培养：将一级种子培养液按20％的接种量接入装有300升总糖含量为20％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养19小时，得到二级液体种子培养物；
5、三级液体种子培养：将二级种子培养液按20％的接种量接入装有3000升总糖含量为20％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养19小时，得到三级液体种子培养物。
6、四级液体种子培养：将三级种子培养液按20％的接种量接入装有30000升总糖含量为20％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养19小时，得到四级液体种子培养物。
7、五级液体种子培养：将四级种子培养液按20％的接种量接入装有300000升总糖含量为20％的玉米淀粉糖化液种子培养罐，在35℃搅拌条件下，培养19小时，得到五级液体种子培养物。
8、发酵培养基的制备
培养基是总还原糖浓度为56％的甜菜糖蜜，1.0％的玉米水解液，添加0.1％硫酸铵，0.1％磷酸，培养基的pH为6；
9、发酵罐发酵：将五级种子培养液按26％的接种量接入装有2000升上一步配制的培养基中，在30℃条件下搅拌培养22小时，然后静止培养25小时；
10、按常规方法将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣(滤渣中80％以上为酵母细胞)；
11按工业生产中的常规方法自上清液中蒸馏获得酒精，自酵母菌细胞中提取麦角固醇。
Claims (9)
1、酿酒酵母工程菌ZHJM-1 CGMCC №0578。
2、一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的酿酒酵母工程菌ZHJM-1接种于总还原糖浓度为30％-60％，含0.1-0.5％硫酸铵，0.1％磷酸，pH为4.5-7.0的发酵培养基中，在28-40℃条件下培养35-60小时；
2)将得到的发酵液进行过滤，分别收集上清液及滤渣；
3)自上清液中蒸馏获得酒精，自滤渣中提取麦角固醇。
3、根据权利要求2所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述菌种的接种量为10％-40％，其中优选的是20％-30％，最优选的是25％。
4、根据权利要求2所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述培养基的还原糖为玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液或糖蜜。
5、根据权利要求2所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述在28-40℃条件下培养35-60小时，是指首先搅拌培养15-30小时，然后静止培养20-30小时。
6、根据权利要求2所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：在接种所述的酿酒酵母工程菌ZHJM-1之前，将斜面培养的菌种活化，培养为液体菌种，液体菌种经过至少三级液体种子培养后，接种到发酵培养基中。
7、根据权利要求6所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述的斜面菌种是将酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种接种于总糖含量为2-35％的麦芽汁固体斜面或YEPD固体斜面上，在28-40℃条件下培养20-72小时后，放入4℃冰箱保存。
8、根据权利要求6所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述液体菌种是将保存的酿酒酵母工程菌ZHJM-1菌种活化后，接一环细胞于装有150毫升总糖含量为8-35％的麦芽汁或YEPD液体培养基的三角瓶中，于28-40℃搅拌培养14-20小时，即为液体菌种。
9、根据权利要求6所述的一种同时生产酒精和麦角固醇的方法，其特征在于：所述至少三级液体种子培养是指：一级液体种子培养，是将液体菌种按5-30％的接种量接入装有250毫升，总糖含量8-35％的糖化液的三角瓶中，于28-40℃搅拌培养14-20小时，即为一级液体种子培养物；所述二级液体种子培养，是将一级种子培养液按5-30％的接种量接入装有300升，总糖含量为10-35％的糖化液的种子培养罐，在28-40℃条件下搅拌培养14-20小时，即为二级液体种子培养物；所述三级液体种子培养：是将二级种子培养液按10-30％的接种量接入装有3000升，总糖含量为10-35％的糖化液的种子培养罐，在28-40℃条件下搅拌培养14-20小时，即为三级液体种子培养物。
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