CN113980825A - 富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法 - Google Patents
富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法。本发明提供了一种富含麦角甾醇的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020118。本发明的目的是为了提供一种绿色，经济，高效、新颖、稳定的富含麦角甾醇酵母粉及酵母浸出物联产的方法。该方法能完美实现副产物的二次开发及利用，全套工艺无副产物产生，符合绿色环保生产的要求，且具有突出显著的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株富含麦角甾醇的菌株及其联产麦角甾醇和浸出物的方法。
背景技术
麦角甾醇(ergosterol)，又名麦角固醇，其化学名称为24β-甲基胆固醇-5,7烯-3β-羟基，分子式为C28H44O，分子量396.66。在1889年，由Tanret首次从燕麦中分离得到，是甾族(steriol)化合物中甾醇(sterol)的一种，甾醇是一类含环戊烷多氢菲核的饱和和不饱和高分子一元醇，在生物体内可以以游离形式存在，也可与脂肪酸结合形成甾醇酯。麦角甾醇难溶于水，易溶于乙醇、石油醚、正庚烷等有机溶剂，麦角固醇属不饱和化合物，即使是在常温下，在遇到光线和空气中氧的时候也会被氧化，麦角甾醇的生理功能主要承担细胞的内吞作用、蛋白质稳定作用、蛋白质分选作用、膜曲率的形成、保持膜的通透性、调节受体功能，促进膜微区(筏状结构)形成等。
麦角固醇的经济价值在于它是重要的医药化工中间体，是脂溶性维生素D2的前体，在受到紫外线照射时，分子中四个碳环中的一个发生断裂，变成维生素D2，麦角固醇的衍生物22，23-二氢麦角固醇，经紫外线照射后转变为维生素D4。而维生素D2，是一种具有广泛效应的激素载体，在调节人体代谢过程中起着重要作用，能促进钙、磷等矿物质的吸收，保证骨的正常形成和代谢，且具有明显的抗癌功效。若摄入量不足，会产生严重的缺乏病，临床上用于治疗佝偻病，特别是婴幼儿佝偻性病变、老年人的骨质疏松病、骨结核和龋齿等病症。另外，对居住在常年光照不足地区以及长期从事井下、夜间和户内工作的人有重要的保健作用。在饲料工业上，维生素D2被大量用作饲料添加剂，以增加家禽和鸟类等的产蛋率和孵化率。维生素D，亦可用作不同类型、不同层次的食品、饮料、糖果等的添加剂，在植物营养领域，有研究认为维生素D2可刺激某些植物根系的生成。
近些年，生产维生素D2的技术路线主要是从酵母细胞中提取麦角固醇，经紫外光照射转变为维生素D2，也是工业上生产维生素D2的主要方法，我国维生素D2行业主要因为上游原料富含麦角固醇的微生物菌种发酵水平低和提取工艺落后而一直未能满足市场需求，每年需进口大量的维生素D2以用于药用和生产婴幼儿保健食品，因此随着人们健康意识的提高，维生素D2逐渐成为大家关注品种之一。
由于麦角甾醇化学结构中存在不对称中心，其通过化学合成方法工艺复杂，成本高昂。因此生物发酵法成为最有潜力的技术路线。麦角甾醇主要存于真核生物细胞壁中，酵母中含量一般在0.3-6％，工业生产的抗生素废菌丝中含有0.04-1％等。目前国内外生产麦角固醇的方法主要有两种：利用酵母菌发酵生产麦角固醇和从抗生素菌丝体中提取麦角固醇。据相关研究报道的从青霉素废菌丝体中提取麦角固醇技术，主要以青霉素、柠檬酸或乳酸发酵废菌丝体为原料，经细胞破壁、皂化、萃取、结晶、干燥等工艺提取麦角固醇但因其提取收率低，生产成本偏高，目前未见规模化的工业生产报道。
发明内容
目前，国内关于酵母法生产麦角固醇的研究主要集中在菌种选育、配方优化、发酵策略优化等方面，菌种的研究主要在于通过诱变或原生质体融合等方式进行优良菌种的选择，进行培养，收获酵母菌体，后工序中麦角固醇的提取工艺主要集中在传统的皂化法，该工艺会涉及使用到大量的有机溶剂，甚至易燃易爆化有毒性原料化学物，生产安全隐患大，另外该路线也并不符合规模化绿色大生产的趋势要求。
本发明的目的是为了提供一种绿色，经济，高效、新颖、稳定的富含麦角甾醇酵母粉及酵母浸出物联产的方法。安琪酵母公司凭借酵母及其酵母浸出物联产的生产线配制优势，及对酵母菌本身属性30多年的认知及生产控制经验的积累，创新地开发出本发明提出的以同时实现富含麦角甾醇酵母粉及酵母浸出物的高效经济的绿色方法，且该方法能完美实现副产物的二次开发及利用，全套工艺无副产物产生，符合绿色环保生产的要求，且具有突出显著的经济效益。
麦角甾醇作为医药级中间体原料，对于“食药同源”品质划分要求来说，食品级富含麦角甾醇酵母粉原料安全性更高：本发明实施方法中菌种符合法律法规，生产原料均符合食品级标准，且实施过程均符合食品级标准生产线要求。解决酿酒酵母麦角甾醇含量与麦角甾醇总产量的平衡问题：发酵周期短，实现单位酵母麦角甾醇含量及酵母产量的“双高”平衡，麦角甾醇含量30000ppm-45000ppm以上，酵母生物量45-55g/L，麦角甾醇总产量135-300mg/100ml以上；解决了麦角甾醇在酵母细胞内稳定性问题：胞内麦角甾醇的稳定性关键控制方法；解决了麦角甾醇生产经济效益及绿色生产问题：采用本技术方法，可实现富含麦角甾醇酵母及其浸出物的联产，大大降低产品成本及经济效益叠加，不存在副产物浪费。原因是酵母麦角甾醇(或总固醇)仅占酵母细胞内含物的5％以下，如果仅以酵母粉提取麦角甾醇，剩下95％副产物无法经济利用，此方法提取的麦角甾醇不仅成本高，另一方面通过皂化法提取麦角甾醇后的酵母粉副产物往往因为残留有机溶剂及灰分超标而无法回收利用，造成巨大浪费。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种产麦角甾醇的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020118。
本发明还提供了所述的酵母菌株在发酵生产麦角甾醇方面的应用，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，其麦角甾醇的总产量为80mg/ml以上，优选为130mg/ml以上，更优选为220mg/ml以上。
优选的，其中，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，酵母的生物量干重为45-85g/L，优选为45-55g/L。
本发明还提供了一种含有麦角甾醇的干酵母，其特征在于，所述干酵母为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)的干酵母，其中，麦角甾醇的含量为15000-45000ppm，优选为30000-45000ppm。
本发明还提供了一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的酿酒酵母ER18，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母ER18，所述微生物菌剂含有酿酒酵母ER18的干酵母活细胞总数在60-100亿CFU/g。
本发明还提供了一种利用所述的酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：将酵母菌株接种在摇瓶培养基中进行发酵培养，得到摇瓶培养液，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18，保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M 2020118，其中，培养基的含糖量为5-10％；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到摇瓶培养基中进行发酵培养，得到一级发酵培养液；一级发酵罐体积为0.2-20m3；培养液的含糖量为5-10％；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，得到二级发酵培养液，一级发酵罐体积为20-60m3；培养液的含糖量为5-10％；
(4)三级发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于三级培养基中进行发酵培养，得到三级发酵培养液，三级发酵罐的体积为60-150m3；培养液的含糖量为5-10％；
(5)商品发酵：将步骤(3)得到的三级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，得到商品发酵培养液，商品发酵罐的体积为150-400m3，培养液的含糖量为10-30％；得到富含麦角甾醇的酵母乳；
优选的，所述方法中的步骤(3)-(5)中可以根据需要省略其中的步骤。
优选的，其中，步骤(1)-(5)中培养温度为28-35℃，优选为30-33℃；pH值为4.5-7.0，优选为4.8-6.0。
优选的，其中，所述摇瓶培养的时间为20-30h，一级发酵的时间为8-15h；优选的，二级发酵的时间为40-50h，三级发酵的时间为30-40h；更优选的，商品发酵的时间为20-30h。
优选的，其中，按重量份计，步骤(1)-(5)中所述的培养基包含以下组分：碳源25-50份，氮源2-5份，磷酸二氢钾0.1-0.6份，硫酸镁0.02-0.04份，硫酸锌0.02-0.05份和磷酸二氢铵0.2-0.8份。
优选的，其中，所述碳源选自甘蔗糖蜜，甜菜糖蜜，玉米水解糖，葡萄糖，蔗糖和麦芽糖中的一种或两种以上；所述氮源选自玉米浆，植物蛋白胨，氨水，硫酸铵和酵母浸出物中的一种或两种以上。
优选的，其中，所述发酵溶解氧DO为40-80％，优选的，所述呼吸商RQ为0.95-1.2。
优选的，其中，所述步骤(5)后还可以包括联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉的步骤。
优选的，其中，所述步骤(5)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为60-90℃，所述时间为1-10h，优选为1-2h。
优选的，其中，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-15％的溶液，将pH调节为4.5-5.5，经过酶解处理；优选的，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-30％的溶液，将pH调节为4-7。
优选的，其中，所述酶选自蛋白酶和/或破壁酶，所述酶用量为0.2-2‰，优选的，酶解时间为5-20h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉；进一步优选的，所述酶解时间为5-8h。
本发明还提供了所述的方法生产得到的富含麦角甾醇的酵母乳，酵母浸出物和/或富含麦角甾醇的酵母粉。
本发明还提供了一种酵母浸出物，其特征在于，其总氮的含量为≥9.97，氨基酸含量为≥4.75，麦角甾醇含量为≥500ppm。
本发明所取得的有益效果是：本发明将高附加值产品麦角甾醇与酵母浸出物实行联产是一种经济、有效、可行的技术方法。通过本发明的实施，可将生物量及单位细胞麦角甾醇含量均达到高于以上文献专利报道水平。通过本发明的实施，既可实现高附加值麦角甾醇原料酵母的生产，又可将副产物酵母浸出物作开发利用，最大程度上实现副产物的开发，生产成本的大幅降低，以及经济收益的双重叠加，实现产业链的绿色，高效，清洁生产。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)于2020年05月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2020118，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
具体实施方式
如上所述，本发明是安琪酵母股份有限公司选育一株酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)，该酵母菌株于2020年05月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO:M2020118。
该酿酒酵母ER18，细胞直径约3-5μm，呈现椭球形，以出芽方式无性繁殖；在固体培养基平板上30℃培养24h后，为乳白色，不透明，光滑圆形菌落,发酵浓度能达到200-300g/L发酵液，麦角甾醇含量可达到3-4.5％，麦角甾醇总产量达到总产量220-300mg/ml发酵液，适用于工业化大生产。
本发明提供了一种产麦角甾醇的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2020118。
本发明还提供了所述的酵母菌株在发酵生产麦角甾醇方面的应用，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，其麦角甾醇的总产量为80mg/ml以上，优选为130mg/ml以上，更优选为220mg/ml以上。
优选的，其中，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，酵母的生物量干重为45-85g/L，优选为45-55g/L。
本发明还提供了一种含有麦角甾醇的干酵母，其特征在于，所述干酵母为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)的干酵母，其中，麦角甾醇的含量为15000-45000ppm，优选为30000-45000ppm。
本发明还提供了一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的酿酒酵母ER18，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母ER18，所述微生物菌剂含有酿酒酵母ER18的干酵母活细胞总数在60-100亿CFU/g。
本发明还提供了一种利用所述的酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：将酵母菌株接种在摇瓶培养基中进行发酵培养，得到摇瓶培养液，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18，保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M 2020118，其中，培养基的含糖量为5-10％；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到摇瓶培养基中进行发酵培养，得到一级发酵培养液；一级发酵罐体积为0.2-20m3；培养液的含糖量为5-10％；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，得到二级发酵培养液，一级发酵罐体积为20-60m3；培养液的含糖量为5-10％；
(4)三级发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于三级培养基中进行发酵培养，得到三级发酵培养液，三级发酵罐的体积为60-150m3；培养液的含糖量为5-10％；
(5)商品发酵：将步骤(3)得到的三级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，得到商品发酵培养液，商品发酵罐的体积为150-400m3，培养液的含糖量为10-30％；得到富含麦角甾醇的酵母乳；
优选的，所述方法中的步骤(3)-(5)中可以根据需要省略其中的步骤。
优选的，其中，步骤(1)-(5)中培养温度为28-35℃，优选为30-33℃；pH值为4.5-7.0，优选为4.8-6.0。
优选的，其中，所述摇瓶培养的时间为20-30h，一级发酵的时间为8-15h；优选的，二级发酵的时间为40-50h，三级发酵的时间为30-40h；更优选的，商品发酵的时间为20-30h。
优选的，其中，按重量份计，步骤(1)-(5)中所述的培养基包含以下组分：碳源25-50份，氮源2-5份，磷酸二氢钾0.1-0.6份，硫酸镁0.02-0.04份，硫酸锌0.02-0.05份和磷酸二氢铵0.2-0.8份。
优选的，其中，所述碳源选自甘蔗糖蜜，甜菜糖蜜，玉米水解糖，葡萄糖，蔗糖和麦芽糖中的一种或两种以上；所述氮源选自玉米浆，植物蛋白胨，氨水，硫酸铵和酵母浸出物中的一种或两种以上。
优选的，其中，所述发酵溶解氧DO为40-80％，优选的，所述呼吸商RQ为0.95-1.2。
优选的，其中，所述步骤(5)后还可以包括联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉的步骤。
优选的，其中，所述步骤(5)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为60-90℃，所述时间为1-10h，优选为1-2h。
优选的，其中，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-15％的溶液，将pH调节为4.5-5.5，经过酶解处理；优选的，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-30％的溶液，将pH调节为4-7。
优选的，其中，所述酶选自蛋白酶和/或破壁酶，所述酶用量为0.2-2‰，优选的，酶解时间为5-20h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉；进一步优选的，所述酶解时间为5-8h。
本发明还提供了所述的方法生产得到的富含麦角甾醇的酵母乳，酵母浸出物和/或富含麦角甾醇的酵母粉。
本发明还提供了一种酵母浸出物，其特征在于，其总氮的含量为≥9.97，氨基酸含量为≥4.75，麦角甾醇含量为≥500ppm。
总产量指的是麦角甾醇的mg数与发酵液ml数的比值。
麦角甾醇含量是指每100g干酵母中所含多少g麦角甾醇，或者是mg麦角甾醇/kg干酵母，1ppm＝1mg/kg.
酵母生物量(细胞干重)指的是每1L发酵液中酵母菌体绝干质量所占比例，单位是g/L。
RQ定义：呼吸商(respiratory quotient，简称RQ)，又称气体交换率，指生物体在同一时间内，释放二氧化碳与吸收氧气的体积之比或摩尔数之比，即指呼吸作用所释放的CO2和吸收的O2的分子数之比。
DO定义：溶解氧(dissolved oxygen)是指溶解在水里氧的量，通常记作DO，用每升水里氧气的毫克数表示。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。其中，实施例和对比例中所用到的原料的信息如下表所示。
表1本发明所用到的原料和仪器的信息
实施例1
利用酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子活化培养：将一环酿酒酵母ER18菌株接种在5L摇瓶培养基中进行活化发酵培养，其中，摇瓶培养培养基的含糖量为6％；其中摇瓶培养基的组成为：碳源(葡萄糖)20g，氮源(硫酸铵)8g，酵母浸出物4g，磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.2g，无菌水2L。培养时间为24h，培养温度为30℃，pH值为5.4，得到摇瓶培养液；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，一级发酵罐体积为0.5m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(葡萄糖)50kg，氮源(玉米浆)12.5kg，磷酸二氢钾2.5kg，硫酸镁0.1kg，硫酸锌0.1kg，无菌水450kg。培养时间为15h，培养温度为32℃，pH值为5.0，得到一级发酵培养液；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，二级发酵罐体积为50m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(甘蔗糖蜜)3000kg，氮源(玉米浆)750kg，磷酸二氢钾60kg，硫酸镁3kg，硫酸锌6kg，和无菌水30000kg。培养时间为40h，培养温度为30℃，pH值为5.2，DO为40-45％，所述RQ为0.95，得到二级发酵培养液；
(4)商品发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，商品发酵罐的体积为150m3，培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(甘蔗糖蜜)5000kg，氮源(氨水)1250kg，磷酸二氢钾100kg，磷酸二氢铵100kg，硫酸镁5kg，硫酸锌10kg，无菌水50m3。待RQ将至1.1，开始流加葡萄糖(10％)，根据RQ值控制在0.9±0.05，从800-1600L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速率200L/h,使得pH恒定在5.2-5.3波动，培养时间为20h，培养温度为30℃，DO控制为40％-50％，得到富含麦角甾醇的酵母乳。
(5)联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉：步骤(4)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为90℃，所述时间为4h，所述热击后得到的酵母乳配制成为15％的溶液，将pH调节为5.2，经过(碱性蛋白酶和破壁酶)1.5kg酶解处理，酶解时间为10h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉。
实施例2
利用酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子活化培养：将一环酿酒酵母ER18菌株接种在5L摇瓶培养基中进行活化发酵培养，其中，摇瓶培养培养基的含糖量为10％；其中摇瓶培养基的组成为：碳源(葡萄糖)200g，氮源(硫酸铵)50g，酵母浸出物10g，磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.2g，无菌水2L。培养时间为24h，培养温度为30℃，pH值为5.4，得到摇瓶培养液；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，一级发酵罐体积为5m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(葡萄糖)300kg，氮源(玉米浆)75kg，磷酸二氢钾6kg，硫酸镁0.3kg，硫酸锌0.6kg，无菌水3000kg。培养时间为15h，培养温度为32℃，pH值为5.0，得到一级发酵培养液；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，二级发酵罐体积为20m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(甘蔗糖蜜)1500kg，氮源(玉米浆)375kg，磷酸二氢钾30kg，硫酸镁1.5kg，硫酸锌3kg，和无菌水15m3。培养时间为45h，培养温度为30℃，pH值为5.4，DO为45-50％，所述RQ为1.1，得到二级发酵培养液；
(4)商品发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，商品发酵罐的体积为200m3，培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(甘蔗糖蜜)8000kg，氮源(氨水)2000kg，磷酸二氢钾160kg，磷酸二氢铵160kg，硫酸镁8kg，硫酸锌16kg，无菌水80m3。待RQ将至1.1，开始流加葡萄糖(10％)，根据RQ值控制在0.9±0.05，从800-1600L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速率200L/h,使得pH恒定在5.2-5.3波动，培养时间为22h，培养温度为34℃，DO控制为50％，得到富含麦角甾醇的酵母乳。
(5)联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉：步骤(4)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为90℃，所述时间为5h，所述热击后得到的酵母乳配制成为13％的溶液，将pH调节为5.5，经过(木瓜蛋白酶)3kg酶解处理，酶解时间为8h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉。
实施例3
利用酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子活化培养：将一环酿酒酵母ER18菌株接种在5L摇瓶培养基中进行活化发酵培养，其中，摇瓶培养培养基的含糖量为10％；其中摇瓶培养基的组成为：碳源(葡萄糖)200g，氮源(硫酸铵)50g，酵母浸出物10g，磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.2g，无菌水2L。培养时间为24h，培养温度为30℃，pH值为5.4，得到摇瓶培养液；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，一级发酵罐体积为15m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(玉米水解糖)1200kg，氮源(玉米浆)300kg，磷酸二氢钾24kg，硫酸镁1.2kg，硫酸锌2.4kg，无菌水12000kg。培养时间为8h，培养温度为30℃，pH值为4.8，得到一级发酵培养液；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，二级发酵罐体积为20m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(玉米水解糖)1200kg，氮源(玉米浆)300kg，磷酸二氢钾24kg，硫酸镁1.2kg，硫酸锌2.4kg，和无菌水12m3。培养时间为40h，培养温度为32℃，pH值为5.0，DO为30％，所述RQ为1.2，得到二级发酵培养液；
(4)商品发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，商品发酵罐的体积为200m3，培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(玉米水解糖)8000kg，氮源(氨水)2000kg，磷酸二氢钾160kg，磷酸二氢铵160kg，硫酸镁8kg，硫酸锌16kg，无菌水80m3。待RQ将至0.9，开始流加葡萄糖(10％)，根据RQ值控制在1.1±0.05，从800-1600L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速率200L/h,使得pH恒定在5.2-5.3波动，培养时间为25h，培养温度为34℃，DO控制为40％，得到富含麦角甾醇的酵母乳。
(5)联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉：步骤(4)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为80℃，所述时间为3h，所述热击后得到的酵母乳配制成为10％的溶液，将pH调节为5.0，经过蜗牛酶1.5kg酶解处理，酶解时间为5h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉。
实施例4
利用酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子活化培养：将一环酿酒酵母ER18菌株接种在5L摇瓶培养基中进行活化发酵培养，其中，摇瓶培养培养基的含糖量为10％；其中摇瓶培养基的组成为：碳源(葡萄糖)200g，氮源(硫酸铵)50g，酵母浸出物10g，磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.2g，无菌水2L。培养时间为22h，培养温度为32℃，pH值为5.4，得到摇瓶培养液；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，一级发酵罐体积为15m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(淀粉水解糖)1200kg，氮源(玉米浆)300kg，磷酸二氢钾24kg，硫酸镁1.2kg，硫酸锌2.4kg，无菌水12000kg。培养时间为10h，培养温度为32℃，pH值为4.8，得到一级发酵培养液；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，二级发酵罐体积为20m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(淀粉水解糖)1200kg，氮源(玉米浆)300kg，磷酸二氢钾24kg，硫酸镁1.2kg，硫酸锌2.4kg，和无菌水12m3。培养时间为45h，培养温度为32℃，pH值为5.5，DO为45％，所述RQ为1.0，得到二级发酵培养液；
(4)商品发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，商品发酵罐的体积为200m3，培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(淀粉水解糖)8000kg，氮源(氨水)2000kg，磷酸二氢钾160kg，磷酸二氢铵160kg，硫酸镁8kg，硫酸锌16kg，无菌水80m3。待RQ将至0.9，开始流加葡萄糖(10％)，根据RQ值控制在1.05±0.05，从800-1600L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速率200L/h,使得pH恒定在5.2波动，培养时间为25h，培养温度为30℃，DO控制为55％，得到富含麦角甾醇的酵母乳。
(5)联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉：步骤(4)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为85℃，所述时间为2h，所述热击后得到的酵母乳配制成为13％的溶液，将pH调节为4.8，经过(葡聚糖酶)1.8kg酶解处理，酶解时间为8h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉。
实施例5
利用酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)种子活化培养：将一环酿酒酵母ER18菌株接种在5L摇瓶培养基中进行活化发酵培养，其中，摇瓶培养培养基的含糖量为10％；其中摇瓶培养基的组成为：碳源(葡萄糖)200g，氮源(硫酸铵)50g，酵母浸出物10g，磷酸二氢钾2g和硫酸镁0.2g，无菌水2L。培养时间为28h，培养温度为30℃，pH值为5.2，得到摇瓶培养液；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到发酵罐中进行发酵培养，一级发酵罐体积为5m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(混合糖)300kg，氮源(玉米浆)75kg，磷酸二氢钾6kg，硫酸镁0.3kg，硫酸锌0.6kg，无菌水3000kg。培养时间为15h，培养温度为32℃，pH值为4.8，得到一级发酵培养液；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，二级发酵罐体积为60m3；培养基的含糖量为10％；其中培养基的组成为：碳源(混合糖)4000kg，氮源(玉米浆)1000kg，磷酸二氢钾80kg，硫酸镁4kg，硫酸锌8kg，和无菌水40m3。培养时间为43h，培养温度为32℃，pH值为4.8，DO为50％，所述RQ为1.1，得到二级发酵培养液；
(4)三级发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种到三级培养基中进行发酵培养，三级级发酵罐体积为150m3；培养基的含糖量为5％；其中培养基的组成为：碳源(混合糖)2500kg，氮源(玉米浆)1250kg，磷酸二氢钾100kg，硫酸镁5kg，硫酸锌10kg，和无菌水50m3。待RQ将至0.85，开始流加混合糖(10％)，根据RQ值控制在0.9±0.05，从200-800L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速50L/h,使得pH恒定在5.0波动，培养时间为38h，培养温度为30℃，DO为40％，得到三级级发酵培养液；
(5)商品发酵：将步骤(3)得到的三级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，商品发酵罐的体积为400m3，培养基的含糖量为5％；其中培养基的组成为：碳源(混合糖)7500kg，氮源(氨水)3750kg，磷酸二氢钾300kg，磷酸二氢铵300kg，硫酸镁15kg，硫酸锌30kg，无菌水150m3。待RQ将至1.05，开始流加葡萄糖(10％)，根据RQ值控制在1.05±0.05，从800-1600L/h逐步增加葡萄糖流加速率，氨水流加速率200L/h,使得pH恒定在5.2波动，培养时间为26h，培养温度为30℃，DO控制为55％，得到富含麦角甾醇的酵母乳。
(6)联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉：步骤(4)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为95℃，所述时间为2.5h，所述热击后得到的酵母乳配制成为20％的溶液，将pH调节为5.5，经过碱性蛋白酶2.6kg酶解处理，酶解时间为5h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉。
实施例中生产得到的含麦角甾醇的酵母粉中的生物量，单位细胞麦角甾醇含量及麦角甾醇的总产量见表2。
实施例中生产得到的酵母浸粉中的总氮(以干基计)，氨基氮(以干基计)，水分，灰分，pH(2％水溶液)，NaCl，铅，总砷含量见表3。
表2实施例生产得到酵母粉的指标
表3实施例生产得到酵母浸粉的指标
实施例1-5中联产制备得到酵母浸出物，其中，总氮的含量为9.97-11.2％，氨基酸含量为4.75-5.37％，均高于酵母浸粉的国标(GB/T35536-2017)；水分含量为2.55-3.95％，灰分含量为8.2-10.2％，pH在5.4-5.9之间，NaCl含量为0.9-3.2％，铅含量为0.1-0.3mg/kg，总砷含量为0-0.05mg/kg，均符合典型的酵母浸粉国际标准特征。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种产麦角甾醇的酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2020118。
2.权利要求1所述的酵母菌株在发酵生产麦角甾醇方面的应用，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，其麦角甾醇的总产量为80mg/ml以上，优选为130mg/ml以上，更优选为220mg/ml以上。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述发酵得到含有麦角甾醇的发酵液时，酵母的生物量干重为45-85g/L，优选为45-55g/L。
4.一种含有麦角甾醇的干酵母，其特征在于，所述干酵母为酿酒酵母ER18(Saccharomyces cerevisiae ER18)的干酵母，其中，麦角甾醇的含量为15000-45000ppm，优选为30000-45000ppm。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的酿酒酵母ER18，其活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母ER18，所述微生物菌剂含有酿酒酵母ER18的干酵母活细胞总数在60-100亿CFU/g。
6.一种利用权利要求1所述的酿酒酵母ER18菌种发酵生产富含麦角甾醇的酵母乳的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)摇瓶培养：将酵母菌株接种在摇瓶培养基中进行发酵培养，得到摇瓶培养液，所述酵母菌株为酿酒酵母ER18，保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M 2020118，其中，培养基的含糖量为5-10％；
(2)一级培养：将步骤(1)得到的摇瓶培养液接种到摇瓶培养基中进行发酵培养，得到一级发酵培养液；一级发酵罐体积为0.2-20m3；培养液的含糖量为5-10％；
(3)二级发酵：将步骤(2)得到的一级发酵培养液接种到二级培养基中进行发酵培养，得到二级发酵培养液，一级发酵罐体积为20-60m3；培养液的含糖量为5-10％；
(4)三级发酵：将步骤(3)得到的二级发酵培养液接种于三级培养基中进行发酵培养，得到三级发酵培养液，三级发酵罐的体积为60-150m3；培养液的含糖量为5-10％；
(5)商品发酵：将步骤(3)得到的三级发酵培养液接种于商品培养基中进行发酵培养，得到商品发酵培养液，商品发酵罐的体积为150-400m3，培养液的含糖量为10-30％；得到富含麦角甾醇的酵母乳；
优选的，所述方法中的步骤(3)-(5)中可以根据需要省略其中的步骤。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，步骤(1)-(5)中培养温度为28-35℃，优选为30-33℃；pH值为4.5-7.0，优选为4.8-6.0。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述摇瓶培养的时间为20-30h，一级发酵的时间为8-15h；优选的，二级发酵的时间为40-50h，三级发酵的时间为30-40h；更优选的，商品发酵的时间为20-30h。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，按重量份计，步骤(1)-(5)中所述的培养基包含以下组分：碳源25-50份，氮源2-5份，磷酸二氢钾0.1-0.6份，硫酸镁0.02-0.04份，硫酸锌0.02-0.05份和磷酸二氢铵0.2-0.8份。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述碳源选自甘蔗糖蜜，甜菜糖蜜，玉米水解糖，葡萄糖，蔗糖和麦芽糖中的一种或两种以上；所述氮源选自玉米浆，植物蛋白胨，氨水，硫酸铵和酵母浸出物中的一种或两种以上。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中，所述发酵溶解氧DO为40-80％，优选的，所述呼吸商RQ为0.95-1.2。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的方法，其中，所述步骤(5)后还可以包括联产酵母浸出物和富含麦角甾醇的酵母粉的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述步骤(5)中得到富含麦角甾醇的酵母乳进过分离后，进行热击，所述温度为60-90℃，所述时间为1-10h，优选为1-2h。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-15％的溶液，将pH调节为4.5-5.5，经过酶解处理；优选的，所述热击后得到的酵母乳配制成为10-30％的溶液，将pH调节为4-7。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述酶选自蛋白酶和/或破壁酶，所述酶用量为0.2-2‰，优选的，酶解时间为5-20h，酶解后分离，轻相经过浓缩，喷雾干燥制备出酵母浸出物，重相为富含麦角甾醇的酵母粉；进一步优选的，所述酶解时间为5-8h。
16.权利要求6-15所述的方法生产得到的富含麦角甾醇的酵母乳，酵母浸出物和/或富含麦角甾醇的酵母粉。
17.一种酵母浸出物，其特征在于，其总氮的含量为≥9.97，氨基酸含量为≥4.75，麦角甾醇含量为≥500ppm。
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