KR20130055553A - 환자가 면역치료제에 대한 반응자일지의 여부를 확인하는 방법 - Google Patents

환자가 면역치료제에 대한 반응자일지의 여부를 확인하는 방법 Download PDF

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KR20130055553A
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올리비어 그루셀리
자밀라 로우아헤드
페르난도 울로아-몬토야
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 유전자의 차별적인 발현에 기반하여 환자를 요법에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법에 관한 것이다. 유전자 발현 프로필, 유전자 발현 프로필을 나타내는 핵산 서열을 포함하는 마이크로어레이, 및 신규한 진단 키트 및 치료 방법이 또한 제공된다. 키트 및 방법은, MAGE 발현 종양을 지니는 유전자 발현 프로필을 특징으로 하는, 예를 들어 암 환자의 특수한 집단의 치료에 관한 것이다.

Description

환자가 면역치료제에 대한 반응자일지의 여부를 확인하는 방법 {METHOD FOR IDENTIFYING WHETHER A PATIENT WILL BE RESPONDER OR NOT TO IMMUNOTHERAPY}
콤팩트 디스크로 제출된 자료
본 출원인은 2009년 10월 6일자 출원된 미국 가특허출원 61/278387호에서 제출된 2009년 10월 6일자로 생성된 파일명 "VR63933P_pe.txt" (파일 크기 23.330 MB); 및 2009년 10월 6일자로 생성된 "VR63933P_rq.txt" (파일 크기 15.767 MB)를 함유하는 콤팩트 디스크의 자료를 본원에서 참조하며, 이러한 자료의 이익을 본원에서 청구한다. 총 두 개의 콤팩트 디스크 (사본 포함)를 본 문단에서 언급한다.
이러한 디스크상의 pe 데이터를 이용하려면, R 세션에 다음 명령어를 쳐서 VR63933P_pe.txt ASCII 파일을 R 세션으로 가져온다:
pe <- read.table("VR63933P_pe.txt ")
pe <- unstack(pe)
이러한 디스크상의 rq 데이터를 이용하려면, R 세션에 다음 명령어를 쳐서 VR63933P_rq.txt ASCII 파일을 R 세션으로 가져온다:
rq <- scan("VR63933P_rq.txt.")
이러한 데이터의 공개 배포는 본원의 다른 부분에서 기재된다.
본 발명은 유전자 발현 프로필; 환자를 분류하는 방법; 마이크로어레이; 및 본원에 기재된 방법 및 마이크로어레이를 이용하여 선택된 환자 집단의 치료에 관한 것이다.
흑색종은 표피의 멜라닌 세포로부터 기원된 종양이다. 원격 전이로 악성 흑색종을 갖는 환자 (더 아메리칸 조인트 코미션 온 캔서 (the American Joint Commission on Cancer; AJCC) 분류에 따라 단계 IV)는 1년의 평균 생존 기간을 가지며, 단지 5%의 장기 생존율을 갖는다. 단계 IV 흑색종에 대한 표준 화학요법이 단지 8-25%의 치료 반응율을 갖지만, 전반적인 생존에는 영향을 미치지 못하였다. 국소 전이 (단계 III)를 갖는 환자는 2 내지 3년의 평균 수명을 가지며, 심지어 일차 및 국소 전이의 적당한 수술적 제어 후에도 장기간 생존할 확률은 매우 낮다 (Balch et ai, 1992). 단계 I 내지 III 흑색종을 갖는 대부분의 환자는 이들의 종양을 수술에 의해 제거하였으나, 이들 환자는 실질적인 재발 위험성을 갖고 있다. 따라서, 흑색종 진행이 예방되어야 하며, 전이성 흑색종에 대한 개선된 치료법 및 일차 종양이 제거된 환자의 보조적인 치료법에 대한 요구가 남아 있다.
두 유형의 폐암이 존재한다: 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 소세포 폐암 (SCLC). 명칭은 단순히 종양이 발견된 세포의 유형을 기술한다. NSCLC는 편평세포암종, 선암종 및 대세포 암종을 포함하며, 폐암의 약 80%를 차지한다. NSCLC은 치료가 어려우며, 이용가능한 치료법은 가능한 길게 삶을 연장시키는데 목표를 두는 경향이 있다. NSCLC는 가장 흔한 유형의 폐암이며, 이에 대한 성과는 적다 (Gatzmeier et al., 1994). 모든 NSCLC 환자의 단지 약 25%는 진단시 국소병변을 가지며, 여전히 수술에 의해 적출해낼 여지가 있다 (AJCC 분류에 따라 단계 IB, IIA 또는 IIB). 그러나, 이들 환자중 50% 초과는 완전한 절제 수술 후 2년 이내에 재발될 것이다. 따라서, 이러한 환자를 위한 더욱 우수한 치료가 제공되어야 한다.
전통적인 화학치료제는 환자로의 독성 물질 투여에 기반하고, 부분적으로, 종양/암 세포에 의한 독성제의 침략적인 흡수에 의존적이다. 이들 독성 물질은 환자의 면역계에 나쁜 영향을 미쳐, 개체가 육체적으로 약해지고, 감염에 민감해지게 한다.
암 환자 모두가 현재 암 치료법에 반응하는 것은 아님이 공지되어 있다. 암 환자중 단지 30% 또는 그 미만만이 임의의 주어진 치료법에 반응할 것으로 여겨진다. 치료법에 반응하지 않는 암은 내성으로서 설명된다. 많은 경우에, 환자가 치료에 반응적일 지의 여부를 확인시켜주는 신뢰할 만한 방법은 존재하지 않았다. 그러나, 반응자 및 비-반응자인 환자로의 치료제 투여는 이들이 구별될 수 없기 때문에 자원의 비효율적인 사용에 해당하며, 더욱 나쁘게는, 이미 기술된 바와 같이 많은 암 치료제가 현저한 부작용 예컨대, 심각한 면역억제, 구토 및/또는 탈모를 갖기 때문에 환자에 해를 끼칠 수 있다. 치료제가 필요하지 않거나 비효과적일 경우에도, 환자가 이를 수용하는 경우가 많은 것으로 여겨진다.
항원, 펩티드, DNA 등에 기반한 암 치료제의 새로운 생성은 수많은 그룹에 의해 현재 조사중에 있다. 종종 암 면역치료제로서 불리는 많은 이러한 치료제 배후의 방법은 환자 면역 시스템을 암과 싸우도록 자극하는 것이다. 이러한 치료제는 이러한 치료로 인한 부작용이 암 치료시 환자가 일반적으로 겪게 되는 부작용과 비교하여 최소인 것으로 예상되기 때문에 유리할 것으로 여겨진다. 암 면역치료제에 사용된 항원은 ASCI로서 불릴 수 있으며, 이는 항원-특이적 암 면역치료제이다.
1980년대 초기에, 반 펠 (Van Pel) 및 본 (Boon)은 종양 세포상에 제시된 항원에 대해 유도된 세포용해성 T 세포의 발견을 공개하였다. 이는 제 1 종양 특이적 공유된 항원의 특징을 규명하였다: 흑색종 AGE-I (MAGE-I, 후에, MAGE-A1로 다시 불림). 이어서, 동일한 유전자 발현 패턴을 공유하는 수많은 유전자를 확인하였다: 이들은 다양한 범위의 종양 유형, 예컨대 흑색종, 폐암, 방광암, 유방암, 두경부암에서 발현된다. 이들은 고환을 제외한 정상 세포에서는 발현되지 않는다. 그러나, 고환에서의 이러한 발현은 일반적으로 항원 발현을 유도하지 않는데, 이들 생식선 세포는 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않기 때문이다. 이들의 독특한 발현 프로필로부터, 고환암 (CT) 유전자의 명칭이 이들 유전자에 대해 제안되었다.
MAGE 항원은 흑색종-관련 항원 유전자 (MAGE)의 패밀리에 의해 엔코딩된 항원이다. MAGE 유전자는 흑색종 세포 (악성 흑색종 포함) 및 NSCLC (비소세포 폐암), 두경부 편평세포 암종, 방광 이행세포 암종 및 식도 암종을 포함하는 일부 그 밖의 암 상에서 우세하게 발현되지만, 고환 및 태반을 제외한 정상 조직에서는 검출불가능하다 (Gaugler et al Human gene MAGE-3 codes for an antigen recognized on a melanoma by autologous cytolytic T lymphocytes J Exp Med. 1994 Mar 1; 179(3):921-930); Weynants et al Expression of mage genes by non-small-cell lung carcinomas Int. J Cancer. 1994 Mar 15;56(6):826-829, Patard et al Int J. Cancer 64: 60, 1995). MAGE-A3는 흑색종의 69%에서 발현되며 (Gaugler, 1994), NSCLC의 44% (Yoshimatsu 1988), 두경부 편평 세포 암종의 48%, 방광 이행세포 암종의 34%, 식도 암종의 57%, 결장암의 32% 및 유방암의 24%에서도 검출될 수 있다 (Van Pel, et al Genes coding for tumor antigens recognized by cytolytic T lymphocytes Immunological Reviews 145, 229-250, 1995, 1995.); Inoue 1995; Fujie 1997; Nishimura 1997). MAGE 단백질을 발현하는 암은 Mage 관련 종양으로서 공지되어 있다.
예를 들어, 암 환자의 진단 및 예측을 보조하는, 예를 들어 전이, 재발 또는 질환의 진행 위험성을 갖지 않기 때문에 추가의 치료가 불필요한 환자를 식별하기 위한 많은 작업이 수행되었다.
WO 2006/124836는 수개의 암유발 경로에 대한 특정 유전자 발현 시그너처를 확인하여, 환자의 예후 및 이들 경로를 표적으로 하는 치료제에 대한 민감성을 규정한다. 특이적 발암유전자로는 Myc, Ras, E2, S3, Src 및 베타-카테닌이 있다.
US 2006/0265138에는 일반적으로, 일차 종양을 확인하기 위한 유전자 프로필을 생성시켜 적합한 치료제를 제공할 수 있는 방법이 기술되어 있다.
US 2006/0240441 및 US 2006/0252057에는 특정 유전자의 차별적인 발현에 기반하여 폐암을 진단하는 방법이 기술된다.
US 2006/0234259는 전립선암과 관련된 특정 유전자 발현 프로필의 확인 및 용도에 관한 것이다.
WO 2006/103442에는 타목시펜과 같은 특정 호르몬 치료제 및 또한, 특정 화학치료제에 대한 반응의 예측적인 시그너처로서 작용하는 에스트로겐 수용체 (ER) 포지티브 종양의 서브세트에서 발현된 유전자 발현 프로필이 기술되어 있다.
WO 2006/093507에는 결장직장암 환자를 우수한 예후 또는 나쁜 예후를 갖는 환자로 특성화하는데 유용한 유전자 프로필이 기술되어 있으며, 여기서 우수한 예후를 갖는 환자가 화학치료제에 적합하다.
WO 2006/092610에는 특정 유전자의 차별적인 발현에 기반한 흑색종 진행을 모니터링하는 방법 및 질환에 대한 신규한 마커, 특히 TSBYl, CYBA 및 MT2A가 기술되어 있다.
WO 2005/049829에는 erbB 수용체 키나제 억제제, 예컨대 게피티닙 (gefitinib)인 화학치료제에 대한 특정 암의 민감성을 예측하는데 사용될 수 있는 분리된 마커 유전자 세트가 기술되어 있다.
마이크로어레이 유전자 프로파일링은, 어떠한 치료적 중재에도 불구하고, 암환자가 치료제에 반응할지를 예측하거나 질병의 예후를 평가하기 위한 강력한 기법인 것으로 밝혀졌다. 유방암 및 여포성 림프종에서 상이한 예후와 관련되는 것으로 여겨지는 프로필을 확인하기 위해 수많은 광범한 범위의 임상 시험이 현재 진행중이다 (Dave, 2004; Hu, 2006; Weigelt, 2005).
종양 세포를 포함하는 세포는 수 백 심지어 수 천개의 유전자를 발현시킨다. 치료제에 반응하지 않는 환자에 비해 반응하는 환자들간에 유전자의 차별적인 발현은 반응할 것 같은 환자에 대한 특수한 맞춤 치료를 가능하게 할 수 있다.
발명의 개요
일 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 환자를 적합한 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 분류하는 방법을 제공한다:
(a) 환자 유래 샘플에서 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계로서, 유전자(들)는 표 1로부터 선택된 것인, 단계; 및
(b) 파라메터가 트레이닝 세트에 의해 정의된 알고리듬을 이용하여 상기 (a)의 발현 수준에 기반하여 환자를 반응자 또는 비-반응자 그룹으로 분류하는 단계.
일 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 환자를 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법을 제공한다:
(a) 환자 유래 샘플을 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 분석하는 단계; 및
(b) 샘플이 유래된 환자를 상기 (a)의 결과에 기반하여 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 단계로서, 특성화 단계가 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행되는, 단계.
일 구체예에서, 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 환자 유래 샘플의 분석을 달성함에 의해 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 그 결과로부터 환자를 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하고, 특성화 단계는 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행된다. 그 후, 환자가 면역치료제에 대해 반응자로서 특성화된 경우, 적합한 면역치료제의 하나 이상의 투여를 위해 환자를 선택한다.
일 구체예에서, 환자 유래 샘플을 수득하고 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 환자 유래 샘플을 분석함으로써 환자가 면역치료제에 대해 반응자 또는 비-반응자일지를 결정하는 방법이 제공된다. 그 결과로부터 환자를 면역치료제에 대해 반응자 또는 비-반응자로서 특성화할지를 결정하며, 특성화 단계는 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행된다.
일 구체예에서, 단계 (b)는 수리적 분별 함수 또는 판단 트리(decision tree)에 기반한다. 판단 트리는 하나 이상의 이변량 분류 단계를 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 발명은, 환자 유래 샘플에서, 표 1에 나열된 프로브 세트 중 하나 이상에 의해 인지된 유전자 생성물을 분석하는 것을 포함하는, 환자를 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법을 제공하며, 프로브 세트의 표적 서열은 표 3에 제시되어 있고, 특성화 단계는 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행된다.
예시적인 구체예에서, 표 1의 하나 이상의 유전자 또는 프로브 세트는 표 1에 나열된 적어도 63개의 유전자 또는 표 1에 나열된 적어도 74개의 프로브 세트이다.
예시적인 구체예에서, 본 발명의 방법은 표 2, 5, 7 또는 9에 명시된 유전자의 발현 수준의 측정 또는 프로브 세트의 유전자 생성물의 측정을 포함한다. 이러한 표들의 각각의 유전자 및 프로브 세트 뿐 아니라 유전자의 그룹 또는 프로브 세트들이 본 발명의 특정 양태를 형성한다. 표 2, 5, 7 및 9의 유전자 및 프로브 세트는 표 1의 유전자 및 프로브 세트의 특수한 서브세트를 나타낸다.
또한 MAGE-A3 ASCI 또는 임의의 면역치료 접근법에 대한 반응자 환자 및 비-반응자 환자를 구별하는데 사용될 수 있는 예측 유전자 프로필이 제공되며, 여기서 프로필은 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.
일 구체예에서, 본원에 기재된 유전자 프로필이 제공되며, 여기서 유전자는 표 1에 나열된 프로브 세트에 의해 인지된 유전자이다.
추가의 양태에서, 프로필은 표 1에 나열된 모든 유전자를 포함하거나 이로 구성되거나, 표 1에 나열된 프로브 세트에 의해 인지되거나 표적화된 모든 유전자를 포함하거나 이로 구성된다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하며, 이 때 표 1의 유전자에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브 또는 프로브 세트는 상기 마이크로어레이 상의 프로브 또는 프로브 세트의 50% 이상을 구성한다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자 중 적어도 63개의 다수의 검출제에 결합된 솔리드 표면(solid suface)을 제공하며, 검출제는 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 유전자의 발현을 검출할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상 또는 표 1에 나열된 유전자의 유전자 생성물 중 하나 이상의 발현을 검출하는 수단을 포함하는 진단 키트를 제공한다. 발현은 mRNA 또는 cDNA 유전자 생성물과 하이브리드화되는 프로브에 의해 검출될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물, 예를 들어 mRNA 또는 cDNA, 또는 표 1에 나열된 유전자의 유전자 생성물을 확인하기 위한 하나 이상의 프로브를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1의 유전자 생성물 중 하나 이상, 또는 본원에 기재된 유전자 프로필의 유전자 생성물의 차별적인 발현 (예를 들어 상향조절)을 확인하기 위한 PCR (또는 다른 공지된 기법)의 용도를 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료제, 백신 또는 면역원성 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료제에 대한 반응자로서 특성화된 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 대안적인 치료제 또는 조합된 치료제, 예를 들어 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물 대신에 또는 이에 추가하여 사용될 수 있는 화학치료제 및/또는 방사선 요법을 투여하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 방법에 따라 치료제에 대해 비-반응자로서 특성화된 환자를 치료하는 방법 또는 본원에 기재된 진단 키트의 용도를 제공한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 반응자로서 특성화된 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 종양 관련 항원을 포함하는 조성물의 용도, 본원에 기재된 마이크로어레이의 용도, 본원에 기재된 유전자 프로필의 용도 또는 본원에 기재된 진단 키트의 용도를 제공한다.
도 1/21은 리브 원 아웃 교차확인 (Leave One Out Cross Validation (LOOCV))을 위한 계획을 도시한다.
도 2/21은 각각의 루프에서 분류에 가장 좋은 100개 PS를 선택하는 LOOCV의 결과를 도시한다. 빈 원 = 비-반응자, AS02B 아암. 채워진 원 = 반응자, AS02B 아암. 빈 삼각형 = 비-반응자, AS15 아암. 채워진 삼각형 = 반응자, AS15 아암.
도 3/21은 프로브 세트 (PS)가 각각의 LOOCV에서 100개의 상위 s2n (신호 대 노이즈) 내에 있는 갯수를 나타낸다 (X 축상의 PS 수).
도 4/21은 II상 흑색종 시험에서 모든 환자에 대하여 애주번트에 의한 전반적인 생존 (OS)에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선(KM)을 도시한다; 실선 = AS15 아암. 점선 = AS02B 아암.
도 5/21은 LOOCV 분류에 기반한 유전자 시그너처에 의한 전반적인 생존에 대한 KM을 도시한다: 실선 = 유전자 시그너처 포지티브 (GS+); 점선 = 유전자 시그너처 네거티브 (GS-).
도 6/21은 LOOCV 분류에 기반한 유전자 시그너처 및 애주번트에 의한 전반적인 생존 카플란-마이어 곡선을 도시한다. 굵은 실선 = AS15 아암, GS+. 굵은 점선 = AS15 아암, GS-. 얇은 실선 = AS02B 아암, GS+. 얇은 점선 = AS02B 아암, GS-.
도 7/21은 100개 PS를 이용한 샘플의 분류를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 빈 원 = 비-반응자, AS02B 아암. 채워진 원 = 반응자, AS02B 아암. 빈 삼각형 = 비-반응자, AS15 아암. 채워진 삼각형 = 반응자, AS15 아암.
도 8/21은 표 5에 명시된 PCR에 의해 측정된 22개 유전자를 이용한 상응하는 샘플의 리브 원 아웃 분류를 도시한다. 빈 원 = 비-반응자, AS02B 아암. 채워진 원 = 반응자, AS02B 아암. 빈 삼각형 = 비-반응자, AS15 아암. 채워진 삼각형 = 반응자, AS15 아암.
도 9/21은 표 5에 명시된 22개 유전자를 이용한 샘플의 분류를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 빈 원 = 비-반응자, AS02B 아암. 채워진 원 = 반응자, AS02B 아암. 빈 삼각형 = 비-반응자, AS15 아암. 채워진 삼각형 = 반응자, AS15 아암.
도 10/21은 NSCLC II상 시험 설계를 도시한다.
도 11/21은 NSCLC 시험에 있어서 질환이 없는 간격에 대한 KM 곡선을 도시한다. 원으로 된 실선 = MAGE-A3; 사각형으로 된 대시 선 = 플라시보.
도 12/21은 본 출원의 실시예에 사용된 Cox-SPCA 방법을 도시한다.
도 13/21은 PCR에 의해 측정된 표 6에 나열된 23개 유전자를 이용하여 정중값이 컷오프인 LOOCV 분류에 기반한 유전자 프로필에 의한 생존 곡선을 도시한다: 굵은 실선 = MAGE 면역치료제, GS+. 굵은 점선 = MAGE 면역치료제, GS-. 얇은 실선 = 플라시보, GS+. 얇은 점선 = 플라시보, GS-.
도 14/21은 LOOCV 분류를 이용하여 PCR에 의해 측정된 표 6에 나열된 23개 유전자를 이용하여 129개 NSCLC 샘플에서 플라시보 (왼쪽 패널) 및 백신 아암 (오른쪽 패널)간 위험 점수의 분포를 도시한다. 채워진 마름모 = 재발; 빈 마름모 = 비-재발.
도 15/21은 표 6에 나열된 대로 분류자에서 Q-PCR에 의한 23개 유전자를 이용한 분류에 기반한 임상 결과를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 굵은 실선 = MAGE 면역치료제, GS+. 굵은 점선 = MAGE 면역치료제, GS-. 얇은 실선 = 플라시보, GS+. 얇은 점선 = 플라시보, GS-.
도 16/21은 표 6에 나열된 대로 분류자에서 Q-PCR에 의한 23개 유전자를 이용한 분류에 기반한 플라시보 (왼쪽 패널) 및 백신 아암 (오른쪽 패널)간 위험 점수를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 채워진 마름모 = 재발; 빈 마름모 = 비-재발.
도 17/21은 표 5에 나열된 22개 유전자를 이용하여 129개 NSCLC 샘플에서 정중값이 컷오프인 LOOCV 분류에 기반한 유전자 프로필에 의한 생존 곡선을 도시한다: 굵은 실선 = MAGE 면역치료제, GS+. 굵은 점선 = MAGE 면역치료제, GS-. 얇은 실선 = 플라시보, GS+. 얇은 점선 = 플라시보, GS-.
도 18/21은 LOOCV 분류를 이용하여 표 5에 나열된 22개 유전자를 이용하여 129개 NSCLC 샘플에서 플라시보 (왼쪽 패널) 및 백신 아암 (오른쪽 패널)간 위험 점수의 분포를 도시한다. 채워진 마름모 = 재발; 빈 마름모 = 비-재발.
도 19/21은 표 5에 나열된 대로 분류자에서 Q-PCR에 의한 22개 유전자를 이용한 분류에 기반한 임상 결과를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 굵은 실선 = MAGE 면역치료제, GS+. 굵은 점선 = MAGE 면역치료제, GS-. 얇은 실선 = 플라시보, GS+. 얇은 점선 = 플라시보, GS-.
도 20/21은 표 5에 나열된 대로 분류자에서 Q-PCR에 의한 22개 유전자를 이용한 분류에 기반한 위험 점수를 도시한다 (리브 원 아웃 아님). 채워진 마름모 = 재발; 빈 마름모 = 비-재발.
도 21/21은 단백질 D 1/3 - MAGE3 - HIS 단백질을 도시한다.
서열 인식표시 및 표:
하기 서열 인식표시를 서열 목록에 포함시켰다:
SEQ ID NO: 1-100 - 표 3에 도시된 프로브 세트 표적 서열
SEQ ID NO: 101 - 단백질 D - MAGE-A3 융합 단백질
SEQ ID NO: 102-106 - CpG 올리고누클레오티드 서열
SEQ ID NO: 107-113 - MAGE 펩티드 서열
표 1: 100 PS 및 상응하는 유전자 목록.
표 1A: 모든 샘플을 이용하여 선택된 100 PS 및 LOOCV에서 선택된 시간
표 2: 표 1로부터의 27 PS 및 21개 유전자의 서브세트
표 3: 100 PS 표적 서열
표 4: 100 PS 분류자 피처(feature)에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
표 5: 흑색종에서 22개 유전자의 적합한 서브세트
표 6: 흑색종의 22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
표 7: NSCLC에서 23개 유전자의 적합한 서브세트
표 8: NSCLC의 23개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수.
표 9: NSCLC에서 22개 유전자의 적합한 서브세트
표 10: NSCLC의 22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수.
표 11: 흑색종 샘플에서 Q-PCR에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
표 12: NSCLC 샘플에서 Q-PCR에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
표 13: 흑색종 샘플에서 마이크로어레이에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
발명의 상세한 설명
예측 유전자 프로필
외과적 절제술 후에, 악성 흑색종을 지니는 환자로부터의 전처리 종양 조직에 대해 수행된 분석은, 특정 유전자가 치료제에 덜 반응할 것 같았던 환자 (비-반응자)에 비해 더 잘 반응할 것 같았던 환자 (반응자)에서 차별적으로 발현되었음을 확인시켜 주었다.
본 발명자들은 치료제에 대한 환자의 반응의 가능성을 예측하는 유전자 프로필을 발견하였다.
"유전자 프로필"은 유전자 또는 유전자 세트의 발현이 치료제에 대한 환자 반응과 관련된 유전자 또는 유전자 세트를 나타내는데, 그 이유는 유전자 또는 유전자 세트가 치료제에 대해 유리한 반응을 지니는 환자와 치료제에 대해 불리한 반응을 지니는 환자간에 차별적인 발현을 나타내기 때문이다. 본 발명의 일 구체예에서, 용어 "유전자 프로필"은 표 1에 나열된 유전자 또는 본원에 기재된 표 1의 유전자의 어떠한 선택을 지칭한다.
본원에서 사용된, 예를 들어 항암 치료에 대한 "유리한 반응" (또는 "유리한 임상 반응")은 교대 치료를 발생시키거나 어떠한 치료가 없는 종양 성장에 비해, 감소된 속도의 종양 성장을 나타내는 당업자에게 인지된 생물학적 또는 물리적 반응을 지칭한다. 치료제에 대한 유리한 임상 반응은 피검체가 경험하는 징후의 감소, 예상되거나 달성된 생존 시간의 증가, 종양 성장의 감소된 속도, 종양 성장의 정지 (안정한 질환), 전이 병변의 수 또는 크기에서의 회귀, 및/또는 전체적인 종양 크기의 회귀 (각각은 치료제의 부재하에 또는 교대 치료제에 반응하여 발생할 종양 성장과 비교됨)를 포함할 수 있다. 애주번트 암 치료제의 경우에, 유리한 임상 반응은 재발의 부재 또는 재발 속도의 지연 또는 질환이 없는 생존 기간 또는 시간 간격의 증가를 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 "차별적인 발현"이란 유전자가 이의 정상적인 발현과 비교하여 상향조절되거나 하향조절됨을 의미한다. 유전자의 차별적인 발현을 계산하기 위한 통계학적 방법은 본원의 다른 부분에서 논의된다.
일부 양태에서, 본 발명은 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 환자를 특성화하는 유전자 프로필을 제공하는데, 상기 프로필은 표 1의 하나 이상의 유전자의 차별적인 발현을 포함하거나 상기 프로필은 표 1에 나열된 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 프로필은 반응자 또는 비-반응자를 나타낼 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 기재된 유전자 프로필은 반응자를 나타낸다.
표 1의 프로브 세트에 의해 인지되거니 표적화된 유전자 서열이 표 3에 나열된다.
"표 1의 유전자"는 표 1, 2, 5, 7 또는 9의 "유전자 명칭"하에 나열된 유전자를 의미한다. "유전자 생성물"은 천연적이거나 인위적인 수단에 의해 생산되든지 간에, 유전자의 전사 또는 번역의 어떠한 생성물을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에서 지칭된 유전자는 "유전자 명칭"이라고 표시된 열(column)에 정의된 대로 표 1, 2, 5, 7 또는 9에 나열된 것들이다. 또 다른 구체예에서, 본원에서 지칭된 유전자는 유전자의 생성물이 표 1에 나열된 프로브 세트에 의해 인지될 수 있는 유전자이다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 표 1에서 확인된 유전자 시그너처는 사실상 면역/염증, 예컨대 반응자로서 지정된 환자에서 T 세포 침윤/활성화 반응을 나타내는 것으로 가정되고, 예를 들어 상기 시그너처는 T 세포 활성화 마커를 나타낼 수 있다. 상기 시그너처는 또한 세포 매개 면역 반응의 유도를 촉진하는 경향이 있는 인터페론 경로의 구성원을 포함하는 Th1 마커를 나타낼 수 있다. 이러한 반응의 존재는 면역치료제의 투여 후에 암과 같은 질병과 싸우는 환자의 몸을 도와서 환자가 상기 면역치료제에 더욱 반응성이 되게 하는 것으로 여겨진다.
따라서 본 발명의 시그너처는 일반적으로 관련 질병, 예를 들어 종양유전자와 같은 암의 진단 및/또는 예후와 특이적으로 관련된 마커/유전자에 초점을 맞추는 것이 아니라, 오히려 암 면역치료제과 같은 적합한 면역치료제에 환자가 반응할지 여부를 예측하는 것이다.
본원에서 확인된 유전자 프로필은 종양의 미세환경을 나타내는 것으로 여겨진다. 적어도 이러한 양태에서, 종양의 정확한 미세환경은 환자가 적합한 암 면역치료제에 반응할지에 관한 관문이 될 것으로 보인다.
시그너처의 생물학은 ASCI 작용 방식과 관련되는데, 그 이유는 상기 시그너처가 인터페론 경로의 구성원을 포함하는 T 세포 마커 및 Th1 마커의 상향조절을 나타내는 반응자 환자의 종양에서 면역 이펙터 세포의 존재에 유리한 특이적 종양 미세환경(케모킨)의 존재를 암시하는 유전자를 함유하기 때문이다. 전이 흑색종에서 최근의 유전자 발현 프로파일링 연구는 종양이 T 세포 관련 전사체의 존재 또는 부재에 기반하여 분리될 수 있었음을 나타내었다 (Harlin, 2009). 종양에서 림프구의 존재는 6개 케모킨 (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10)의 서브세트의 발현과 관련되었고, 이러한 6개의 유전자 중 3개(CCL5, CXCL9, CXCL10)는 표 1의 100 PS에 존재한다.
일 구체예에서, 본 발명은 표 1에 나열된 하나 이상의 (예컨대 실질적으로 모든) 유전자를 사용한다. 적합하게는, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자들 중 적어도 63개 또는 프로브 세트 중 적어도 74개를 사용한다.
적합하게는, 표 1의 하나 이상의 유전자는 표 1에 나열된 적어도 63개, 적어도 64개, 적어도 65개, 적어도 66개, 적어도 67개, 적어도 68개, 적어도 69개, 적어도 70개, 적어도 71개, 적어도 72개, 적어도 73개, 적어도 74개, 적어도 75개, 적어도 76개, 적어도 77개, 적어도 78개, 적어도 79개, 적어도 80개의 유전자 또는 실질적으로 모든 유전자 및/또는 이들의 임의의 조합이다.
적합하게는, 표 1의 하나 이상의 프로브 세트는 표 1에 나열된 적어도 74개, 적어도 75개, 적어도 76개, 적어도 77개, 적어도 78개, 적어도 79개, 적어도 80개, 적어도 81개, 적어도 82개, 적어도 83개, 적어도 84개, 적어도 85개, 적어도 86개, 적어도 87개, 적어도 88개, 적어도 89개, 적어도 90개의 프로브 세트 또는 실질적으로 모든 프로브 세트 및/또는 이들의 임의의 조합이다.
유전자 목록과 관련하여 실질적으로 모든이라 함은 주어진 목록의 유전자의 적어도 90%, 예컨대 95%, 특히 96, 97, 98 또는 99%일 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 전이 환경에 적용된다.
유전자가 반응자 (또는 대안적으로 비-반응자)로서 간주된 환자에서 항상 상향조절되거나 항상 하향 조절되는 경우, 일단 역치가 성립되면 환자가 반응자 또는 비-반응자인지의 여부를 확립하는데 이러한 단일 유전자를 사용할 수 있는데, 단, 두 그룹이 충분히 분리되어야 한다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 유전자 중 하나 이상을 포함하는 반응자를 확인하기 위한 유전자 프로필을 제공하며, 여기서 유전자의 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100%가 상향조절된다. 대조적으로 비-반응자에서, 유전자/유전자들은 상향조절되지 않고/거나 하향조절된다.
본 발명과 관련하여, 샘플은 잠재적으로 치료가 필요한 환자로부터 유래된 어떠한 생물학적 조직 또는 체액일 수 있다. 샘플은 타액, 혈액, 소변, 또는 일차 종양 또는 전이부, 또는 사전에 제거된 조직의 단편으로부터의 생검과 같은 고형 조직으로부터 유래될 수 있다.
샘플은, 예를 들어 바늘 생검 중심부, 외과적 절제 샘플 또는 림프절 조직을 포함하거나 이로 구성될 수 있었다. 이러한 방법은, 종양 세포를 총 세포 집단의 약 80%까지 풍부하게 하기 위한 냉동미세절단 절편에 의해 임의로 분획화된 생검을 수득하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이러한 샘플로부터 추출된 핵산을 당 분야에 널리 공지된 기법을 이용하여 증폭시킬 수 있다. 선택된 마커의 수준을 검출할 수 있고, 예를 들어 Mage 포지티브 비-반응자 환자의 통계적으로 유효한 그룹과 비교할 수 있다.
종양에 관한 분석을 위해, 생물학적 샘플을 수득하여 암 또는 종양 세포를 함유하는 샘플에 대한 기회를 최대화할 것이고, 생물학적 샘플은, 예를 들어 신선한 샘플 (동결된 샘플 포함) 또는 파라핀에서 보존된 샘플과 같은 암 또는 종양으로부터 유래될 수 있다. 여기에 언급된 파라핀에서 보존된 샘플은 분해될 수 있고, 관찰된 프로필은 변형될 수 있다. 당 분야에 종사하는 기술자는 프로필의 파라메터를 재측정함에 의해 관찰된 이러한 변화들을 잘 보정할 수 있다.
일 양태에서, 생물학적 샘플은, 예를 들어 종양 또는 암성 조직으로부터의 생검 샘플이다.
일 양태에서, 암 면역치료제는 흑색종, 폐암, 예를 들어 NSCLC, 방광암, 경부암, 결장암, 유방암, 식도 암종 및/또는 전립선암, 예컨대 폐암 및/또는 흑색종, 특히 흑색종의 치료를 위한 것이다.
본 발명과 관련하여 "반응자"는 암/종양(들)이 근절되거나, 감소되거나 개선되거나 (완전 반응자 또는 부분 반응자; 혼합된 반응자) 단순히 안정화되어 이러한 질환이 더 이상 진행되지 않는 ("안정한 질환") 사람을 포함한다. 암에 관해 "완전 임상 반응자"는 표적 병변이 전부 사라진 것이다.
암에 있어서 "부분 임상 반응자" 또는 "부분 반응자"는 종양/암의 전부가 어느 정도 치료에 반응한 것이며, 예를 들어 상기 암이 30, 40, 50, 60% 또는 그 초과로 감소된다.
"진행성 질환"은 표적 병변의 크기가 20% 증가하거나 하나 이상의 새로운 병변이 출현하거나 이들 둘 모두를 나타낸다.
진행성 질환 (PD)을 지니는 환자는 추가로 혼합된 반응을 지니지 않는 PD 또는 타입 I 또는 II의 "혼합된 임상 반응자"를 지니는 진행성 질환에 대한 분류자일 수 있거나 암에 관한 "혼합된 반응자"는 종양/암의 일부가 치료에 반응하고 나머지는 변화되지 않은 채로 남아 있거나 진행되는 것으로서 정의된다.
비-반응자(NR)는 하나 이상의 표적 병변의 소실을 나타내지 않은 혼합된 반응 II를 지니는 진행성 질환 및 혼합된 반응이 없는 진행성 질환을 지닌 환자로서 정의된다.
반응자에서, 암이 안정되면, 안정화 기간은 삶의 질 및/또는 환자의 삶의 기대가 치료를 받지 않은 환자에 비해 증가되도록 한다 (예를 들어, 6개월 초과 동안 안정한 질환).
일부 구체예에서, 용어 "반응자"는 "혼합된 반응자"를 포함하지 않을 수 있다.
반응자 (유전자 시그너처 포지티브) 또는 비-반응자 (유전자 시그너처 네거티브)로서 새로운 환자의 예측된 특성화는 "표준(standard)" 또는 트레이닝 세트 (training set)를 참조로 하여 또는 파라메터가 트레이닝 세트로부터 수득된 수리적 모델/알고리듬 (분류자)를 이용하여 수행될 수 있다. 표준은 반응자 또는 비-반응자인 것으로 공지된 인간/환자(들)의 프로필일 수 있거나, 대안적으로, 수치값일 수 있다. 그러한 소정의 표준은 인쇄된 목록 또는 다이아그램, 컴퓨터 소트프웨어 프로그램 또는 그 밖의 매체와 같은 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다.
표준은 적합하게는, 표준 정보와 환자 유래 샘플에서 동일한 유전자의 발현 관련 정보와의 비교가 환자에서 반응자 또는 비-반응자 상태에 대한 결론을 도출할 수 있도록 하는, 공지된 반응자 또는 비-반응자 상태에 있는 환자 또는 환자들의 유전자 생성물 또는 생성물들의 발현에 대한 수치, 또는 이들의 기능이다. 표준은 반응자 또는 비-반응자로 공지된 하나 이상의 개체의 분석으로부터, 및 표 1의 하나 이상의 유전자를 이용하여 수득될 수 있다.
트레이닝 세트 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 파라메터의 비제한적인 예는 하기 실시예 1에 논의된 샘플 표준화에 사용된 참조 데이터 세트, 참조 분위수(quantile), 프로브 효과 또는 R 대상 포맷 데이터이다. 반응자 또는 비-반응자로서의 환자의 분류에 있어서 이러한 특정 실시예의 이용은 본 발명의 특정 양태를 형성한다.
일 양태에서, 표준 또는 트레이닝 세트를 참조로 하여 통계적 분석을 수행한다. 표 1의 유전자 목록은 비교상 그룹으로서의 트레이닝 세트의 환자의 임상 결과 (반응자 및 비-반응자)를 이용하여 각각의 프로브 세트의 신호 대 노이즈를 계산함에 의해 생성되었다. 이어서 트레이닝 세트로부터 유래된 분류자 파라메터를 이용하여 새로운 샘플에 대한 분류를 예측한다.
본 명세서와 관련하여 트레이닝 세트는 임상 결과가 유전자 프로필과 상호관련될 수 있으며, 새로운 샘플에 대한 반응자 및/또는 비-반응자를 확인하기 위한 적합한 통계학적 모델/프로그램을 트레이닝하는데 사용될 수 있는 샘플의 그룹을 나타내고자 한 것이다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 표 1의 100개 유전자 중 적어도 68개가 트레이닝 세트에서의 변화에 내성인 것으로 여겨진다. 이러한 유전자는 본 발명의 특수한 양태를 형성한다. 이러한 유전자는 표 1A의 5열로부터 확인될 수 있다.
일 양태에서, 수리적 모델/알고리듬/통계학적 방법을 이용하여 환자를 반응자 또는 비-반응자로서 특성화한다.
특성화를 위한 알고리듬은, 비록 실시예 1-7의 어떠한 알고리듬과 같은 임의의 적합한 특성화 알고리듬을 이용할 수 있으나, 어떠한 하나의 유전자 및 어떠한 하나의 공지된 반응자 또는 비-반응자로부터의 유전자 발현 정보를 이용하고 적합하게는 관리된 주요 성분 분석(supervised principal component analysis)에 기반한다.
특히, 알고리듬은 실시예 1에 도시된 분별 분석 알고리듬 (Discriminant analysis algorithm)과 함께 관리된 주요 성분 분석을 이용하거나 실시예 3에 도시된 cox 판단 규칙과 함께 관리된 주요 성분 분석을 이용하여 공지된 임상 결과와 함께 개별 또는 트레이닝 세트로부터 표준을 생성할 수 있다.
따라서, 일 양태에서 본 발명은 또한 새로운 환자를 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하기 위한 분류자의 개발에 관한 것이고, 분류자의 파라메터는 공지된 임상 결과를 지닌 트레이닝 세트로부터 수득된다 (반응자 및 비-반응자).
유전자 목록은 신호 대 노이즈, 발디(Baldi) 분석 표준적인 T 시험의 편차, 및/또는 피어슨스(Pearsons) 상관 계수 및/또는 선형 분별 분석을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Golub T, Slonim D, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 1999; 286: 531-36. Van't Veer LJ , Dai H, van de Vijver MJ , He YD , Hart AA , Mao M, Peterse HL , van der Kooy K, Marton MJ , Witteveen AT , et al . (2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer . Nature , 415(6871), 530-56] 참조.
분류자는 관리된 주요 성분들, 분별 분석, 최단 중심(nearest centroid), kNN, 서포트 벡터 기구 또는 분류를 위한 그 밖의 적합한 알고리듬을 이용할 수 있었고; 분류를 위해 시간 (예컨대, 생존 시간, 질환이 없는 시간 간격)을 이용하는 알고리듬을 포함한다. 대안적으로, 분류는 당 분야에 널리 공지된 그 밖의 수리적 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
분류자는 실시예 1 및/또는 2에 예시된 DA 판단 규칙을 갖는 SPCA 또는 실시예 3 및/또는 4에 예시된 SPCA-Cox 판단 규칙을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 기재된 방법은 반응자 및 비-반응자를 정확하게 예측하는데 있어서 50%, 60% 또는 70% 넘게 정확하고, 예컨대 약 70% 정확하다.
일 구체예에서, 반응자 및 비-반응자는 연속적인 변수이며, 예를 들어 수 개월간 측정될 수 있는 시간 대 치료 실패(TTF)/ 전반적인 생존(OS)을 참조하여 정의된다. 시간 대 치료 실패 변수가 크면, 환자가 반응자로서 고려될 것이다. 시간 대 치료 실패 변수가 작으면, 환자는 비-반응자로서 고려될 것이다. 일반적으로, 이러한 접근법을 이용하여, 혼합된 반응자도 반응자로서 분류된다.
치료 실패란 환자가 본원에 정의된 반응자, 부분 반응자, 혼합된 반응자 또는 안정한 질환의 정의에 속하지 않는 경우이다.
일 양태에서, 비-반응자는 6개월 또는 그 미만의 TTF를 지니는 것으로서 정의될 수 있다.
일 양태에서, 반응자는 6개월 초과, 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24개월 또는 그 초과의 TTF를 지니는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 치료에 대한 환자 반응은 연속적인 변수이며, 예를 들어 수 개월간 측정될 수 있는 질환이 없는 간격 (DFI) 또는 질환이 없는 생존 (DFS)이다. DFI 및 DFS는 예를 들어 애주번트 치료에 사용된다; 종양이 제거되었거나, 재발을 피하거나 지연시키거나 질환이 없는 간격 또는 생존을 동등하게 연장시키도록 치료가 제공된 경우이다.
DFI 및 DFS는 바이오마커 또는 유전자 발현 프로필과 같이 환자 임상 정보 또는 측정된 환자 파라메터와 관련될 수 있고 이를 이용하여 새로운 환자의 반응을 예측하기 위한 수리적 모델을 세울 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은 표 1에 나열된 유전자의 발현 수준을 측정하거나 프로브 세트의 유전자 생성물을 측정하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 폐암 및 흑색종 둘 모두에 대해 환자를 면역치료제, 적합하게는 Mage와 같은 고환암 항원에 기반한 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 예측하거나 확인하기 위한 표 1에 나열된 하나 이상의 (예컨대 실질적으로 전부) 유전자 또는 프로브 세트의 이용을 포함한다. 적합하게는, 본 발명은 표 1에 나열된 적어도 63개의 유전자 또는 적어도 74개의 프로브 세트를 이용한다.
표 1
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*: R2.9에서 NA가 된 R2.6으로부터의 주석
일 양태에서, 본 발명의 방법은 표 2에 나열된 유전자의 발현 수준을 측정하거나 프로브 세트의 유전자 생성물을 측정하는 것을 포함한다.
표 2
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*: R2.9에서 NA가 된 R2.6으로부터의 주석
표 1에 나열된 프로브 세트에 대한 표적 서열은 하기에 제공된다.
표 3
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일 양태에서, 본 발명은 전가공 단계를 수행하여 표준화된 유전자 또는 프로브 세트 세기 매트릭스를 생산하고 상기 매트릭스를 신호 대 노이즈 통계학적 분석으로 처리하여 차별적으로 발현된 유전자 또는 프로브 세트를 확인한 다음 가장 차별적으로 발현된 유전자 순서대로 유전자 또는 프로브 세트를 랭킹함에 의해 생성된 유전자 프로필을 제공한다.
일 구체예에서, 각 환자에 대한 관련 유전자 발현의 측정치 또는 유전자 세기 벡터로부터 유래된 "지수(index)"를 플롯팅함으로써 역치가 성립될 수 있다. 일반적으로, 반응자 및 비-반응자는 대략 상이한 축/초점에서 군집화될 것이다. 역치는 전형적인 통계학적 방법에 의해 또는 두 그룹 사이의 중도를 확립하기 위한 "추세선 (best fit line)"을 단순히 플롯팅함으로써 군집 사이의 갭에서 확립될 수 있다. 예를 들어, 소정의 역치를 초과하는 값은 반응자로서 지정될 수 있으며, 예를 들어, 소정의 역치 미만의 값은 비-반응자로서 지정될 수 있다.
일 구체예에서, 주어진 어떠한 분류자의 성능을 분석할 수 있다. 역치의 수준을 변화시키고, 각각의 역치 값에 대해, 모델의 예측 능력 (민감성, 특이성, 포지티브 및 네거티브 예측 값, 정확성)을 계산함에 의해 철저한 성능 분석이 수행된다. 이러한 분석은 주어진 분류자에 대해 적합한 역치를 선택하는데 도움이 될 수 있다.
또한, 분류자의 성능 분석은 모델의 민감성, 특이성, 포지티브 및 네거티브 예측 값 및 정확성을 평가하기 위해 주어진 역치 값에 대해 수행될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 양태에 의해 제공된 프로필의 적합한 구체예에서, 성별과 밀접하게 관련된 유전자의 효과는 배제된다.
일 구체예에서, 흑색종의 유전자 발견 분별인자(discriminant)의 서브세트를 이용하여 Q-PCR에 의해 평가된 이들의 유전자 프로필에 따라 종양 샘플을 분류하는 방법이 제공된다 (실시예 1).
일 구체예에서, 흑색종에서 유전자 발견 분별인자의 전부 또는 서브세트를 이용하여 Q-PCR에 의해 평가된 이들의 유전자 프로필에 따라 NSCLC암 종양 샘플을 분류하는 방법이 제공된다.
분류자는 관리된 주요 성분 분석 및 Cox 비례 위험성 모델의 사용을 포함할 수 있다; 유전자 발현 프로필에 추가하여, 이러한 접근법에서 시험 세트 유전자 발현에 기반하여, 모델 파라메터를 계산하고 후속하여 시험 세트에 대한 위험 지수를 계산하기 위해, 종양 단계 및 외과술 상태와 함께 트레이닝 세트에서 샘플의 DFI 또는 DFS, 전반적인 생존 (OS)을 이용할 수 있다.
일단 유전자 프로필이 확인되고 샘플에 대한 분석이 수행되면, 예를 들어 한 가지 색으로 반응자를 표시하고 또 다른 색으로 비-반응자를 표시하는 히트 맵 (heat map)과 같은, 결과를 나타내는 다수의 방법이 존재한다. 그럼에도 불구하고, 더욱 정성적인 정보는 지수로서 표시될 수 있는데, 지수는 역치를 지니는 스펙트럼으로서 결과를 도시하며, 예를 들어 역치를 초과하는 환자는 반응자로서 고려되고 역치 미만의 환자는 비-반응자로서 고려된다. 스펙트럼으로서 정보를 제시하는 이점은 의사로 하여금 비-반응자로 여겨지나, 역치에 가깝게 위치하는 환자에게 치료를 제공할지를 결정할 수 있게 해 준다는 것이다.
본 발명과 관련하여 "면역치료제"는 일반적으로 항원에 대한 면역 반응을 자극하는 것에 기반한 치료제를 의미하며, 상기 반응은 그와 관련된 질환을 치료, 개선 및/또는 진행을 지연시킨다. 이와 관련하여 치료는 일반적으로 예방적 치료를 포함하지 않을 것이다.
본 발명과 관련하여 "암 면역치료제"는 암을 치료하기 위한 면역치료제를 의미한다. 일 양태에서, 면역치료제는 Mage와 같은 고환암 항원에 기반한다 (하기에 보다 상세하게 논의됨).
유리하게는, 본 발명의 신규한 방법에 의해 적합한 면역치료제 치료에 반응할 것 같은 환자를 확인할 수 있다. 상기 방법은 그러한 치료가 이로울 환자로의 자원의 적합한 채널링을 촉진하고 그러한 치료가 이롭지 않을 환자에게 더욱 유익할 수 있는 대안적인 치료를 환자가 받게 할 수 있다.
본 발명은 적합한 면역치료제에 반응할 것 같은 암환자, 예를 들어 흑색종, 유방암, 방광암, 폐암, NSCLC, 두경부암, 편평세포 암종, 결장 암종 및 식도 암종을 지닌 환자, 예컨대, MAGE-발현 암을 지닌 환자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 구체예에서, 본 발명은 그러한 암, 특히 폐암 및 흑색종에서 애주번트 (수술 후, 예를 들어 질환 없음) 환경에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 전이 환경에서 암의 치료에 유용성을 지닌다.
면역 활성화 유전자는 적합한 면역 반응을 촉진하거나, 증가시키거나 자극하는 유전자를 나타내고자 한다. 면역 반응 유전자 및 면역 활성화 유전자는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
마이크로어레이
암/종양 세포와 같은 세포에 의해 발현된 유전자를 분석하기 위한 중요한 기법은 수 백개 이상의 프로브 서열 (예컨대 55,000개 프로브 세트)이 유리 표면에 부착되어 있는 DNA 마이크로어레이이다 (유전자 칩 기법으로도 알려짐). 프로브 서열은 대체로 모두 25 mer 또는 60 mer이고 공지 유전자로부터의 서열이다. 이러한 프로브는 일반적으로 임의의 특정 유전자 (프로브 세트)에 대한 11개의 개별적인 프로브의 세트로 정렬되며 유리 표면 상에서 소정의 패턴으로 고정되어 있다. 적합한 생물학적 샘플에 노출되면, 이러한 프로브는 특정 유전자의 관련 RNA 또는 DNA에 하이브리드화된다. 세척 후, 칩은 적합한 방법에 의해 "판독"되고 색의 세기와 같은 양이 기록된다. 특정 유전자의 차별적인 발현은 기록된 측정치/세기에 비례한다. 상기 기법은 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
마이크로어레이는 불연속 영역, 전형적으로 핵산의 어레이이며, 이는 서로 분리되며, 전형적으로 약 100/cm2 내지 1000/cm2의 밀도로 정렬되나, 10000/cm2와 같은 더 높은 밀도에서도 정렬될 수 있다. 마이크로어레이 실험의 원리는 제공된 세포주 또는 조직으로부터의 mRNA가 표지된 샘플, 전형적으로 표지된 cDNA, 소위 "표적"'을 생성하기 위해 사용되며, 이는 정렬된 어레이의 솔리드 표면상에 부동화된 수많은 핵산 서열, 전형적으로 DNA 서열과 동시에 하이브리드화된다.
수 만개의 전사체 종이 검출될 수 있으며, 동시에 정량될 수 있다. 많은 상이한 마이크로어레이 시스템이 개발되었지만, 오늘날 가장 통상적으로 사용되는 대부분의 시스템은 어레이된 물질에 따라 두 그룹으로 나누어질 수 있다: 상보적 DNA (cDNA) 및 올리고누클레오티드 마이크로어레이. 어레이된 물질은 일반적으로 프로브로 불리는데, 그 이유는 이것이 노던 블롯 검정에 사용된 프로브에 상당하는 것이기 때문이다. cDNA 어레이에 대한 프로브는 일반적으로 벡터-특이적 또는 유전자-특이적 프라이머를 사용하여 cDNA 라이브러리 또는 클론 콜렉션으로부터 생성된 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 생성물이며, 규정된 위치에서 스팟 (spot)으로서 유리 슬라이드 또는 나일론 멤브레인상에 프린팅된다. 스팟은 전형적으로 10-300㎛ 크기이며, 거의 동일한 간격을 두고 이격되어 있다. 이러한 기법을 이용하여, 30,000개 초과의 cDNA로 이루어진 어레이는 통상적인 현미경 슬라이드 표면상에 핏팅될 수 있다. 올리고누클레오티드 어레이에 있어서, 짧은 20-25 mer는 실리콘 웨이퍼상으로의 포토리소그래피에 의해 (Affimetrix로부터의 고밀도-올리고누클레오티드 어레이) 또는 잉크-젯 기법 (로제타 인파마틱스(Rosetta Inpharmatics)에 의해 개발되어, 어질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies)로 라이센싱됨)에 의해 동일계에서 합성된다. 대안적으로, 미리 합성된 올리고누클레오티드는 유리 슬라이드상에 프린팅될 수 있다. 합성 올리고누클레오티드에 기반한 방법은 서열 정보 단독으로도 어레이될 DNA를 생성시키기에 충분하기 때문에, cDNA 공급원의 시간 소모적 작업이 요구되지 않는다는 이점을 제공한다. 또한, 프로브는 주어진 전사체의 가장 독특한 부분을 나타내도록 설계되어 밀접하게 관련된 유전자 또는 스플라이스 변이체 가능성을 검출할 수 있게 한다. 짧은 올리고누클레오티드가 덜 특이적인 하이브리드화 및 저하된 민감성을 유도할 수 있지만, 미리 합성된 더 긴 올리고누클레오티드 (50-100 mer)의 어레이도 최근 이러한 단점과 직면하게 됨이 밝혀졌다.
따라서, 환자가 본 발명의 유전자 시그너처를 나타내는 지의 여부를 확인하기 위한 마이크로어레이를 수행하는데 있어서, 하기 단계가 수행된다: 샘플로부터 mRNA를 수득하고 핵산 표적을 준비하고, 전형적으로 마이크로어레이의 제조업자에 의해 제안된 바에 따른 조건하에 어레이를 접촉시켜 (적합하게는, 3X SSC, 0.1% SDS, 50℃의 엄격한 하이브리드화 조건) 어레이상에 상응하는 프로브를 결합시키고, 필요에 따라 세척하여 비결합된 핵산 표적을 제거하고, 결과를 분석한다.
당업계에 공지된 방법, 예컨대 프라이머 특이적 cDNA 합성에 의해 표 1에 기재된 것과 같은 대상 서열에 대한 mRNA는 풍부해질 수 있음이 자명할 것이다. 집단은 추가로, 예를 들어, PCR 기법을 이용하여 증폭될 수 있다. 표적 또는 프로브는 표적 분자의 마이크로어레이로의 하이브리드화 검출을 가능하게 하도록 표지된다. 적합한 표지는 프로브로 혼입될 수 있는 동위 원소 또는 형광 표지를 포함한다.
일단 표적 유전자/프로필이 확인되면, 유전자(들)가 차별적으로 발현되는지를 측정하는데 이용될 수 있는 마이크로어레이에 대안적인 여러 개의 분석적인 방법이 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 유전자들 중 하나 이상의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다. 적합하게는, 표 1의 유전자에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브 또는 프로브 세트가 상기 마이크로어레이 상의 프로브 또는 프로브 세트의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 실질적으로 전부를 구성한다.
적합하게는, 마이크로어레이는 표 2에 나열된 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함한다.
적합하게는, 본 발명에 따른 검출제 또는 마이크로어레이를 지니는 고체 표면은, 예를 들어 표 1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83개 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 cDNA를 검출할 수 있는 검출제 또는 프로브를 포함한다.
일부 예에서, PCR은 마이크로어레이보다 더욱 민감한 기법이므로, 보다 낮은 수준의 차별적으로 발현된 유전자를 검출할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 환자는 그/그녀의 종양이 PCR 기법, 특히 정량적 PCR (Quantative PCR)에 기반한 진단 키트를 사용하여 본 발명의 유전자 시그너처를 발현하는지의 여부를 확인하기 위해 진단될 수 있다 (검토를 위해 Ginzinger D Expenmental haematology 30 (2002) p 503-512 and Gmliette et al Methods, 25 p 386 (2001) 참조).
분석 기법은 실시간 중합효소 연쇄 반응, 소위 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응 (QRT-PCR 또는 Q-PCR)을 포함하며, 이는 샘플에 존재하는 주어진 DNA 분자의 특정 부분을 동시에 정량하고 증폭하는데 사용된다.
공정은 중합효소 연쇄 반응의 일반적 패턴을 따르나, DNA는 각 횟수의 증폭 후에 정량화된다 ("실시간" 양상). 정량화의 세 개의 공통된 방법은 (1) 이중-가닥 DNA에 삽입되는 형광 염료의 사용, (2) 상보적인 DNA와 하이브리드화되는 경우 형광을 발하는 변형된 DNA 올리고누클레오티드 프로브의 사용 및 (3) 형광 염료를 방출시키는 연장 동안 DNA 중합효소에 의해 가수분해되는 증폭된 서열에 상보적인 Taqman 프로브의 사용이다.
실시간 중합효소 연쇄 반응의 배후의 기본 개념은 샘플 중에 특정 cDNA (및 따라서, mRNA)가 더 많을수록, 반복되는 증폭 사이클 동안 더 먼저 검출될 것이라는 점이다. 향후의 DNA 증폭을 허용하는 다양한 시스템이 존재하며, 이들은 종종 실시간 증폭 동안 새롭게 합성된 DNA 분자로 혼입되는 형광 염료의 사용을 포함한다. 열순환 공정을 조정하는 실시간 중합효소 연쇄 반응 머신은 이어서, 형광 DNA의 존재비를 검출하고, 주어진 샘플의 증폭 진행을 검출할 수 있다. 전형적으로, 시간에 따른 주어진 cDNA의 증폭은 초기 평평한 상태 이어서, 지수 상태를 갖는 곡선에 따른다. 최종적으로, 실험 시약을 다 사용했을 때, DNA 합성은 느려지며, 지수 곡선은 플래토 (plateau) 상태로 평평하게 된다.
대안적으로, mRNA 또는 표적 유전자(들)의 단백질 생성물은 노던 블롯 검정, 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학법에 의해 측정될 수 있다.
일 양태에서, 프로필/시그너처를 확인하기 위한 분석을 고환암 항원이 발현되는 환자 샘플 상에서 수행한다.
단일 유전자가, 예를 들어 Q-PCR에 의해 분석되는 경우, 유전자 발현은 불변부를 보유하는 유전자를 참조로 하여 표준화될 수 있고, 예를 들어 기호 H3F3A, EIF4G2, HNRNPC, GUSB, PGK1, GAPDH 또는 TFRC를 갖는 유전자가 표준화에 적용하기에 적합할 수 있다. 표준화는 고려되는 유전자에 대해 수득된 Ct 값으로부터 불변 유전자에 대해 수득된 값을 감함으로써 수행될 수 있다.
유전자의 차별적인 발현을 정량화하는데 사용된 하나의 파라메터는 배수 변화 (fold chage)이며, 이는 두 개의 구별되는 실험 조건 사이의 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교하기 위한 측정 규준(metric)이다. 이의 산술적 정의는 연구자 마다 상이하다. 그러나, 배수 변화가 높을수록, 관련 유전자의 차별적인 발현이 더욱 충분히 구별될 것이며, 이는 환자가 어느 범주 (반응자 또는 비-반응자)에 속할지를 용이하게 결정하게 한다.
배수 변화는, 예를 들어 2 이상, 10 이상, 15 이상, 20 또는 30 이상일 수 있다.
차별적인 발현을 정량화하는데 또한 사용된 또 다른 파라메터는 "p" 값이다. p 값이 더 낮을수록, 유전자는 더욱 차별적으로 발현할 것으로 여겨지며, 이로 인해 본 발명의 프로필에 사용하기 위한 우수한 후보가 된다. P 값은, 예를 들어 0.1 또는 그 미만, 예컨대, 0.05 또는 그 미만, 특히, 0.01 또는 그 미만을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 P 값은 수정된 "P" 값 및/또는 또한 비수정된 "P" 값을 포함한다.
샘플 분류에 사용될 수 있었던 유전자를 확인하기 위한 또 다른 파라메터는 신호 대 노이즈이고, 이러한 알고리듬은 그룹내 표준 편차의 가중된 합계에 비해 두 그룹간 발현 수준의 차이를 측정한다. 따라서, 그룹내 편차가 적은 그룹들 간 가장 높은 발현 차이를 지니는 유전자를 랭크하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 본 발명에 따른 분리된 구체예로 확장되며, 이는 본원에 기재된 구성요소/엘리먼트를 포함하거나, 이들을 필수적으로 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명은, 예를 들어 문헌 [Hongwei Wu et al 2007 (Hierarchical classification of equivalent genes in prokaryotes-Nucliec Acid Research Advance Access)]에 기술된 바와 같이 유전자의 계층적 분류를 특징으로 하는 본원에 나열된 유전자의 기능적 등가물로 확장된다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 유전자 자체가 반드시 시그너처의 특징일 필요는 없지만, 이는 근본적으로 중요한 유전자 기능인 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어, 표 1에 나열된 바와 같은 면역 활성화 유전자와 기능적으로 동등한 유전자가 시그너처에 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Journal of the National Cancer Institute Vol 98, No. 7 April 5 2006] 참조).
유전자는 특이적 프로브에 의해 확인되었으며, 따라서, 당업자는 상기 유전자에 대한 기재가 무엇이 프로브에 하이브리드화되는 지에 대한 현재의 지식에 기반한 설명임을 이해할 것이다. 그러나, 규정된 조건하에 관련 프로브로의 하이브리드화를 반복함으로써 유전자에 대해 사용된 명명법과 상관없이, 필요한 유전자를 확인할 수 있다.
본 발명은 면역치료제, 예컨대 암 면역치료제, 예를 들어, 고환암 면역치료제, 구체적으로 특히 흑색종에 대한 Mage 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 환자를 예측하거나 확인하기 위한 본 발명에 따른 프로필(들)의 용도로 확장된다.
이와 같이, 본 발명은 샘플이 유래된 환자를 본 발명에 따른 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로 특성화하기 위해, 본 발명에 따라 프로필/유전자(들)의 차별적인 발현에 기반하여 환자 유래 샘플을 분석하는 방법을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은
샘플로부터 RNA를 분리하는 단계,
상기 유전자에 대해 샘플로부터의 cDNA의 복사체(copy)를 임의로 증폭시키는 단계, 및
샘플에서 cDNA의 수준을 정량화하는 단계를 포함하는, 샘플이 유래된 환자가 면역치료제, 예컨대 본 발명에 따른 암 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자일지를 확인할 목적으로 샘플에서 본원에서 확인된 유전자로부터의 폴리누클레오티드의 발현 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 프로필을 확인하기 위해 환자로부터 유래된 샘플에 대한 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 구성요소를 포함하는 진단 키트를 제공하고, 그 결과를 이용하여 샘플이 유래된 환자를 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 지정할 수 있다.
키트는 PCR (예컨대, QPCR), 마이크로어레이 분석, 면역조직화학법 또는 하나 이상의 유전자의 차별적인 발현을 평가하는데 사용될 수 있는 기타 분석 기법을 위한 재료/시약을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 관해 본원에 기재된 하나 이상, 예컨대 5개 이상의 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 하이브리드화될 수 있는 프로브의 세트를 포함하는 진단 키트를 제공하고, 예를 들어, 표 1의 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52,53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83개 유전자의 mRNA 또는 이의 cDNA에 하이브리드화될 수 있는 프로브의 세트를 포함하는 진단 키트를 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 진단 키트에 관한 것이다. 예를 들어, 진단 키트는, 예를 들어 본 발명의 유전자 시그너처를 나타낼 수 있는 표 1의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83개 유전자로부터의 mRNA 또는 cDNA에 하이브리드화될 수 있는 프로브 및 마이크로어레이 기재(substrate)를 포함하는 그러한 마이크로어레이를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 시그너처의 식별에 적합한 마이크로어레이를 제공한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 또한 본 발명에 사용된, 예를 들어 표 1로부터의 하나 이상의 유전자로부터 발현된 mRNA 또는 cDNA 모이어티(moiety)에 하이브리드화되기에 적합한 프로브 및 기재로 확장된다.
시중에서 입수가능한 마이크로어레이는 분석의 정확성을 위해 임의의 한 시점에서 고려중인 유전자의 차별적인 발현을 특성화하는데 요구되는 것보다 매우 많은 프로브를 함유한다. 따라서, 하나 이상의 프로브 세트는 동일한 유전자를 인지할 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 다중 프로브 또는 프로브 세트는 본원에 기재된 본 발명의 어떠한 양태에 따른 유전자의 차별적인 발현, 예컨대 상향조절을 확인하게 위해 사용된다.
진단 키트는, 예를 들어 마이크로어레이에서 정렬된 프로브를 포함한다.
특히, 예를 들어, 본원에 기술된 하나 이상의 프로브 세트를 함유하는 제조된 마이크로어레이는 Affimetrix와 같은 회사에 의해 용이하게 제조될 수 있어 본 발명에 따른 프로필을 확인하기 위한 특이적 시험 및 임의로 시약을 제공한다.
구체예에서, 마이크로어레이 또는 진단 키트는 추가적으로 Mage 유전자와 같은 관련 고환암 항원 발현 유전자의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있을 것이다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 적합한 조건하에 상기 하이브리드화에 적합한 프로브 및/또는 프로브 세트를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전자 프로필을 확인하기 위한, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 프로브 또는 이의 기능적 등가물의 사용으로 확장된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 발명은 상기 시그너처의 확인을 위해 본원에 나열된 모든 순열의 프로브 (또는 이의 기능적 상동체)의 사용에까지 확장된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 프로필이 환자 유래 샘플에 존재하는지를 확립하기 위해 면역 활성화 유전자의 하나 이상의 유전자 생성물의 차별적인 발현을 확인하기 위한 프로브의 용도를 제공한다.
하이브리드화가 적용된 본 발명의 구체예에서, 하이브리드화는 일반적으로 엄격한 조건, 예컨대 3X SSC, 0.1% SDS하에 50℃에서 수행될 것이다.
일단 표적 유전자(들)/프로필이 확인되면, 당업자는 동일한 표적에 하이브리드화되는 대안적인 프로브를 설계할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 적합한 조건하에, 기술된 바와 같은 시그너처/프로필을 제공하기 위해 본 발명의 유전자(들)의 동일한 차별적인 발현을 측정하는 프로브로 확장된다.
본 발명은 또한 암 환자가 적합한 면역치료제로의 치료에 대한 반응자 또는 비-반응자일 지의 여부를 분석하는데 있어서 관련 프로브의 용도로 확장된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 시그너처를 확인하기 위한 공지된 마이크로어레이의 용도 (및 이를 이용한 방법)로 확장된다.
핵산 프로브는 길이가 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 그 초과의 누클레오티드일 수 있으며, 전장 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 프로브는 엄격한 조건하에 표 1에 나열된 유전자로부터 발현된 mRNA (또는 이의 cDNA)에 특이적으로 하이브리드될 수 있는 것들이다.
본 발명은 추가로 본원에 기술된 본 발명의 어떠한 구체예를 적용하여 발현 프로필을 약물 처리 전 및 후에 분석하는 단계를 포함하여, 조직 또는 세포 샘플 상에서 약물의 효과를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어 Mage 항원 특이적 암 면역치료제로부터 환자가 이익을 얻을 수 있도록 (즉, 유전자 프로필을 반응자의 유전자 프로필로 변경시키기 위해), 예를 들어, Mage 항원 특이적 암 면역치료제로 치료 후 개선된 생존율을 갖는 환자의 유전자 프로필로 유전자 프로필을 변경시킬 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 예를 들어 본원에 기재된 본 발명의 어떠한 구체예에 따른 발현 프로필을 분석하는 단계 및 이를 표준과 비교하여 환자가 Mage 특이적 면역치료로부터 이익을 얻을지를 진단하는 단계를 포함하는, 환자의 진단 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 환자에 의해 제공된 종양 조직 샘플로부터 본 발명의 어떠한 구체예에 따라 발현 프로필을 분석하는 단계 및, 예를 들어 표 1의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82 또는 83개의 상기 유전자가 발현되는지의 여부를 평가하는 단계를 포함하는, 환자의 진단 방법을 제공한다.
이와 같이, 임상 적용에서, 인간 환자로부터의 조직 샘플은 본원에 기재된 본 발명의 어떠한 구체예의 발현의 존재 및/또는 부재에 대해 스크리닝될 수 있다.
대안적인 양태에서, 본 발명은 항원(들)이 종양에 의해 발현되는지를 측정하기 위해 종양 유래 샘플을 분석하는 단계 및 이에 따라 치료학적 유효량의 적합한 항원 특이적 암 면역치료제를 투여가능하게 하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공하며, 예를 들어 여기서 종양이 MAGE (예컨대, Mage A3) 포지티브인 것으로 밝혀진 경우, 적합한 치료는, 예를 들어 Mage A3 항원 특이적 면역치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 유전자, 예컨대 본 발명의 어떠한 구체예의 유전자가 실질적으로 모두 차별적으로 발현되고 (예컨대, 상향조절되고), 마이크로어레이 분석 또는 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 다른 적합한 분석에 의해 검출될 수 있는 경우, 환자의 종양 조직과 같은 샘플은 본 발명의 유전자 시그너처를 제공하는 것으로 간주된다.
추가의 특수한 구체예를 하기에 기술한다.
일부 구체예에서, 본 발명은,
1 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 발현을 위해 환자 유래 샘플을 분석하는 단계,
2 유전자 생성물의 발현 수준을 표준화하는 단계,
3 표준화된 발현 수준을 표준과 비교하는 단계로서, 상기 표준은 공지된 반응자 또는 비-반응자 상태인 환자 또는 환자들에서 표 1의 유전자 생성물 또는 생성물들을 발현하기 위한 값 또는 발현하기 위한 기능이어서, 표준 정보를 환자 유래 샘플에서 동일한 유전자의 발현과 관련된 정보와 비교하는 것은 환자가 반응자 또는 비-반응자 상태인지에 대한 결론을 도출할 수 있게 하는 단계,
4 샘플이 유래된 환자를 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 단계를 포함하고,
5 환자가 면역치료제에 대한 반응자로서 특성화된 경우, 적합한 면역치료제의 하나 이상의 투여를 위해 환자를 선택하는 단계를 임의로 포함한다.
일 양태에서, 표준화는 동일한 샘플로부터의 유전자 또는 유전자들을 유지하는 하우스(house)의 발현과 같은 "내부(internal)" 참조를 이용하여 수행된다. 일 양태에서, 표준화는 상이한 개체 또는 개체들로부터 유래된 것과 같은, 외부 참조를 이용하여 수행된다.
일 양태에서, 샘플의 특성화는 마이크로어레이를 이용하여 수행된다. 일 양태에서, 샘플의 특성화는 PCR과 같은 핵산 증폭 기술을 이용하여 수행된다.
일 양태에서, 마이크로어레이-기반 기술을 이용한 신규한 샘플의 특성화는 표준 또는 트레이닝 세트에 필적하는 유전자 발현 값을 생산하기 위한 샘플의 전가공 단계 및 유전자 표준화를 포함한다. 샘플 표준화는, 예를 들어 적합한 트레이닝 데이터로부터 계산된 참조 GCRMA 파라메터를 지니는, 부록 1에 예시된 GCRMA 알고리듬 (Wu, 2004)을 이용하여 수행될 수 있다. 트레이닝 데이터 상에서 계산될 수 있는 파라메터의 예는 참조 분위수 및 프로브 효과이다. 유전자 표준화는 Z-점수 계산을 이용하여 수행될 수 있으며, 여기서 프로브 세트 특이적 평균은 프로브 세트 값에서 감해지고, 이러한 평균-중심 발현 값은 그 후 프로브 세트 특이적 표준 편차에 의해 가중된다.
일 양태에서, Q-PCR을 이용한 신규한 샘플의 특성화는 특정 참조 또는 살림(housekeeping) 유전자를 이용한 환자의 미가공 데이터의 표준화의 전가공 단계를 포함한다. Z-점수 계산은 표준 또는 트레이닝 세트로부터의 파라메터를 이용하여 수행될 수 있다.
일 양태에서, 흑색종 환자를 비교하고 특성화하는 단계는 하기 알고리듬을 이용하여 환자를 반응자 (R) 또는 유전자 시그너처 (GS)+ 또는 비-반응자 (NR, GS-)로 특성화하기 위해 표 1에 나열된 100개의 프로브 세트 또는 83개의 유전자를 이용한다:
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
상기에서,
- testset은 100개 PS에 대해 표준화된 마이크로어레이 데이터를 함유하는 100개 행(row)을 지니는 매트릭스이다
- M8.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 100개 PS의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 PS에 대한 100개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 PS에 대한 100개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 100개 행 및 56개 열의 매트릭스
5. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 평균 값
6. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 sd 값
7. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 평균 값
8. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 sd 값
트레이닝 세트에서 각각의 그룹에 대한 평균 및 sd는 다음과 같다 (세 개의 유효 숫자까지 반올림됨):
Figure pct00031
100개 PS 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
일 양태에서, 흑색종 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 단일 유전자 발현 값이 첫 번째 주요 성분 (PC1) 대신 사용된 상기 명시된 알고리듬을 이용하여 환자를 개별적으로 특성화하기 위해 표 13에 언급된 100개 프로브 세트 또는 83개 유전자 중 어느 하나를 이용한다.
일 양태에서, 흑색종 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 하기 알고리듬을 이용하여 환자를 반응자 (R) 또는 유전자 시그너처 (GS)+ 또는 비-반응자 (NR, GS-)로서 특성화하기 위해 표 5에 나열된 22개 유전자를 이용한다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
상기에서,
- testset.RData는 22개 유전자에 대해 표준화된 log-스케일 PCR 데이터를 함유하는 22개 행을 지니는 매트릭스이다
- M8.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 22개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 22개 행 및 22개 열의 매트릭스
5. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 평균 값
6. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 sd 값
7. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 평균 값
8. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 sd 값
22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
Figure pct00038
트레이닝 세트에서 각각의 그룹에 대한 평균 및 sd는 다음과 같다 (세 개의 유효 숫자까지 반올림됨):
Figure pct00039
일 양태에서, 흑색종 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 단일 유전자 발현 값이 첫 번째 주요 성분 (PC1) 대신 사용된 상기 명시된 알고리듬을 이용하여 환자를 개별적으로 특성화하기 위해 표 11에 언급된 22개 유전자 중 어느 하나를 이용한다.
일 양태에서, NSCLC 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 하기 알고리듬을 이용하여 환자를 반응자 (비-재발 또는 유전자 시그너처 + (GS+), 1) 또는 비-반응자 (재발, GS-, 0)로서 특성화하기 위해 표 7에 나열된 23개 유전자를 이용한다.
Figure pct00040
Figure pct00041
상기에서,
- testset.RData는 23개 유전자에 대해 표준화된 log-스케일 PCR 데이터를 함유하는 23개 행을 지니는 매트릭스이다
- M4.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 23개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 23개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 23개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 23개 행 및 23개 열의 매트릭스
5. 위험 점수 계산에서 B치료
6. 위험 점수 계산에서 BPC1 상호작용
7. 트레인에서 정중(median) 위험 점수
23개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
Figure pct00042
Figure pct00043
상기에서, B치료0-0.2429033
및 BPC1 상호작용= 0.1720062가 트레이닝 세트로부터 수득되었다.
신규한 샘플의 위험 점수를 트레이닝 세트의 정중 위험 점수 = -0.323947288과 비교하고, 위험 점수가 상기 값보다 낮은 경우, 샘플을 GS+ (반응자, 비-재발, 1)로 분류한다.
일 양태에서, NSCLC 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 단일 유전자 발현 값이 첫 번째 주요 성분 (PC1) 대신 사용된 상기 명시된 알고리듬을 이용하여 환자를 개별적으로 특성화하기 위해 표 12에 언급된 23개 유전자 중 어느 하나를 이용한다.
일 양태에서, NSCLC 환자를 비교하고 특성화하는 단계는, 하기 알고리듬을 이용하여 환자를 반응자 (비-재발 또는 유전자 시그너처 + (GS+), 1) 또는 비-반응자 (재발, GS-, 0)로서 특성화하기 위해 표 9에 나열된 22개 유전자를 이용한다:
Figure pct00044
Figure pct00045
상기에서,
- Testset.RData는 22개 유전자에 대해 표준화된 log-스케일 PCR 데이터를 함유하는 22개 행을 지니는 매트릭스이다
- M4.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 22개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 22개 행 및 22개 열의 매트릭스
5. 위험 점수 계산에서 B치료
6. 위험 점수 계산에서 BPC1 상호작용
7. 트레인에서 정중 위험 점수
22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 (Sd) 및 PC1 계수
Figure pct00046
Figure pct00047
상기에서, B치료= -0.193146993 및 BPC1 상호작용= -0.163704817이 트레이닝 세트로부터 수득되었다.
신규한 샘플의 위험 점수를 트레이닝 세트의 정중 위험 점수 = -0.25737421과 비교하고, 위험 점수가 상기 값보다 낮은 경우, 샘플을 GS+ (반응자, 비-재발, 1)로 분류한다.
면역치료제
추가의 양태에서, 본 발명은 환자를 면역치료제에 대한 반응자로서 확인한 후, 적합한 면역치료제, 예를 들어 암 면역치료제, 예컨대 고환암 면역치료제로 반응자 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은, 예를 들어 환자로부터 유래된 샘플의 적합한 분석에 의해 입증된 바에 따라 하나 이상의 면역 활성화 유전자의 차별적인 발현에 기반하여 환자를 반응자로서 먼저 특성화한 후, 치료학적 유효량의 적합한 면역치료제 (예를 들어 암 면역치료제, 예컨대 Mage 암 면역치료제)를 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 특히, 환자는 본원에 기술된 하나 이상의 구체예에 기반하여 반응자로서 특성화된다.
일 양태에서, 면역치료제는 적합한 애주번트 (면역자극제)를 포함한다 (하기 설명 참조).
본 발명의 또 다른 추가의 구체예에서, 예를 들어 Mage 발현 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 환자가 본 발명의 유전자 시그너처를 발현하는지의 여부를 결정한 후, 예를 들어 Mage 특이적 면역치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 추가의 구체예에서, 환자는, 예를 들어 Mage 특이적 면역치료제로 처리되어, 어떠한 종양의 절제 수술 또는 다른 화학치료제 또는 방사선 치료와 같은 일차 처리 후 질환의 재발이 억제되거나 완화된다.
본 발명의 추가의 양태는 Mage 발현 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서, 환자의 종양이 환자에 의해 제공된 생물학적 샘플로부터 본 발명의 어떠한 구체예에 따른 프로필을 발현하는지의 여부를 결정한 다음, Mage 특이적 면역치료제를 상기 환자에 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
또한, Mage 발현 종양을 제거/치료하기 위해 치료해왔던 Mage 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하는 방법으로서, 환자 종양이 환자에 의해 제공된 생물학적 샘플로부터 본 발명의 어떠한 구체예로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는지의 여부를 결정한 후, Mage 특이적 면역치료제를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기를 사용한 치료 방법 또는 용도를 제공한다:
- MAGE 항원 또는 이의 펩티드를 포함하는 MAGE 특이적 면역치료제,
- MAGE-A3 단백질 또는 펩티드를 포함하는 MAGE 항원,
- 펩티드 EVDPIGHLY를 포함하는 MAGE 항원,
- 예를 들어, 단백질 D, NS1 또는 CLytA 또는 이의 단편으로부터 선택된 담체 단백질에 융합되거나 컨쥬게이션된 MAGE 항원 또는 펩티드, 및/또는
- 예를 들어, 3D-MPL; 알루미늄 염; CpG 함유 올리고누클레오티드; 사포닌-함유 애주번트, 예컨대 QS21 또는 ISCOM; 수중유 에멀젼; 및 리포좀 중 하나 이상 또는 이들의 조합물을 포함하는 애주번트를 추가로 포함하는 MAGE 특이적 면역치료제.
본 발명은 또한 면역치료제에 대한 반응자로서 지정된 암 환자와 같은 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 면역치료제, 예컨대 암 면역치료제, 특히 Mage 면역치료제의 용도로 확장된다.
초기에 비-반응자로서 특성화된 한 환자가 방사선 치료 후에는 반응자로서 그 후에 특성화됨이 관찰되었다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 또한, 예를 들어 환자를 방사선 치료하거나 염증 자극제, 예컨대 인터페론 또는 TLR3 (예를 들어, WO 2006/054177에 기술된 바와 같음), 4, 7, 8 또는 TLR 9 효능제 (예를 들어, CpG 모티프 함유, 특히 예를 들어, 매주 투여된 Kg 당 0.1 내지 75mg과 같은 이의 높은 용량 투여)를 투여함으로써 적어도 일부의 비-반응자에서 반응자 프로필을 유도하는 것이 가능할 수 있는 것으로 여겼다. 예를 들어, 문헌 [Krieg, A. M., Efler, S. M., Wittpoth, M., Al Adhami, M. J. & Davis, H. L. Induction of systemic TH1-like innate immunity in normal volunteers following subcutaneous but not intravenous administration of CPG 7909, a synthetic B-class CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonist. J. Immunother. 27, 460-471 (2004)] 참조.
고용량의 CpG는, 예를 들어 흡입되거나 피하 제공될 수 있다.
본 발명은 추가로 Mage 발현 종양을 갖는 환자 또는 Mage 발현 종양을 제거/치료하기 위해 처리 (예를 들어, 외과술, 화학요법 또는 방사선요법)되었던 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 Mage 특이적 면역치료제의 용도를 추가로 제공하며, 상기 환자는 본 발명의 유전자 시그너처를 발현한다.
그 후, 반응자 프로필이 유도되면 면역치료제가 예를 들어 반응자에게 투여될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 Mage 발현 종양을 갖는 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 Mage 특이적 면역치료제의 용도를 제공하며, 상기 환자는 본 발명의 어떠한 구체예로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 종양을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 Mage 발현 종양의 재발에 민감한 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 Mage 특이적 면역치료제의 용도를 제공하며, 상기 환자는 본 발명의 어떠한 구체예로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 종양을 특징으로 한다.
유리하게는, 본 발명은 의사가 적합한 면역치료제를 투여받는 것으로부터 임상적 이익을 얻게 될 환자 집단을 대상으로 삼을 수 있도록 할 수 있다. 스크리닝 후, 반응자로서 간주/특성된 환자의 60% 이상, 예컨대 환자의 70, 75, 80, 85% 또는 그 초과가 면역치료제로부터 임상적 이득을 얻을 것으로 예상되며, 이는 일반적으로 암 요법과 같은 요법에서 관찰된 현행 수준에 비해 현저하게 증가된 수준이다.
유리하게는, 암 면역치료제가 화학요법과 동시에 또는 후속으로 제공되는 경우, 화학요법에 의해 고갈될 수 있는 환자의 면역 반응을 증가시키는 것을 도울 수 있다.
추가의 구체예에서, 면역치료제는 외과술, 화학요법 및/또는 방사선요법에 앞서 제공될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 항원 특이적 암 면역치료제 (ASCI)는, 예를 들어 Mage 특이적 면역 반응을 일으킬 수 있는 것들을 포함할 수 있다. 이러한 면역치료제는 Mage 유전자 생성물, 예를 들어 Mage-A 항원, 예컨대 Mage-A3에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 면역치료제는 일반적으로 Mage 유전자 생성물로부터의 하나 이상의 에피토프를 함유할 것이다. 이러한 에피토프는 담체에 선택적으로 공유 결합된 펩티드 항원으로서 임의로 애주번트의 존재하에 제시될 수 있다. 대안적으로, 더 큰 단백질 단편이 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 사용하기 위한 면역치료제는 MAGE-A1의 아미노산 195-279에 상응하거나 이를 포함하는 항원을 포함할 수 있다. 그러나, 적합하게 존재하는 경우, 사용을 위한 단편 및 펩티드는 Mage 특이적 면역 반응을 유발시킬 수 있어야 한다. 본 발명에 사용될 수 있는 펩티드의 예로는 MAGE-3.A1 나노펩티드 EVDPIGHLY [Seq. ID No ] (문헌 [Marchand et al., International Journal of Cancer 80(2), 219-230] 참조), 및 하기 MAGE-A3 펩티드를 포함한다:
Figure pct00048
대안적인 ASCI는 고환암 항원, 예컨대 NY-ESO1, LAGE 1, LAGE 2 등을 포함하며, 예를 들어 이에 대한 더욱 상세한 내역은 www.cancerimmunity.org/CTdatabase로부터 얻을 수 있다. 또한 ASCI는 PRAME 및 WT1과 같이 고환암 특이적이 아닐 수 있는 그 밖의 항원을 포함한다.
암 면역치료제는, 예를 들어 하기 논의된 항원 중 하나 이상을 기반으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 사용되는 항원은 MAGE 종양 항원, 예를 들어 MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11 또는 MAGE 12로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다. 이러한 MAGE 항원을 엔코딩하는 유전자는 염색체 X에 위치하며, 이들의 코딩 서열에서 서로 64 내지 85% 상동성을 공유한다 (De Plaen, 1994). 이들 항원은 종종 MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11 및/또는 MAGE A12 (AGE A 패밀리)로서 공지되어 있다. 일 구체예에서, 항원은 MAGE A3이다.
일 구체예에서, 2개의 추가의 MAGE 패밀리 중 하나로부터의 항원을 사용할 수 있다: MAGE B 및 MAGE C 그룹. MAGE B 패밀리는 MAGE B1 (또한, MAGE Xp1, 및 DAM 10으로서 공지됨), MAGE B2 (또한, MAGE Xp2 및 DAM 6로서 공지됨) MAGE B3 및 MAGE B4를 포함한다 - Mage C 패밀리는 현재 MAGE C1 및 MAGE C2를 포함한다.
일반적으로, MAGE 단백질은 단백질의 C-말단부를 향하여 위치한 코어 서열 시그너처를 함유하는 것으로 규정될 수 있다 (예를 들어, MAGE A1에 있어서, 309 아미노산 단백질, 즉 코어 시그너처는 아미노산 195-279에 상응한다).
따라서, 코어 시그너처의 컨센서스 패턴은 하기와 같이 기술되며, 여기서 x는 임의의 아미노산을 나타내며, 소문자로 나타낸 잔기는 보존되며 (허용된 보존적 변이체) 및 대문자로 나타낸 잔기는 완벽하게 보존된다.
코어 서열 시그너처
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWex1(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)IIt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
보존적 치환은 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 서열 정렬 컴퓨터 프로그램에서 디폴트 스코어링 매트릭스 (default scoring matrices)로서 세팅된다. 이러한 프로그램은 PAM250 (Dayhoft M.O. et ah, (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", In "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, and Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919)을 포함한다.
일반적으로, 하기 그룹 내에서의 치환은 보존적 치환이나, 그룹간 치환은 비보존적인 것으로 간주된다. 그룹은 다음과 같다:
i) 아스파르테이트/아스파라긴/글루타메이트/글루타민
ii) 세린/트레오닌
iii) 리신/아르기닌
iv) 페닐알라닌/티로신/트립토판
v) 류신/이소류신/발린/메티오닌
vi) 글리신/알라닌
일반적으로 그리고 본 발명의 문맥상, MAGE 단백질은 MAGE A1의 아미노산 195 내지 279를 갖는 이의 코어 영역에서 약 50% 이상 동일하고, 예컨대 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일할 것이다.
MAGE 단백질 유도체는 또한 당 분야에 공지되어 있다. WO 99/40188 참조. 이러한 유도체는 다양한 유형의 종양의 치료에 적합한 치료학적 백신 제형 (면역치료제)에 사용하기 적합하다.
MAGE-3 단백질 상의 여러 개의 CTL 에피토프는 동일하였다. 이러한 하나의 에피토프인 MAGE-3.A1은 MHC 클래스 I 분자 HLA.A1과 함께 존재하는 경우 CTL에 대해 특이적인 에피토프를 구성하는 MAGE-3 단백질의 아미노산 168 내지 176에 위치한 나노펩티드 서열이다. 최근에, 두 개의 추가적인 CTL 에피토프는 흑색종 세포 및 자가이식 림프구의 혼합된 배양에서 CTL 반응을 개시할 수 있는 이들의 능력에 의해 MAGE-3 단백질의 펩티드 서열상에서 확인되었다. 이들 두 에피토프는 HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) 및 HLA.B44 (Herman, 1996) 대립유전자 각각에 대한 특이적 결합 모티프를 갖는다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 종양 항원은 하기 항원 중 하나 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다: SSX-2; SSX-4; SSX-5; NA17; MELAN-A; 티로시나제; LAGE-1; NY-ESO-1; PRAME; P790; P510; P835; B305D; B854; CASB618 (WO00/53748에 기술된 바와 같음); CASB7439 (WO01/62778에 기술된 바와 같음); C1491; C1584; 및 C1585.
일 구체예에서, 항원은 P501S (또한 프로스테인으로서 공지됨)을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. P501S 항원은, 테타누스 톡소이드의 P2 유니버셜 T 헬퍼 펩티드가 삽입된 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)의 단백질 LytA의 C 말단부를 포함하는 박테리아 융합 단백질 즉, WO03/104272에 기술된 바와 같이 CLytA-P2-CLyta ("CPC" 융합 파트너)를 포함하는 융합체와 대부분의 P501S 단백질을 조합시킨 재조합 단백질일 수 있다.
일 구체예에서, 항원은 윌름즈(Wilm's) 종양 유전자에 의해 발현된 WT-1 또는 약 또는 대략적인 아미노산 1-249를 포함하는 이의 N-말단 단편 WT-1F; Her-2/neu 유전자에 의해 발현된 항원, 또는 이의 단편을 포함하거나 이들로 구성될 수 있다. 일 구체예에서, Her-2/neu 항원은 WO00/44899에 기술된 하기 융합 단백질 중 하나일 수 있다.
추가의 구체예에서, 항원은 "ECD-ICD" 또는 "ECD-ICD 융합 단백질"로도 불리는 "HER-2/neu ECD-ICD 융합 단백질"을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 이는 HER-2/neu 단백질의 세포외 도메인 (또는 이의 단편) 및 세포내 도메인 (또는 이의 단편)을 포함하는 융합 단백질 (또는 이의 단편)을 나타낸다. 일 구체예에서, 이러한 ECD-ICD 융합 단백질은 HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 실질적인 부분을 포함하지 않거나, HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 어떤 부분도 포함하지 않는다.
추가의 구체예에서, 항원은 "ECD-PD" 또는 "ECD-PD 융합 단백질"로도 불리는 "HER-2/neu ECD-PD 융합 단백질" 또는 "ECD-ΔPD" 또는 "ECD-ΔPD 융합 단백질"로 도 불리는 "HER-2/neu ECD-ΔPD 융합 단백질"을 포함하거나 이로 이루어질 수 있으며, 이는 HER-2/neu 단백질의 세포외 도메인 (또는 이의 단편) 및 포스포릴화 도메인 (또는 이의 단편 예를 들어, ΔPD)을 포함하는 융합 단백질 (또는 이의 단편)을 나타낸다. 일 구체예에서, ECD-PD 및 ECD-ΔPD 융합 단백질은 HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 실질적인 부분을 포함하지 않거나, HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 어떤 부분도 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 항원은 면역학적 융합 또는 발현 인핸서 파트너에 연결된 Mage 또는 다른 적합한 단백질을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 주어진 질환에 관련된 2개 또는 그 초과의 항원을 포함하는 하이브리드 단백질을 포함할 수 있거나, 항원과 발현 인핸서 파트너의 하이브리드일 수 있다.
일 구체예에서, MAGE 항원은 전장 MAGE 단백질을 포함할 수 있다. 대안적인 구체예에서, Mage 항원은 MAGE 항원의 아미노산 3 내지 312를 포함할 수 있다.
대안적인 구체예에서, MAGE 항원은 MAGE 단백질로부터의 100, 150, 200, 250 또는 300개 아미노산을 포함할 수 있는데, 단, 항원은 면역치료 요법에 적용될 때 MAGE에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다.
항원 및 파트너는 화학적으로 컨쥬게이션될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 항원 및 파트너가 재조합 융합 단백질로서 발현되는 구체예에서, 이것은 융합되지 않은 단백질과 비교하여 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성될 수 있다. 따라서, 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프 (면역학적 융합 파트너), 바람직하게는, 인간에 의해 인지된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 돕고/거나 천연 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질 (발현 인핸서)을 발현시키는 것을 도울 수 있다. 일 구체예에서, 융합 파트너는 면역학적 융합 파트너 및 발현 증강 파트너일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 사용될 수 있는 면역학적 융합 파트너는 단백질 D, 그람-네거티브 박테리아의 표면 단백질, 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B (WO 91/18926) 또는 이의 유도체로부터 유래된다. 단백질 D 유도체는 단백질의 처음 1/3, 또는 단백질의 대략적으로 또는 거의 처음 1/3을 포함할 수 있으며, 특히, 처음 N-말단 100-110개 아미노산 또는 대략적으로 처음 N-말단 100-110개 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 융합 단백질은 단백질 D의 처음 109개 잔기 (또는 이로부터의 108개 잔기) 또는 아미노산 20 내지 127을 포함한다.
사용될 수 있는 다른 융합 파트너는 인플루엔자 바이러스로부터의 비구조적 단백질, NS1 (헤마글루티닌)을 포함한다. 전형적으로, NS1의 N 말단 81개 아미노산이 사용될 수 있으며, 상이한 단편이 사용될 수 있지만, 단 이들은 T-헬퍼 에피토프를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 면역학적 융합 파트너는 LytA로서 공지된 단백질이다. LytA는 N-아세틸-L-알라닌 아미다제, 아미다제 LytA (LytA 유전자에 의해 코딩됨 (Gene, 43 (1986) page 265-272)), 펩티도글리칸 백본에서 특정 결합을 특이적으로 분해하는 오토리신을 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화도에 기여한다. 이러한 성향은 융합 단백질의 발현에 유용한 플라스미드를 발현하는 이. 콜라이(E. coli) C-LytA의 개발에 이용되었다. 아미노산 말단에서 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 기술되어 있다 (Biotechnology: 10, (1992) page 795-798). 일 구체예에서, 분자의 C 말단 부분이 사용될 수 있다. 구체예는 잔기 178에서 개시되는 C 말단부에서 발견된 LytA 분자의 반복부를 이용할 수 있다. 일 구체예에서, LytA 부분은 잔기 188-305를 통합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, Mage 단백질은 유도체화된 유리 티올을 포함할 수 있다. 이러한 항원은 WO 99/40188에 기술되어 있다. 특히, 카르복시아미드화되거나 카르복시메틸화된 유도체가 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 종양 관련 항원은 Mage-A3-단백질 D 분자를 포함한다. 이러한 항원 및 하기 요약된 항원은 WO 99/40188에 더욱 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 종양 관련 항원은 하기 융합 단백질 중 어느 것을 포함할 수 있다: 리포단백질 D 단편, MAGE1 단편, 및 히스티딘 꼬리의 융합 단백질; NS1-MAGE3 및 히스티딘 꼬리의 융합 단백질; CLYTA-MAGE1-히스티딘의 융합 단백질; CLYTA-MAGE3-히스티딘의 융합 단백질.
본 발명의 추가의 구체예는 핵산 면역치료제를 이용하는 것을 포함하며, 이는 본원에 기술된 바와 같은 Mage 특이적 종양 관련 항원을 엔코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 이러한 서열을 적합한 발현 벡터로 삽입하고, DNA/RNA 백신화를 위해 사용할 수 있다. 핵산을 발현하는 미생물 벡터가 또한 벡터 전달된 면역치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는, 예를 들어 폭스바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스 및 리스테리아를 포함한다.
핵산 서열을 수득하기 위한 통상적인 재조합 기법, 및 이의 발현 벡터의 생산은 문헌 [Maniatis et ah, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기술되어 있다.
단백질 기반 면역치료제에 있어서, 본 발명의 단백질은 액체 형태 또는 동결건조된 형태로 제공된다.
일반적으로, 각각의 인간 용량은 1 내지 1000 ㎍의 단백질, 예를 들어 30-300 ㎍, 예컨대 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 ㎍의 단백질을 포함할 것이다.
본원에 기술된 바와 같은 방법(들)은 백신 애주번트 및/또는 면역자극 사이토킨 또는 케모킨을 추가로 포함하는 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 백신 애주번트는 시중에서 입수가능하며, 예컨대 프로인트 불완전 애주번트 및 완전 애주번트 (Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 애주번트 65 (Merck Adjuvant 65) (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 알루미늄 염, 예컨대 알루미늄 히드록시드 겔 (알룸) 또는 알루미늄 포스페이트; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화된 티로신의 불용성 현탁물; 아실화된 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드; 폴리포스포파젠; 생물분해성 미소구체; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 (quil) A. 사이토킨, 예컨대 GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7, 또는 -12, 및 케모킨을 또한 애주번트로서 사용할 수 있다.
제형에서, 애주번트 조성물이 Th1 타입의 면역 반응을 우세하게 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 높은 수준의 Th1-타입 사이토킨 (예를 들어, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개 면역 반응 유도를 촉진하는 경향이 있다. 반응이 우세한 Th1-타입인 일 구체예에 있어서, Th1-타입 사이토킨의 수준은 Th2-타입 사이토킨의 수준 보다 더 큰 범위로 증가될 것이다. 이러한 사이토킨의 수준은 표준 검정을 이용하여 용이하게 평가될 수 있다. 사이토킨 패밀리에 있어서는, 문헌 [Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989] 참조.
따라서, 우세한 Th1-타입 반응을 유도하는데 사용될 수 있는 적합한 애주번트는, 예를 들어 알루미늄 염과 모노포스포릴 지질 A의 조합물, 예컨대 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)를 포함한다. 3D-MPL 또는 기타 톨(toll) 유사 수용체 4 (TLR4) 리간드, 예컨대 WO 98/50399, WO 01/34617 및 WO 03/065806에 기술된 바와 같은 아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트가 또한 단독으로 사용되어 우세한 Th1-타입 반응을 생성시킬 수 있다.
우선적으로 Th1-타입 면역 반응을 유도할 수 있는 기타 공지된 애주번트는 TLR9 효능제, 예컨대 비메틸화된 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드가 비메틸화 (unmethylated)됨을 특징으로 한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 96/02555에 기술되어 있다.
적합한 올리고누클레오티드는 하기를 포함한다:
Figure pct00049
CpG-함유 올리고누클레오티드는 단독으로 또는 다른 애주번트와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 향상된 시스템은 WO 00/09159 및 WO 00/62800에 기술된 바와 같이 CpG-함유 올리고누클레오티드와 사포닌 유도체의 조합물, 특히 CpG와 QS21의 조합물을 포함한다.
제형은 수중유 에멀젼 및/또는 토코페롤을 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 적합한 애주번트는 사포닌, 예를 들어 QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이며, 이는 단독으로 또는 다른 애주번트와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 향상된 시스템은 WO 94/00153에 기술된 바와 같이 QS21과 3D-MPL의 조합물과 같은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 조합물, 또는 WO 96/33739에 기술된 바와 같이, QS21이 콜레스테롤로 켄칭된 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 기타 적합한 제형은 수중유 에멀젼 및 토코페롤을 포함한다. 예를 들어, 수중유 에멀젼으로 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 유효한 애주번트 제형은 WO 95/17210에 기술되어 있다.
또 다른 구체예에서, 애주번트는 리포좀 조성물로 제형화될 수 있다.
사용된 3D-MPL의 양은 일반적으로 적으나, 면역치료제 제형에 따라, 용량 당 1-1000 ㎍, 예를 들어 용량 당 1-500 ㎍, 및 예컨대 용량 당 1 내지 100 ㎍, 특히 용량 당 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 ㎍일 수 있다.
구체예에서, 애주번트 시스템은 3개의 면역자극제를 포함한다: WO 95/17210에 기술된 바와 같은 리포좀 제형 또는 수중유 에멀젼으로 존재하는 CpG 올리고누클레오티드, 3D-MPL, & QS21.
본 발명의 애주번트 또는 면역치료제에서 CpG 또는 면역자극성 올리고누클레오티드의 양은 일반적으로 적으나, 면역치료제 제형에 따라, 용량 당 1-1000 ㎍, 예를 들어, 용량 당 1-500 ㎍일 수 있다.
본 발명의 애주번트에 사용하기 위한 사포닌의 양은 용량 당 1-1000 ㎍, 예를 들어 용량 당 1-500 ㎍, 예컨대 용량 당 1-100 ㎍, 특히 용량 당 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 ㎍일 수 있다.
일반적으로, 각 인간 용량은 0.1-1000 ㎍의 항원, 예를 들어 0.1-500 ㎍, 예컨대 0.1-100 ㎍, 특히 0.1 내지 50 ㎍, 특히 25 또는 50 ㎍의 항원을 포함할 것으로 예상된다. 특정 면역치료제에 대한 최적량은 백신화된 피검체에서 적합한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신화 후, 피검체는 적합하게 간격을 두고 1회 또는 수회의 부스터 면역화 처리될 수 있다.
기타 적합한 애주번트는 몬타니드 ISA 720 (Montanide ISA 720) (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), 리비 데톡스 (Ribi Detox), RC-529 (GSK, Hamilton, MT) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트 (AGPs)를 포함한다.
따라서, 본원에 기술된 항원 및 애주번트를 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 애주번트는 3D-MPL, QS21, CpG 올리고누클레오티드, 또는 이러한 애주번트 중 두 개 이상의 조합물 중 하나 이상을 포함한다. 면역원성 조성물내의 항원은 수중유 또는 유중수 에멀젼 비히클 또는 리포좀 제형 중에 존재할 수 있다.
일 구체예에서, 애주번트는 3D-MPL, QS21 및 면역자극성 CpG 올리고누클레오티드 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체예에서, 모든 세 개의 면역자극제가 존재한다. 또 다른 구체예에서, 3D-MPL 및 QS21이 CpG 올리고누클레오티드의 부재하에 수중유 에멀젼 중에 존재한다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 종양 관련 항원, 또는 이의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 포함이라는 용어의 사용은 비제한적인 것으로 해석되며, 즉 포함하는 것을 의미한다.
특정 엘리먼트 또는 엘리먼트들을 포함하는 본 발명의 양태를 분리된 구체예로서의 관련 엘리먼트로 이루어지거나 필수적으로 포함하는 상기 양태들로 제한시킨 구체예를 특히 구상한다.
하기 실시예는 본 발명의 입자를 제조하는데 이용될 수 있는 방법을 설명하기 위해 제시된다.
본 명세서에서 문헌들의 논의는 본 발명의 배경을 제공하고 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이다. 문헌 또는 견해가 공지되어 있거나 관련 분야에서 보편적인 일반 상식임을 인정하려는 것은 결코 아니다.
하나 이상의 양태에서, 본 발명은 하기 문단 1 내지 101 중 어느 하나에 기재된 구체예를 제공한다.
1) 이와 같이, 본 발명은 표 1로부터의 하나 이상의 유전자를 사용할 수 있다.
2) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.2 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 STAT1을 갖는 유전자를 사용한다.
3) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 및 1.3 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PSMB9을 갖는 유전자를 사용한다.
4) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.2 및 1.4 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 JAK2을 갖는 유전자를 사용한다.
5) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.3 및 1.5 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITGA3을 갖는 유전자를 사용한다.
6) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.4 및 1.6 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PSMB10을 갖는 유전자를 사용한다.
7) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.5 및 1.7 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL9을 갖는 유전자를 사용한다.
8) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.6 및 1.8 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 RARRES3을 갖는 유전자를 사용한다.
9) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.7 및 1.9 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IL2RG을 갖는 유전자를 사용한다.
10) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.8 및 1.10 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL10을 갖는 유전자를 사용한다.
11) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.9 및 1.11 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD8A을 갖는 유전자를 사용한다.
12) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.10 및 1.12 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UBD을 갖는 유전자를 사용한다.
13) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.11 및 1.13 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GPR171을 갖는 유전자를 사용한다.
14) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.12 및 1.14 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRD1을 갖는 유전자를 사용한다.
15) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.13 및 1.15 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-B을 갖는 유전자를 사용한다.
16) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.14 및 1.16 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LCP1을 갖는 유전자를 사용한다.
17) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.15 및 1.17 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DRA을 갖는 유전자를 사용한다.
18) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.16 및 1.18 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CYTIP을 갖는 유전자를 사용한다.
19) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.17 및 1.19 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IL23A을 갖는 유전자를 사용한다.
20) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.18 및 1.20 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRA@을 갖는 유전자를 사용한다.
21) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.19 및 1.21 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DRA을 갖는 유전자를 사용한다.
22) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.20 및 1.22 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TARP을 갖는 유전자를 사용한다.
23) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.21 및 1.23 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITK을 갖는 유전자를 사용한다.
24) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.22 및 1.24 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 211796_s_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
25) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.23 및 1.25 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-B을 갖는 유전자를 사용한다.
26) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.24 및 1.26 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DQA1을 갖는 유전자를 사용한다.
27) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.25 및 1.27 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HOMER1을 갖는 유전자를 사용한다.
28) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.26 및 1.28 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRGC2을 갖는 유전자를 사용한다.
29) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.27 및 1.29 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 216920_s_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
30) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.28 및 1.30 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-A을 갖는 유전자를 사용한다.
31) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.29 및 1.31 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DMA을 갖는 유전자를 사용한다.
32) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.30 및 1.32 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-F을 갖는 유전자를 사용한다.
33) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.31 및 1.33 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLAMF7을 갖는 유전자를 사용한다.
34) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.32 및 1.34 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KIAA1549을 갖는 유전자를 사용한다.
35) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.35 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LONRF2을 갖는 유전자를 사용한다.
36) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.34 및 1.36 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
37) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.35 및 1.37 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C1orf162을 갖는 유전자를 사용한다.
38) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.36 및 1.38 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
39) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.37 및 1.39 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP5을 갖는 유전자를 사용한다.
40) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.38 및 1.40 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 232375_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
41) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.39 및 1.41 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLITRK6을 갖는 유전자를 사용한다.
42) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.40 및 1.42 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP4을 갖는 유전자를 사용한다.
43) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.41 및 1.43 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 EPSTI1을 갖는 유전자를 사용한다.
44) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.42 및 1.44 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AKR1C2을 갖는 유전자를 사용한다.
45) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.43 및 1.45 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITGAL을 갖는 유전자를 사용한다.
46) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.44 및 1.46 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CDC42SE2을 갖는 유전자를 사용한다.
47) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.45 및 1.47 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 DZIP1을 갖는 유전자를 사용한다.
48) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.46 및 1.48 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PTGER4을 갖는 유전자를 사용한다.
49) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.47 및 1.49 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HCP5을 갖는 유전자를 사용한다.
50) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.48 및 1.50 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UTY을 갖는 유전자를 사용한다.
51) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.49 및 1.51 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRB1을 갖는 유전자를 사용한다.
52) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.50 및 1.52 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
53) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.51 및 1.53 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HILS1을 갖는 유전자를 사용한다.
54) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.52 및 1.54 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C20orf24을 갖는 유전자를 사용한다.
55) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.53 및 1.55 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 B2M을 갖는 유전자를 사용한다.
56) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.54 및 1.56 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ZNF285A을 갖는 유전자를 사용한다.
57) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.55 및 1.57 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TMEM56을 갖는 유전자를 사용한다.
58) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.56 및 1.58 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IRF1을 갖는 유전자를 사용한다.
59) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.57 및 1.59 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRGV9을 갖는 유전자를 사용한다.
60) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.58 및 1.60 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 238524_at에 의해 확인된 기호 NA을 갖는 유전자를 사용한다.
61) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.59 및 1.61 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLC26A2을 갖는 유전자를 사용한다.
62) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.60 및 1.62 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL2을 갖는 유전자를 사용한다.
63) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.61 및 1.63 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ICOS을 갖는 유전자를 사용한다.
64) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.62 및 1.64 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 213193_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
65) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.63 및 1.65 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CCL5을 갖는 유전자를 사용한다.
66) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.64 및 1.66 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LOC284757을 갖는 유전자를 사용한다.
67) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.65 및 1.67 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD86을 갖는 유전자를 사용한다.
68) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.66 및 1.68 내지 4.488으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRD1을 갖는 유전자를 사용한다.
69) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.67 및 1.69 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 211902_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
70) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.68 및 1.70 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLAMF6을 갖는 유전자를 사용한다.
71) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.69 및 1.71 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TOX을 갖는 유전자를 사용한다.
72) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.70 및 1.72 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GZMK을 갖는 유전자를 사용한다.
73) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.71 및 1.73 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CDC42SE2을 갖는 유전자를 사용한다.
74) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.72 및 1.74 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PPP1R16B을 갖는 유전자를 사용한다.
75) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.73 및 1.75 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 EAF2을 갖는 유전자를 사용한다.
76) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.74 및 1.76 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 USP9Y을 갖는 유전자를 사용한다.
77) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.75 및 1.77 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F를 갖는 유전자를 사용한다.
78) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.76 및 1.78 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FLJ31438를 갖는 유전자를 사용한다.
79) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.77 및 1.79 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SHROOM3를 갖는 유전자를 사용한다.
80) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.78 및 1.80 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFAIP3를 갖는 유전자를 사용한다.
81) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.79 및 1.81 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-F를 갖는 유전자를 사용한다.
82) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.80 및 1.82 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD3D를 갖는 유전자를 사용한다.
83) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.81 및 1.83 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 MAP1B를 갖는 유전자를 사용한다.
84) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.82 및 1.84 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SRPX2를 갖는 유전자를 사용한다.
85) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.83 및 1.85 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AADAT를 갖는 유전자를 사용한다.
86) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.84 및 1.86 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ARHGAP15를 갖는 유전자를 사용한다.
87) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.85 및 1.87 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 MCM10를 갖는 유전자를 사용한다.
88) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.86 및 1.88 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TC2N를 갖는 유전자를 사용한다.
89) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.87 및 1.89 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AP2B1를 갖는 유전자를 사용한다.
90) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.88 및 1.90 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GOLGA7를 갖는 유전자를 사용한다.
91) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.89 및 1.91 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFRSF9를 갖는 유전자를 사용한다.
92) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.90 및 1.92 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 RNF144B를 갖는 유전자를 사용한다.
93) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.91 및 1.93 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 209671_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
94) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.92 및 1.94 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UBASH3B를 갖는 유전자를 사용한다.
95) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.93 및 1.95 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 BTN3A1를 갖는 유전자를 사용한다.
96) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.94 및 1.96 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GCH1를 갖는 유전자를 사용한다.
97) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.95 및 1.97 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 DENND2D를 갖는 유전자를 사용한다.
98) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.96 및 1.98 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C4orf7를 갖는 유전자를 사용한다.
99) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.1 내지 1.97 및 1.99 내지 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFAIP3를 갖는 유전자를 사용한다.
100) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.100으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP5를 갖는 유전자를 사용한다.
101) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 1.1 내지 1.99으로서 표지된 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP1를 갖는 유전자를 사용한다.
하나 이상의 양태에서, 본 발명은 하기 문단 1 내지 101 중 어느 하나에 기재된 구체예를 제공한다. 문단 2 내지 100 중 어느 하나를 인용할 때 문단 3 내지 101의 "유전자"라는 표현은 문단 2 내지 100에서 언급된 특수한 유전자를 대체하려는 것이 아니라 이를 부가하려는 것이다.
1) 이와 같이, 본 발명은 표 1로부터의 하나 이상의 유전자를 사용할 수 있다.
2) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.2 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 STAT1을 갖는 유전자를 사용한다.
3) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1 또는 2에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.3 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PSMB9을 갖는 유전자를 사용한다.
4) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-3 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.4 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 JAK2을 갖는 유전자를 사용한다.
5) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-4 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.5 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITGA3을 갖는 유전자를 사용한다.
6) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-5 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.6 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PSMB10을 갖는 유전자를 사용한다.
7) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-6 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.7 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL9을 갖는 유전자를 사용한다.
8) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-7 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.8 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 RARRES3을 갖는 유전자를 사용한다.
9) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-8 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.9 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IL2RG을 갖는 유전자를 사용한다.
10) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-9 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.10 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL10을 갖는 유전자를 사용한다.
11) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-10 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.11 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD8A을 갖는 유전자를 사용한다.
12) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-11 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.12 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UBD을 갖는 유전자를 사용한다.
13) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-12 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.13 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GPR171을 갖는 유전자를 사용한다.
14) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-13 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.14 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRD1을 갖는 유전자를 사용한다.
15) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-14 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.15 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-B을 갖는 유전자를 사용한다.
16) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-15 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.16 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LCP1을 갖는 유전자를 사용한다.
17) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-16 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.17 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DRA을 갖는 유전자를 사용한다.
18) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-17 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.18 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CYTIP을 갖는 유전자를 사용한다.
19) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-18 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.19 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IL23A을 갖는 유전자를 사용한다.
20) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-19 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.20 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRA@을 갖는 유전자를 사용한다.
21) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-20 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.21 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DRA을 갖는 유전자를 사용한다.
22) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-21 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.22 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TARP을 갖는 유전자를 사용한다.
23) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-22 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.23 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITK을 갖는 유전자를 사용한다.
24) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-23 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.24 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 211796_s_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
25) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-24 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.25 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-B을 갖는 유전자를 사용한다.
26) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-25 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.26 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DQA1을 갖는 유전자를 사용한다.
27) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-26 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.27 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HOMER1을 갖는 유전자를 사용한다.
28) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-27 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.28 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRGC2을 갖는 유전자를 사용한다.
29) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-28 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.29 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 216920_s_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
30) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-29 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.30 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-A을 갖는 유전자를 사용한다.
31) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-30 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.31 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-DMA을 갖는 유전자를 사용한다.
32) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-31 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.32 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-F을 갖는 유전자를 사용한다.
33) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-32 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.33 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLAMF7을 갖는 유전자를 사용한다.
34) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-33 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.34 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KIAA1549을 갖는 유전자를 사용한다.
35) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-34 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.35 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LONRF2을 갖는 유전자를 사용한다.
36) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-35 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.36 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
37) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-36 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.37 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C1orf162을 갖는 유전자를 사용한다.
38) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-37 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.38 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
39) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-38 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.39 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP5을 갖는 유전자를 사용한다.
40) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-39 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.40 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 232375_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
41) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-40 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.41 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLITRK6을 갖는 유전자를 사용한다.
42) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-41 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.42 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP4을 갖는 유전자를 사용한다.
43) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-42 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.43 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 EPSTI1을 갖는 유전자를 사용한다.
44) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-43 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.44 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AKR1C2을 갖는 유전자를 사용한다.
45) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-44 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.45 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ITGAL을 갖는 유전자를 사용한다.
46) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-45 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.46 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CDC42SE2을 갖는 유전자를 사용한다.
47) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-46 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.47 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 DZIP1을 갖는 유전자를 사용한다.
48) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-47 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.48 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PTGER4을 갖는 유전자를 사용한다.
49) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-48 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.49 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HCP5을 갖는 유전자를 사용한다.
50) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-49 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.50 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UTY을 갖는 유전자를 사용한다.
51) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-50 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.51 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRB1을 갖는 유전자를 사용한다.
52) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-51 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.52 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F을 갖는 유전자를 사용한다.
53) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-52 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.53 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HILS1을 갖는 유전자를 사용한다.
54) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-53 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.54 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C20orf24을 갖는 유전자를 사용한다.
55) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-54 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.55 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 B2M을 갖는 유전자를 사용한다.
56) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-55 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.56 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ZNF285A을 갖는 유전자를 사용한다.
57) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-56 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.57 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TMEM56을 갖는 유전자를 사용한다.
58) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-57 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.58 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 IRF1을 갖는 유전자를 사용한다.
59) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-58 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.59 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TRGV9을 갖는 유전자를 사용한다.
60) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-59 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.60 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 238524_at에 의해 확인된 기호 NA을 갖는 유전자를 사용한다.
61) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-60 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.61 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLC26A2을 갖는 유전자를 사용한다.
62) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-61 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.62 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CXCL2을 갖는 유전자를 사용한다.
63) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-62 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.63 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ICOS을 갖는 유전자를 사용한다.
64) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-63 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.64 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 213193_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
65) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-64 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.65 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CCL5을 갖는 유전자를 사용한다.
66) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-65 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.66 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 LOC284757을 갖는 유전자를 사용한다.
67) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-66 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.67 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD86을 갖는 유전자를 사용한다.
68) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-67 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.68 내지 4.488으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 KLRD1을 갖는 유전자를 사용한다.
69) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-68 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.69 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 211902_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
70) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-69 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.70 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SLAMF6을 갖는 유전자를 사용한다.
71) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-70 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.71 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TOX을 갖는 유전자를 사용한다.
72) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-71 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.72 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GZMK을 갖는 유전자를 사용한다.
73) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-72 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.73 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CDC42SE2을 갖는 유전자를 사용한다.
74) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-73 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.74 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 PPP1R16B을 갖는 유전자를 사용한다.
75) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-74 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.75 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 EAF2을 갖는 유전자를 사용한다.
76) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-75 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.76 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 USP9Y을 갖는 유전자를 사용한다.
77) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-76 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.77 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FAM26F를 갖는 유전자를 사용한다.
78) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-77 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.78 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 FLJ31438를 갖는 유전자를 사용한다.
79) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-78 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.79 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SHROOM3를 갖는 유전자를 사용한다.
80) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-79 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.80 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFAIP3를 갖는 유전자를 사용한다.
81) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-80 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.81 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 HLA-F를 갖는 유전자를 사용한다.
82) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-81 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.82 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 CD3D를 갖는 유전자를 사용한다.
83) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-82 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.83 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 MAP1B를 갖는 유전자를 사용한다.
84) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-83 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.84 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 SRPX2를 갖는 유전자를 사용한다.
85) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-84 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.85 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AADAT를 갖는 유전자를 사용한다.
86) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-85 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.86 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 ARHGAP15를 갖는 유전자를 사용한다.
87) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-86 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.87 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 MCM10를 갖는 유전자를 사용한다.
88) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-87 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.88 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TC2N를 갖는 유전자를 사용한다.
89) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-88 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.89 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 AP2B1를 갖는 유전자를 사용한다.
90) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-89 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.90 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GOLGA7를 갖는 유전자를 사용한다.
91) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-90 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.91 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFRSF9를 갖는 유전자를 사용한다.
92) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-91 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.92 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 RNF144B를 갖는 유전자를 사용한다.
93) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-92 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.93 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 프로브 세트 209671_x_at에 의해 확인된 것을 사용한다.
94) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-93 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.94 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 UBASH3B를 갖는 유전자를 사용한다.
95) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-94 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.95 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 BTN3A1를 갖는 유전자를 사용한다.
96) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-95 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.96 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GCH1를 갖는 유전자를 사용한다.
97) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-96 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.97 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 DENND2D를 갖는 유전자를 사용한다.
98) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-97 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.98 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 C4orf7를 갖는 유전자를 사용한다.
99) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-98 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.99 내지 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 TNFAIP3를 갖는 유전자를 사용한다.
100) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-99 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 표 1에서 확인된 1.100으로서 표지된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 기호 GBP5를 갖는 유전자를 사용한다.
101) 또 다른 양태에서, 본 발명은 문단 1-100 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 유전자로서, 기호 GBP1를 갖는 유전자를 사용한다.
실험 실시예
실시예 1
MAGE008 Mage 흑색종 임상 실험:
이러한 진행중인 실험에서, recMAGE-A3 단백질 (재조합 mage 융합 단백질)은 두 개의 상이한 면역학적 애주번트와 조합된다: AS02B (QS21, MPL) 또는 AS15 (QS21, MPL 및 CpG7909). 목적은 안전한 프로필, 임상 반응 및 면역학적 반응에 있어서 애주번트를 구별하기 위한 것이었다.
본 실험에서, 두 개의 애주번트 조성물은 두 개의 면역자극제의 혼합물로 이루어졌다:
1. QS21 (남미 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)로부터의 정제된 천연 발생 사포닌 분자), 및
2. MPL (S. 미네소타(S. minnesota) LPS로부터 유래된 3 데-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A - 지질 A의 탈독소화된 유도체).
AS02B는 QS21 및 MPL의 수중유 에멀젼이다.
동물 모델에서, 이들 애주번트는 IFNα를 생성하는 CD4 및 CD8 T-세포를 포함하는, 체액성 및 TH1 타입의 세포 매개 면역 반응 둘 모두를 유도하는 것으로 성공적으로 입증되었다 (Moore et al, 1999; Gerard et al, 2001). 게다가, 이러한 유형의 애주번트에서 제형화된 재조합 단백질의 주입은 전신 항종양 반응의 유도를 유도하며; 실제로, 백신화된 동물은 종양 항원을 발현하도록 유전적으로 공학처리된 뮤린 종양 세포로의 챌린지에 대해 보호되는 것으로 나타났으며, 퇴화되는 종양은 CD8, CD4 및 NK 세포에 의해 그리고, 대식세포에 의해 고도로 침윤되는 것으로 나타났다.
두 번째 애주번트 시스템은 AS15이다: 이는 리포좀 제형 중에 MPL 및 QS21 이외에 제 3의 면역자극제 즉, CpG7909 (다르게는, CpG 2006으로 공지됨, 상기 참조)를 함유한다. 동물 모델 (주로, 마우스)에서, CpG7909의 첨가는 유도된 면역 및 항종양 반응을 추가로 향상시키는 것으로 나타났다 (Krieg and Davis, 2001; Ren et al, 2004). CpG 올리고데옥시누클레오티드 (ODN)는 TLR9 촉발을 통해 수지 세포 활성화를 직접적으로 자극한다. 또한, 마우스에서, CpG7909의 전신 적용은 종양으로 이동된 T-세포의 침윤을 크게 증가시킨다 (Meidenbauer et al, 2004).
연구 개요
1. 계획
MAGE008 실험은 다음과 같다:
ㆍ 개방형
ㆍ 무작위형
ㆍ 투-암 (two-arm) (AS02B 대 AS15)
ㆍ총 68명 환자
상기 기술된 바와 같이, recMAGE-A3 단백질은 AS02B 또는 AS15 애주번트 시스템과 조합된다.
2. 환자 집단
recMAGE-A3 단백질을 국소 또는 원위 피부 및/또는 림프절 병변 (절제불가능한 단계 III 및 단계 IV M1a)을 갖는 진행성 전이 흑색종 환자에게 투여하였다. 종양에 의한 MAGE-A3 유전자의 발현은 정량적 PCR에 의해 평가하였다. 선택된 환자는 흑색종에 대해 이전에 치료를 받은 적이 없고 (recMAGE-A3는 일차선 치료로서 제공됨), 내장 질환을 갖지 않았다.
3. 면역화 스케줄
처리 스케줄의 방법
MAGE008 임상 시험으로 이어진 면역화 스케줄은 다음과 같았다:
사이클 1: 2주 간격으로 6회 백신접종 (1, 3, 5, 7, 9, 11 주)
사이클 2: 3주 간격으로 6회 백신접종 (15, 18, 21, 24, 27, 30 주)
사이클 3: 6주 간격으로 4회 백신접종 (34, 40, 46, 52 주)
장기간 치료: 예를 들어 3개월 간격으로 4회 백신접종, 이어서 6개월 간격으로 4회 백신접종
상기 치료 계획 둘 모두에 있어서, 추가적인 백신화가 필요에 따라 치료 후에 제공될 수 있다.
상기 임상 시험에서 잠재적인 관여인자를 스크리닝하기 위해, 본 발명자들은 임의의 면역화 전에 종양 생검을 수득하였다. MAGE-A3 정량적 PCR을 위해 RNA를 생검으로부터 추출하였고 이러한 RNA를 또한 마이크로어레이에 의해 유전자 발현 프로파일링에 이용하였다. 목적은 백신화 전 생검에서 임상 반응과 관련된 유전자 세트를 확인하고 환자의 임상 결과를 예측할 수리적 모델을 개발하여, 이러한 항원-특이적 암 면역치료제가 유리할 것 같은 환자를 적절히 확인하고 선택하는 것이었다. 유전자 프로파일링 분석은 마이크로어레이 분석을 위한 동의서에 서명한 환자로부터의 생검에 대해서만 수행하였다.
1. 재료 및 방법
1.1. 종양 견본 및 RNA 정제
Mage008 Mage-3 흑색종 임상 시험으로부터 65명 환자로부터의 백신화 전 취해진 65개의 종양 생검을 사용하였다. 이들을 RNA 안정화 용액 RNAlater에서 신선하게 냉동 보존하였다.
총 RNA를 트리퓨어 방법 (Tripure method, Roche Cat. No. 1 667 165)을 이용하여 정제하였다. 제공된 프로토콜에 따른 후, DNAse 처리와 함께 RNeasy 미니 킷-클린-업 프로토콜 (RNeasy Mini kit-clean-up protocol)을 사용하였다 (Qiagen Cat. No. 74106). 멜라닌 함량이 높은 (가시적인 검사에 의해 측정됨) 샘플로부터의 RNA를 CsCl 원심분리를 이용하여 추가로 처리하였다.
RNA의 정량은 260 nm에서의 광학 밀도 및 Quant-IT 리보그린(RiboGreen) RNA 검정 키트 (Invitrogen - Molecular probes R11490)를 이용하여 초기에 완료되었다.
1.2. 마이크로어레이 분석을 위한 RNA 표지화 및 증폭
임상 연구 동안 얻은 작은 생검 크기로 인해, 마이크로어레이 분석을 위해 RNA의 표지화와 함께 증폭 방법을 이용하였다: 뉴젠 3' 오베이션 바이오틴 키트 (Nugen 3' ovation biotin kit) (50 ng의 RNA로 표지화-Ovation biotin system Cat; 2300-12, 2300-60). 50 ng의 총 RNA의 출발 투입량을 이용하였다.
1.3. 마이크로어레이 칩, 하이브리드화 및 스캐닝
Affymetrix HU-U133.플러스 2.0 유전자 칩을 표준 Affymetrix 프로토콜에 따라 하이브리드화하고, 세척하고, 스캐닝하였다.
1.1.1. 유전자 시그너처 분석에 사용된 환자의 정의
이원 분류 접근법을 이용하여 환자를 유전자 시그너처 (GS) 포지티브 (GS+) 또는 GS 네거티브 (GS-) 그룹으로 지정하였다. 트레이닝 세트는 양호한 품질의 마이크로어레이 데이터를 지니고 6회 이상 백신화된 유전자 시그너처 분석에 동의한 56명의 유효한 환자로 이루어졌다.
이러한 유전자 시그너처 분석을 위해, 반응자 (R)는 임상 활성의 객관적인 표시를 나타내는 환자로서 정의되었고 하기를 포함하였다; 객관적인 반응 (완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정한 질환 (SD), 혼합된 반응 (MR)). 비-반응자 (NR)는 진행성 질환 (PD)으로서 정의되었다.
6회 이상 백신화된 유효한 환자만이 유전자 프로필 분석에 이용되었는데, 그 이유는 대체로 그 때 면역 반응이 검출되었기 때문이다.
유전자 프로필 분석을 위한 반응자 (R)은 생물학적 활성의 표시를 나타내는 환자이며 하기를 포함한다: 완전 및 부분 반응자 (CR, PR), 안정한 질환 (SD), 혼합된 반응 1 (MxR1)을 지니는 진행성 질환 (PD) 및 하나 이상의 표적 병변이 사라진 PD MxR2.
비-반응자 ( NR ): PD No MxR, 하나 이상의 표적 병변의 소실을 나타내지 않는 PD MxR2 및 진행성 질환 No MxR
이러한 임상 연구에서 두 아암(arm)에서의 트레이닝 세트 분포는 (두 면역학적 애주번트 비교) 22 R (AS15 아암 중 14 및 AS02B 아암 중 8개) 및 34 NR (13 AS15, 21 AS02B)로 이루어졌다.
샘플 표준화
RNA의 증폭 및 표준화 후에, HG-U133 플러스 2 Affymetrix 유전자 칩으로의 하이브리드화를 수행하였다. 스캐닝 후에 수득한 CEL 파일을 양호한 품질의 마이크로어레이 데이터 (스케일링 인자 및 gcrma 표준화 기반)를 지니는 모든 환자를 이용하여 Bioconductor로부터의 gcrma 패키지에서 변형된 버젼의 GCRMA 알고리듬 (Wu, 2004)을 이용하여 표준화하였다. 상기 알고리듬은 이러한 세트의 어레이로 수득된 전가공 파라메터를 저장하도록 형성되었다. 파라메터는 하기 두 유형이다: 분위수 표준화에 필요한 평균 경험적 분포, 및 프로브 세트(PS) 요약을 수행하기 위한 프로브-특이적 효과. 이러한 파라메터를 65개 샘플로부터 수득하고 트레이닝 세트의 56개 샘플에 적용시켜 각각의 프로브 세트에 대한 요약된 값을 수득하였다.
1.1. 부재/존재 및 비-특이적 필터링
표준화에 사용된 65개 모든 샘플에서 부재로 명명된 Affymetrix 프로브 세트 (PS)를 PANP 프로그램 (1.8.0 소프트웨어 버젼)의 R 임플러먼테이션을 이용하여 제거하였다. 이것은 데이터세트를 54,613에서 약 28,100 PS로 감소시킨다.
표준화된 하이브리드화 샘플의 4분위 범위 (IQR) 필터링된 프로브 세트 (PS)를 각각의 샘플과 관련된 결과와 별개로 필터링하였다. 이러한 비-특이적 필터링의 목적은 샘플들을 가로질러 대충 일정한 발현을 나타내는 유전자를 제거하는 것인데, 그 이유는 이러한 유전자가 분별력을 거의 제공하지 않는 경향이 있기 때문이다 (Heidebreck et al., 2004).
트레이닝 세트 (56개 샘플)의 발현 매트릭스에서 1.7과 같거나 이보다 높은 4분위 범위를 갖는 PS만을 보유하는 4분위 필터를 실행시켰다. 이러한 단계는 PS 크기를 28,100에서 약 5045로 감소시켰다.
피처 표준화
요약되고 필터링된 PS를 후속하여 Z-점수 계산으로 표준화하였다. 각각의 개별적인 환자 발현 PS 값에 대한 Z-점수는 다음과 같이 계산된다: PS-특이적 평균을 PS 값으로부터 감하고, 이러한 평균-중심 발현 값을 이어서 PS-특이적 표준 편차에 의해 가중시킨다. Z-점수 계산에 포함된 PS-특이적 평균 및 표준 편차는 트레이닝 세트로부터 계산된 것이다.
피처 선택
신호 대 노이즈 점수로 된 임상 결과 환자 데이터의 분류에 있어서 피처로서 사용되는 관련 PS의 선택은 트레이닝 세트에서 56개 샘플에 대해 표준화되고 Z-점수화된 발현 매트릭스를 이용하여 수득된다:
Figure pct00050
가장 높은 절대 신호 대 노이즈 점수를 지닌 100개 PS를 분류자 피처로서 선택하였다 (표 1). 이러한 숫자는 적절한 것으로 판단되는데, 그 이유는 이것이 또 다른 기법으로 측정하기에 가능한 수의 유전자이기 때문이다 (즉, Q-RT-PCR).
유전자 선택의 상기 방법을 다음 섹션에 기재한 대로 크로스확인 (crossvalidation)에 의해 시험하였다.
분류 방법의 리브 원 아웃 (Leave one out) 크로스확인 (LOOCV)
방법의 성능을 판단하고 분류자에 대한 적합한 컷오프(cutoff)를 선택하기 위해; 분류 계획을 개발하고 각각의 크로스확인 루프에서 리포터 목록의 재-계산을 이용하여 리브-원-아웃에 의한 크로스확인을 이용하여 시험하였다.
먼저, 비-특이적 필터를 적용시켜 4분위 범위 (IQR)가 1.7 미만인 프로브 세트 (PS)를 폐기하였다 (각각의 크로스확인에서 남아 있는 ~5000개 PS). 후속하여, Z-점수 표준화를 각각의 트레이닝 세트 내에서 수행하였고 시험 샘플에 적용시켰다. 유전자를 문헌[Golub et al. (Golub, 1999)]에 기재된 바와 같은 신호-대-노이즈 (s2n)를 이용하여 랭킹하였고, 가장 좋은 100개 PS (절대 s2n 점수)를 분류자 피처로서 선택하였다.
관리된 주요 성분 - 분별 분석 (SPCA)에 기반한 분류 알고리듬을 선택된 PS를 이용하여 수립하였다 (Bair and Tibshirani, PLOS Biol 2004 and Tibshirani et al., PNAS 2002). 분류자는 분류자 피처로서 선택된 PS만을 지니는 트레이닝 세트의 발현 매트릭스의 특이값 분해(singular value decomposition)에 기반한다. 첫 번째 주요 성분 (PC1)에서 트레이닝 세트의 각각의 그룹 (R 및 NR)의 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 시험 샘플을 분류하기 위해, 이의 Z-점수화된 발현 값을 트레인 세트에 의해 정의된 PC1에 넣고 PC1에서 각각의 그룹의 평균까지의 차이를 이용하여 샘플이 반응자 또는 비-반응자 그룹에 속할 가능성을 계산하였다. 이에 따라, 분류자 결과는 샘플이 반응자 (GS+)일 가능성인 지수이며, 0 내지 1의 범위이다.
도 1/21는 LOOCV에 대한 계획을 도시한다.
도 2/21는 각각의 루프에서 분류에 가장 좋은 100개 PS를 선택하는 LOOCV의 결과를 도시한다.
민감성 (Se) 및 특이성 (Sp)을 성능 지수로서 이용하였다. Se는 반응자로서 예측된 샘플들 중에서 진정한 포지티브 (TP)의 비율로서 정의되며, Sp는 비-반응자로서 예측된 환자들 중에서 진정한 네거티브 (TN)의 비율로서 정의된다.
도 2/21의 그래프로부터, 0.41 내지 0.47 사이의 어떠한 값이 동일한 민감성 및 특이성을 지닐 것임을 알 수 있다. 0.43의 컷오프를 취하도록 결정되었다. 이러한 컷오프는 56개 샘플에 대해 32개 샘플을 반응자 (R)로서 분류할 것이고 민감성은 19/34 (0.56)의 특이성과 함께 17/22 (0.77)일 것이다. 주목할 만하게는, 단지 AS15 아암에서 민감성 및 특이성이 더 높으며, 각각 0.79 및 0.69이다. 중요하게는, 모든 대상 반응자 (CR 및 PR)가 정확하게 분류된다.
LOOCV에 의해 수립된 56개 분류자 각각에서의 선택된 피처의 안정성을 모든 샘플을 이용하여 선택된 피처와 비교하였다.
표 1A. 모든 샘플을 이용하여 선택된 100개 PS 및 LOOCV 에서 선택된 시간
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
*: R2.9에서 NA가 된 R2.6으로부터의 주석
도 3/21은 PS가 각각의 LOOCV에서 100개의 상위 s2n 내에 있는 갯수를 나타낸다. 또한 모든 샘플을 이용하여 선택된 PS를 검정색으로 나타내었다. 모든 샘플을 이용하여 선택된 100개 PS 중 68개를 또한 LOOCV의 적어도 50개에서 선택하였고, 모든 샘플을 이용하여 선택된 100개 PS의 목록은 독립적인 환자의 반응을 예측하는데 사용되는 분류자 피처일 것이다 (표 1).
전반적인 생존 ( OS )에 대한 유전자 시그너처의 영향
Cox 회귀에서, 위험성은 사건 (사망, 질환 진행)이 기간 동안 일어날 가능성을 나타낸다. 기준 위험성은 모든 샘플이 공유하는 것으로 가정되며 위험성에 영향을 미치는 설명 변수인 공변량이 모델에 부가된다. 위험성 비율은 위험성에 대해 공변량이 지니는 영향력을 정량한 것이다. 이것은 변수의 상대적인 위험성을 반영한다.
예를 들어, 하기 표 2에서와 같은 위험성 비가 0.4인 치료는, 유전자 시그너처 포지티브 환자가 유전자 시그너처 네거티브 환자에 비해 기간 동안 60% 감소된 사망 위험을 지님을 의미한다. 0.4는 예상되는 HR의 평균이고, 95% 신뢰 구간이 또한 상기 모델에서 추정됨을 주목한다.
도 4/21은 II상 흑색종 임상에서 모든 환자에 대하여 애주번트에 의한 OS에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선(KM)을 도시한다; 위험성 비율 (HR): 0.55 (95%CI [0.28; 1.06]). 트레이닝 세트의 단지 56명 환자 이용시에 추정된 위험성 비율은 0.41이다 (95% CI [0.191; 0.88]). 전반적인 생존 (OS)에 대한 GS의 영향을 추정하기 위해, 0.43의 컷오프를 이용하여 LOOCV에 의해 수득된 분류를 이용하였다 (섹션 1.4); 도 5/21의 그래프는 GS에 의한 OS에 대한 KM을 도시한다.
다변량 Cox-모델에 애주번트와 GS를 공변량으로서 핏팅시켜 GS에 대한 하기 HR을 수득하였다:
Figure pct00055
GS에 의해 추정된 정중 생존 시간은 다음과 같았다:
Figure pct00056
LOOCV 분류에 기반한 유전자 시그너처 및 애주번트에 의한 전반적인 생존 카플란-마이어 곡선을 도 6/21에 도시하며, HR은 다음과 같았다:
Figure pct00057
상기 논의된 대로, MAGE-A3 ASCI에 대한 임상 반응을 예측하기 위해 주어진 유전자 발현 프로필에 기반한 분류자를 개발하였고 II상 흑색종 임상에서 크로스확인하였다 (GSK 249553/008). 분류자 성능은 0.77의 민감성 및 0.56의 특이성을 수득하는 LOOCV를 이용하여 추정되었다. AS15 아암에서의 특이성은 단지 0.79 및 민감성은 0.69였다. 이러한 분류는 GS+ 집단에서 전반적인 생존에 대한 위험성 비율의 현저한 감소를 초래하였으며, AS15 아암에서 더욱 중요한 효과를 지녔다.
분류자 피처 선택의 안정성을 또한 평가하였고, 이것은 트레이닝 세트에서 하나의 샘플을 제거하는 것에 대해 강한(robust) 것으로 나타났다. MAGE-A3-ASCI (트레이닝 세트의 56명 환자를 모두 이용하여 s2n에 의해 상위 100 PS; 표 1)의 임상 효능에 결부된 시그너처의 생물학은 ASCI의 작용 모드와 관련되는데, 그 이유는 이것이 T-세포 마커의 상향조절을 나타내는 반응자 환자의 종양에서 면역 이펙터 세포의 존재에 유리한 특이적 종양 미세환경 (케모킨)의 존재를 암시하는 유전자를 함유하기 때문이다. 전이 흑색종에서 최근의 유전자 발현 프로파일링 연구는 종양이 T-세포 관련 전사체의 존재 또는 부재에 기반하여 분리될 수 있었음을 밝혀내었다 (Harlin, 2009). 종양에서 림프구의 존재는 6개 케모킨 (CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, CXCL10)의 서브세트의 발현과 관련되었고, 이러한 6개의 유전자 중 3개(CCL5, CXCL9, CXCL10)는 100개 PS에 존재한다. 흥미롭게도, HLA 분자가 또한 반응자 환자에서 상향조절되는 것으로 나타났다. 종양 세포에서 HLA 분자의 하향조절은 면역 감시를 피하는 메커니즘일 수 있는 것으로 여겨져 왔다 (Aptsiauri, 2008).
독창적 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis)으로부터 최고의 생물학적 기능은 100개 PS 시그너처에서 면역 관련 유전자를 풍부하게 하는 것임이 확인되었다 (p-값은 서브-기능에 대해 수득된 범위이다):
Figure pct00058
4. 신규한 샘플의 임상 결과 예측
임상 결과 예측을 수행하기 위해 본원에 기재된 단계들은 R 스크립트로서 기록되었다. 주어진 환자에 대한 임상 결과 예측을 수행하기 전에, 환자 Affymetrix 유전자칩 데이터의 2회 연속 표준화를 수행하였다. 이러한 표준화의 목적은 트레이닝 세트 데이터로 정확하게 스케일링됨에 의해, 유사할 환자에 대한 유전자 발현 값을 생산하는 것이고, 이로부터 예측 계획을 전개시켰다. 트레이닝 세트는 II상 흑색종 임상으로부터의 56개 샘플로 이루어진다. 트레이닝 세트 및 샘플 표준화에 관한 상세한 설명은 이전의 섹션에 기재되어 있고 하기 문단에서 더욱 상세히 기재되었다.
4.1 샘플 표준화
전가공으로도 알려진 샘플 표준화는 각각의 샘플에 대한 CEL 파일에서 출발함으로써 수행되며 하기 양태를 처리할 것이다:
1. 배경 미가공 Affymetrix 올리고누클레오티드 프로브 세기에 대한 수정
2. 분위수 표준화 절차를 이용하여 배경 수정된 프로브 세기의 표준화
3. 칩 정의 파일(Chip Definition File (CDF))에서 정의된 프로브-대-PS 맵핑에 따라서 프로브 세기를 단일 프로브 세트 세기로 전환. CDF 파일은 Affymetrix에 의해 사용되고 제공된 유전자칩 어레이 (hgu133plus2)에 특이적이다. 이러한 마지막 단계를 요약이라고 부른다.
이러한 단계의 목적은 알려지지 않은 환자 데이터의 프로브 세트 (PS) 세기의 분포를 트레이닝 세트의 PS 세기 분포에 맞추는 것이다. 이것은 GCRMA 알고리듬 (Wu, 2004)을 이용하여 수행된다. 이러한 알고리듬은 참조 마이크로어레이 데이터 세트 상에 정의된 전가공 파라메터를 설명하도록 구성되었다. 파라메터는 하기 두 유형이다: 분위수 표준화에 필요한 평균 경험적 분포, 및 PS 요약을 수행하기 위한 프로브-특이적 효과.
참조 GCRMA 파라메터를 II상 흑색종 임상 연구로부터의 65개 샘플로 수립하였고, 이들을 refplus R 패키지에 기반한 코드를 이용하여 신규한 환자 샘플에 적용하였다.
부록 1 코드 청크(chunk)는 Bioconductor에서 이용가능한 Refplus R 패키지 (Harbron et al., 2007)에 함유된 코드의 변형이다. RefPlus 코드는 참조 데이터 세트로부터 계산된 표준화 파라메터를 고려하여, 주어진 샘플 하이브리드화의 GCRMA 표준화를 수행하도록 변형된다. 참조 데이터 세트는 이전 섹션에 기재된 데이터 세트이다 (65명 환자). RefPlus는 참조 데이터 세트 표준화를 위해 초기에 정해지나, GCRMA 보다는 RMA 알고리듬을 이용한다. RMA와 GCRMA 사이의 유일한 차이는 배경 수정 단계에 있다. RefPlus는 rmaplus R 기능에 내장된 bg.correct.rma R 기능을 bg.adjust.gcrma R 기능으로 대체시킴에 의해 GCRMA 배경을 수정하는 것이 가능해졌다. RefPlus 코드 변형은 2007년 10월에 수행되었고 글락소스마스클라인으로부터 이용가능하다. 부록 1의 GCRMA-가능해지고, 변형된 RefPlus 코드로 샘플을 표준화하기 위해서는, 표준화하기 위한 데이터 외에 (부류 AffyBatch의), 참조 데이터 세트에 대해 계산된 참조 분위수 (r.q 옵션) 및 프로브 효과 (p.e 옵션)를 파라메터로서 이용한 GCRMA 배경 수정 가능해진 rmaplus 기능을 불러 와야 할 것이다. 참조 분위수 및 프로브 효과는 GSK로부터 이용가능하고 상기 언급된 대로 USPTO에 콤팩트 디스크로 제출된 rq.txt 및 pe.txt 파일에 포함되어 있다.
부록 1의 GCRMA-가능해지고, 변형된 RefPlus 코드로 샘플을 표준화하기 위해서는 (도 5), 표준화하기 위한 데이터 외에 (부류 AffyBatch의), 참조 데이터 세트에 대해 계산된 참조 분위수 (r.q 옵션) 및 프로브 효과 (p.e 옵션)를 파라메터로서 이용한 GCRMA 배경 수정 가능해진 rmaplus 기능을 불러 와야 할 것이다. 참조 분위수 및 프로브 효과는 GSK의 헤드 오프 코퍼레이트 인텔렉츄얼 프로퍼티(Head of Corporate Intellectual Property)로부터 이용가능한 rq.txt 및 pe.txt 파일에 포함되어 있고, 각각의 명칭은 VR63933P_rq.txt 및 VR63933P_pe.txt이다. 이러한 파일들이 또한 2009년 10월 6일 출원된 미국 우선권 출원 61/278387호에 관해 콤팩트 디스크로 USPTO에 제출되었고 이용가능한 시간에 미국 가특허출원 61/278387호의 파일 히스토리를 요청함에 의해 USPTO로부터 입수할 수 있다.
한편, 이러한 파일들은 또한 zip 파일로서 https://sites.***.com/site/vr63933/vr63933r_files에서 이용가능하다 (https 주소에서 문자 "r"과 단어 "files" 사이에 "_"이 존재함을 주의한다). 웹사이트 상의 파일의 명칭은 각각 VR63933P_rq.zip 및 VR63933P_pe.zip이다. 이러한 두 파일의 사본을 얻기 위해, 본 문단에서 제공된 주소를 네비게이션하고 각각의 파일에 대해 하이퍼텍스트 "다운로드"를 선택한다. 즉시 "저장" 옵션을 선택하고 요망되는 위치에 저장한다. 일반적으로 zip 파일을 여는 바와 같이 파일을 열고 이들을 ASCII (.txt) 파일로서 요망되는 위치에 저장한다. 이어서, 본 출원의 처음 두 문단에서의 지시에 따른다.
요약된 프로브 세트 (PS)를 후속하여 Z-점수 계산으로 표준화한다; 이것을 분류자 피처로서 선택된 PS에 적용한다. 이러한 두 번째 표준화 단계의 목적은 데이터의 전체에 걸쳐서 유사한 발현 패턴을 공유하지만 상이한 절대 발현 값 범위를 지니는 유전자를 동일하게 만드는 것이다.
각각의 개별적인 환자 발현 PS 값에 대한 Z-점수는 다음과 같이 계산된다: PS-특이적 평균을 PS 값으로부터 감하고, 이러한 평균-중심 발현 값을 이어서 PS-특이적 표준 편차에 의해 가중시킨다. Z-점수 계산에 포함된 PS-특이적 평균 및 표준 편차는 트레이닝 세트로부터 계산된 것들이다 (표 4).
일단 환자의 미가공 데이터가 트레이닝 세트 파라메터로 표준화되면, 이들은 환자에 대한 임상 결과를 예측하기 위한 판단 규칙 (분류자 또는 분류 계획)으로 처리될 수 있다.
4.2 새로운 샘플의 분류용 알고리듬
표준화된 환자 PS에 기반하여 환자 임상 결과를 예측하기 위해, 관리된 주요 성분 (SPCA) - 분별인자 분석 (DA) 판단 규칙을 이용하였다 (adapted from Bair, 2004; Tibshirani, 2002). SPCA-DA를 호출하는 예측 공정은 다음과 같이 구동된다:
- 분류에 사용된 프로브 세트는 단지 분류자 피처이며 (100개 PS) 트레이닝 세트에 기반한 모델 개발 동안 확인되었다 (표 1).
- 분류를 위한 환자의 표준화된 발현 프로필 (분류자 피처)를 분류자 피처의 선형 결합을 이용하여 트레이닝 세트에 의해 정의된 첫 번째 주요 성분 (PC1) 스페이스에 투입하였다 (선형 결합에서 각각의 피처에 대한 계수는 트레이닝 세트의 특이값 분해에 의해 수득되었고 이들은 표 4에 제공된다).
- 반응자 및 비-반응자 그룹의 평균에 대한 PC1에서의 시험 샘플의 표준화된 간격은 다음 방정식을 이용하여 수득된다:
Figure pct00059
i=시험 샘플
K= 반응자 (R) 또는 비-반응자 (NR)
평균_PC1 K = 트레이닝 세트에서 R 또는 NR 그룹의 PC1 평균
sd_PC1 K = 트레이닝 세트에서 R 또는 NR 그룹의 PC1 표준 편차
- 트레이닝 세트에서 각각의 그룹의 평균 및 sd는 다음과 같다 (세 개의 유효 숫자까지 반올림됨):
Figure pct00060
- 각각의 샘플에 대한 지수 (샘플이 반응자일 가능성)를 하기를 이용하여 수득하였다:
Figure pct00061
- P R 이 0.43보다 큰 경우 샘플을 유전자 시그너처 포지티브 (반응자, R)로서 분류하였다.
본 방법을 예시할 목적으로 상기 분류자를 트레이닝 세트에 적용시켜, 도 7/21을 생산한다.
새로운 샘플을 예측하기 위한 알고리듬
Figure pct00062
Figure pct00063
상기에서,
- testset은 100개 PS에 대해 표준화된 마이크로어레이 데이터를 함유하는 100개 행을 지니는 매트릭스이다
- M8.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 100개 PS의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 PS에 대한 100개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 PS에 대한 100개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 100개 행 및 56개 열의 매트릭스
5. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 평균 값
6. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 sd 값
7. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 평균 값
8. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 sd 값
표 4. 100개 PS 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차( Sd ) 및 PC 1 계수
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
실시예 2
Q- RT - PCR 데이터를 이용한 흑색종 분류자
마이크로어레이에 의한 유전자 발현 프로파일링에 이용된 RNA를 100개 PS(83개 유전자)로부터의 22개 유전자 및 표준화를 위한 5개 참조 유전자 (GUSB, PGK1, H3F3A, EIF4G2, HNRNPC)를 함유하는 커스텀 Taqman 로우 덴시티 어레이 (ABI, PN 4342259)에서 시험하였다 (표 3).
상기 분석을 위해; 총 54개의 흑색종 샘플을 포함시켰다 (마이크로어레이 분석에 사용된 52개와 마이크로어레이 하이브리드화가 양호한 품질을 지니지 않았던 두 개의 추가의 샘플도 이용하였다).
표 5. 흑색종 샘플에서 PCR 기반 분류자를 확립하는데 사용된 22개 유전자 플러스 참조 유전자에 대한 ABI Taqman 검정 번호들
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
500ng (OD260 측정)의 총 RNA로부터의 cDNA 합성을 1x 첫 번째 가닥 완충제, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 10 mM의 디티오트레이톨, 20 U의 rRNase 억제제 (Promega cat.N2511), 250ng의 랜덤 헥사머 및 200 U의 M-MLV 역전사효소 (Life Technologies cat. 28025-013)를 함유하는 20 ㎕의 혼합물에서 1시간 30분간 42℃에서 수행하였다. 200 ng의 총 RNA에 상응하는 cDNA를 TaqMan 완충제, 5mM MgCl2, 0.4 mM dUTP, 0.625 U의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소, 0.05 U의 UNG를 포함시켜 200 ㎕의 총 부피로 혼합시키고 제조자의 추천에 따라 TaqMan 로우 덴시티 어레이에 로딩시켰다. Taqman 로우 덴시티 어레이를 어플라이드 바이오시스템 7900HT 상에서 진행시켰다. 증폭 프로필은 50℃에서 2분의 1회 사이클, 94.5℃에서 10분의 1회 사이클 및 97℃에서 30초와 59.7℃에서 1분의 40회 사이클이었다. 미가공 데이터를 SDS 2.2 소프트웨어 (ABI)를 이용하여 분석하였다. Ct 값을 자동 기준선 및 0.15를 역치로서 이용하여 수득하였다.
22개 유전자 Q- PCR 데이터를 이용한 SPCA - DA 분류의 리브 원 아웃 교차확인:
분류 계획을 세우고 Q-PCR에 의해 측정된 22개 모든 유전자를 이용하여 리브-원-아웃에 의한 교차확인을 이용하여 시험하였다 (즉, 분류자 피처 재계산 없이).
먼저, 각각의 트레이닝 세트 내에서 Z-점수 표준화를 수행하고 시험 샘플에 적용하였다. 다음으로, 관리된 주요 성분에 기반한 마이크로어레이 데이터에 적용된 동일한 분류 알고리듬 - 분별인자 분석(SPCA-DA)을 확립하고 그 루프에 남아 있는 각각의 샘플에 적용하였다 (Bair and Tibshirai, PLOS Biol 2004 and Tibshirani et al., PNAS 2002).
마이크로어레이로부터 0.43 컷오프를 이용하여, 54개 샘플 중 33개를 GS+로서 분류하였고, 민감성은 85% (17/20)이고 특이성은 53%였다 (18/34). 마이크로어레이에서와 같이, AS15 아암은 보다 나은 성능을 지녔고, 민감성 92% 및 특이성 57%였다.
PCR 데이터 상에서 계산된 0.47의 컷오프를 이용하여, 54개 샘플 중 31개를 GS+로서 분류하였고, 민감성은 85% (17/20)이고 특이성은 59%였다 (20/34).
PCR 상에서 시험된 52개 샘플은 마이크로어레이 모델이었다. 본 발명자들은 100PS는 지니는 LOO SPCA-DA 마이크로어레이 (피처 선택됨) 및 22개 유전자를 지니는 LOO SPCA-DA PCR (피처 선택되지 않음) 상에서 상응하는 샘플의 분류를 비교하였는데, 상기 둘 모두의 가능성 컷오프는 0.43이었다. 리브 원 아웃 모델간 샘플 분류의 일치는 두 분류 모두에서 동일한 표지를 지니는 52개 샘플 중 49개였다 (잘못 분류된 것은 경계에 있는 샘플이다).
도 8/21은 22개 유전자를 이용한 LOO SPCA-DA PCR에 의해 수득된 분류자 지수를 나타낸다 (피처 선택되지 않음).
트레이닝 세트로부터 유래된 파라메터를 이용한 새로운 샘플의 분류
분류자에서 22개 유전자에 대한 Q-PCR 발현 수준에 기반하여 새로운 환자의 임상 결과를 예측하기 위해, 실시예 1의 마이크로어레이 기반 분류자에 대해 앞서 제시된 대로 관리된 주요 성분 (SPCA) - 분별인자 분석 (DA) 판단 규칙을 이용하였다 (adapted from Bair, 2004; Tibshirani, 2002).
일단 환자 미가공 데이터를 참조 유전자를 이용하여 표준화하고 log 변환시키고 나서 (이것은 발현 매트릭스로 불릴 것이다), 이것을 판단 규칙 (분류자 또는 분류 계획)으로 처리하여 환자에 대한 임상 결과를 예측할 수 있다.
- 발현 매트릭스는 트레이닝 세트로부터의 평균 및 표준 편차 (Sd)를 이용하여 z-점수화된다 (표 6)
- 분류를 위한 환자의 z-점수화된 표준화된 발현 프로필 (분류자 피처)을 분류자 피처의 선형 결합을 이용하여 트레이닝 세트에 의해 정의된 첫 번째 주요 성분 (PC1) 스페이스에 투입하였다 (선형 결합에서 각각의 22개 피처에 대한 계수는 트레이닝 세트의 특이값 분해에 의해 수득되었고 이들은 표 6에 제공된다).
표 6. 22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 ( Sd ) 및 PC1 계수
Figure pct00070
- 반응자 및 비-반응자 그룹의 평균에 대한 PC1에서의 시험 샘플의 표준화된 간격은 다음 방정식을 이용하여 수득된다:
Figure pct00071
i=시험 샘플
K= 반응자 (R) 또는 비-반응자 (NR)
평균_PC1 K = 트레이닝 세트에서 R 또는 NR 그룹의 PC1 평균
sd_PC1 K = 트레이닝 세트에서 R 또는 NR 그룹의 PC1 표준 편차
트레이닝 세트에서 각각의 그룹의 평균 및 sd는 다음과 같다 (세 개의 유효 숫자까지 반올림됨):
Figure pct00072
- 각각의 샘플에 대한 지수 (샘플이 반응자일 가능성)를 하기를 이용하여 수득하였다:
Figure pct00073
- P R 이 0.47보다 큰 경우 샘플을 유전자 시그너처 포지티브 (반응자, R)로서 분류하였다.
이러한 분류자를 트레이닝 세트에 적용시켜, 도 9/21을 생산하는데, 상기 도면에서 22개 유전자가 69% 일치에 대해 민감성 0.85 (17/20) 및 특이성 0.59 (20/34)로 트레인 세트를 분류할 수 있는 것으로 나타났다.
결과 예측 코드
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
상기에서,
- Testset.RData은 22개 유전자에 대한 표준화된 로그-스케일 PCR 데이터를 함유하는 22개 행을 지니는 매트릭스이다
- M8.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 22개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 PS에 대한 22개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 22개 행 및 22개 열의 매트릭스
5. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 평균 값
6. 트레인에서 반응자 그룹의 PC1 sd 값
7. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 평균 값
8. 트레인에서 비-반응자 그룹의 PC1 sd 값
실시예 3
PCR 에 의해 평가된 23개 유전자의 서브세트를 이용한 NSCLC 샘플의 분류
배경: NSCLC II 상 임상 시험
이것은 종양의 외과적 완전 절제술 후에 MAGE-A3 포지티브, IB기 및 II기 NSCLC 환자에서의 이중 맹검 플라시보 제어된 개념 증명 시험이다 (CPMS 249553/004). ASCI제 (항원-특이적 암 면역치료제)는 단백질-D 및 Hist-꼬리와 융합된 재조합 MAGE-A3 융합 단백질이다. 상기 단백질을 AS02B 면역학적 애주번트와 조합시킨다. AS02B는 QS21 및 MPL의 수중유 에멀젼이다. QS21은 남미 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)로부터의 정제된 천연 발생 사포닌 분자이고, MPL은 3 데-O-아세틸화된 모노포스포릴 지질 A - S. 미네소타(S. minnesota) LPS로부터 유래된 지질 A의 탈독소화된 유도체이다. 이러한 이중 맹검 랜덤화된 플라시보 제어된 시험은 재발까지의 시간을 평가하기 위해 설계되었다 (도 11/21).
도 10/21은 NSCLC II상 시험 설계를 도시한다. MAGE-A3-포지티브이고 완전히 절제된 IB기 또는 II기 NSCLC를 지니는 총 182명의 환자를 2년에 걸쳐 등재시키고 ASCI 표적화 MAGE-A3 또는 플라시보 (2:1 비)를 투여받도록 임의로 할당하였다. 27개월의 기간에 걸쳐 최대 13회 용량을 투여하였다. 절제한 날로부터 28개월의 정중 추적검사 기간 후에 주요 분석을 수행하였고 2006년 11월에 공개하였다.
이러한 시험은 상기 환자 집단에서 암 면역치료제에 대한 활성의 첫 번째 증거를 제공하였다. 주요 분석 시점에, 67명의 환자가 질환 재발을 나타내었다: recMAGE-A3 + AS02B ASCI 아암에서 41명 (33.6%) 및 플라시보 아암에서 26명 (43.3%). Cox 회귀 분석을 이용하여 각각의 환자의 개별적인 시간-대-사건을 고려하면서, 질환이 없는 간격 (DFI)의 상대적인 개선을 계산하였다. 그 결과는, 28개월의 정중 추적검사 후에 플라시보에 비해 ASCI를 투여받은 그룹에서 암 재발 위험성에 있어서 27%의 상대적 감소를 나타내었다 (위험성 비 = 0.73; CI = 0.44 - 1.2; p = 0.108, 일측 로그랭크 시험) (도 11/21).
질환이 없는 생존 (DFS) 및 전반적인 생존 (OS)에 대한 위험성 비는 각각 0.73 (CI: 0.45 - 1.16) 및 0.66 (CI = 0.36 - 1.20)이었다.
이러한 결과는 최종 분석 시점에 추가로 확인되었다 (2007년 12월 - 44개월의 정중 추적검사): DFI에 대한 HR 0.75 (CI = 0.46 - 1.23), DFS에 대해 0.76 (CI = 0.48 - 1.21) 및 OS에 대해 0.81 (CI = 0.47 - 1.40).
도 11/21은 NSCLC 시험에 있어서 질환이 없는 간격에 대한 카플란-마이어 곡선을 나타낸다. 이러한 연구로부터의 샘플을 이용하여 이러한 환자 집단에서 ASCI-치료의 임상 반응을 예측하는 잠재적인 바이오마커로서 흑색종 시그너처의 이용을 결정하였다.
PCR 데이터로 NSCLC 샘플의 분류:
100PS로부터 23개 유전자의 서브세트 (표-1)를 이용하여 MAGE-A3 NSCLC 임상 시험으로부터의 샘플로 LOO 분류자를 확립하였다 (MAGE004; 글락소스미스클라인).
표 7. NSCLC 샘플에서 PCR 기반 분류자를 확립하기 위해 사용된 23개 유전자에 대한 ABI Taqman 검정 번호들 ( 실시예 2에서의 흑색종 분류자와 동일한 참조 유전자)
Figure pct00077
Figure pct00078
방법
129개 종양 견본 (백신화 전)을 MAGE-A3 NSCLC 임상 시험 (MAGE004; 글락소스미스클라인)으로부터 이용하였다. 이들은 RNAlater, RNA 안정화 용액에 보존된 갓 동결된 샘플이었다. 총 RNA를 트리퓨어 방법 (Roche Cat. No. 1 667 165)을 이용하여 정제하였다. 제공된 프로토콜에 따른 후, DNAse 처리와 함께 RNeasy 미니 키트-클린-업 프로토콜을 사용하였다 (Qiagen Cat. No. 74106). RNA의 정량은 260 nm에서의 광학 밀도를 이용하여 초기에 완료되었다.
500ng의 총 RNA로부터의 cDNA 합성을 1x 첫 번째 가닥 완충제, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 10 mM의 디티오트레이톨, 20 U의 rRNase 억제제 (Promega cat.N2511), 250ng의 랜덤 헥사머 및 200 U의 M-MLV 역전사효소 (Life Technologies cat. 28025-013)를 함유하는 20 ㎕의 혼합물에서 1시간 30분간 42℃에서 수행하였다. 200 ng의 총 RNA에 상응하는 cDNA를 TaqMan 완충제, 5mM MgCl2, 0.4 mM dUTP, 0.625 U의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소, 0.05 U의 UNG를 포함시켜 200 ㎕의 총 부피로 혼합시키고 제조자의 추천에 따라 TaqMan 로우 덴시티 어레이에 로딩시켰다.
Taqman 로우 덴시티 어레이를 어플라이드 바이오시스템 7900HT 상에서 진행시켰다. 증폭 프로필은 50℃에서 2분의 1회 사이클, 94.5℃에서 10분의 1회 사이클 및 97℃에서 30초와 59.7℃에서 1분의 40회 사이클이었다. 미가공 데이터를 SDS 2.2 소프트웨어 (ABI)를 이용하여 분석하였다. Ct 값을 자동 기준선 및 0.15를 역치로서 이용하여 수득하였다.
23개 유전자 Q- PCR 데이터를 이용한 SPCA - Cox 분류의 리브 원 아웃 교차확인:
이러한 임상 시험은 플라시보 및 치료된 아암을 포함하였고, 공변량으로서 치료, 유전자 프로필, 단계, 외과술 및 조직학적 유형 외에 치료와 유전자 프로필간 상호작용을 갖는 (주요 성분으로서 요약됨) Cox 비례적 위험성 모델에 기반한 위험 점수를 추정하기 위해 질환이 없는 간격 (DFI)을 이용한 분류자를 개발하였다.
각각의 유전자에 대한 Ct 값을 5개 참조 유전자의 기하 평균으로 표준화하고 log 변환시켰다. 후속하여, 유전자를 각각의 트레이닝 세트에서 Z-점수로 표준화하였고 이러한 파라메터를 시험 세트에 적용시켰다.
z-점수 표준화 후에, 트레이닝 세트에서 특이값 분해 (SVD)를 수행하여 첫 번째 주요 성분 (PC1)을 수득하였다. 이러한 첫 번째 성분을 치료와 상호작용을 갖는 Cox 회귀에 이용하여 트레인 세트에서 공변량 계수를 추정하였다; Cox 회귀를 조직학, 단계 및 외과술 효과의 유형에 대해 조정하였다. 이러한 회귀로부터의 계수를 이용하여 트레이닝 세트 및 시험 샘플 (남아 있는 샘플)에서 위험 점수를 계산하였다. 트레인 세트의 정중 위험 점수를 컷오프 값으로서 이용하여 환자 유전자 시그너처 (GS)+ 또는 유전자 시그너처 (GS)-를 불러왔다. 상기 방법을 Cox-SPCA라고 하며 도 12/21에 예시되어 있다.
도 13/21 및 14/21은 정중값이 컷오프인 LOOCV 분류에 기반한 유전자 프로필에 의한 생존 곡선 및 플라시보와 백신 아암간에 위험 점수의 분포를 각각 도시한다. 위험 점수 분포는 다음과 같다:
Figure pct00079
Cox - SPCA 알고리듬을 이용한 새로운 샘플의 분류
분류자에서 23개 유전자에 대한 Q-PCR 발현 수준에 기반하여 새로운 환자의 임상 결과를 예측하기 위하여, 관리된 주요 성분 (SPCA) - Cox 판단 규칙을 이용하였다:
일단 환자 미가공 데이터를 참조 유전자를 이용하여 표준화하고 log 변환시키고 나서, 이것을 판단 규칙 (분류자 또는 분류 계획)으로 처리하여 환자에 대한 임상 결과를 예측할 수 있다.
- 발현 매트릭스는 트레이닝 세트의 파라메터를 이용하여 z-점수화된다 (표 8)
표 8. 23개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 ( Sd ) 및 PC1 계수
Figure pct00080
Figure pct00081
- 분류를 위한 환자의 z-점수화된 표준화된 발현 프로필 (분류자 피처)를 분류자 피처의 선형 결합을 이용하여 트레이닝 세트에 의해 정의된 첫 번째 주요 성분 (PC1) 스페이스에 투입하였다 (선형 결합에서 각각의 23개 피처에 대한 계수는 트레이닝 세트의 특이값 분해에 의해 수득되었고 이들은 표 8에 제공된다).
- 새로운 샘플에 대한 위험 점수를 하기 방정식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00082
상기에서, B치료= -0.232051457
및 BPC1 상호작용= 0.176736586을 트레이닝 세트로부터 수득하였다.
새로운 샘플의 위험 점수를 트레이닝 세트의 정중 위험 점수=-0.315324195와 비교하였고, 위험 점수가 상기 값보다 낮은 경우 샘플을 GS+ (반응자, 비-재발, 1)로서 분류하였다.
도 15/21 및 16/21은 분류자에서 23개 유전자에 대한 Q-PCR 발현 수준에 기반한 임상 결과를 도시한다. HR에 대한 GS의 영향은 다음과 같았다:
Figure pct00083
결과 예측 코드
Figure pct00084
Figure pct00085
상기에서,
- Testset.RData는 23개 유전자에 대한 표준화된 log-스케일 PCR 데이터를 함유하는 23개 행을 지니는 매트릭스이다
- M4.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 23개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 23개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 23개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 23개 행 및 23개 열의 매트릭스
5. 위험 점수 계산에서 B치료
6. 위험 점수 계산에서 BPC1 상호작용
7. 트레인에서 정중 위험 점수
실시예 4
PCR 에 의해 평가된 22개 유전자의 서브세트로 NSCLC 샘플의 분류:
MAGE-A3 NSCLC 임상 시험으로부터의 샘플로 LOO 분류자를 확립하기 위해 100PS로부터의 22개 유전자의 서브세트 (표-1)를 이용하였다 (MAGE004; 글락소스미스클라인)
표 9. NSCLC 샘플에서 PCR 기반 분류자를 확립하기 위해 이용된 22개 유전자에 대한 ABI Taqman 검정 번호들 ( 실시예 2에서의 흑색종 분류자와 동일한 참조 유전자)
Figure pct00086
Figure pct00087
방법
137개 종양 견본 (백신화 전)을 MAGE-A3 NSCLC 임상 시험 (MAGE004; 글락소스미스클라인)으로부터 이용하였다. 이들은 RNAlater, RNA 안정화 용액에 보존된 갓 동결된 샘플이었다.
총 RNA를 트리퓨어 방법 (Roche Cat. No. 1 667 165)을 이용하여 정제하였다. 제공된 프로토콜에 따른 후, DNAse 처리와 함께 RNeasy 미니 키트-클린-업 프로토콜을 사용하였다 (Qiagen Cat. No. 74106). RNA의 정량은 260 nm에서의 광학 밀도를 이용하여 초기에 완료되었다.
500ng의 총 RNA로부터의 cDNA 합성을 1x 첫 번째 가닥 완충제, 0.5 mM의 각각의 dNTP, 10 mM의 디티오트레이톨, 20 U의 rRNase 억제제 (Promega cat.N2511), 250ng의 랜덤 헥사머 및 200 U의 M-MLV 역전사효소 (Life Technologies cat. 28025-013)를 함유하는 20 ㎕의 혼합물에서 1시간 30분간 42℃에서 수행하였다. 200 ng의 총 RNA에 상응하는 cDNA를 TaqMan 완충제, 5mM MgCl2, 0.4 mM dUTP, 0.625 U의 Ampli Taq Gold DNA 중합효소, 0.05 U의 UNG를 포함시켜 200 ㎕의 총 부피로 혼합시키고 제조자의 추천에 따라 TaqMan 로우 덴시티 어레이에 로딩시켰다.
Taqman 로우 덴시티 어레이를 어플라이드 바이오시스템 7900HT 상에서 진행시켰다. 증폭 프로필은 50℃에서 2분의 1회 사이클, 94.5℃에서 10분의 1회 사이클 및 97℃에서 30초와 59.7℃에서 1분의 40회 사이클이었다. 미가공 데이터를 SDS 2.2 소프트웨어 (ABI)를 이용하여 분석하였다. Ct 값을 자동 기준선 및 0.15를 역치로서 이용하여 수득하였다.
22개 유전자 Q- PCR 데이터를 이용한 SPCA - Cox 분류의 리브 원 아웃 교차확인:
이러한 임상 시험은 플라시보 및 치료된 아암을 포함하였고, 공변량으로서 치료, 유전자 프로필, 단계, 외과술 및 조직학적 유형 외에 치료와 유전자 프로필간 상호작용을 갖는 (주요 성분 1로서 요약됨) Cox 비례적 위험성 모델에 기반한 위험 점수를 추정하기 위해 질환이 없는 간격 (DFI)을 이용한 분류자를 개발하였다.
각각의 유전자에 대한 Ct 값을 5개 참조 유전자의 기하 평균으로 표준화하고 log 변환시켰다. 후속하여, 유전자를 각각의 트레이닝 세트에서 Z-점수로 표준화하였고 이러한 파라메터를 시험 세트에 적용시켰다.
z-점수 표준화 후에, 트레이닝 세트에서 특이값 분해 (SVD)를 수행하여 첫 번째 주요 성분 (PC1)을 수득하였다. 이러한 첫 번째 성분을 치료와 상호작용을 갖는 Cox 회귀에 이용하여 트레인 세트에서 공변량 계수를 추정하였다; Cox 회귀를 조직학, 단계 및 외과술 효과의 유형에 대해 조정하였다. 이러한 회귀로부터의 계수를 이용하여 트레이닝 세트 및 시험 샘플 (남아 있는 샘플)에서 위험 점수를 계산하였다. 트레인 세트의 정중 위험 점수를 컷오프 값으로서 이용하여 환자 GS+ 또는 GS-를 불러왔다. 상기 방법을 추가의 문서에서 Cox-SPCA라고 한다. 상기 방법이 도 12/21에 예시되어 있다.
도 17/21 및 18/21은 정중값이 컷오프인 LOOCV 분류에 기반한 유전자 프로필에 의한 생존 곡선 및 플라시보와 백신 아암간에 위험 점수의 분포를 각각 도시한다.
위험 점수 분포
Figure pct00088
Cox - SPCA 알고리듬을 이용한 새로운 샘플의 분류
분류자에서 22개 유전자에 대한 Q-PCR 발현 수준에 기반하여 새로운 환자의 임상 결과를 예측하기 위하여, 관리된 주요 성분 (SPCA) - Cox 판단 규칙을 이용하였다:
일단 환자 미가공 데이터를 참조 유전자를 이용하여 표준화하고 log 변환시키고 나서, 이것을 판단 규칙 (분류자 또는 분류 계획)으로 처리하여 환자에 대한 임상 결과를 예측할 수 있다.
- 발현 매트릭스는 트레이닝 세트의 파라메터를 이용하여 z-점수화된다 (표 10)
표 10. 22개 유전자 분류자 피처에 대한 평균, 표준 편차 ( Sd ) 및 PC1 계수
Figure pct00089
- 분류를 위한 환자의 z-점수화된 표준화된 발현 프로필 (분류자 피처)를 분류자 피처의 선형 결합을 이용하여 트레이닝 세트에 의해 정의된 첫 번째 주요 성분 (PC1) 스페이스에 투입하였다 (선형 결합에서 각각의 22개 피처에 대한 계수는 트레이닝 세트의 특이값 분해에 의해 수득되었고 이들은 표 10에 제공된다).
- 새로운 샘플에 대한 위험 점수를 하기 방정식을 이용하여 계산하였다:
Figure pct00090
상기에서, B치료= -0.193146993 및 BPC1 상호작용= 0.163704817을 트레이닝 세트로부터 수득하였다.
새로운 샘플의 위험 점수를 트레이닝 세트의 정중 위험 점수=-0.25737421과 비교하였고, 위험 점수가 상기 값보다 낮은 경우 샘플을 GS+ (반응자, 비-재발, 1)로서 분류하였다.
도 19/21 및 20/21은 분류자에서 22개 유전자에 대한 Q-PCR 발현 수준에 기반한 임상 결과를 도시한다.
Figure pct00091
결과 예측 코드
Figure pct00092
Figure pct00093
상기에서,
- Testset.RData는 22개 유전자에 대한 표준화된 log-스케일 PCR 데이터를 함유하는 22개 행을 지니는 매트릭스이다
- M4.train.파라메터는 하기를 함유하는 분류 목록의 객체이다:
1. 22개 유전자 명칭의 특성 목록
2. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 평균 값의 벡터
3. 트레인 세트에서 각각의 유전자에 대한 22개 sd 값의 벡터
4. 트레인 매트릭스의 svd 분해의 U 매트릭스를 함유하는 22개 행 및 22개 열의 매트릭스
5. 위험 점수 계산에서 B치료
6. 위험 점수 계산에서 BPC1 상호작용
7. 트레인에서 정중 위험 점수
실시예 5
흑색종 샘플에서 Q- PCR 에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
실시예 2로부터의 각각의 22개 유전자를, 첫 번째 주요 성분 대신 단일 유전자 발현 값을 이용하여 흑색종 샘플에서 다변량 분류에 적용된 알고리듬을 이용함에 의해 단변량 분류 성능에 대해 평가하였다. 발현 값을 참조 유전자를 이용하여 표준화시키고 z-점수를 실행한 후에, 각각의 개별적인 유전자에 대한 발현 수준을 이용하여 트레이닝 세트에서 모든 샘플을 이용하여 분류자를 확립하였다. 트레이닝 세트에서 각각의 유전자의 차별적인 발현에 대한 t-시험 p-값 및 반응자 대 비-반응자의 배수 변화를 계산하였다. 트레이닝 세트에 있는 각각의 샘플이 반응자일 가능성을 수득하고, 임상 표지와의 일치를 최대화시켜 각각의 유전자에 대해 가장 좋은 컷오프를 결정하였고, 결과는 하기 표에 제시된다:
표 11
Figure pct00094
Figure pct00095
개별적인 유전자에 대해 수득된 상기 결과는 실시예 2에서 모든 유전자를 이용한 다변량 분류에서 수득된 69%의 일치%에 필적한다.
실시예 6
NSCLC 샘플에서 Q- PCR 에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
실시예 3으로부터의 각각의 23개 유전자를, 첫 번째 주요 성분 대신 단일 유전자 발현 값을 이용하여 NSCLC 샘플 (Cox-SPCA)에서 다변량 분류에 적용된 알고리듬을 이용함에 의해 분류 성능에 대해 평가하였다.
발현 값을 참조 유전자를 이용하여 표준화시키고 z-점수를 실행한 후에, 각각의 개별적인 유전자에 대한 발현 수준을 이용하여 실시예 3에 기재된 분류자를 확립하였다. 트레이닝 세트에서 각각의 샘플에 대한 위험 점수를 수득하였고, 상이한 컷오프에 기반하여 샘플을 GS+ 또는 GS-로 할당하였다. 각각의 GS+ 및 GS- 그룹에서 이러한 컷오프와 관련된 치료 HR을 계산함에 의해 각각의 컷오프의 성능을 평가하였다. 분류의 상호작용 계수를 최대화함에 의해, 즉 GS+ 및 GS-에서 치료 HR간에 차이를 최대화함에 의해, 유전자에 대해 가장 좋은 컷오프를 개별적으로 결정하였다. 하기 표는 최적화 공정을 이용하여 수득된 GS+ 및 GS-에서의 치료 HR 및 그러한 HR과 관련된 p-값을 나타낸다.
표 12
Figure pct00096
실시예 7
흑색종 샘플에서 마이크로어레이에 의해 측정된 개별적인 유전자의 분류 성능
실시예 1로부터의 각각의 100개 PS를, 첫 번째 주요 성분 대신 단일 유전자 발현 값을 이용하여 흑색종 샘플에서 다변량 분류에 적용된 알고리듬을 이용함에 의해 단변량 분류 성능에 대해 평가하였다.
발현 값을 표준화시키고 (gcrma) z-점수를 실행한 후에, 각각의 개별적인 PS에 대한 발현 수준을 이용하여 트레이닝 세트의 모든 샘플을 이용한 분류자를 확립하였다. 트레이닝 세트에서 각각의 PS의 차별적인 발현에 대한 t-시험 p-값 및 반응자 대 비-반응자의 배수 변화를 계산하였다. 트레이닝 세트에 있는 각각의 샘플이 반응자일 가능성을 수득하고, 임상 표지와의 일치를 최대화시켜 각각의 유전자에 대해 가장 좋은 컷오프를 결정하였고, 결과는 하기 표에 제시된다:
표 13
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
개별적인 PS에 대해 수득된 상기 결과는 실시예 1에서 모든 유전자를 이용한 다변량 분류에서 수득된 68%의 일치%에 필적한다.
참조문헌
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
부록 1 - GCRMA-가능해지고, 변형된 RefPlus R 코드
Figure pct00103
SEQUENCE LISTING <110> Vincent Brichard Benjamin Georges Elie Lea Ghislain Dizier Olivier Gruselle Jamila Louahed Fernando Olloa-Montoya <120> Method <130> VR63933WO <140> to be assigned <141> - - <150> GB0917457.4 <151> 2009-10-06 <150> 61/278387 <151> 2009-10-06 <150> 61/277046 <151> 2009-09-18 <160> 113 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLAMF6 Affymetrix annotation <400> 1 tagcattacc cttctgacac tctctatgta gcctccctga tcttctttca gctcctctat 60 taaaggaaaa gttctttatg ttaattattt acatcttcct gcaggccctt cctctgcctg 120 ctggggtcct cctattcttt aggtttaatt ttaaatatgt cacctcctaa gagaaacctt 180 cccagaccac tctttctaaa atgaatcttc taggctgggc atggtggctc acacctgtaa 240 tcccagtact ttgggaggcc aaggggggag atcacttgag gtcaggagtt caagaccagc 300 ctggccaact tggtgaaacc ccgtctttac taaaaataca aaaaaattag ccaggcgtgg 360 tggtgcaccc ctaaaatccc agctacttga gagactgagg caggagaatc gcttgaaccc 420 aggaggtgga ggttccagtg agccaaaatc atgccaatgt attccagtct g 471 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ncccnnngcc ttacgatttt 180 atnnggaaag caaggaccnt gctattattn ntntaatttg ccatcattta tgtatattnn 240 ggaaggtatg agacccacaa gcacaantga tcattttnat tngttngtnn gttngaaact 300 tcagcagaat agatatctgc atgctttatg aangttgttg cttcggtaag agcccatggg 360 atgccagaaa ttaacatttc tttgctgcca tgggntgatg atgctgctat tagataaang 420 tttagctgtg gnaccaagtc acatcatttt catagaaaaa gatnacttgt agcttatttt 480 agaagtatga ccttttggtc tgtttga 507 <210> 4 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 373 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 373 <223> n = A,T,C or G <220> <223> TC2N Affymetrix annotation <220> <221> misc_feature <222> 373 <223> n = A,T,C or G <400> 4 caggtggcac aaattaaatc catcttgaag acttcacaca ttaatttggt gaagaacttg 60 acattctttt agaagactta tgatttcaat ttgctaccaa tgagaagagg caaatcaaca 120 aatttgtcaa tttatggggg ctataattat ggtatataat gtatctgata gaaaatttga 180 taagaaaatg taatgaattt tatcagatat ccaaagtaaa ggaaatgttt taaaactgca 240 acaagagaca cagacagtaa aatcaaagta ttattaggat gactaaataa attataaagt 300 ctgtgagaat atcaaccata gatagttctt tctatattat gtttttgctt ttgtatttta 360 agctttactt agnatattca aaacctggta tatcaagtct ctgttagtac tattggcatt 420 tagaagactt taccattatt tcagtgctag gcattattga ttaggtcttg gctccactgt 480 ttacct 486 <210> 5 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGAL Affymetrix annotation <400> 5 acacttggtt gggtcctcac atctttcaca cttccaccag cctgcactac tccctcaaag 60 cacacgtcat gtttcttcat ccggcagcct ggatgttttt tccctgttta atgattgacg 120 tacttagcag ctatctctca gtgaactgtg agggtaaagg ctatacttgt cttgttcacc 180 ttgggatgat gcctcatgat atgtcagggc gtgggacatc tagtaggtgc ttgacataa 239 <210> 6 <211> 128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5 Affymetrix annotation <400> 6 cccgtgccca catcaaggag tatttctaca ccagtggcaa gtgctccaac ccagcagtcg 60 tctttgtcac ccgaaagaac cgccaagtgt gtgccaaccc agagaagaaa tgggttcggg 120 agtacatc 128 <210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 152, 157, 169 <223> n = 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atatactgcc aagtcaggaa gaaaaaatcc acctgttcag tgatttcagg 60 aactgctgaa gaaaatcacc agtgagtatc agtttctgca agagaatcta atgcaggctt 120 tgcttctcat cggaatcccc cagctggtgt cttggttgac tgagagtctg ggggagaggg 180 cagagaatgg atttattctc tgctaggttt ttaacagtca agaagggctg tggtcctaag 240 gggcactggt caaaccttag tgtgcatcag aattatctgg ataaggctag gcacagtggc 300 tcacgcctgt aatcacagca ctttgggagg ctgaggcgcg tggatcacct gaggtcagaa 360 gttcaagacc agcctggctc ttttagtaga g 391 <210> 10 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP1R16B Annotation from R2.6 that became NA in R2.9 <400> 10 gaaaattcct ggcagtttca actgtgatag acattgctaa cctgttctcc aaagaggctg 60 aaccaatttc tgtttcctca acagtgtatg actgtttccc ccatctattc tccagcactg 120 aggattaagt aactttcatt tttgtcagtc tgacagatat aaagcagaac atttctgcat 180 aaggttctac agtaattttt agattttatg accctttgga ttatgcctac ataatgatga 240 tcaaatattc agaaactaca ttgtacctgg ccttaggctt ggaattggat acaaaattaa 300 atgaaaccag cttttgccct caggttgatc ccatctcctg gagttggcag acaaatgaac 360 aaataaaatg agagcaaaac tgtatggttc acattgtgct agagaaatgc ataagcttag 420 ctaacttttg tttgataaac tctatattca ttaatatcac aaatgaattc ataaaatacc 480 gtatgcatta tgtcccaggg 500 <210> 11 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP2B1 Affymetrix annotation <400> 11 gggcaggaca tgctgtacca atccctgaag ctcactaatg gcatttggat tttggccgaa 60 ctacgtatcc agccaggaaa ccccaattac acgctgtcac tgaagtgtag agctcctgaa 120 gtctctcaat acatctatca ggtctacgac agcattttga aaaactaaca agactggtcc 180 agtacccttc aaccatgctg tgatcggtgc aagtcaagaa ctcttaactg gaagaaattg 240 tattgctgcg tagaatctga acacactgag gccacctagc aaggtagtaa ctagtctaac 300 ctgtgctaac attagggcac aacctgttgg atagttttag cttcctgtga acatttgtaa 360 ccactgcttc agtcacctcc cacctcttgc cacctgctgc tgctatctgt ccttacttgt 420 gggcttctcc atgctgtgcc aatggctggc tttttctaca cc 462 <210> 12 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITGA3 Affymetrix annotation <400> 12 gccacagact gaactcgcag ggagtgcagc aggaaggaac aaagacaggc aaacggcaac 60 gtagcctggg ctcactgtgc tggggcatgg cgggatcctc cacagagagg aggggaccaa 120 ttctggacag acagatgttg ggaggataca gaggagatgc cacttctcac tcaccactac 180 cagccagcct ccagaaggcc ccagagagac cctgcaagac cacggaggga gccgacactt 240 gaatgtagta ataggcaggg ggccctgcca ccccatccag ccagacccca gctgaaccat 300 gcgtcagggg cctagaggtg gagttcttag ctatccttgg ctttctgtgc cagcctggct 360 ctgcccctcc cccatgggct gtgtcctaag gcccatttga gaagctgagg ctagttccaa 420 aaacctctcc tg 432 <210> 13 <211> 502 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRF1 Affymetri x annotation <400> 13 acaggagtca gtgtctggct ttttcctctg agcccagctg cctggagagg gtctcgctgt 60 cactggctgg ctcctagggg aacagaccag tgaccccaga aaagcataac accaatccca 120 gggctggctc tgcactaagc gaaaattgca ctaaatgaat ctcgttccaa agaactaccc 180 cttttcagct gagccctggg gactgttcca aagccagtga atgtgaagga aactcccctc 240 cttcggggca atgctccctc agcctcagag gagctctacc ctgctccctg ctttggctga 300 ggggcttggg aaaaaaactt ggcacttttt cgtgtggatc ttgccacatt tctgatcaga 360 ggtgtacact aacatttccc ccgagctctt ggcctttgca 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<220> <223> ZNF285A Affymetrix annotation <400> 92 gaaacccatg ctcttactat gaaagaacgt tagtacccag gttttccatg agattctcta 60 cacaggcaag aagctccata gaagtggcat ttgaagggtg tggcagaggc agtgctgtgt 120 ttatcacact ggttccattt ccttgcaaat aagaagtcta tttcccagta acccttgcag 180 ttaagagtgt gcccatgtga ttgagttcta gccaatggag tgtgagcaaa agtgatataa 240 gccactttca ggtctagcct ttacaaacat cctcaggctt ctctatccct gccaaggtga 300 ccttggaggc tgcttattcc agactgggtt gatagaaggt cactacttca tctgtgttgg 360 a 361 <210> 93 <211> 350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 26, 324 <223> n = A,T,C or G <220> <223> TMEM56 Affymetrix annotation <220> <221> misc_feature <222> 26, 324 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 26, 324 <223> n = A,T,C or G <400> 93 atgaatcagt gttactagga cttatncagt acttaaaata gcaacttggc attctttatt 60 ttgtttcctg gttgttttat ttggagggat aataaatgtc taagttattt ccattaaaat 120 tttgaaatgt ttgtatactt tatgtgtgcc attttaaagt atatgcaagt tctaagcaat 180 aatctgcatg ttatacaagg ttgacatatt ttgtcctgaa atttttagtt aacatttcaa 240 gaatgataaa atgaacaccc tgtaaattac ccttctcccc ctcccctcca tgaaaacctt 300 gggattttct tgtgctagaa cacntaccac aatgtggtgc aaagctttgt 350 <210> 94 <211> 536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 117, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 152, 153, 154, 155, 221 <223> n = A,T,C or G <220> <223> NA <220> <221> misc_feature <222> 117, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 152, 153, 154, 155, 221 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 117, 137, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 149, 152, 153, 154, 155, 221 <223> n = A,T,C or G <400> 94 aaatgtaccc ttgatttgat gctaatgctg tatttagggc tgaaggaagc acacactaaa 60 tatctgagtg cttttcagat tccatctatg ctgaaaaaga atctaggaga ataaacncat 120 ttcaattagc ccttaanann nnnnnnnana annnnagccc actaaagccc agtagggcat 180 aggagagaac actgcaccag gattcagatc tggattctaa nttttgttct gaaaaatagc 240 aagtgacact ggcatgccat ttaacctctc cgggcctcaa tttccactat agatagtacc 300 tgatgtgtca gtaagacaac tgatgtaact ttgccaaaca agtagaatta tccttcctcc 360 tttgtcctgc tctgtcctag cttttaatac ttggtctgcc ctaacatttt cctgtatgta 420 tttctttatc ccagatattc gaacaattgc tagcaaggaa aagtaatgac ggattttcat 480 ttcccaatat agtctggcaa agaaatgaaa ggtttacttc tccttgctaa ttcaat 536 <210> 95 <211> 403 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GBP5 Affymetrix annotation <400> 95 aacaatgtgc agctttcaac tgggtggagg ctgctattct gtggacagtg agatgtttcc 60 ttggcactgt caatagacaa tctgcgtaga gaaattccaa gctgaaagcc aataatgtta 120 taataaaata gagattcttc agaagatgaa aggaattacc agcatggaaa ttgtgtcata 180 ggcttaaggg ctaaagaaga agccttttct tttctgttca ccctcaccaa gagcacaact 240 taaatagggc attttataac ctgaacacaa tttatattgg acttaattat tatgtgtaat 300 atgtttataa tcctttagat cttataaata tgtggtataa ggaatgccat ataatgtgcc 360 aaaaatctga gtgcatttaa tttaatgctt gcttatagtg cta 403 <210> 96 <211> 346 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UBASH3B Afymetrix annotation <400> 96 gcttctacaa gtgtgccaca tcaatccggt aatgccccag tgttattcac agacagaact 60 ttgtttcctg tgattttaaa ataccgcgtc tgttcctcca tggaccagag taattggcac 120 attttaatgc ataagctggg ggtttcattt tcccaggctc tcttcaccat cactgcattg 180 gtagctagga gcttattgct tcaccccagt atggagttca gattacagtg ttttccatta 240 catttagatt catagaatct gaatggctga ttaaatggcc atctgatggc tgaaagaggg 300 gcgtattttt cactctgtag tgaaaggctt ggaggagttt ctactt 346 <210> 97 <211> 435 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 220, 221, 225, 229, 231, 245, 248, 332 <223> n = A,T,C or G <220> <223> RNF144B Affymetrix annotation <220> <221> misc_feature <222> 220, 221, 225, 229, 231, 245, 248, 332 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 220, 221, 225, 229, 231, 245, 248, 332 <223> n = A,T,C or G <400> 97 taaaaataag tcgccagctc tctcctttat aaacagtctt tagactggtt tgtatcatgc 60 cccttgatgt accagagata tgtttaacca acctagtttt gttgattctg acaatctcac 120 acacatttaa gaatttacca tttttcaggc acttttcaat gttaaaaaaa attaaatcca 180 attattgaaa atcagtttga caaacaaccc ccactccatn ncccnggcna naaaaaaaaa 240 aaaanaanaa caaaagcagc taattcagtg atacaaactc tgtaaggtgg caaattcccc 300 caactcgcca aggaaatagc acatatttat tntctcccat ctttactcca aatttgggac 360 ctcttcctct gataacacag tcttttaggt tacttgaaat cagcccccat ttaaagactc 420 tttgcggcac caagc 435 <210> 98 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 94, 95 <223> n = A,T,C or G <220> <223> ARHGAP15 Annotation from R2.6 that became NA in R2.9 <220> <221> misc_feature <222> 94, 95 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 94, 95 <223> n = A,T,C or G <400> 98 gaaatggcac attttctgga tgtgagagtt ggtcaaaaga tcacaaaaaa agtcaaaaaa 60 taattctact ctgtgaatga aaaatggata tttnngtact taccctcata agcattaaaa 120 gaaaataatg catgaaattc catagaaatg tgcctatcat gttatactga ctcaaaccag 180 aagacctaga gtatgatatt gctaatataa tacatgtggt gggtatgagt ggaagtatgt 240 gtgtgagatt tatcattgcc atagtgtaaa agagttgaat tagcttccac ttgactagat 300 gagagctctt agttcttatt 320 <210> 99 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> 103, 130 <223> n = A,T,C or G <220> <223> AKR1C2* Annotation from R2.6 that became NA in R2.9 <220> <221> misc_feature <222> 103, 130 <223> n = A,T,C or G <220> <221> misc_feature <222> 103, 130 <223> n = A,T,C or G <400> 99 cccagccgct ataactttta acaattccca tatgtccttt attccactaa gatgagtgca 60 gtatatattt ccatctgtcc aaggcttcct aaatgtagcc aangccaagc caacaccagt 120 cacatgatcn aaatcaaagg gcatttgggg aatccaggct gtgattcagg gaagttccaa 180 gtgtctgatg aagtgtttgt tttacatctt tgtgtccctt gcaggtctag cactgtgcta 240 tgtaggtaac atgtgctcc 259 <210> 100 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STAT1 Affymetrix annotation <400> 100 ctggatatat caagactgag ttgatttctg tgtctgaagt tcacccttct agacttcaga 60 ccacagacaa cctgctcccc atgtctcctg aggagtttga cgaggtgtct cggatagtgg 120 gctctgtaga attcgacagt atgatgaaca cagtatagag catgaatttt tttcatcttc 180 tctggcgaca gttttccttc tcatctgtga ttccctcctg ctactctgtt ccttcacatc 240 ctgtgtttct agggaaatga aagaaaggcc agcaaattcg ctgcaacctg ttgatagcaa 300 gtgaattttt ctctaactca gaaacatcag ttactctgaa gggcatcatg catcttactg 360 aaggtaaaat tgaaaggcat tctctgaaga gtgggtttca caagtgaaaa acatccagat 420 acacccaaag tatcaggacg agaatgaggg tcctttggga aaggagaagt taagcaacat 480 ctagcaaatg ttatgcataa agtcagtgcc caactgttat aggttgttgg ataaatcagt 540 ggttatttag ggaactgctt gacgtaggaa cggtaaattt ctgtgggag 589 <210> 101 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Proetin D MAGEA3 fuison protein <400> 101 Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15 Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30 Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45 Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp 50 55 60 Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80 Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 85 90 95 Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110 Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met 115 120 125 Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu 130 135 140 Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr 145 150 155 160 Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr 165 170 175 Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro 180 185 190 Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser 195 200 205 Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr 210 215 220 Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val 225 230 235 240 Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro 245 250 255 Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr 260 265 270 Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val 275 280 285 Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile 290 295 300 Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn 305 310 315 320 Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile 325 330 335 Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu 340 345 350 Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp 355 360 365 Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu 370 375 380 Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 385 390 395 400 Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His 405 410 415 Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His 420 425 430 Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His His 435 440 445 His His 450 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG 1826 <400> 102 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 103 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG 1758 <400> 103 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG 1758 <400> 104 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG 2006, CpG 7909 <400> 105 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG 1668 <400> 106 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 107 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val 1 5 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 108 Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 109 Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala 1 5 10 <210> 110 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 110 Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1 5 10 <210> 111 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 111 Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr 1 5 10 <210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 112 Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser 1 5 10 15 <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MAGE A3 peptide <400> 113 Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr 1 5 10

Claims (32)

  1. (a) 환자 유래 샘플을 본원 상세한 설명에 기재된 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 분석하는 단계; 및
    (b) 샘플이 유래된 환자를 상기 단계 (a)의 결과에 기반하여 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 단계로서, 상기 특성화 단계가 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행되는 단계를 포함하는, 환자를 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법.
  2. (a) 본원 상세한 설명에 기재된 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 환자 유래 샘플의 분석을 달성하는 단계로서, 그 결과는 환자를 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 것이고, 상기 특성화 단계가 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행되는 단계; 및
    (b) 환자가 면역치료제에 대한 반응자로서 특성화된 경우, 적합한 면역치료제의 1회 이상의 투여를 위해 환자를 선택하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  3. (a) 환자 유래 샘플을 수득하는 단계; 및
    (b) 환자 유래 샘플을 본원 상세한 설명에 기재된 표 1의 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 차별적인 발현에 대해 분석하는 단계로서, 그 결과로부터 상기 환자가 면역치료제에 대해 반응자 또는 비-반응자로서 특성화되는 것이 결정되고, 상기 특성화 단계가 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행되는 단계를 포함하는, 환자가 면역치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자인지를 결정하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1의 하나 이상의 유전자가 표 1에 나열된 적어도 63개의 유전자 또는 본원 상세한 설명의 표 2, 5 또는 7에 명시된 실질적으로 모든 유전자인 방법.
  5. 본원 상세한 설명의 표 1에 나열된 프로브 세트로서 그 표적 서열이 본원 상세한 설명의 표 3에 제시되어 있는 프로브 세트 중 하나 이상에 의해 인지된 유전자 생성물을 환자 유래 샘플에서 분석하는 것을 포함하는, 환자를 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법으로서,
    상기 특성화 단계가 표준 또는 트레이닝 세트에 대한 참조 또는 비교에 의해서 수행되거나 알고리듬의 파라메터가 표준 또는 트레이닝 세트로부터 수득된 알고리듬을 이용하여 수행되는, 환자를 치료제에 대한 반응자 또는 비-반응자로서 특성화하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 표 1의 하나 이상의 프로브 세트가 표 1에 나열된 적어도 74개의 프로브 세트 또는 표 2, 5 또는 7에 기재된 모든 프로브 세트인 방법.
  7. 제 1항 또는 제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 환자를 반응자로서 확인하는 단계 및 치료를 위해 환자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표준이 공지된 임상 결과를 각각 지니는 환자 또는 환자들로부터의 환자 유래 샘플 또는 샘플들인 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 치료가 암 면역치료제, 바람직하게는 흑색종 및/또는 폐암에 대한 암 면역치료제인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 암 면역치료제가 흑색종-관련 항원 유전자 (Melanoma-associated antigen gene (MAGE))인 방법.
  11. 제 10항에 있어서, MAGE 면역치료제가 MAGE A3 면역치료제인 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1의 하나 이상의 유전자가 표 1에 나열된 적어도 63개, 적어도 68개, 적어도 70개, 적어도 75개, 적어도 80개의 유전자 또는 실질적으로 모든 유전자 및/또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  13. 제 5항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1의 하나 이상의 프로브 세트가 표 1에 나열된 적어도 74개, 적어도 75개, 적어도 80개, 적어도 85개, 적어도 90개의 프로브 세트 또는 모든 프로브 세트 및/또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유전자가 이들의 정상적인 발현에 비해 상향조절되는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자의 80% 이상이 이들의 정상적인 발현에 비해 상향조절되는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 생성물이 상향조절되고/거나 하향조절되는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 유전자 생성물이 상향조절되고/거나 하향조절되는지를 결정하는 것이 반응자를 나타내는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자가 면역 관련 유전자인 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 유전자 생성물을 확인하기 위한 프로브의 이용을 포함하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현을 분석하기 위해 마이크로어레이 키트 또는 PCR의 이용을 포함하는 방법.
  21. 환자가 암 면역치료제와 같은 치료제에 대해 반응자 또는 비-반응자일지를 분석하기 위한, 본원 상세한 설명의 표 1에 기재된 적어도 63개의 유전자 또는 그로부터 생성된 데이터 또는 상기 표 1의 적어도 74개의 프로브 세트 또는 그로부터 생성된 데이터의 유전자 목록의 용도.
  22. 제 20항에 있어서, 유전자 목록이 표 1의 실질적으로 모든 유전자 또는 프로브 세트를 포함하거나 이로 구성된 용도.
  23. 본원 상세한 설명의 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이로서,
    표 1의 유전자에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브 또는 프로브 세트가 상기 마이크로어레이 상에 있는 프로브 또는 프로브 세트의 50% 이상을 구성하는, 마이크로어레이.
  24. 본원 상세한 설명의 표 1에 나열된 유전자로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 본원 상세한 설명의 표 2에 나열된 유전자의 유전자 생성물의 서열에 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 폴리누클레오티드 프로브를 포함하는 마이크로어레이.
  26. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위해, 발현을 측정하기 위한 수단, 예를 들어 본원 상세한 설명의 표 1에 나열된 유전자 중 하나 이상 또는 표 1에 나열된 유전자의 유전자 생성물의 mRNA 또는 cDNA 유전자 생성물에 하이브리드화되는 프로브를 포함하는 진단 키트.
  27. 종양 관련 항원을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 마이크로어레이 또는 제 26항의 진단 키트의 사용에 따라 반응자로서 특성화된 환자를 치료하는 방법.
  28. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 마이크로어레이 또는 제 26항의 진단 키트의 사용에 따라 반응자인 것으로 결정되거나 반응자로서 특성화된 환자를 치료하기 위한 종양 관련 항원을 포함하는 조성물.
  29. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항의 마이크로어레이 또는 제 26항의 진단 키트의 사용에 따라 반응자인 것으로 결정되거나 반응자로서 특성화된 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 종양 관련 항원을 포함하는 조성물의 용도.
  30. 제 27항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원이 MAGE 항원인 방법, 조성물 또는 용도.
  31. 제 27항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 애주번트를 추가로 포함하는 방법, 조성물 또는 용도.
  32. 본원 상세한 설명의 표 1에 나열된 적어도 63개의 유전자의 다수의 검출제에 결합된 솔리드 표면 (solid surface)으로서, 상기 검출제가 유전자의 발현 또는 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 검출할 수 있는, 솔리드 표면.
KR1020127009956A 2009-09-18 2010-09-17 환자가 면역치료제에 대한 반응자일지의 여부를 확인하는 방법 KR20130055553A (ko)

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