CN115850377A - 基于nras基因q61k突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于肿瘤驱动基因NRAS上Q61K突变相关的肿瘤新抗原多肽及其应用。本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的不足，提供一种基于MHC‑II类分子的针对肿瘤驱动基因NRAS的Q61K突变的特异性免疫治疗方案。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种基于NRAS基因Q61K突变的肿瘤新抗原多肽。该抗原肽的氨基酸序列为GKEEYSAMRDQYMRT。本发明的抗原肽能够显著激活人体特异性针对NRAS突变的T细胞，以增加T细胞对NRAS突变肿瘤细胞的杀伤能力，能够制备预防和治疗NRAS突变肿瘤的药物，尤其是用于制备肿瘤细胞疫苗。

Description

基于NRAS基因Q61K突变的肿瘤新抗原多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于肿瘤驱动基因NRAS的Q61K突变相关的肿瘤新抗原多肽及其应用。

背景技术

人类RAS(Rat SArcoma，大鼠肉瘤)肿瘤驱动基因包括HRAS、KRAS和NRAS基因，可在约30％的恶性肿瘤中发生突变。NRAS在质膜中的激活会导致蛋白质磷酸化和信号转导，促进细胞生长、增殖和分化。其激活突变主要发生在G12、G13和Q61位点，与G12，G13号位点突变不同的是，Q61位置的突变会加强GTP的结合，从而减少GTP的水解，最后都会导致RAS的过度激活、产生促癌信号以及耐药。NRAS Q61K突变主要出现在黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌和肺癌等多种类型的肿瘤中。但是，由于NRAS蛋白本身具有特殊性，开发靶向NRAS的治疗手段非常具有挑战性。因此，尽管经过30多年的深入研究，有效的抗RAS疗法仍未进入临床。

肿瘤的免疫治疗被认为是继手术、放疗、化疗和小分子靶向治疗之后的新一代的肿瘤治疗方法，它与之前传统治疗方法的不同之处在于：免疫治疗将治疗手段从药物直接杀伤肿瘤细胞转到增强免疫细胞，通过提高患者自身的抗肿瘤免疫能力来***，与传统治疗相比具有杀伤精准、副作用小、疗效持久、个性化程度高等优势。此外，机体免疫***具有免疫记忆的特性，因此免疫治疗可以帮助患者形成记忆型免疫，在防止肿瘤复发和转移上具有显著优势。基于肽的疫苗将肿瘤突变肽提供给MHC分子，以诱导产生特异性和长期记忆T细胞来对抗肿瘤。肿瘤抗原通常被认为是内源性抗原，与MHC I类分子结合，刺激CD8+细胞毒性反应。还有小部分较大的多肽与MHC II分子结合，专门刺激CD4+T辅助细胞。

鉴于NRAS突变在肿瘤中的高频率，其已经成为免疫治疗的潜在靶点。有研究发现突变的NRAS肽可诱导特异性的CD8+和CD4+T细胞抗RAS免疫应答，且NRAS突变肽具有增强的免疫原性。因此，靶向NRAS突变肽的疫苗可作为NRAS突变肿瘤患者的特异性免疫治疗手段。已有的研究中，针对NRAS的研究主要集中在MHC-I类分子中，例如研究者发现，在HLA-A*01:01基因型的黑色素瘤病人中，使用针对RAS.Q61K的新抗原(ILDTAGKEEY,SEQ ID No.31)可以有效地激活患者体内的T细胞并对肿瘤进行杀伤(Peri et.al,J Clin Invest.2021Oct15)，但是其仅针对包含HLA-A*01:01基因型的病人。而基于MHC-II类分子的RAS新抗原目前还未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中的不足，提供一种基于MHC-II类分子的针对肿瘤驱动基因NRAS上Q61K突变的特异性免疫治疗方案。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种基于NRAS基因Q61K突变的肿瘤新抗原多肽。该抗原肽的氨基酸序列为GKEEYSAMRDQYMRT(SEQ ID No.17)。

或者，为上述各多肽的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的功能相同或者相似的多肽。

其中，上述的相同或相似的功能是指抗原多肽能激活HLA分型为HLA-DRB1*09:01且伴随有NRAS的Q61K突变的患者产生特异性的针对具有NRAS Q61K突变的肿瘤的T细胞。

本发明还提供了上述肿瘤新抗原多肽在制备可诱导产生特异性细胞毒性T细胞克隆的免疫活性调节剂中的应用。

本发明还提供了上述肿瘤新抗原多肽在制备存在NRAS高频突变的肿瘤风险干预和/或治疗剂中的应用。其中，上述的NRAS高频突变为Q61K突变。

基于上述方案，本发明还进一步提供了一种DC细胞。该DC细胞为经上述的肿瘤新抗原多肽刺激而得。进一步的，上述的DC细胞中所述的刺激方式为DC细胞与肿瘤新抗原多肽进行共孵育。

其中，上述的DC细胞为成熟的DC细胞。

其中，上述的DC细胞为NRAS发生Q61K突变的患者的离体DC细胞。

进一步的，上述的DC细胞为含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患者的离体DC细胞。

本发明也提供了上述肿瘤新抗原多肽和上述的DC细胞在制备伴随NRAS突变的肿瘤的免疫治疗药物中的应用。

其中，上述应用中所述的伴随NRAS突变的肿瘤为NRAS发生Q61K突变的肿瘤。

其中，上述应用中所述的肿瘤为黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌和肺癌。

其中，上述应用中所述的肿瘤为含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患者所患肿瘤。

此外，本发明也提供了上述抗权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽的抗体。

其中，所述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

进一步的，上述的抗体还可与偶联部分形成偶联物。所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白或生物素中的至少一种。

本发明也提供了编码上述肿瘤新抗原多肽或上述的抗体的基因。

同时，本发明还提供了装载有上述的基因的载体。进一步的，所述载体为表达载体，表达载体可在质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体等常用载体中选择。当使用腺病毒载体时，一般采用复制缺陷型腺病毒载体。

本发明的有益效果在于：本发明的抗原肽能够显著激活人体特异性针对NRAS突变的T细胞，以增加T细胞对NRAS突变肿瘤细胞的杀伤能力，能够制备预防和治疗NRAS突变肿瘤的药物。而经本发明抗原肽刺激的NRAS突变肿瘤患者的DC细胞，回输回患者体内后，能够激活特异性针对NRAS突变肽的T细胞，以增加T细胞对存在NRAS突变的癌细胞的杀伤能力。本发明的抗原肽弥补了个体化抗原肽在同时具有NRAS-Q61K体细胞突变和HLA-DRB1*09:01基因型的肿瘤病人中治疗的空白。同时，本发明的抗原便于大规模的合成，可用于NRAS突变肿瘤患者标准化、个体化的的免疫治疗之中。

附图说明

图1为酶联免疫吸附试验实验结果。

具体实施方式

本发明基于NRAS基因突变肽的氨基酸序列，结合MHC-II类分子中的人类白细胞抗原单倍型，使用生物信息预测方法，得到一系列的抗原肽。并进一步地筛选得到氨基酸序列为GKEEYSAMRDQYMRT新抗原肽的，命名为M9。该新抗原肽M9对应的人类白细胞抗原分型为HLA-DRB1*09:01，即能够使具有HLA-DRB1*09:01分型、且NRAS基因Q61K突变的病人激活特异性针对NRAS突变的DC细胞，以增加T细胞对NRAS突变肿瘤细胞的杀伤能力。

本领域技术人员知晓，在GKEEYSAMRDQYMRT抗原多肽的氨基酸序列中进行取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的功能相同或者相似的多肽也是在本发明的保护范围之中。其中，所述的相同或相似的功能是指抗原多肽能激活HLA分型为HLA-DRB1*09:01且伴随有NRAS的Q61K突变的患者产生特异性的针对具有NRAS Q61K突变的肿瘤的T细胞。

在本发明中，“各肽段的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的肽段的与上述蛋白的的功能相同或相似的蛋白”的表述包括但并不限于若干个(通常为1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(可40个以内，通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述多肽中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。

“各肽段的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的肽段”的表述还包括但并不限于有至多10个(即一个或几个)，较佳地至多8个，更佳地至多5个(5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽，即保守性变异多肽。进一步的，这些保守性变异多肽可根据表1进行替换而产生。

表1氨基酸替换表

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

上述的多肽可以作为活性成分，制备抗肿瘤的药物。一般来说，本领域技术人员可将上述的多肽作为抗原活性成分制备预防和/或治疗NRAS突变的肿瘤的疫苗。该疫苗以上述的多肽作为抗原成分，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

制备疫苗时，经常会添加免疫佐剂以增强机体对疫苗的免疫响应。其中，所述的免疫佐剂为弗氏不完全佐剂、完全弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、磷酸铝佐剂、乳佐剂、脂质体佐剂、微生物佐剂等。

自然的，本领域在本发明记载的多肽的基础上，容易得到抗上述蛋白的抗体。上述的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体；优选为单克隆抗体。上述抗体还可与偶联部分形成偶联物。进一步的，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白或生物素中的一种或多种。可特异性结合前述的蛋白的抗体一方面可用于制备预防和/或治疗NRAS突变的肿瘤的，另一方面可用于NRAS突变的肿瘤的免疫检测。

此外，本发明也包含了上述蛋白的编码基因。上述蛋白的编码基因一方面可以用于表达制备上述的多肽外；另一方面还可以可操作地装载在表达载体中，进而可制备成载体疫苗或载体药物的。表达可在质粒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体等常用载体中选择。当使用腺病毒载体时，一般采用复制缺陷型腺病毒载体。

在一些情况下，本发明的肿瘤新抗原多肽，还包括了的长度不超过40个氨基酸，其氨基酸序列包含有SEQ ID No.17所述序列的，且仍然具有与新抗原肽M9相同或者相似的功能的抗原肽。进一步的，所述的氨基酸序列包含有SEQ ID No.17所述序列的肿瘤新抗原多肽，不超过30个氨基酸；其仍然具有与新抗原肽M9相同或者相似的功能。

进一步的，本发明的肿瘤新抗原多肽叶包括在所述SEQ ID No.17序列的氮端连接有1～20个氨基酸和/或在所述SEQ ID No.17序列的碳端连接有不超过且不超过1～20个氨基酸形成的多肽，其仍然具有与新抗原肽M9相同或者相似的功能。

也就是说，本本发明可以在上述的SEQ ID No.17所述序列的肿瘤新抗原多肽M9的任意一侧或者两侧添加一定长度的氨基酸序列，仍然能得到能激活HLA分型为HLA-DRB1*09:01且伴随有NRAS的Q61K突变的患者产生特异性的针对具有NRAS Q61K突变的肿瘤的T细胞的抗原多肽。

可以理解的是，上面的在肿瘤新抗原多肽M9的任意一侧或两侧添加的氨基酸序列，可以来源于NRAS蛋白中的由GKEEYSAMRDQYMRT所对应的位点的两侧。

由于本发明的新抗原肽M9能够显著激活人体特异性针对NRAS突变的T细胞，增加T细胞对NRAS突变肿瘤细胞的杀伤能力。在此基础上，本发明自然也提供了上述的一系列的新抗原肽在制备NRAS突变的肿瘤的免疫治疗药物中的应用。由于使用上述新抗原肽治疗NRAS突变的肿瘤时，目前使用新抗原刺激树突状细胞作为疫苗，将疫苗接种给NRAS突变的肿瘤患者后，使T淋巴细胞活化增殖，开始攻击以新抗原肽为识别标靶的癌细胞。在此基础上，本发明也提供了一种DC细胞，是经上述的肿瘤新抗原多肽刺激而得。刺激方式一般为DC细胞与肿瘤新抗原多肽进行共孵育。DC细胞常用为的离体DC细胞。自然，上述的DC细胞为肿瘤中的NRAS发生Q61K突变的患者的离体DC细胞。一般来说，是需要把离体DC细胞培养至成熟之后再进行新抗原的刺激步骤。自然，上述的DC细胞为含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患者的离体DC细胞。

本发明也提供了上述肿瘤新抗原多肽和上述的DC细胞在制备伴随NRAS突变的肿瘤的免疫治疗药物中的应用。上述应用中所述的伴随NRAS突变的肿瘤为NRAS发生Q61K突变的肿瘤。伴随NRAS发生Q61K突变的肿瘤有为黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌和肺癌等多种肿瘤。当然，主要是适用于含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患有上述肿瘤的患者。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

实施例1新抗原分析和预测

通过临床采样搜集1肺癌患者的外周血和肺癌肿瘤组织。对外周血进行DNA抽提并通过外显子组测序获得基因组数据，对肿瘤组织同时进行DNA和RNA的抽提，分别进行外显子组测序和转录组测序，以获得肿瘤组织的基因组数据和转录组数据。

将高通量测序的原始数据进行基于参考基因组的比对、重复序列的标记以及短***缺失的重比对等操作，最终获得质控合格的比对基因组数据和比对转录组数据。基于这些数据，使用HLA基因型分型软件获取患者的HLA基因型；使用拷贝数分析软件获得肿瘤组织中基因组拷贝数的变化数据；使用纯度分析软件获得肿瘤组织的纯度及克隆结构；使用体细胞突变分析软件获得肿瘤组织中的体细胞突变；使用突变位点翻译软件获得氨基酸发生改变的突变多肽序列；使用基因表达定量软件分析基因表达水平的数据。

在获得了新抗原相关的数据后，我们使用HLA-新抗原结合力预测软件分析突变多肽序列是否可以有效地结合HLA分子(IC50值<500nM)。并以此为根据，结合多肽表达等情况挑选出IC50值排名前15的突变多肽作为备选的肿瘤新抗原(参见表2)。

表2备选肿瘤新抗原的信息

实施例二抗原肽通过MHC-II途径激活树突状细胞的结果

1、外周血PBMC的采集及处理

使用单核细胞采集***对实施例一中的病人进行机采，得到病人外周血中的单核细胞。该病人含有HLA-DRB1*09:01分型。

a)用生理盐水1:1稀释单核细胞，加入人淋巴细胞分离液后离心，小心吸出单核细胞所在的白膜层到另一个洁净的离心管；

b)用生理盐水洗涤两次、用AIM-V细胞培养基洗涤一次后进行细胞计数，并取适量细胞冻存留标本。

2、树突状细胞(DC)培养及与新抗原的共孵育

a)将步骤1中获取的PBMC进行细胞培养，培养箱中孵育以使单核细胞贴壁；

b)将贴壁细胞分离出来进行培养，在培养基中加入重组人GM-CSF和重组人IL-4以诱导单核细胞向DC细胞进行分化；

c)培养6天后，在细胞培养基中加入DC促成熟因子LPS、IFN-γ以诱导DC成熟；

d)加入促成熟因子培养7天后，收获成熟的DC细胞，按照HLA分组将实施例1挑选出的抗原肽进行分组，设置共5组DC细胞，把HLA分组的各组抗原肽加入对应的各组DC细胞中，分别孵育4～6小时后冻存备用。

e)将孵育后的五组DC细胞回输给病人进行临床的治疗。在腋窝和腹股沟***引流区域进行皮下注射。回输分别在第1，2，4，6，8周进行，完成此5次注射为一个免疫疗程，一个免疫疗程后评估疗效，有效则进行下周起治疗，无效则终止治疗。每次回输细胞量为3*10⁸个细胞。

，一个治疗周期后抽取病人的外周血进行效果的鉴定。

3、酶联免疫吸附试验(ELISPOT法)

a)在上述经回输治疗后的病人外周血中分离得到T细胞，按照抗原肽进行分组，分别加入不同的抗原肽；

b)孵育20小时后，使用去离子水洗涤细胞；

c)加入生物素标记的IFN-gamma抗体孵育1小时，孵育完成后同样进行细胞的洗涤；

d)加入酶标亲和素孵育1小时，赋予完成进行细胞的洗涤；

e)加入显色液并孵育，待斑点生长到适合的大小后终止显色并用软件进行ELISPOT板斑点计数。

4、结果分析

通过ELISPOT板斑点计数，***地分析了挑选的15条肿瘤新抗原多肽对患者T细胞的激活效果(参见图1，每个视野图左下方的***数字就是该实验中的小孔中的斑点数)，发现其中标号为M9的多肽具有最好的激活效果(肿瘤新抗原组实验小孔中的斑点数均值为1050个)，而对照的正常多肽的斑点数均值为143，该多肽为来源于NRAS的Q61K突变的多肽GKEEYSAMRDQYMRT。实验结果表明NRAS-Q61K体细胞突变和HLA-DRB1*09:01基因型的肿瘤病人中，M9多肽GKEEYSAMRDQYMRT够显著激活人体特异性针对NRAS突变肽的T细胞，以增加T细胞对存在NRAS突变的癌细胞的杀伤能力。

综上所述，本发明的抗原肽已在人体实验中利用免疫实验验证了其个体化的有效性，从而弥补了个体化抗原肽在同时具有NRAS-Q61K体细胞突变和HLA-DRB1*09:01基因型的肿瘤病人中治疗中的空白；本发明的抗原肽能够显著激活人体特异性针对NRAS突变肽的T细胞，增加T细胞对存在NRAS突变的癌细胞的杀伤能力，利于大规模的合成以便用于标准化个体化的肿瘤免疫治疗之中。

以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (18)

1.肿瘤新抗原多肽，其特征在于：其氨基酸序列为GKEEYSAMRDQYMRT(SEQ ID No.17)；

或者，上述多肽的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加至少一个氨基酸所得的功能相同或者相似的多肽。

2.权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽在制备可诱导产生特异性细胞毒性T细胞克隆的免疫活性调节剂中的应用。

3.权利要求1所述肿瘤新抗原多肽在制备存在NRAS高频突变的肿瘤风险干预和/或治疗剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的NRAS高频突变为Q61K突变。

5.DC细胞，其特征在于所述的DC细胞经权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽刺激而得。

6.根据权利要求6所述的DC细胞，其特征在于所述的刺激方式为DC细胞与肿瘤新抗原多肽进行共孵育。

7.根据权利要求6所述的DC细胞，其特征在于所述DC细胞为成熟的DC细胞。

8.根据权利要求7所述的DC细胞，其特征在于所述DC细胞为NRAS发生Q61K突变的患者的离体DC细胞。

9.根据权利要求7所述的DC细胞，其特征在于所述DC细胞为含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患者的离体DC细胞。

10.权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽和权利要求5～9任一项所述的DC细胞在制备伴随NRAS突变的肿瘤的免疫治疗药物中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述的伴随NRAS突变的肿瘤为NRAS发生Q61K突变的肿瘤。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌和肺癌。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于所述的肿瘤为含有人类白细胞的HLA分型为HLA-DRB1*09:01的患者所患肿瘤。

14.抗权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽的抗体。

15.如权利要求14所述的抗体，其特征在于：为多克隆抗体或单克隆抗体。

16.如权利要求14～15任一项所述的抗体，其特征在于：还与偶联部分形成偶联物；所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白或生物素中的至少一种。

17.编码权利要求1所述的肿瘤新抗原多肽或权利要求14～16任一项所述的抗体的基因。

18.装载有权利要求17所述的基因的载体。

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