CN1331885C - 肿瘤抗原蛋白及抗原肽在作为肿瘤－睾丸抗原、制备治疗肝癌/肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。该肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段。编码该肿瘤抗原蛋白质的DNA序列具有在基因文库中登录号为：TPTE AF007118的序列的核苷酸序列。该肿瘤抗原蛋白质/肿瘤抗原肽可用于制备治疗肝癌或肺癌的药物。

Description

肿瘤抗原蛋白及抗原肽在作为肿瘤-睾丸抗原、制备治疗肝癌/肺癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽的应用，特别是涉及一种肿瘤抗原蛋白及抗原肽在作为肿瘤-睾丸抗原、制备治疗肝癌/肺癌药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的一大类疾病。肿瘤的发生是一个非常复杂的过程。肿瘤细胞能够发生和进展的一个重要因素在于其能够逃避机体免疫***的监视作用，因此如何激发和唤起机体的免疫***识别并排斥“非己”成分的肿瘤细胞是寻找新的肿瘤治疗方法的一个突破口。在对肿瘤的免疫治疗研究的初期，人们发展了很多办法来激发机体的免疫***来排斥“非己”成分的肿瘤细胞，尽管这些方法在动物肿瘤模型的治疗上取得了很好的疗效，但是在人类肿瘤的治疗上仍缺乏显著的效果。

已知人体内的免疫***，包括体液免疫与细胞免疫，尤其是T细胞免疫对肿瘤的杀伤抑制起着重要作用。随着人们对免疫应答反应本质的认识，人们发现不管免疫应答的过程多么复杂，最终导致T细胞活化而产生杀伤效应的就是与主要组织相容性复合体MHC相结合形成抗原肽复合物和共刺激信号，即：细胞毒性T细胞(CTL)通过自身表面的T细胞受体(TCR)，识别表达于肿瘤细胞表面的肿瘤抗原蛋白质/肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原相结合形成的复合体，从而攻击杀伤肿瘤细胞。

肿瘤抗原蛋白质/肽的产生是由肿瘤细胞先表达成肿瘤抗原，其在细胞内由各种蛋白酶分解成8～10个氨基酸大小的抗原肽，这些抗原肽与同时在内质网中产生MHC I类分子结合，通过高尔基复合体表达于细胞的表面，最终提呈给肿瘤抗原特异的CTL，从而诱发免疫应答，杀伤清除肿瘤细胞。这种存在于肿瘤细胞中、能与MHC分子结合并诱发机体免疫反应的蛋白质抗原分子即为肿瘤抗原。可以用这些抗原诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用。因此近几十年来，人们把用免疫方法***的重点放在寻找肿瘤特异和/或相关性抗原上。

在二十世纪五十年代，Foley等人把经化学诱变产生肿瘤的小鼠用灭活的自身肿瘤细胞免疫后，再给该小鼠接种活的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞被排斥而不能生长成肿瘤，小鼠则存活；与之对照，没用灭活的自身肿瘤细胞免疫的小鼠接种活的肿瘤细胞后，肿瘤细胞不被排斥而生长成肿瘤，小鼠则死亡。此实验以令人信服的证据证明了化学诱变的肿瘤存在肿瘤特异性抗原，但是这种保护反应有着精确的特异性，即只针对相同类型的肿瘤而不针对不同类型的肿瘤，即使是对用同一致癌剂在同一小鼠上诱导的不同类型肿瘤也没有保护作用。

1991年，T.Boon等首次从人黑色素瘤细胞中鉴定出肿瘤抗原蛋白质，并命名为MAGE(科学，254：1643-1647，1991)。随后，人们又鉴定出来其它一些肿瘤抗原蛋白质，可以分为肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质、分化抗原蛋白质、突变的肿瘤抗原蛋白质、过表达的肿瘤抗原蛋白质和病毒抗原蛋白质五类。其中，应用于临床上最为广泛的是肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质。

肿瘤-睾丸(CT)抗原蛋白质是目前鉴定的肿瘤抗原中最多的一类，它们编码基因的特点是在很多类型的肿瘤中都有表达，如在黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中都有表达，但在除睾丸外的正常组织都不表达，在胎盘、卵巢、胰腺中有一定量的表达。因为睾丸是免疫特许部位，所以这一类抗原在治疗上被认为是肿瘤特异性的抗原，是最有希望用作为肿瘤免疫治疗用途的一类抗原。目前试用于临床上的也主要就是这一类抗原，如MAGE-1和NY-ESO-1即是在一定类型的肿瘤中有高阳性率的表达，又有很好的免疫原性的抗原蛋白质，用于肿瘤的免疫治疗时有很好的前景。

到目前为止，最具代表性的鉴定肿瘤抗原蛋白质的方法为：基于特异性细胞免疫应答基础上的文库筛选法、基于体液免疫应答基础上的cDNA表达文库筛选法、组合肽文库筛选、酸洗脱法和生物信息学方法。

肝癌和肺癌是人类肿瘤中最为常见与最为恶性的肿瘤，尤其是近些年来，发病率逐渐增加。它们由于恶性度高，生长迅速，一旦发现就已经是中晚期，目前，治疗主要是传统的手术切除和放疗等局部治疗方法，但由于大部分患者确诊时都已进入了中晚期，并且对放疗与化疗有相当的抵抗性，因此治疗的效果和预后往往较差。肝癌病人的一年与五年存活率与其它各类肿瘤病人的存活率相比是很低的。寻找治疗方法上的突破或者是新的治疗方法一直是临床肿瘤学家追求的目标，人们期待着有新的方法来提高肝癌与肺癌的早期诊断与病人良好的预后，以及术后清除体内残留的肿瘤细胞和防止肿瘤细胞的转移。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于肝癌和肺癌治疗的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供一种肿瘤抗原蛋白质，该蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突

变所产生的衍生蛋白质，且该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。

本发明提供一种DNA序列，它编码所述的肿瘤抗原蛋白质。

本发明所述的DNA序列具有序列2所示的核苷酸序列，其在基因文库中登录号为：TPTE AF007118。

本发明提供所述的蛋白质作为肿瘤-睾丸抗原的应用。

本发明提供所述的基因作为肿瘤-睾丸抗原基因的应用。

本发明提供一种与所述肿瘤抗原蛋白质所产生的肽片断同等功能的肿瘤抗原肽，其分别具有序列1中氨基酸序列的第9位～第17位、第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位的氨基酸序列。

本发明所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明所述的肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明所述的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明提供的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽的优益之处在于：本发明首次将TPTE基因鉴定为肿瘤-睾丸抗原基因；在使用免疫方法治疗癌症时，可以用这些抗原诱导机体产生只针对肿瘤细胞的免疫应答反应，从而在不杀伤正常细胞的同时，特异杀伤体内的肿瘤细胞而达到治疗或者防治肿瘤细胞转移的作用；同时，可以通过对该肿瘤抗原基因或抗体的检测，对肿瘤的发生、发展以及是否有转移进行诊断。

附图说明

图1是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在16种成人正常组织的RT-PCR检测结果；图中的1～16分别代表成人正常组织脾、***、卵巢、小肠、大肠、白细胞、睾丸、心脏、肺、肝、脑、肾、胎盘、骨骼肌、胰腺、胸腺；

图2是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在肝癌的癌组织与配对的癌旁组织的RT-PCR结果；图中的ca代表癌组织，adj代表配对的癌旁组织；

图3是编码本发明抗原蛋白质的基因TPTE在肝癌组织与配对的癌旁组织的Northern blot结果；图中的ca代表癌组织，adj代表配对的癌旁组织；

图4是通过Westernblot方法检测的本发明抗原蛋白质在大肠杆菌中的重组蛋白与肝癌病人血清反应的代表性结果；图中的M代表蛋白质分子量标准参照，1代表表达有本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白的sf9昆虫细胞裂解物与抗组氨酸标签的单克隆抗体反应的结果，2代表纯化的本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白与抗组氨酸标签的单克隆抗体反应的结果，3代表表达有本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白的sf9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果，4代表纯化的本发明中的肿瘤-睾丸抗原重组蛋白与肝癌病人血清反应的结果，5代表转染有空表达载体的st9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果，6代表转染有无关蛋白对照表达载体的sf9昆虫细胞裂解物与肝癌病人血清反应的结果；

图5是通过ELISA方法检测的本发明肿瘤-睾丸抗原蛋白质在sf9昆虫细胞中的重组蛋白与肝癌病人血清反应的结果；其中X轴代表血清的稀释度，Y轴代表波长为410nm时的吸光度；“-●-”“-▲-”“-◆-”“-■-”“---”“-■-”分别代表重组蛋白与6个不同肿瘤病人血清反应的结果。

具体实施方式

实施例1、TPTE基因的筛选

以睾丸特异性表达为主题词在美国国家生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的基因数据库(GenBank)与文献检索数据库(PubMed)中检索那些已经有严格定义的在人正常组织中睾丸特异表达的基因，但它必须到目前为止没有任何与肿瘤相关的报道。由此我们获得了包括TPTE基因在内的数个在人正常组织中睾丸特异表达的基因，把他们作为我们下一步Unigene与SAGE数据库分析的靶基因。

实施例2、Unigene与SAGE数据库分析

Unigene是一个将来源于同一个基因的所有Genbank序列自动进行归类的网络工具。在Unigene数据库中，每一个Unigene基因包含有来源于各种组织的、但属于同一个基因的片断大小不同的序列，这些序列的组织来源与表达信息都被注明。SAGE(基因表达的系列分析)数据库是一个可以对某一特定基因的表达谱进行定量和定性的在线工具。因此，应用Unigene与SAGE数据库，就可以对某一特定的基因的时间与空间性表达进行分析，从而获得它的相关功能信息。在本发明过程中，三个标准被用来筛选候选基因，以期望获得目的的肿瘤-睾丸(CT)抗原基因：①候选基因必须是严格定义的在人正常组织中睾丸特异表达的基因，但它必须到目前为止没有任何与肿瘤相关的报道。②在本发明过程中的Unigene数据库分析中，候选基因的Unigene数据中必须含有来源于肿瘤的表达序列标签(EST)③在本发明过程中的SAGE数据库分析中，如果候选基因存在SAGE标签，只有严格对应候选基因的SAGE标签才能被应用于候选基因的分析中。当上述三个标准被采用后，候选基因TPTE被认为是最有可能的肿瘤-睾丸抗原基因。在TPTE基因的Unigene数据中，共有47个EST片段，虽然其中的43个EST来源于睾丸组织，但是另外的4个是来源于肿瘤组织；在TPTE基因的SAGE数据中，TPTE基因有2个来源于肿瘤组织的SAGE标签。基于上述分析，认为TPTE基因有可能是本发明中欲寻找的目的基因-肿瘤-睾丸抗原基因，下一步将设计实验予以证明。

实施例3、用RT-PCR的方法来分析TPTE基因的表达

生物技术公司CLONTECH的16种商品化的人正常组织的cDNA(脾、***、睾丸、卵巢、小肠、大肠、白细胞、心脏、肺、肝、脑、肾、胰腺、胎盘、骨骼肌、胸腺)、来源于62例肝癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于14例肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA、来源于14例胃癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA与来源于14例肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织的cDNA被用来检测TPTE基因在正常组织与肿瘤组织的表达情况。

本发明中进行RT-PCR的条件：应用CLONTECH公司的advanced热启动DNA聚合酶，94℃、15秒；65℃、30秒；72℃、90秒，30循环，之后，72℃、6分钟。进行RT-PCR的引物序列，正向引物：cca caa tgg tcc acc cac aaa tg；反向引物：aac atg tgg cagggt tgg aaa gaa c。结果发现：TPTE基因在40％的肝癌标本、36％的肺癌中表达，而与之配对的癌旁组织都不表达(如图2)；在16种成人重要正常组织中，本发明中发现TPTE基因仅在睾丸组织中表达，TPTE基因在肝癌中的表达量与在睾丸的表达量一致，而在肺癌中比睾丸低。基于以上实验数据，本实施例中证明与实施例1中Unigene与SAGE数据库分析结果一致，TPTE基因是一个新的肿瘤-睾丸抗原基因。

实施例4、用Northern杂交的方法来分析TPTE基因在肝癌与肺癌中的表达

用TRIZOL试剂(PROMEGA)从肝癌与肺癌病人的癌组织与配对的癌旁组织中提取总RNA，接着应用mRNA分离试剂盒(PROMEGA)从总RNA中分离mRNA。在甲酰胺、甲醛存在的条件下将2ug的mRNA变性，进行琼脂糖电泳后转到Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上，用紫外交联的方法固定。用地高辛DNA探针标记试剂盒(Roche)标记实施例2中扩增出来的DNA片段，以制作DNA探针，按照常规的Northern杂交方法与膜上的mRNA进行杂交，之后进行放射自显影，检测出本发明中的睾丸-肿瘤抗原蛋白质基因TPTE的mRNA。然后，将检测出该基因mRNA所用的膜在1％SDS溶液中煮沸，除掉地高辛标记的探针后，用标记的管家基因G3PDH作探针，用同样的方法进行Northern杂交，检测出的mRNA作阳性对照。结果如图3所示。从这一结果可以看出，本发明的肿瘤抗原蛋白质基因的mRNA仅在癌组织中表达，而配对的癌旁组织不表达。与肿瘤-睾丸抗原基因的特性一致。

实施例5、TPTE基因重组蛋白质在sf9昆虫细胞中的表达

应用Bac-To-Bac杆状病毒表达***(GIBCOBRL)，在sf9昆虫细胞中，27℃生长条件下，表达重组蛋白质。SDS-PAGE蛋白电泳对重组蛋白的表达进行鉴定。之后，应用镍离子亲和层析柱子(INVOTRIGEN)将重组蛋白质从sf9昆虫细胞全蛋白中分离、纯化出来。用抗重组蛋白带有的6个组氨酸的单克隆抗体，通过Weatem杂交方法，对重组蛋白进行鉴定。表达肿瘤-睾丸抗原TPTE的杆状病毒储存液以及含有质粒pFASTBac-TPTE的大肠杆菌菌株DH10Bac被保存在中华人民共和国北京大学医学部基础医学院免疫系T细胞研究室的-80℃低温冰箱中，保存日期为2002年7月12日。

实施例6、用Western杂交与ELISA方法检测肝癌与肺癌病人血清中的抗TPTE重组蛋白的抗体

参照实验医学杂志，187：1349，1998中的方法，筛选TPTE mRNA转录本阳性的肿瘤病人的血清，发现在肿瘤病人的血清中存在抗TPTE重组蛋白的抗体(图4、5)。因此，TPTE是一个新的肿瘤-睾丸抗原，具有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。

实施例7、应用肿瘤抗原肽体外诱导CTL的形成与CTL体外杀伤实验

参照中华普通外科杂志(17：218，2002)中的实验方法。将2×106/ml浓度的PBMC(外周血单核细胞)2ml培养于24孔培养板中，作为效应淋巴细胞，同时，将另外一部分PBMC按2×10⁶/ml浓度稀释于RPMI1640培养基中，加入具有序列1中的第9位～第17位的氨基酸序列的肿瘤抗原肽40ug/ml，37℃孵育2小时后，经30GY⁶⁰Coγ射线照射，离心，洗去剩余肽，用作为抗原提成细胞，按效应细胞：APC为1.3∶1的APC细胞数，将抗原提成细胞加入上述效应细胞共同培养，于24小时后加入IL-2(澳大利亚Ludwig Institute for Cancer Research提供)25U/ml继续培养。以后每隔7天，按效应细胞：抗原提成细胞为1.3∶1的抗原提成细胞细胞数量将抗原提成细胞加入效应细胞中再刺激3次，于第28天检测CTL的杀伤效应。杀伤实验按下述进行：(1)采用非放射性细胞毒分析盒，测定CTL与靶细胞共培养后LDH释放值检测CTL的杀伤效应。按照试剂盒推荐程序操作。所用的培养基为含3％FCS的无酚红RPMI1640，每种反应均设3个复孔，同时测定靶细胞自发释放值、靶细胞最大释放值、效应细胞自发释放值、体积校正值和培养基背景值。应用如下公式计算杀伤效应：杀伤效应(％)＝(实验值-效应细胞自发释放值-靶细胞自发释放值)/(靶细胞最大释放值-靶细胞自发释放值)×100。(2)混合淋巴细胞与靶细胞共培养4小时后，观察淋巴细胞与靶细胞的形态学变化。28天后，外周血单核细胞扩增了32倍，其中CD3阳性细胞的比例上升了16％(从54％到70％)，CTL比例上升了20％(从36％到56％)。当效应细胞：靶细胞为10∶1时，CTL对肿瘤抗原肽(由上海吉尔生化有限公司合成)孵育的的自体淋巴母细胞的杀伤效应为62.5％，对肿瘤抗原TPTE阳性的肿瘤细胞的杀伤效应为40.2％，两者均明显高于对自体淋巴母细胞的杀伤效应(17.9％)和肿瘤抗原TPTE阴性的肿瘤细胞的杀伤效应(1.6％)；当效应细胞：靶细胞为3.3∶1时，CTL对肿瘤抗原肽孵育的的自体淋巴母细胞的杀伤效应为53.6％，明显高于对自体淋巴母细胞的杀伤效应(15.6％)。这些结果说明肿瘤抗原TPTE的肿瘤抗原肽能从肿瘤病人的PBMC中有效的诱导出具有特异杀伤肿瘤细胞的CTL，从而增强肿瘤病人清除肿瘤的能力。

使用序列1中第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位氨基酸序列的其它肿瘤抗原肽进行同样的实验，得到同样的结果。

实施例8、CTL细胞被肿瘤抗原肽刺激后分泌IFNγ能力的检测

参照中华医学杂志(81：1234，2001)中的实验方法。用酶联免疫斑点检测法(ELISPOT)进行IFN-γ的定量。96孔平底硝酸纤维素板(购自法国Millipore公司)，用抗人IFNγ单抗(溶于pH9.6碳酸盐缓冲液中，终浓度为2ug/ml)包被，4℃过夜；第2天经含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，用含10％AB血清的RPMI1640培养液室温避光封闭1小时，再以0.05％TweenPBS洗涤，加入经7天诱导的效应细胞(effector cells，E)5×10⁴个/孔。此后实验分两组进行，即效应细胞与T2细胞组(E+T2)、效应细胞与T2细胞加载肿瘤抗原肽组(E+T2肿瘤抗原肽)，每组各作两复孔。单纯T2细胞及加载了10ug/ml肿瘤抗原肽的T2细胞在无血清RPMI1640中，37℃、5％CO₂条件下孵育2小时，经⁶⁰Coγ射线100GY照射，用无血清RPMI1640洗去多余的抗原肽后作为刺激细胞，以1×10⁵个/孔加入各效应细胞孔；该反应体系在不含细胞因子及血清的RPMI1640培养液中，37℃、5％CO₂条件下孵育18～20h后，用0.05％TweenPBS充分冲洗培养板以去除残留细胞；随后加入0.2ug/ml生物素标记的抗人IFNγ二抗，于37℃孵育2小时，洗板；再加入碱性磷酸酶标记的链霉亲和素1ug/m，室温下避光孵育1小时；洗板，加入底物显色液，避光显色5分钟，用自来水冲洗，终止反应。待反应板晾干后，于解剖显微镜下计数每孔呈黑紫色的斑点数，求出两复孔的平均值。E+T2肿瘤抗原肽组斑点数减去E+T2组斑点数即为肿瘤抗原特异的CTL细胞频数。ELISPOT检测中，以产生IFNγ的CD8⁺T细胞的频数为指标，分别在肿瘤组织表达TPTE mRNA的患者中测出对肿瘤抗原TPTE的应答者，而在癌组织无TPTEmRNA表达的患者中均未检测到相应的特异免疫应答。在部分癌组织表达TPTEmRNA，但血清无TPTE抗体的肿瘤患者中，仍然可以检测到CD8+T细胞对肿瘤抗原TPTE与抗原肽的免疫应答。本实验为进一步应用肿瘤抗原TPTE及抗原肽***的临床体内实验提供了依据。

实施例9、突变的肿瘤抗原蛋白质的制备及其血清抗体筛选

应用众所周知的方法制备了如下随机突变的DNA，将序列号2中的第413个碱基由T突变为C，由此也就将序列号1中的第138个氨基酸由L突变为P；将序列号2中的第38个碱基由T突变为C，由此也就将序列号1中的第38个氨基酸由V突变为A。将突变的DNA克隆到表达载体中，表达突变的肿瘤抗原，详细参照实施例4。应用制备的突变的肿瘤抗原参照实施例5筛选肿瘤病人的血清，发现在肿瘤病人的血清中也存在着这些突变肿瘤抗原的抗体。由于该实施例中的突变位点是随机选定的，这说明在肿瘤病人的血清中也存在针对其它位点的突变产生的肿瘤抗原蛋白质的抗体。该实施例说明突变的肿瘤抗原也有诱导肿瘤病人产生免疫应答，排斥杀伤肿瘤细胞的能力，有应用于肿瘤的临床免疫治疗的潜能。

应用本发明的肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽可以提供活化抗肿瘤免疫的医药、可提供肿瘤的诊断方法。抗本发明中的肿瘤抗原蛋白质或肿瘤抗原肽的抗体可用于亲和层析、cDNA文库的筛选、免疫学诊断或医药的制备。

序列表包括序列1和序列2

序列1为肿瘤-睾丸抗原蛋白质TPTE的氨基酸序列：

序列长度：551

拓扑学：线性

序列种类：肽

来源：

生物名：人(Homo sapiens)

组织种类：肝癌组织

序列特征：

特征的记号：肽

存在位置：1..551

序列1：

Met Aan Glu Ser Pro Asp Pro Thr Asp Leu Ala Gly Val Ile Ile Glu

1               5                   10                    15

Leu Gly Pro Asn Asp Ser Pro Gln Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr

            20                  25                   30

Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro His Thr Ser Glu Phe Lys Gly

        35                  40                   45

Ala Ala Arg Val Ser Pro Ile Ser Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Ser

    50                  55                  60

Lys Phe Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys

65                  70                  75                   80

Ile Lys Lys Ile Val His Ser Ile Val Ser Ser Phe Ala Phe Gly Leu

                85                  90                  95

Phe Gly Val Phe Leu Val Leu Leu Asp Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp

            100                 105                 110

Leu Ile Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser

        115                 120                 125

Ile Ser Leu Ala Ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp Val Leu Leu Arg

    130                 135                 140

Val Phe Val Glu Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn He

145             150                     155                  160

Leu Asp Thr Ala Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Val Asp Val Val Tyr

                165             170                      175

Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His

            180                 185                 190

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ile Ile Leu Leu Arg Ile Phe His Leu

        195                 200                 205

Phe His Gln Lys Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg Val Ser

    210                 215                  220

Glu Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr

225                 230                 235                  240

Tyr Val Thr Glu Arg Ile Ile Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg

                245                 250                  255

Gln Ser Phe Tyr Arg Asn Pro Ile Lys Glu Val Val Arg Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Lys Lys His Arg Asn His Tyr Arg Val Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg

        275                 280                 285

Ala Tyr Asp Pro Lys His Phe His Asn Arg Val Val Arg Ile Met Ile

    290                 295                 300

Asp Asp His Asn Val Pro Thr Leu His Gln Met Val Val Phe Thr Lys

305                 310                 315                 320

Glu Val Asn Glu Trp Met Ala Gln Asp Leu Glu Asn Ile Val Ala Ile

                325                 330                 335

His Cys Lys Gly Gly Thr Asp Arg Thr Gly Thr Met Val Cys Ala Phe

            340                     345                 350

Leu Ile Ala Ser Glu Ile Cys Ser Thr Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Tyr

        355                 360                 365

Phe Gly Glu Arg Arg Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Lys Phe Gln Gly

    370                 375                 380

Val Glu Thr Pro Ser Gln Lys Arg Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Gln Val

385                 390                 395                 400

Lys His Leu Tyr Asn Trp Asn Leu Pro Pro Arg Arg Ile Leu Phe Ile

                405                 410                  415

Lys His Phe Ile Ile Tyr Ser Ile Pro Arg Tyr Val Arg Asp Leu Lys

            420                  425                 430

Ile Gln Ile Glu Met Glu Lys Lys Val Val Phe Ser Thr Ile Ser Leu

        435                 440                 445

Gly Lys Cys Ser Val Leu Asp Asn Ile Thr Thr Asp Lys Ile Leu Ile

    450                 455                 460

Asp Val Phe Asp Gly Pro Pro Leu Tyr Asp Asp Val Lys Val Gln Phe

465                 470                 475                  480

Phe Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Tyr Tyr Asp Asn Cys Ser Phe Tyr Phe

                485                 490                  495

Trp Leu His Thr Ser Phe Ile Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Leu Pro Lys

            500                 505                  510

Asn Glu Leu Asp Asn Leu His Lys Gln Lys Ala Arg Arg Ile Tyr Pro

        515                  520                 525

Ser Asp Phe Ala Val Glu Ile Leu Phe Gly Glu Lys Met Thr Ser Ser

    530                 535                 540

Asp Val Val Ala Gly Ser Asp

545                550

序列2为肿瘤-睾丸抗原蛋白质基因TPTE的核苷酸序列：

序列长度：2168

链型：双链

拓扑学：线性

序列种类：cDNA至mRNA

假设序列：无

反义：无

起源：

生物名：人(Homo sapiens)

组织种类：肝癌组织

序列特征：

特征的表示记号：5’UTR

存在位置：1..339

特征的表示记号：CDS

存在位置：340.1995

特征的表示记号：3’UTR

存在位置：1996..2153

特征的表示记号：polyA位点

存在位置：2154..2168

序列2：

GAATCCGCGG GGAGGGCACA ACAGCTGCTA CCTGAACAGT TTCTGACCCA ACAGTTACCC  60

AGCGCCGGAC TCGCTGCGCC CCGGCGGCTC TAGGGACCCC CGGCGCCTAC ACTTAGCTCC  120

GCGCCCGAGA GAATGTTGGA CCGACGACAC AAGACCTCAG ACTTGTGTTA TTCTAGCAGC  180

TGAACACACC CCAGGCTCTT CTGACCGGCA GTGGCTCTGG AAGCAGTCTG GTGTATAGAG  240

TTATGGATTC ACTACCAGAT TCTACTGTAT GCTCTTGACA ACTATGACCA CAATGGTCCA  300

CCCACAAATG AATTATCAGG AGTGAACCCA GAGGCACGTA TGAATGAAAG TCCTGATCCG  360

ACTGACCTGG CGGGAGTCAT CATTGAGCTC GGCCCCAATG ACAGTCCACA GACAAGTGAA  420

TTTAAAGGAG CAACCGAGGA GGCACCTGCG AAAGAAAGCC CACACACAAG TGAATTTAAA  480

GGAGCAGCCC GGGTGTCACC TATCAGTGAA AGTGTGTTAG CACGACTTTC CAAGTTTGAA  540

GTTGAAGATG CTGAAAATGT TGCTTCATAT GACAGCAAGA TTAAGAAAAT TGTGCATTCA  600

ATTGTATCAT CCTTTGCATT TGGACTATTT GGAGTTTTCC TGGTCTTACT GGATGTCACT  660

CTCATCCTTG CCGACCTAAT TTTCACTGAC AGCAAACTTT ATATTCCTTT GGAGTATCGT  720

TCTATTTCTC TAGCTATTGC CTTATTTTTT CTCATGGATG TTCTTCTTCG AGTATTTGTA  780

GAAAGGAGAC AGCAGTATTT TTCTGACTTA TTTAACATTT TAGATACTGC CATTATTGTG  840

ATTCTTCTGC TGGTTGATGT CGTTTACATT TTTTTTGACA TTAAGTTGCT TAGGAATATT  900

CCCAGATGGA CACATTTACT TCGACTTCTA CGACTTATTA TTCTGTTAAG AATTTTTCAT  960

CTGTTTCATC AAAAAAGACA ACTTGAAAAG CTGATAAGAA GGCGGGTTTC AGAAAACAAA  1020

AGGCGATACA CAAGGGATGG ATTTGACCTA GACCTCACTT ACGTTACAGA ACGTATTATT  1080

GCTATGTCAT TTCCATCTTC TGGAAGGCAG TCTTTCTATA GAAATCCAAT CAAGGAAGTT  1140

GTGCGGTTTC TAGATAAGAA ACACCGAAAC CACTATCGAG TCTACAATCT ATGCAGTGAA  1200

AGAGCTTACG ATCCTAAGCA CTTCCATAAT AGGGTCGTTA GAATCATGAT TGATGATCAT  1260

AATGTCCCCA CTCTACATCA GATGGTGGTT TTCACCAAGG AAGTAAATGA GTGGATGGCT  1320

CAAGATCTTG AAAACATCGT AGCGATTCAC TGTAAAGGAG GCACAGATAG AACAGGAACT  1380

ATGGTTTGTG CCTTCCTTAT TGCCTCTGAA ATATGTTCAA CTGCAAAGGA AAGCCTGTAT  1440

TATTTTGGAG AAAGGCGAAC AGATAAAACC CACAGCGAAA AATTTCAGGG AGTAGAAACT  1500

CCTTCTCAGA AGAGATATGT TGCATATTTT GCACAAGTGA AACATCTCTA CAACTGGAAT  1560

CTCCCTCCAA GACGGATACT CTTTATAAAA CACTTCATTA TTTATTCGAT TCCTCGTTAT  1620

GTACGTGATC TAAAAATCCA AATAGAAATG GAGAAAAAGG TTGTCTTTTC CACTATTTCA  1680

TTAGGAAAAT GTTCGGTACT TGATAACATT ACAACAGACA AAATATTAAT TGATGTATTC  1740

GACGGTCCAC CTCTGTATGA TGATGTGAAA GTGCAGTTTT TCTATTCGAA TCTTCCTACA  1800

TACTATGACA ATTGCTCATT TTACTTCTGG TTGCACACAT CTTTTATTGA AAATAACAGG  1860

CTTTATCTAC CAAAAAATGA ATTGGATAAT CTACATAAAC AAAAAGCACG GAGAATTTAT  1920

CCATCAGATT TTGCCGTGGA GATACTTTTT GGCGAGAAAA TGACTTCCAG TGATGTTGTA  1980

GCTGGATCCG ATTAAGTATA GCTCCCCCTT CCCCTTCTGG GAAAGAATTA TGTTCTTTCC  2040

AACCCTGCCA CATGTTCATA TATCCTAAAT CTATCCTAAA TGTTCCCTTG AAGTATTTAT  2100

TTATGTTTAT ATATGTTTAT ACATGTTCTT CAATAAATCT ATTACATATA TATAAAAAAA  2160

AAAAAAAA                                                           2168

SEQUENCE LISTING

<110>北京大学

<120>一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽

<130>PI034448

<160>2

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>551

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

Met Asn Glu Ser Pro Asp Pro Thr Asp Leu Ala Gly Val Ile Ile Glu

1               5                   10                  15

Leu Gly Pro Asn Asp Ser Pro Gln Thr Ser Glu Phe Lys Gly Ala Thr

            20                  25                  30

Glu Glu Ala Pro Ala Lys Glu Ser Pro His Thr Ser Glu Phe Lys Gly

        35                  40                  45

Ala Ala Arg Val Ser Pro Ile Ser Glu Ser Val Leu Ala Arg Leu Ser

    50                  55                  60

Lys Phe Glu Val Glu Asp Ala Glu Asn Val Ala Ser Tyr Asp Ser Lys

65                  70                  75                  80

Ile Lys Lys Ile Val His Ser Ile Val Ser Ser Phe Ala Phe Gly Leu

                85                  90                  95

Phe Gly Val Phe Leu Val Leu Leu Asp Val Thr Leu Ile Leu Ala Asp

            100                 105                 110

Leu Ile Phe Thr Asp Ser Lys Leu Tyr Ile Pro Leu Glu Tyr Arg Ser

        115                 120                 125

Ile Ser Leu Ala Ile Ala Leu Phe Phe Leu Met Asp Val Leu Leu Arg

    130                 135                 140

Val Phe Val Glu Arg Arg Gln Gln Tyr Phe Ser Asp Leu Phe Asn Ile

145                 150                 155                 160

Leu Asp Thr Ala Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Val Asp Val Val Tyr

                165                 170                 175

Ile Phe Phe Asp Ile Lys Leu Leu Arg Asn Ile Pro Arg Trp Thr His

            180                 185                 190

Leu Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ile Ile Leu Leu Arg Ile Phe His Leu

        195                 200                 205

Phe His Gln Lys Arg Gln Leu Glu Lys Leu Ile Arg Arg Arg Val Ser

    210                 215                 220

Glu Asn Lys Arg Arg Tyr Thr Arg Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr

225                 230                 235                 240

Tyr Val Thr Glu Arg Ile Ile Ala Met Ser Phe Pro Ser Ser Gly Arg

                245                 250                 255

Gln Ser Phe Tyr Arg Asn Pro Ile Lys Glu Val Val Arg Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Lys Lys His Arg Asn His Tyr Arg Val Tyr Asn Leu Cys Ser Glu Arg

        275                 280                 285

Ala Tyr Asp Pro Lys His Phe His Asn Arg Val Val Arg Ile Met Ile

    290                 295                 300

Asp Asp His Asn Val Pro Thr Leu His Gln Met Val Val Phe Thr Lys

305                 310                 315                 320

Glu Val Asn Glu Trp Met Ala Gln Asp Leu Glu Asn Ile Val Ala Ile

                325                 330                 335

His Cys Lys Gly Gly Thr Asp Arg Thr Gly Thr Met Val Cys Ala Phe

            340                 345                 350

Leu I1e Ala Ser Glu Ile Cys Ser Thr Ala Lys Glu Ser Leu Tyr Tyr

        355                 360                 365

Phe Gly Glu Arg Arg Thr Asp Lys Thr His Ser Glu Lys Phe Gln Gly

    370                 375                 380

Val Glu Thr Pro Ser Gln Lys Arg Tyr Val Ala Tyr Phe Ala Gln Val

385                 390                 395                 400

Lys His Leu Tyr Asn Trp Asn Leu Pro Pro Arg Arg Ile Leu Phe Ile

                405                 410                 415

Lys His Phe I1e Ile Tyr Ser Ile Pro Arg Tyr Val Arg Asp Leu Lys

            420                 425                 430

Ile Gln Ile Glu Met Glu Lys Lys Val Val Phe Ser Thr Ile Ser Leu

        435                 440                 445

Gly Lys Cys Ser Val Leu Asp Asn Ile Thr Thr Asp Lys Ile Leu Ile

    450                 455                 460

Asp Val Phe Asp Gly Pro Pro Leu Tyr Asp Asp Val Lys Val Gln Phe

465                 470                 475                 480

Phe Tyr Ser Asn Leu Pro Thr Tyr Tyr Asp Asn Cys Ser Phe Tyr Phe

                485                 490                 495

Trp Leu His Thr Ser Phe Ile Glu Asn Asn Arg Leu Tyr Leu Pro Lys

            500                 505                 510

Asn Glu Leu Asp Asn Leu His Lys Gln Lys Ala Arg Arg Ile Tyr Pro

        515                 520                 525

Ser Asp Phe Ala Val Glu Ile Leu Phe Gly Glu Lys Met Thr Ser Ser

    530                 535                 540

Asp Val Val Ala Gly Ser Asp

545                 550

<210>2

<211>2168

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>2

gaatccgcgg ggagggcaca acagctgcta cctgaacagt ttctgaccca acagttaccc  60

agcgccggac tcgctgcgcc ccggcggctc tagggacccc cggcgcctac acttagctcc  120

gcgcccgaga gaatgttgga ccgacgacac aagacctcag acttgtgtta ttctagcagc  180

tgaacacacc ccaggctctt ctgaccggca gtggctctgg aagcagtctg gtgtatagag  240

ttatggattc actaccagat tctactgtat gctcttgaca actatgacca caatggtcca  300

cccacaaatg aattatcagg agtgaaccca gaggcacgta tgaatgaaag tcctgatccg  360

actgacctgg cgggagtcat cattgagctc ggccccaatg acagtccaca gacaagtgaa  420

tttaaaggag caaccgagga ggcacctgcg aaagaaagcc cacacacaag tgaatttaaa  480

ggagcagccc gggtgtcacc tatcagtgaa agtgtgttag cacgactttc caagtttgaa  540

gttgaagatg ctgaaaatgt tgcttcatat gacagcaaga ttaagaaaat tgtgcattca  600

attgtatcat cctttgcatt tggactattt ggagttttcc tggtcttact ggatgtcact  660

ctcatccttg ccgacctaat tttcactgac agcaaacttt atattccttt ggagtatcgt  720

tctatttctc tagctattgc cttatttttt ctcatggatg ttcttcttcg agtatttgta  780

gaaaggagac agcagtattt ttctgactta tttaacattt tagatactgc cattattgtg  840

attcttctgc tggttgatgt cgtttacatt ttttttgaca ttaagttgct taggaatatt  900

cccagatgga cacatttact tcgacttcta cgacttatta ttctgttaag aatttttcat  960

ctgtttcatc aaaaaagaca acttgaaaag ctgataagaa ggcgggtttc agaaaacaaa  1020

aggcgataca caagggatgg atttgaccta gacctcactt acgttacaga acgtattatt  1080

gctatgtcat ttccatcttc tggaaggcag tctttctata gaaatccaat caaggaagtt  1140

gtgcggtttc tagataagaa acaccgaaac cactatcgag tctacaatct atgcagtgaa  1200

agagcttacg atcctaagca cttccataat agggtcgtta gaatcatgat tgatgatcat  1260

aatgtcccca ctctacatca gatggtggtt ttcaccaagg aagtaaatga gtggatggct  1320

caagatcttg aaaacatcgt agcgattcac tgtaaaggag gcacagatag aacaggaact  1380

atggtttgtg ccttccttat tgcctctgaa atatgttcaa ctgcaaagga aagcctgtat  1440

tattttggag aaaggcgaac agataaaacc cacagcgaaa aatttcaggg agtagaaact  1500

ccttctcaga agagatatgt tgcatatttt gcacaagtga aacatctcta caactggaat  1560

ctccctccaa gacggatact ctttataaaa cacttcatta tttattcgat tcctcgttat  1620

gtacgtgatc taaaaatcca aatagaaatg gagaaaaagg ttgtcttttc cactatttca  1680

ttaggaaaat gttcggtact tgataacatt acaacagaca aaatattaat tgatgtattc  1740

gacggtccac ctctgtatga tgatgtgaaa gtgcagtttt tctattcgaa tcttcctaca  1800

tactatgaca attgctcatt ttacttctgg ttgcacacat cttttattga aaataacagg  1860

ctttatctac caaaaaatga attggataat ctacataaac aaaaagcacg gagaatttat  1920

ccatcagatt ttgccgtgga gatacttttt ggcgagaaaa tgacttccag tgatgttgta  1980

gctggatccg attaagtata gctccccctt ccccttctgg gaaagaatta tgttctttcc  2040

aaccctgcca catgttcata tatcctaaat ctatcctaaa tgttcccttg aagtatttat  2100

ttatgtttat atatgtttat acatgttctt caataaatct attacatata tataaaaaaa  2160

aaaaaaaa                                                           2168

Claims (5)

1、一种蛋白质作为肿瘤-睾丸抗原的应用，所述蛋白质为肿瘤抗原蛋白质，该蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。

2、一种肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肝癌药物中的应用，所述肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。

3、一种肿瘤抗原蛋白质在制备治疗肺癌药物中的应用，所述肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能。

4、一种具有与肿瘤抗原蛋白质所产生的肽片段同等功能的肿瘤抗原肽在制备治疗肝癌药物中的应用，所述肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片段，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能；

所述肿瘤抗原肽分别具有序列1所示氨基酸序列的第9位～第17位、第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位的氨基酸。

5、一种具有与肿瘤抗原蛋白质所产生的肽片段同等功能的肿瘤抗原肽在制备治疗肺癌药物中的应用，所述肿瘤抗原蛋白质通过细胞内分解，能产生与主要组织相容性复合体(MHC)-I类分子相结合的、在结合状态能被T细胞所识别的肽片断，其具有如下(a)或(b)所述的氨基酸序列：

(a)具有序列1所示的氨基酸序列；

(b)将(a)中的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加突变所产生的衍生蛋白质，该衍生蛋白质与(a)的蛋白质具有相同的功能；

所述肿瘤抗原肽分别具有序列1所示氨基酸序列的第9位～第17位、第95位～第102位、第100位～第108位、第102位～第110位、第130位～第138位、第137位～第145位、第195位～第203位、第235位～第244位、第263位～第272位、第277位～第287位、第308位～第319位、第330位～第338位或第523位～第535位的氨基酸。

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