JP5249106B2

JP5249106B2 - エタノールの連続発酵製造方法

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Publication number: JP5249106B2
Application number: JP2009081215A
Authority: JP
Inventors: 一弘千葉
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2029-03-30
Also published as: JP2010227074A

Description

本発明は、糖質又はデンプン質原料を基質として用い、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法、特に、糖質又はデンプン質原料を基質として用いるエタノールの連続発酵製造方法において、発酵温度、基質の供給・発酵液の抜き出し速度、通気、酵母濃度、及び発酵液中のエタノール濃度について特定の条件を組み合わせることにより、連続発酵中、酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを可能としたエタノールの連続発酵製造方法に関する。

近年、環境問題等からガソリンのような化石燃料の代替燃料としてバイオエタノールの利用が注目を集めている。最近は、未利用バイオマスの有効活用という観点から、木材や紙類或いはワラ類のような農業廃棄物といったようなセルロース系のバイオマス原料の利用が検討されている（特開２００６−８８１３６号公報；特開２００８−５４６７６号公報；特開２００８−２６０８１１号公報；特開２００８−２９７２２９号公報；特開２００９−５９号公報）。しかし、その製造上の容易さや、製造効率の観点からは、原料として、サトウキビやてん菜に由来する糖質や、穀類等のデンプン質のような製造原料を用いたエタノールの製造が注目されている。

糖質又はデンプン質を含む原料を基質として用いて、酵母によるアルコール発酵によりエタノールを製造する技術は、工業的な発酵によるエタノールの製造技術として従来より開発が進んでいる。従来のデンプン又は糖質を含む原料からエタノールを生産する工業的な方法としては、「回分発酵方法」によるもの、「半連続発酵方法」によるもの、及び「連続発酵方法」によるものがある（大聖泰弘、三井物産（株）編、「図解バイオエタノール最前線」（工業調査会）、ｐｐ１２５−１３１、２００４）。

「回分発酵方法」は、発酵タンクにもろみを供給し、酵母を接種し一定温度で必要時間発酵させて、熟成もろみを得るという最も単純な発酵プロセスによる方法である。回分発酵方法において、濃厚仕込みを行う場合には、発酵開始時は、低基質濃度で仕込み、酵母が充分増殖し、基質が消費された時点で、一定時間毎に新たに基質を供給することによって、高濃度基質による発酵阻害を回避して最終的に高濃度の発酵生産物を得ることが行われている（添掛け発酵法）。これら回分発酵方法では、発酵毎に酵母の添加と培養を必要とするため酵母増殖に糖を使用することになり、エタノール生産効率では不利となる。更に、酵母培養時間を必要とすることからエタノール生産に要する時間も長くなる傾向があり、時間当たりのエタノール生産効率でも不利となる。

「半連続発酵方法」としては、Melle-Boint半連続発酵法が知られている。この方法では、発酵終了時に遠心分離機により酵母を回収し繰り返し酵母を利用している。しかし、これらの方式では、酵母回収用の遠心分離機や雑菌の殺菌処理設備を必要とし、穀類を原料とした発酵液のような酵母以外の固形物を含む場合には適用できないなどの問題がある。酵母を繰り返し利用する凝集性酵母を用いる繰り返し回分発酵法においても、酵母を凝集沈降により回収するため、酵母以外の固形分を含む発酵液への適用は困難である。

「連続発酵方法」として、各種の方法が開発されている。例えば、ブラジルのサトウキビ原料に使用されるカスケード式連続発酵法が知られている。また、糖蜜を用いた本格的な連続発酵方法として、１９７１年国営千葉アルコール工場において実用化された、連続蒸し煮装置で殺菌した糖蜜を１系統７本の発酵槽に連続的に供給して発酵を行わせる連続発酵方法が開発されている（藤巻正生外４名編、「食品工業」恒星社厚生閣（１９８５年９月２５日発行）ｐ４６２）。この方法では、従来の回分方式と同等又はそれ以上の発酵成績を得ることができるが、２０〜３０日以上の発酵を続けると酵母の凝集と雑菌汚染が見られるようになり、連続発酵の持続が難しくなるという技術上の問題点が残されていた。

また、発酵終了時に酵母を回収再利用しない連続発酵方法において、発酵槽の他に酵母培養タンクを持ち、常時発酵と並行して酵母培養を実施し酵母を連続又は半連続的に添加する方式が開発されている（Nottingham University Press, pp. 257-268, 1995)。しかし、この方法においては、酵母の追加的な添加を行わなければならず、また、糖分の一部をエタノール製造ではなく酵母培養に用いることとなり、エタノール生産効率上有利とはいえない。また、近年、連続発酵方法において、酵母を追加添加する方式に代えて、固定化酵母により連続発酵を行う技術が開発されている（藤巻正生外４名編、「食品工業」恒星社厚生閣（１９８５年９月２５日発行）ｐ４６３−４６４）。この方法では、長期間にわたり安定したエタノールの製造を可能としているが、固定化増殖酵母をカラムに充填する方式で、連続発酵を行うものであるため、装置的に及び操作上も複雑となる傾向がある。

一方で、発酵によるアルコールの製造方法として、デンプン質等の原料から、液化・糖化と、アルコール発酵を並行して行う方法が開示されている。該方法による連続発酵法では、酵母の追加の添加が行われている。例えば、特開昭５６−１５６９１号公報には、デンプン質を原料とし、アミラーゼ酵素剤及び酵母菌の存在下にアルコール発酵を行い、生成したアルコールを回収しつつ発酵を行うアルコールの製造方法が開示されている。該方法では、減圧蒸留によって回収されたアルコール蒸留残液を再び、アミラーゼ源、酵母源として利用している。また、特開２００８−１０４４５２号公報には、多糖類を含有する生ゴミの糖化とアルコール発酵とを同時に行うアルコール生産システムについて開示されている。該システムの連続発酵においては、糖化・発酵した醪の一部を、糖化・発酵部の最初に戻して発酵が行われている。他方、ＷＯ２００２／０４２４８３号公報には、グルコアミラーゼを細胞表層に提示する酵母を用いて、デンプンの存在下で繰り返し回分発酵又は連続発酵を行う方法が開示されている。しかし、この方法では、酵母を追加添加する代わりに、担体に固定化した酵母が用いられている。

特開昭５６−１５６９１号公報特開２００６−８８１３６号公報特開２００８−５４６７６号公報特開２００８−１０４４５２号公報特開２００８−２６０８１１号公報特開２００８−２９７２２９号公報特開２００９−５９号公報ＷＯ２００２／０４２４８３号公報

大聖泰弘、三井物産（株）編、「図解バイオエタノール最前線」（工業調査会）、ｐｐ１２５−１３１、２００４藤巻正生外４名編、「食品工業」恒星社厚生閣（１９８５年９月２５日発行）ｐ４６２ Nottingham University Press, pp. 257-268, 1995 藤巻正生外４名編、「食品工業」恒星社厚生閣（１９８５年９月２５日発行）ｐ４６３−４６４

本発明の課題は、糖質又はデンプン質原料を基質として用い、１つ若しくは複数の発酵槽を用いて、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造するエタノールの連続発酵製造方法において、連続発酵のために、酵母の追加添加や、抜き出し発酵液からの酵母の回収・再利用を行う工程を用いることなく、効率的にエタノールを連続生産する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、糖質又はデンプン質原料を基質として用い、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造するエタノールの連続発酵製造方法において、発酵温度、基質の供給・発酵液の抜き出し速度、通気、酵母濃度、及び発酵液中のエタノール濃度について特定の条件を組み合わせることにより、酵母の増殖と増殖した酵母によるアルコール発酵のバランスを有効に採ることができ、連続発酵中、酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、糖質又はデンプン質原料を基質として用いる酵母によるアルコール発酵においては、好気的条件下、基質存在下における酵母の増殖と、嫌気的条件下、基質存在下における増殖した酵母によるアルコール発酵とが行われる。回分発酵方法によるエタノールの製造においては、かかる酵母の増殖工程と、増殖した酵母によるアルコール発酵工程とが交互に行われるため、それぞれの工程に適合した条件を採用することができる。しかし、連続発酵方法におけるアルコール発酵においては、酵母による効率的なアルコールの生成を達成するために、酵母によるアルコール発酵に適した条件が採用される。したがって、酵母の増殖が抑えられると共に、連続的に発酵液として抜き出される酵母とに相俟って、酵母濃度が減少する。よって、連続発酵方法において、高いアルコールの生成を持続するには、酵母の追加添加や、抜き出し発酵液からの酵母の回収・再利用を行い、酵母を補充することが行なわれている。

エタノール製造においては、エタノール生成速度が速いほど一定期間におけるエタノール製造量が多くなり、また、製造に要する設備を削減できることから経済性も高い。したがって、エタノール生成速度を高めるには、発酵開始時の酵母濃度、即ち、培養終了時の酵母濃度を高くする必要があるが、培養終了時の酵母濃度を高めることは、エタノールとなるべき糖を酵母に変換することを意味し、エタノール生産効率を低下させる問題が生じた。

そこで、連続発酵方法におけるアルコール発酵の条件について、鋭意検討する中で、上記のとおり、連続発酵における、発酵温度、基質の供給・発酵液の抜き出し速度、通気、酵母濃度、及び発酵液中のエタノール濃度について特定の条件を組み合わせることにより、酵母の増殖と、増殖した酵母によるアルコール発酵とを両立させることが可能であり、かかる酵母の増殖と、増殖した酵母によるアルコール発酵とのバランスを有効に採ることにより、連続発酵中、酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを可能とし、本発明を完成するに至ったものである。

なお、本発明において発酵槽は、１つ若しくは複数を直列に配して、排出された発酵液が順次以降の発酵槽に供給される形式のものを用いることができる。複数の発酵槽を使用する場合には、複数の発酵槽を直列に配し、基質を第一番目の発酵槽（第１発酵槽）に投入し、第１発酵槽からのオーバーフローを第二番目に発酵槽（第２発酵槽）で受ける。以後、設置した発酵槽の数に従い、順次発酵槽の受払いを連続的に実施する。発酵槽が１つの場合は、その発酵槽を第１発酵槽とする。

そこで、本発明は、１つ若しくは直列に配置した複数の発酵槽に糖質又はデンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、連続発酵の条件を、（１）発酵温度を３０〜３５℃の範囲に設定し、（２）基質の供給・発酵液の抜き出し速度を、基質の供給液により発酵液が２倍に希釈される時間を、酵母が２倍に増殖するのに要する時間以上になるような速度に設定し、更に（３）通気量は、発酵液１ｋＬあたり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎの範囲であり、かつ、（４）酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下になるように調整し、第１発酵槽の発酵液中のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に設定することにより、連続発酵中酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを特徴とするエタノールの連続発酵製造方法からなる。

本発明は、上記のとおり、エタノールの連続発酵製造方法における連続発酵の条件の組合わせからなるものであるが、発酵温度を３０〜３５℃の範囲に設定することにより、酵母の増殖が阻害されない温度を設定している。また、基質の供給・発酵液の抜き出し速度を、基質の供給液により発酵液が２倍に希釈される時間を、酵母が２倍に増殖するのに要する時間以下になるような速度に設定することにより、酵母の増殖サイクルに合わせて、酵母の減少が起こらない条件を設定している。更に、通気量を、発酵液１ｋＬあたり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎの範囲であり、かつ、酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下になるように調整し、第１発酵槽の発酵液中のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に設定することにより、酵母濃度を維持し、エタノールの生成速度を速め、かつ、通気とエタノール濃度の調整により、アルコール発酵条件下における効率的な酵母の増殖を実現している。

本発明において、発酵に用いる酵母は特に限定されないが、Saccharomyces cerevisiaeを特に好ましい酵母として挙げることができる。また、本発明のエタノールの連続発酵製造方法における連続発酵の条件において、酵母が２倍に増殖するのに要する時間としては、例えば、酵母の増殖サイクルが５時間である場合には、５時間を設定することができる。本発明のエタノールの連続発酵製造方法における連続発酵の条件において、糖質原料を基質として用いる場合には、第１発酵槽の通気を、本発明で特定する条件により連続発酵中持続して行う。また、デンプン質原料（穀類粉砕物）を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する場合には、通気を、発酵開始後、酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまで通気を行い、その後は、通気を行うことなく連続発酵を行うことができる。かかる通気を行う時間としては、例えば、発酵開始後、１５時間までを設定することができる。デンプン質原料や、その液化液を基質として用いた場合には、エタノール生産に十分な酵母量となった場合には、通気を行なわなくても酵母の増殖とエタノールの生成を行うことが可能で、その後の通気を省略することができる。

デンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する場合には、発酵を、糖化酵素又は該酵素を産生する微生物を添加した並行複発酵により行うことができる。本発明のエタノールの連続発酵製造方法において、発酵に用いる糖質原料基質としては、サトウキビ或いはてん菜由来の糖質を挙げることができ、より経済的な糖質原料としては、サトウキビ或いはてん菜の抽出液から蔗糖を採取した後の廃糖蜜を挙げることができる。また、本発明のエタノールの連続発酵製造方法において、発酵に用いるデンプン質原料基質としては、穀類由来のデンプン、又は、該デンプンの液化物若しくは糖化物を挙げることができる。

本発明において、培養終了時の酵母濃度をエタノール生成速度とエタノール生産効率を両立する酵母濃度とすることが必要である。培養終了時の酵母濃度を０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌとし、以降濃度を０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下に維持することで、エタノール生成速度とエタノール生産効率の両立が達成できる。

すなわち、具体的には本発明は、［１］１つ若しくは複数の発酵槽に糖質又はデンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、連続発酵の条件を、（１）発酵温度を３０〜３５℃の範囲に設定し、（２）基質の供給・発酵液の抜き出し速度を、基質の供給液により発酵液が２倍に希釈される時間を、酵母が２倍に増殖するのに要する時間以上になるような速度に設定し、更に（３）通気量は、発酵液１ｋＬあたり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎの範囲であり、かつ、（４）酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下になるように調整し、第１発酵槽の発酵液中のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に設定することにより、連続発酵中酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを特徴とするエタノールの連続発酵製造方法や、［２］発酵に用いる酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることを特徴とする上記［１］記載のエタノールの連続発酵製造方法や、［３］糖質原料を基質として供給し、第１発酵槽の通気を、上記［１］に特定する条件により連続発酵中持続して行うことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のエタノールの連続発酵製造方法からなる。

また本発明は、［４］デンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、発酵開始後、酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまで通気を行うことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のエタノールの連続発酵製造方法や、［５］デンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、発酵が、糖化酵素又は該酵素を産生する微生物を添加した並行複発酵であることを特徴とする上記［１］記載のエタノールの連続発酵製造方法や、［６］発酵に用いる糖質原料基質が、サトウキビ或いはてん菜由来の糖質であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のエタノールの連続発酵製造方法からなる。

さらに本発明は、［７］サトウキビ或いはてん菜由来の糖質が、該植物の抽出液から蔗糖を採取後の廃糖蜜であることを特徴とする上記［６］記載のエタノールの連続発酵製造方法や、［８］発酵に用いるデンプン質原料基質が、穀類由来のデンプン、又は、該デンプンの液化物若しくは糖化物であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のエタノールの連続発酵製造方法からなる。

本発明のエタノールの連続発酵製造方法は、従来のエタノールの連続発酵製造方法のように連続発酵のために、酵母の追加添加や、抜き出し発酵液からの酵母の回収・再利用を行う工程を用いることなく、経済的かつ効率的にエタノールを連続生産する方法を提供する。また、本発明のエタノールの連続発酵製造方法は、デンプン質原料を基質として用いて、並行複発酵によるエタノールの連続生産方法に適用することができ、該方法により効率的にエタノールを連続生産することができる。更に、本発明のエタノールの連続発酵製造方法は、工業的なエタノールの連続発酵製造方法として適用することが可能で、経済的かつ効率的なエタノールの連続発酵製造方法を提供する。

図１は、本発明の実施例における同一基質に対する２種の酵母のエタノール生成量及び増殖の比較試験において、エタノール濃度の経時変化についての試験の結果を示す図である。図２は、本発明の実施例における同一基質に対する２種の酵母のエタノール生成量及び増殖の比較試験において、酵母濃度の経時変化についての試験の結果を示す図である。図３は、本発明の実施例における酵母濃度とエタノール生成速度との関係についての試験において、添加直後の酵母濃度と２４時間後のエタノール濃度の関係についての試験の結果を示す図である。図４は、本発明の実施例における酵母濃度とエタノール濃度との関係についての試験において、酵母濃度とエタノール濃度との関係についての試験の結果を示す図である。図５は、本発明の実施例における発酵時間と酵母濃度との関係についての試験において、発酵時間と酵母濃度との関係についての試験の結果を示す図である。図６は、本発明の実施例における発酵温度と酵母増殖及びエタノール生成との関係についての試験において、発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度との関係（その１）についての試験の結果を示す図である。図７は、本発明の実施例における発酵温度と酵母増殖及びエタノール生成との関係についての試験において、発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度との関係（その２）についての試験の結果を示す図である。図８は、本発明の実施例における発酵温度と酵母増殖及びエタノール生成との関係についての試験において、発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度との関係（その３）についての試験の結果を示す図である。図９は、本発明の実施例における通気量と酵母増殖及びエタノール生成との関係についての試験において、各通気量における酵母濃度の関係についての試験の結果を示す図である。図１０は、本発明の実施例における通気量と酵母増殖及びエタノール生成との関係についての試験において、各通気量におけるエタノール濃度の関係についての試験の結果を示す図である。図１１は、本発明の実施例における全粒穀類原料使用時の通気量についての試験において、全粒小麦粉砕物を原料とした発酵液のエタノール濃度変化の関係についての試験の結果を示す図である。

本発明は、１つ若しくは直列に配置した複数の発酵槽に糖質又はデンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、連続発酵の条件を、（１）発酵温度を３０〜３５℃の範囲に設定し、（２）基質の供給・発酵液の抜き出し速度を、基質の供給液により発酵液が２倍に希釈される時間を、酵母が２倍に増殖するのに要する時間以上になるような速度に設定し、更に（３）通気量は、発酵液１ｋＬあたり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎの範囲であり、かつ、（４）酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下になるように調整し、第１発酵槽の発酵液中のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に設定することにより、連続発酵中酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを特徴とするエタノールの連続発酵製造方法からなる。

本発明のエタノールの連続発酵製造方法に用いる酵母としては、エタノール発酵能を有する酵母であれば特に限定はされないが、特に好ましい酵母として、Saccharomyces cerevisiaeを挙げることができる。

本発明のエタノールの連続発酵製造方法に用いる基質としては、糖質基質として、サトウキビやてん菜などの植物搾汁液を由来とする糖液或いは該糖液から蔗糖を回収した後の廃糖蜜、更には、デンプンを含む穀類原料から製造される糖液などの糖質原料、穀類などのデンプンを含む原料を液化及び糖化、若しくは直接糖化処理を行ったものを用いることができる。又、デンプン質基質としては各種デンプン類を、挙げることができるが、特に好ましいデンプン質基質としては、米、麦、トウモロコシのような穀類のデンプンを用いることができる。

穀類などのデンプン質を原料として用いる場合には、予め液化及び糖化処理を行なって用いることができるが、エタノールの連続発酵において、発酵基質としてデンプン若しくはデンプンを液化した状態のものを基質とする場合には、糖化酵素若しくは該酵素を生成する微生物及び、エタノール生成能をもつ酵母を、共に発酵槽に投入し並行複発酵によりアルコール発酵を行う。液化をしていないデンプンを基質として用いる場合は、液化酵素若しくは該酵素を生成する微生物を添加することができる。なお、該酵素を生成する微生物がエタノール生成能をもつ酵母の場合は、該酵母のみを用いることができる。並行複発酵に用いる酵素又は微生物としては、例えば液化酵素（α−アミラーゼ）、糖化酵素（グルコアミラーゼ）、Saccharomyces diastaticus、麹などを挙げることができる。

本発明のエタノールの連続発酵製造方法を実施するには、本発明で特定するエタノールの連続発酵製造方法における連続発酵の条件に従い、基質を連続的に発酵槽に投入し、発酵槽から連続的にエタノールを含有する発酵液を抜出すことにより実施するが、連続発酵に用いる装置や制御の手段自体は、公知のものを使用することができる。例えば、用いる発酵槽は、１つ若しくは複数を直列に配して、排出された発酵液が順次以降の発酵槽に供給される形式のものを用いることができる。複数の発酵槽を使用する場合には、複数の発酵槽を直列に配し、基質を第一番目の発酵槽（第１発酵槽）に投入し、第１発酵槽からのオーバーフローを第二番目に発酵槽（第２発酵槽）で受ける。以後、設置した発酵槽の数に従い、順次発酵槽の受払いを連続的に実施する。発酵槽が１つの場合は、その発酵槽を第１発酵槽とする。

以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。

［同一基質に対する２種の酵母のエタノール生成量及び増殖比較］

＜材料と方法＞
（材料）
基質：糖液（Ｂｒｉｘに対するショ糖濃度９０％、Ｂｒｉｘ２０．５％に調製）、発酵補助剤としてリン酸水素二アンモニウムを添加。
酵母：市販乾燥酵母(Saccharomyces cerevisiae)
サンプル１：焼酎酵母きょうかい３号（日本醸造協会）
サンプル２：Ethanol Red（Fermentis）

（方法）
基質１００ｍｌに予め復水した乾燥酵母を添加し、３３℃で発酵を行った。

＜結果＞
（添加直後の酵母濃度）：結果を表１に示す。添加直後の酵母濃度は以下の通りとなり、２つのサンプルは同等の酵母濃度となった。

（エタノール濃度）：結果を図１（エタノール濃度の経時変化）に示す。エタノール濃度の経時変化は、２種の酵母で同等の結果となった。

（酵母濃度）：結果を図２（酵母濃度の経時変化）に示す。増殖の指標である酵母濃度の経時変化は、２種の酵母で同等の結果となった。

＜結論＞
市販の２種の乾燥酵母(Saccharomyces cerevisiae)において、エタノール生成及び酵母増殖は同等であった。

［酵母濃度とエタノール生成速度］

＜材料と方法＞
（材料）
基質：糖液（Ｂｒｉｘに対するショ糖濃度９０％、Ｂｒｉｘ２０．５％に調製）、発酵補助剤としてリン酸水素二アンモニウムを添加。
酵母：焼酎酵母きょうかい３号（日本醸造協会）

（方法）
基質１００ｍｌに予め復水した乾燥酵母を添加し、３３℃で発酵を行った。添加直後の酵母濃度を、表２に示す。

（結果）
添加直後の酵母濃度と２４時間後のエタノール濃度の関係を図３（添加直後の酵母濃度と２４時間後のエタノール濃度の関係）に示す。２４時間後のエタノール濃度は、添加する酵母数によって決定されることが明らかとなった。

＜結論＞
添加直後、即ち発酵開始時の酵母濃度が高いほどエタノール生成速度が速まることが明らかになった。

［酵母濃度とエタノール濃度］

＜材料と方法＞
（材料）
基質：糖液（Ｂｒｉｘに対するショ糖濃度９０％、Ｂｒｉｘ２３％に調製）、発酵補助剤としてリン酸水素二アンモニウムを添加。
酵母：市販乾燥酵母（Ethanol Red(Fermentis)）

（方法）
基質１００ｍｌに予め復水した乾燥酵母を表３に示す酵母濃度となるように添加し、３３℃で発酵を行った。サンプル２は基質に濃度５ｖ／ｖ％となるようにエタノールを添加した。

＜結果＞
（エタノール濃度と酵母濃度の関係）：
エタノール濃度と酵母濃度の関係を図４に示す。エタノール濃度が３．５ｖ／ｖ％以上になると増殖が緩慢になり、６．０ｖ／ｖ％以上になるとエタノール生成は継続するが増殖はほぼ停止する。

（発酵時間と酵母濃度）：
サンプル１の発酵時間と酵母濃度の関係を図５に示す。酵母濃度は、２０時間で１６倍となっていることから、増殖のサイクルは５時間と推定される。

＜結論＞
エタノール生成量が多いほど効率的ではあるが、酵母の増殖を維持しつつエタノール生成を行うには、第１発酵槽のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に維持する必要がある。また、酵母の増殖のサイクルは５時間であることから、この実験に用いた基質と酵母で連続発酵を行う際は、基質の供給と抜出しで発酵液が２倍に稀釈される時間、即ち発酵液の半量分の基質を供給及び抜出す時間を５時間以上に設定する必要がある。

［発酵温度と酵母増殖及びエタノール生成］

＜材料と方法＞
（材料）
基質：糖液（Ｂｒｉｘに対するショ糖濃度９０％、Ｂｒｉｘ２１．５％に調製）、発酵補助剤としてリン酸水素二アンモニウムを添加。
酵母：市販乾燥酵母（Ethanol Red(Fermentis)）

（方法）
乾燥酵母を復水後添加した２５５Ｌの発酵液に対し、基質を１７Ｌ／ｈの流量で添加しつつ、同流量で発酵槽から発酵液を抜出す。発酵液は撹拌及び循環により均一化し、発酵温度は３３℃を目標に調整を行った。発酵液は、経時的に酵母濃度、エタノール濃度、発酵温度を測定した。

＜結果＞
発酵温度と酵母増殖及びエタノール生成の関係を図６（発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度（その１））、図７（発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度（その２））、及び、図８（発酵温度と酵母濃度及びエタノール濃度（その３））に示す。発酵温度が３５℃以上となる発酵１６時間から９６時間の間は、エタノール生成は活発であったが、酵母濃度は減少した（図６）。２３２時間付近で３５℃を上回った後、酵母濃度が低下した。酵母数が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌを下回りエタノール生成に必要な酵母濃度が得られず、エタノール濃度も低下した。しかし、発酵温度を３０℃以上３５℃以下に維持したため、酵母濃度・エタノール濃度は２６４時間以降回復・増加した（図７）。発酵温度が３０℃以下に低下する発酵２０８時間付近は、エタノール濃度が低下しており、酵母濃度が増加しているにも関わらずエタノール生成速度が低下している（図８）。

＜結論＞
酵母濃度とエタノール生成速度を維持するには、本実験に使用した酵母においては発酵温度を３０〜３５℃に調整する必要がある。また、酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌを下回ると、エタノール生成に十分な酵母濃度が得られないため、酵母濃度は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以上に管理する必要がある。

［通気量と酵母増殖及びエタノール生成］

＜材料と方法＞
（材料）
基質:糖液(Ｂｒｉｘに対するショ糖濃度９０％、ショ糖Ｂｒｉｘ２３％に調製)、発酵補助剤としてリン酸水素二アンモニウムを添加。
酵母：市販乾燥酵母（Ethanol Red(Fermentis)）。

（方法）
乾燥酵母を復水後添加した２５５Ｌの発酵液に対し、基質を１７Ｌ／ｈの流量で添加しつつ、同流量で発酵槽から発酵液を抜出す。第１発酵槽には、発酵液１ｋＬ当たり、０ＮＬ／ｍｉｎ、５ＮＬ／ｍｉｎ、１０ＮＬ／ｍｉｎ、４０ＮＬ／ｍｉｎの通気を実施した。発酵液は撹拌及び循環により均一化し、発酵温度は３３℃を目標に調整を行った。発酵液は、発酵１７時間は第１発酵槽、発酵４１時間は第２発酵槽からサンプルを採取し、酵母濃度、エタノール濃度を測定した。

＜結果＞
各通気量における酵母濃度及びエタノール濃度を図９（各通気量における酵母濃度）及び図１０（各通気量におけるエタノール濃度）に示す。発酵液１ｋＬ当たりの通気量が、０ＮＬ／ｍｉｎのサンプルは、発酵１７時間の酵母濃度が低く、エタノール濃度は、発酵１７時間、発酵４１時間とも最低であった。発酵液１ｋＬ当たりの通気量が４０ＮＬ／ｍｉｎのサンプルは、酵母濃度は発酵４１時間でサンプル中最高の２．０×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであったが、エタノール濃度は低い。発酵液１ｋＬ当たりの通気量が５ＮＬ／ｍｉｎ及び１０ＮＬ／ｍｉｎのサンプルは、酵母濃度、エタノール濃度とも良好な値となった。

＜結論＞
発酵中の通気量を発酵液１ｋＬ当たり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎとすることで、効率的なエタノール生成と酵母増殖を両立できることが明らかとなった。通気量が少ないとエタノール生成及び酵母増殖が遅延し、通気量が多いと酵母増殖が活発になりエタノール生成が減少する。また、酵母濃度は発酵液１ｋＬ当たり１０ＮＬ／ｍｉｎの時のレベルである１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下に管理することでエタノール生成を減少させることのない発酵が可能である。

［全粒穀類原料使用時の通気量］

＜材料と方法＞
（材料）
基質：全粒小麦粉砕物（酵素剤による液化糖化処理を実施）。
酵母：市販乾燥酵母（Ethanol Red(Fermentis)）。

（方法）
乾燥酵母を復水後添加した２５５Ｌの発酵液に対し、基質である液化液を１７Ｌ／ｈの流量で添加しつつ、同流量で発酵槽から発酵液を抜出す。液化には、液化酵素（耐熱性α−アミラーゼ、Novozymes社製 Liquozyme SC）を使用し、発酵槽には、糖化酵素（グルコアミラーゼ、Novozymes社製 Spirizyme Fuel）、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ、Novozymes社製 Alcalase 2.4L）、細胞壁分解酵素（セルラーゼ・ヘミセルラーゼ、Novozymes社製 Viscozyme Wheat）を基質流量に応じて連続的に添加した。酵母は、発酵開始時のみ第１発酵槽に添加し、並行複発酵を連続発酵として実施した。発酵槽には、酵母添加後１５時間、発酵液１ｋＬ当たり、４０ＮＬ／ｍｉｎの通気を実施した。発酵液は撹拌及び循環により均一化し、発酵温度は３３℃を目標に調整を行った。発酵液サンプルを経時的に採取しエタノール濃度を測定した。

＜結果＞
エタノール濃度の変化を図１１（全粒小麦粉砕物を原料とした発酵液のエタノール濃度変化）に示す。全粒の穀物を原料とした場合は、発酵液の通気を停止してもエタノール濃度は良好に上昇した。

＜結論＞
全粒の穀物を原料とした場合には、酵母添加後１５時間以降は通気を行わなくても、エタノール生成は速度は良好に保たれる。並行複発酵を連続発酵として行うことで、発酵槽のグルコース濃度を抑制可能となり、グルコース濃度上昇による発酵遅延を防止することが可能である。また、並行複発酵とすることで糖液としてのハンドリング部分を最小限とすることが可能となり、微生物汚染などのリスクを低減することが可能である。

本発明のエタノールの連続発酵製造方法は、工業的なエタノールの連続発酵製造方法として適用することが可能で、経済的かつ効率的なエタノールの連続発酵製造方法を提供するものであり、産業上優れた利用可能性を有するものである。

Claims

１つ若しくは複数の発酵槽に糖質又はデンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、連続発酵の条件を、（１）発酵温度を３０〜３５℃の範囲に設定し、（２）基質の供給・発酵液の抜き出し速度を、基質の供給液により発酵液が２倍に希釈される時間を、酵母が２倍に増殖するのに要する時間以上になるような速度に設定し、更に（３）通気量は、発酵液１ｋＬあたり５〜１０ＮＬ／ｍｉｎの範囲であり、かつ、（４）酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した後は０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ〜１．７×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ以下になるように調整し、第１発酵槽の発酵液中のエタノール濃度を６．０ｖ／ｖ％以下に設定することにより、連続発酵中酵母の追加供給を行うことなく効率的なエタノールの生成を持続することを特徴とするエタノールの連続発酵製造方法。
発酵に用いる酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであることを特徴とする請求項１記載のエタノールの連続発酵製造方法。
糖質原料を基質として供給し、第１発酵槽の通気を、請求項１に特定する条件により連続発酵中持続して行うことを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの連続発酵製造方法。
デンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、発酵開始後、酵母濃度が０．８×１０^８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達するまで通気を行うことを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの連続発酵製造方法。
デンプン質原料を基質として供給し、酵母によるアルコール発酵により連続的にエタノールを製造する方法において、発酵が、糖化酵素又は該酵素を産生する微生物を添加した並行複発酵であることを特徴とする請求項１記載のエタノールの連続発酵製造方法。
発酵に用いる糖質原料基質が、サトウキビ或いはてん菜由来の糖質であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のエタノールの連続発酵製造方法。
サトウキビ或いはてん菜由来の糖質が、該植物の抽出液から蔗糖を採取後の廃糖蜜であることを特徴とする請求項６記載のエタノールの連続発酵製造方法。
発酵に用いるデンプン質原料基質が、穀類由来のデンプン、又は、該デンプンの液化物若しくは糖化物であることを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの連続発酵製造方法。