CN1330770C - 淀粉加工方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在将颗粒淀粉酶促水解成可溶性淀粉水解产物的方法，该方法在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行。

Description

淀粉加工方法
发明领域
本发明涉及在将颗粒淀粉水解成可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行。
发明背景
已经描述了许多将淀粉转化成淀粉水解产物、诸如麦芽糖、葡萄糖或特种糖浆的方法，这些水解产物既可以用作增甜剂、也可以用作诸如果糖这类其它糖的前体。还可以将葡萄糖发酵成酒精或其它发酵产物。
淀粉是由葡萄糖单位组成的高分子量聚合物。它通常由约80％的支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉为支链多糖，其中α-1，4D-葡萄糖残基的直链通过α-1，6糖苷键连接。
直链淀粉为由彼此通过α-1，4糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖单位构成的直链多糖。在将淀粉转化成可溶性淀粉水解产物的情况中，淀粉解聚。常用的解聚法由胶凝步骤和两个连续的工艺步骤、即液化工艺和糖化工艺组成。
颗粒淀粉由在室温下不溶于水的微观颗粒组成。当将含水淀粉浆加热时，颗粒溶胀且最终破裂，从而使淀粉分子分散于溶液中。在这种″胶凝″工艺过程中，粘度显著增加。当典型的工业化方法中固体浓度为30-40％时，必须使淀粉变稀或″液化″以便可以对其进行操作。目前主要通过酶促降解使粘度降低。在液化步骤过程中，α-淀粉酶将长链淀粉降解成较小的支链和直链单位(麦芽糖糊精)。液化步骤一般在约105-110℃下进行约5-10分钟、随后在约95℃下进行约1-2小时。然后使温度降至60℃，加入葡糖淀粉酶或β-淀粉酶和任选的脱支酶、诸如异淀粉酶或支链淀粉酶并使糖化步骤进行约24-72小时。
从上述讨论中显然可以看到常规的淀粉转化法因在各种步骤中对温度的需求而极其耗能。由此需要能够选择在该方法中所用的酶以便整个工艺可以在不必使淀粉胶凝的条件下进行。这类方法是US4591560、US4727026和US4009074以及EP0171218专利的主题。
本发明涉及将颗粒淀粉在低于该淀粉的起始胶凝温度的温度下转化成可溶性淀粉水解产物的一步法。
发明概述
本发明在第一个方面中提供了用于生产可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法包括使含水颗粒淀粉浆在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行下列酶活性的同时作用的步骤：第一种酶，它为第13族苷水解酶的成员、具有α-1.4-糖苷水解活性且包括第20族糖类结合成分(Carbohydrate-Binding Module Family 20)；和第二种酶，它为真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。
本发明在第二该方面中提供了基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)的生产方法，该方法包括使用本发明第一个方面的方法生产可溶性淀粉水解产物且进一步包括将该可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)的步骤。
本发明在第三该方面中提供了燃料酒精或可饮用酒精的生产方法，该方法包括使用本发明第一个方面的方法生产可溶性淀粉水解产物且进一步包括将该可溶性淀粉水解产物发酵成酒精的步骤，其中发酵步骤与颗粒淀粉的水解步骤同时或分别/依次进行。
发明详述
定义
应将术语″颗粒淀粉″理解为生未热制的淀粉(raw uncooked starch)，即未进行胶凝的淀粉。淀粉作为微小的不溶于水的颗粒在植物中形成。这些颗粒在低于起始胶凝温度的温度下在淀粉中得到保护。当放入冷水中时，这些颗粒可以吸收少量液体。在高达50℃-70℃下，溶胀是可逆的，可逆性的程度取决于特定的淀粉。在较高的温度下，称作胶凝的不可逆溶胀开始发生。
应将术语″起始胶凝温度″理解为淀粉开始胶凝的最低温度。淀粉在60℃-70℃之间开始胶凝，确切的温度取决于具体的淀粉。起始胶凝温度取决于所加工淀粉的来源。小麦的起始胶凝温度约为52℃，马铃薯的起始胶凝温度约为56℃，而玉米的起始胶凝温度约为62℃。然而，淀粉原始的质量随特定植物种类的和生长条件的不同而改变且由此应对每批淀粉测定起始胶凝温度。
应将″可溶性淀粉水解产物″理解为本发明方法的可溶性产物且可以包括单糖类、二糖类和寡糖类，诸如葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、环糊精及其任意的混合物。优选将至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的颗粒淀粉干固体转化成可溶性淀粉水解产物。
术语″特制糖浆″是本领域众所周知的术语且通过DE和糖类光谱表征(参见教科书″Molecular Structure and Function of Food Carbohydrate″中p.50+上的文章″新特制的葡萄糖浆″，G.G.Birch和L.F.Green编辑，AppliedScience Publishers LTD.，London)。一般来说，特制糖浆具有35-45范围的DE。
在本发明的上下文中，将″第13族苷水解酶″定义为包括具有(β/α)8或TIM桶(barrel)结构且通过α-保留反应机制对淀粉和相关底物起作用的催化结构域的水解酶族(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc 28，416-436)。
在本发明的上下文中，将具有″α-1.4-糖苷水解活性″的酶定义为包括由定义的Takata(Takata等，1992，J.Biol.Chem.267，18447-18452)和Koshland(Koshland，1953，Biol.Rev.Camp.Philos.Soc 28，416-436)催化α-1.4-糖苷键水解和/或合成的酶族。
在本发明的上下文中，将″第20族糖类结合成分″或CBM-20成分定义为与Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.19：1027-1031图1中公开的多肽的糖类结合成分(CBM)具有至少45％同源性的约100个氨基酸的序列。CBM包括该多肽的最末的102个氨基酸，即来自第582位氨基酸-第683位氨基酸的亚序列。
(a)属于第13族苷水解酶族成员、(b)具有α-1.4-糖苷水解活性且(c)包括第20族糖类结合成分，并且为本发明特别关注的酶包括分类为EC 2.4.1.19的酶、即环糊精葡聚糖转移酶和EC 3.2.1.1 33、即生麦芽糖α-淀粉酶和3.2.1.1α-淀粉酶和3.2.1.60麦芽四糖形成淀粉酶中的选择成员。
通过在与淀粉一起保温过程中按照Wind，R.D.等1995在Appl.Environ.Microbiol.61：1257-1265所述测定还原能力(reducing power)的增加来确定CGTases和生麦芽糖α-淀粉酶的″水解活性″。使用Bernfield(Bernfield，P.1955.Amylases alpha and beta.Methods Enzymol.1：149-158)的二硝基水杨酸法经适当修改来测定还原糖的浓度。在60℃下将稀释的酶与1％(wt/v)可溶性淀粉(来自荷兰Avebe的Paselli SA2淀粉或可以选择来自Merck的可溶性淀粉)一起在10mM柠檬酸钠(pH5.9)缓冲液中保温适当时间期限。将一个单位的水解活性定义为在标准条件下每分钟产生1微摩尔麦芽糖的酶量。
将在本说明书中涉及的多肽″同源性″理解为表示第一种序列从第二种序列衍生的两种序列之间的同一性程度。可以通过本领域中公知的计算机程序适当测定同源性，诸如GCG程序包中提供的GAP(Wisconsin Package程序手册，Version 8，8月，1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453。使用下列对多肽序列比较的设定：GAP生成补偿(penalty)3.0且GAP扩展补偿为0.1。
环糊精葡聚糖转移酶(CGTases)
用作本发明方法中的第一种酶的具体酶可以为环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(E.C.2.4.1.19)、也称作环糊精葡聚糖转移酶或环糊精糖基转移酶，在下文中称作CGTase，它通过分子内转糖基反应将淀粉和相似底物催化转化成环麦芽糖糊精，由此形成各种大小的环麦芽糖糊精。大部分CGTases既具有转糖基活性、又具有降解淀粉的活性。所关注的CGTases优选来源于微生物且最优选来源于细菌。特别关注的CGTases包括：与WO02/06508中SEQ ID NO：2的第1-679位氨基酸所示序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的CGTases；与Joergensen等1997在Biotechnol.Lett.19：1027-1031图1中公开的多肽氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同源性的CGTases；以及US5278059和US5545587中所述的CGTases。优选作为所述方法第一种酶使用的CGTase具有的水解活性至少为3.5、优选至少为4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或最优选至少为23微摩尔/分钟/mg。可以加入0.01-100.0 NU/g DS、优选0.2-50.0NU/g DS、优选10.0-20.0 NU/g用量的DS CGTases。
生麦芽糖α-淀粉酶
用作本发明方法的第一种酶的另一种具体酶为生麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。生麦芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麦芽糖水解酶)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。此外，生麦芽糖α-淀粉酶能够水解麦芽三糖和环糊精。特别关注的生麦芽糖α-淀粉酶可以来源于芽孢杆菌属的种类、优选来源于嗜热脂肪芽孢杆菌、最优选来源于诸如描述在EP120.693中的嗜热脂肪芽孢杆菌C599。这种特定的生麦芽糖α-淀粉酶具有如US6162628中SEQ ID NO：1的第1-686位氨基酸所示的氨基酸序列(即本申请文件序列表的SEQ ID NO：5)。优选的生麦芽糖α-淀粉酶含有的氨基酸序列与US6162628中SEQ ID NO：1的第1-686位氨基酸具有至少70％的同一性、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特别是至少99％的同一性。最优选的生麦芽糖α-淀粉酶的变体包括WO99/43794中公开的变体。
含有如US6162628中SEQ ID NO：1的第1-686位氨基酸所示的氨基酸序列的生麦芽糖α-淀粉酶具有714的水解活性。优选用作本发明方法第一种酶的生麦芽糖α-淀粉酶具有至少3.5、优选至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、100、200、300、400、500、600或最优选至少700微摩尔/分钟/mg的水解活性。
可以加入0.01-40.0 MANU/g DS、优选0.02-10 MANU/g DS、优选0.05-5.0 MANU/g用量的生麦芽糖α-淀粉酶。
真菌α-淀粉酶
用作本发明方法第二种酶的具体酶为真菌α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)，诸如芬加密尔样(Fungamyl-like)α-淀粉酶。在本说明书中，术语″芬加密尔样α-淀粉酶″指的是表现出与WO96/23874的SEQ ID No.10中所示氨基酸序列具有高度同源性、即与WO96/23874的SEQ ID No.10中所示氨基酸序列具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％以上同源性的α-淀粉酶。可以加入0.001-1.0 AFAU/g DS、优选0.002-0.5 AFAU/g DS、优选0.02-0.1 AFAU/g DS用量的真菌α-淀粉酶。
β-淀粉酶
用作本发明方法中的第二种酶的另一种具体酶为β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。β-淀粉酶是一般对起外切作用的麦芽淀粉酶给予的名称，它催化直链淀粉、支链淀粉和相关葡萄糖聚合物上的1，4-α-糖苷键的水解。
已经从各种植物和微生物中分离了β-淀粉酶(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。这些β-淀粉酶的特征在于具40℃-65℃范围的最佳温度和4.5-7.0范围的最佳pH。关注的β-淀粉酶包括来自大麦SpezymeBBA 1500、SpezymeDBA和OptimaltTM ME的β-淀粉酶、来自Genencor int的OptimaltTM BBA以及来自Novozymes A/S的NovozymTM WBA。
葡糖淀粉酶
用作本发明方法中的第二种酶的另一种具体酶也可以为来源于微生物或来源于植物的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。优选来源于真菌或细菌的葡糖淀粉酶，它们选自曲霉属葡糖淀粉酶、特别是黑色曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)或其诸如公开在WO92/00381和WO00/04136中的变体、泡盛曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)、米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)或其变体或片段组成的组。
其它关注的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括提高热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prof.Engng.9，499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8，575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704；和A435和S436位上导入的Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10，1199-1204。此外，Clark Ford在1997年10月17日的ENZYMEENGINEERING 14，Beijing/China 10月，12-17，97，摘要文集p.0-61中提供了为论文。该摘要中提出了为改善热稳定性而在泡盛曲霉葡糖淀粉酶中G137A、N20C/A27C和S30P位上的突变。其它关注的葡糖淀粉酶包括Talaromyces葡糖淀粉酶，特别是来源于Talaromycesemersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(US patent no.Re.32，153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(US patent no.4,587,215)的葡糖淀粉酶。关注的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭状芽孢杆菌属、特别是C.thermoamylolyticum(EP135，138)和热硫化氢热厌氧杆菌(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。优选的葡糖淀粉酶包括来源于黑曲霉的葡糖淀粉酶，诸如与WO00/04136的SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列(即本申请文件序列表的SEQ ID NO：6)具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％乃至90％同一性的葡糖淀粉酶。另外关注的是商品AMG 200L、AMG 300L、SANTM SUPER和AMGTM E(来自Novozymes)、OPTIDEXTM 300(来自Genencor Int.)、AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)、G-ZYMETMG900(来自Enzyme Bio-Systems)、G-ZYMETM G990 ZR(黑色曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。
可以加入0.02-2.0 AGU/g DS、优选0.1-1.0 AGU/gDS、诸如0.2 AGU/gDS用量的葡糖淀粉酶。
其它酶
还可以在有第三种酶存在的情况下实施本发明的方法。具体的第三种酶可以为芽孢杆菌属的α-淀粉酶(通常称作″透阿米尔样(Termamyl-like)α-淀粉酶″)。众所周知的透阿米尔样α-淀粉酶包括来源于地衣形芽孢杆菌(作为透阿米尔商购)、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌菌株α-淀粉酶的α-淀粉酶。其它透阿米尔样α-淀粉酶包括来源于全部具体描述在WO95/26397中的芽孢杆菌属种类NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375菌株的α-淀粉酶和由Tsukamoto等在Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31中描述的α-淀粉酶。在本发明的上下文中，透阿米尔样α-淀粉酶为WO99/19467中第3页第18行至第6页第27行上定义的α-淀粉酶。关注的变体和杂种描述在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中。特别关注含有突变I181*+G182*+N193F的重组嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体。可以加入本领域技术人员众所周知的有效量的芽孢杆菌属α-淀粉酶。
所述方法中的另一种第三种具体酶可以为脱支酶，诸如异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精上的α-1，6-D-糖苷支化键且可以在不能与出芽短梗霉聚糖发生化学反应和在对α-极限糊精的有限作用方面不同于支链淀粉酶。可以加入本领域技术人员众所周知的有效量的脱支酶。
本发明的实施方案
用于实施本发明方法的淀粉浆可以含有20-55％的干固体颗粒淀粉、优选25-40％的干固体颗粒淀粉、更优选30-35％的干固体颗粒淀粉。
在实施本发明第-个方面的方法后，至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或优选99％的干固体颗粒淀粉被转化成可溶性淀粉水解产物。
本发明第一个和第二个方面的方法在低于起始胶凝温度的温度下进行。优选实施该方法的温度至少为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、5 1℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或优选至少60℃。
实施本发明第一个方面的pH可以在3.0-7.0、优选3.5-6.0或更优选4.0-5.0的范围。
本发明第一个方面的方法中的产物可溶性淀粉水解产物的确切组成取决于所用酶的组合和所加工的颗粒淀粉的类型。优选可溶性水解产物为具有至少85％、90％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％纯度的麦芽糖。甚至更优选可溶性淀粉水解产物为葡萄糖且最优选淀粉水解产物具有至少94.5％、95.0％、95.5％、96.0％、96.5％、97.0％、97.5％、98.0％、98.5、99.0％或99.5％的DX(溶解的干固体中葡萄糖的百分比)。不过，同样关注的是本发明方法中的产物可溶性淀粉水解产物为特制糖浆(specialty syrup)的方法，所述的特制糖浆诸如含有葡萄糖、麦芽糖、DP3和DPn的混合物的用于冰淇淋、蛋糕、糖果、水果罐头的特制糖浆。
本发明方法中加工的颗粒淀粉特别可以获自块茎、根、茎、豆类、谷类或全谷物。更具体地说，颗粒淀粉可以获自玉米、玉米穗轴(cobs)、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁(milo)、西米(sago)、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、高梁、稻、豌豆、豆、香蕉或马铃薯。特别关注蜡类和非蜡类玉米和大麦。所加工的颗粒淀粉可以具有为高度精制的淀粉质量、优选纯度高于90％、95％、97％或99.5％或其可以为含有包括磨碎的全谷物的物质的更粗的淀粉，所述的磨碎的全谷物包括非淀粉部分，诸如胚芽残余部分和纤维。磨碎诸如全谷物这样的粗物质是为了使结构开放并进行进一步加工。本发明优选两种研磨法：湿磨和干磨。在干磨法中，磨碎完整的谷粒并使用。湿磨法可以使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)得到良好分离且该方法可以用于除少数情况外的任意生产糖浆中使用淀粉水解产物的情况。干磨和湿磨是淀粉加工领域中众所周知的且同样关注本发明的方法。本发明的第一个方面的方法可以在超滤***中进行，其中回流液保持在有酶。生淀粉(raw starch)和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。同样关注在带有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。还关注在带有微滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
在本发明第二个方面的方法中，将本发明第一个方面方法中的可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆(HFSS)，诸如高果糖玉米浆(HFCS)。优选使用葡萄糖异构酶且更优选通过固相支持体上支持的固定化葡萄糖异构酶进行这种转化。关注的异构酶包括来自Novozymes A/S的商品SweetzymeTM IT、来自Rhodia的G-zymeTM IMGI和G-zymeTM G993、KetomaxTM和G-zymeTM G993、来自Genemcor Int的G-zymeTM G993液体和GenSweetTM。
在本发明第三该方面的方法中，本发明第一个方面方法中的可溶性淀粉水解产物用于生产燃料酒精或可饮用酒精。在第三个方面的方法中，发酵可以与颗粒淀粉浆的水解同时或分别/依次进行。当发酵与水解同时进行时，温度优选在30℃-35℃且更优选在31℃-34℃。本发明第三个方面的方法可以在超滤***中进行，其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。同样关注在带有超滤膜的连续膜反应器中进行的方法且其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
材料和方法
α-淀粉酶活性(KNU)
使用马铃薯淀粉作为底物测定淀粉分解活性。该方法基于酶对改性的马铃薯淀粉的分解且在该反应后浆淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。开始形成蓝黑色，但在淀粉分解的过程中，蓝色变浅且逐步变成浅红棕色，将其与有色玻璃标准品比较。
将一个Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003 M Ca2+；和pH5.6下)使5.26g可溶性淀粉干物质糊精化的酶用量。
更具体地描述这种分析方法的文件AF 9/6获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
CGTase活性(KNU)
通过使用Phadebas片作为底物测定CGTase α-淀粉酶活性。Phadebas片(Phadebas淀粉酶试验，由Pharmacia Diagnostic提供)含有已经与牛血清清蛋白和缓冲物质混合的交联不溶性蓝色淀粉聚合物。
对每次单一测定而言，将一片悬浮于含有5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液(50mM乙酸、50mM磷酸、50mM硼酸、0.1mMCaCl2，用NaOH将pH调节至有意义的值)的管中。该试验在所关注温度下的水浴中进行。用x ml的50mM Britton-Robinson缓冲液稀释所测试的α-淀粉酶。将1ml这种α-淀粉酶溶液加入到5ml 50mM Britton-Robinson缓冲液中。用α-淀粉酶水解淀粉，得到可溶性蓝色部分。在620nm处通过分光光度法测定的所得蓝色溶液的吸收度为α-淀粉酶活性的函数。
重要的是在保温10或15分钟(测试时间)后测定的620nm处吸收度在620nm处为0.2-2.0吸收度范围。在该吸收度范围内，活性与吸收度之间呈线性关系(Lambert-Beer定律)。由此必须调节酶稀释液以适合这种标准。在一组具体条件(温度、pH、反应时间、缓冲液条件)下，1mg指定的α-淀粉酶会水解一定量的底物且产生蓝色。在620nm处测定颜色强度。测定的吸收度与所述α-淀粉酶的特异性活性(活性/mg纯α-淀粉酶蛋白)在指定的一组条件下成正比。
更具体地描述这种分析方法的文件EAL-SM-0351获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
生麦芽糖α-淀粉酶活性(MANU)
将一个麦芽淀粉酶Novo单位(MANU)定义为在标准条件下每分钟裂解1微摩尔麦芽三糖的酶量。标准条件为10mg/ml麦芽三糖、37℃、pH5.0和30分钟反应时间。在形成NADH的条件下用葡萄糖脱氢酶(GlucDH，Merck)将形成的葡萄糖将转化成葡糖酸内酯，在340nm处通过分光光度法测定。更具体地描述这种分析方法的文件(EAL-SM-0203.01)获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
葡糖淀粉酶活性(AGU)
将Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在37℃和pH4.3下每分钟裂解1微摩尔麦芽糖的酶量。
用使用来自Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid试剂盒的(AEL-SM-0131，根据需要从Novozymes得到)后修改的方法将活性测定为AGU/ml。标准品：AMG-标准品，批号7-1195，195 AGU/ml。在37℃下将375microL底物(在50mM乙酸钠中的1％麦芽糖，pH4.3)保温5分钟。加入用乙酸钠稀释的25microL酶。10分钟后通过添加100microL 0.25MNaOH使反应终止。将20microL转入96孔微量滴定板并加入200microLGOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。在室温下30分钟后，在650nm处测定吸收度并根据AMG-标准品计算按AGU/ml计的活性。更具体地描述这种分析方法的文件(AEL-SM-0131)根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
真菌α-淀粉酶活性(FAU)
以FAU(真菌α-淀粉酶活性单位)测定α-淀粉酶活性。一个单位(1)FAU为在标准条件(即在37℃和pH4.7下)下每小时分解5260mg固体淀粉(Amylum solubile，Merck)的酶量。更具体地描述这种分析方法的文件AF9.1/3根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
酸性α-淀粉酶活性(AFAU)
以AFAU(酸性真菌α-淀粉酶活性单位)测定酸性α-淀粉酶活性，将它们对比酶标准品测定。
所用的标准品为AMG 300L(来自Novozymes A/S，葡糖淀粉酶野生型黑色曲霉G1，还公开在Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102WO92/00381中)。在这种AMG中的中性α-淀粉酶在室温下储存3周后从约1 FAU/mL下降至0.05 FAU/mL以下。
按照下列描述测定这种AMG标准品中的酸性α-淀粉酶活性。在这种方法中，将1个AFAU定义为在标准条件下每小时使5.26mg淀粉干固体降解的酶量。
碘与淀粉、而不与其降解产物形成蓝色复合物。颜色强度由此与淀粉浓度成正比。使用反相比色法将淀粉酶活性测定为在具体分析条件下淀粉浓度的下降。
α-淀粉酶
淀粉+碘→糊精+寡糖类
40℃，pH2.5
蓝色/紫色t＝23秒    脱色
标准条件/反应条件：(每分钟)
底物        淀粉，约0.17g/L
缓冲液      柠檬酸盐，约0.03M
碘(I)：     0.03g/L
CaCl2：     1.85mM
pH：        2.50-0.05
保温时间：  40℃
反应时间：  23秒
波长：      λ＝590nm
酶浓度：    0.025AFAU/mL
酶工作范围：0.01-0.04AFAU/mL
如果优选其它具体内容，则可以根据需要在从获自Novozymes A/S的EB-SM-0259.02/01中找到它们并将它们引入作为参考。
β-淀粉酶活性(DP°)
用糖化力(DP)程度表示SPEZYMEBBA 1500的活性。它是当在20℃下将样品与100ml底物一起保温1小时时产生足以还原5ml费林氏溶液的还原糖类的0.1ml 5％酶制品样品溶液中含有的酶量。
支链淀粉酶活性(新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)
相对出芽短梗霉聚糖底物测定支链淀粉酶活性。出芽短梗霉聚糖是主要由通过1，6-α-键连接的麦芽三糖基单位组成的直链D-葡萄糖聚合物。内切-支链淀粉酶随机水解1，6-α-键，释放麦芽三糖、63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖、63-α-(63-α-麦芽三糖基-麦芽三糖基)-麦芽三糖。
一个新支链淀粉酶单位Novo(NPUN)为内切-支链淀粉酶活性单位且对比Novozymes A/S Promozyme D标准品测定。标准条件为在40℃和pH4.5下的30分钟反应时间和将0.7％出芽短梗霉聚糖用作底物。在510nm出通过分光光度法测定红色底物降解产物的量且该量与样品中的内切-支链淀粉酶活性成正比。更具体地描述这种分析方法的文件(EB-SM.0420.02/01)根据需要获自Novozymes A/S，Denmark，将该文件包括在本文中作为参考。
在标准条件下，一个NPUN约等于释放具有等于2.86微摩尔葡萄糖/分钟还原力的还原糖的酶量。
CGTase水解活性的测定
通过如Wind等1995在Appl.Environ.Microbiol.61：1257-1265中所述测定与Paselli SA2淀粉(来自Avebe，The Netherlands)一起保温过程中还原力的增加来确定CGTase的水解活性。
糖分布和溶解的干固体的测定
通过HPLC测定淀粉水解产物中的糖组成且随后将葡萄糖产率计算为DX。通过测定折射率来确定淀粉水解产物中溶解的(可溶性)干固体°BRIX。
材料
使用下列酶活性。生麦芽糖α-淀粉酶含有WO9/943794的SEQ ID No：1中所示的氨基酸序列。葡糖淀粉酶来源于含有WO00/04136的SEQ ID No：2中所示氨基酸序列或公开的变体之一的黑曲霉。酸性真菌α-淀粉酶来源于黑色曲霉。芽孢杆菌属α-淀粉酶为含有突变I181*+G182*+N193F的重组嗜热脂肪芽孢杆菌变体。真菌α-淀粉酶来源于米曲霉。CGTase O含有如本文SEQ ID NO 2所示的序列。CGTaseT含有Joergensen等(1997)在Biotechnol.Lett.19：1027-1031中的图1中所公开和本文SEQ ID NO 3中所示的氨基酸序列。CGTase A含有如本文SEQ ID NO 4中所示的序列。
普通玉米淀粉(Cx PHARM 03406)获自Cerestar。
实施例1
本实施例解释了使用CGTase T和葡糖淀粉酶以及酸性真菌淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。通过在搅拌条件下将247.5g常用的玉米淀粉加入到502.5ml水中制备具有33％干固体(DS)颗粒淀粉浆。用HCl将pH调节至4.5。使颗粒淀粉浆分布于100ml蓝盖烧瓶中，每只烧瓶含有75g。在磁性搅拌的同时将烧瓶在60℃的水浴中保温。在0小时时对烧瓶给予表1中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品。
表1.所用的酶活性水平为：
    CGTase TKNU/kg DS     葡糖淀粉酶AGU/kg DS     酸性真菌α-淀粉酶AFAU/kg DS
    12.5     200     50
    25.0     200     50
    100.0     200     50
使用下列方法测定总固体淀粉。通过加入过量的α-淀粉酶(300 KNU/Kg干固体)且随后将样品置于95℃下的油浴中45分钟使淀粉完全水解。在通过0.22microM滤膜过滤后，通过测定折射率来确定干固体。
在通过0.22microM滤膜过滤后对样品测定淀粉水解产物中的可溶性干固体。通过测定折射率确定可溶性干固体且通过HPLC测定糖分布。将葡萄糖的量计算为DX。结果如表2和3中所示。
表2.在三种CGTase活性水平下可溶性干固体占总干物质的百分比。
KNU/kgDS 24小时 48小时   72小时     96小时
12.5 68 82   89     94
25.0 76 89   93     97
100.0 83 96   98     99
表3.在三种CGTase活性水平下可溶性水解产物的DX。
KNU/kgDS 24小时 48小时     72小时     96小时
12.5 92.6 94.5     95.1     95.3
25.0 92.4 94.8     95.4     95.5
100.0 92.7 94.9     95.4     95.4
实施例2
本实施例解释了使用CGTase T、葡糖淀粉酶、酸性真菌α-淀粉酶和芽孢杆菌α-淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述制备保温。在0小时时对烧瓶给予表4中给出的酶活性。
表4.所用的酶活性水平为：
  CGTase TKNU/kg DS     葡糖淀粉酶AGU/kg DS   酸性真菌α-淀粉酶AFAU/kg DS     芽孢杆菌α-淀粉酶KNU/kg DS
  5.0     200   50     300
在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析。结果如表4和5中所示。
表5.可溶性干固体占总干物质的百分比。
    24小时     48小时   72小时   96小时
    82.8     93.0   96.3   98.7
表6.可溶性水解产物的DX。
    24小时     48小时     72小时     96小时
    92.8     94.9     95.5     95.8
实施例3
本实施例解释了使用生麦芽糖α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表6中给出的酶活性。
表6.所用的酶活性水平为：
   生麦芽糖α-淀粉酶MANU/kgDS     葡糖淀粉酶AGU/kg DS     酸性真菌α-淀粉酶AFAU/kg DS
    烧瓶1    5000     200     50
    烧瓶2    20000     200     50
在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析。结果如表7和8中所示。
表7.在两种生麦芽糖α-淀粉酶的活性水平下可溶性干固体占总干物质的百分比。
MANU/kgDS     24小时     48小时     72小时     96小时
500020000     63.167.0     7577.9     79.382.7     85.388.1
表8.在两种生麦芽糖α-淀粉酶的活性水平下可溶性水解产物的DX。
MANU/kgDS     24小时     48小时     72小时     96小时
500020000     95.293.8     95.494.9     95.394.9     95.594.8
实施例4
本实施例解释了使用葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶仅将部分颗粒淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表9中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品。如实施例1中所述分析样品。结果如表10和11中所示。
表9.所用的酶活性水平为：
    葡糖淀粉酶AGU/kg DS     酸性真菌α-淀粉酶AFAU/kg DS
    200     50
表10.可溶性干固体占总干物质的百分比。
    24小时   48小时     72小时   96小时
    28.5   36.3     41.6   45.7
表11.可溶性水解产物的DX。
    24小时     48小时     72小时     96小时
    27.7     34.9     39.2     42.2
实施例5
本实施例解释了作为可溶性干固体和DX出现所测定的在使用CGTase和葡糖淀粉酶将颗粒淀粉转化成葡萄糖浆的过程中4种不同的CGTases(CGTase A、CGTase N、CGTase O和CGTase T)与产率之间的相关性。
准备好含有33％DS颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时全部给予100KNU/kg DS的CGTases与200AGU/kg DS的葡糖淀粉酶。在48小时时抽取样品并如实施例1中所述进行分析。将结果列在表12中。
表12.水解活性(微摩尔/分钟/mg蛋白质)以及48小时后的可溶性干固体(DS)和DX
    CGTase     水解活性     可溶性DS     DX
    CGTase N     0.27     37.4     35.1
    CGTase A     0.38     49.9     46.7
    CGTase O     1.62     60.9     57.1
    CGTase T     4.59     97.9     91.2
实施例6
本实施例解释了在超滤***中进行的所述方法，其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。在带有管状膜组件(PU 120型)的分批超滤***(PCI型)中处理包括悬浮于233 L城市自来水的100kg颗粒玉米淀粉和CGTase T(12.5KNU/kg淀粉)、芽孢杆菌α-淀粉酶(300KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(200AGU/kg淀粉)的浆。以100rpm搅拌该淤浆，使用170mL的30％HCl将pH调节至4.5并将反应温度设定在57℃。
分析透过物和回流液样品中的干固体含量和糖的组成。
不溶性物质的校正因子为：q＝(100-S％)/(100-BRIX)。糖的离心指数为：ciS％＝BRIX/S％(未校准)。糖(葡萄糖)的理论产率S产率＝ciS％*q*100/111*100％。由此对100kg淀粉进行校正，作为水解反应的结果得到约111kg葡萄糖干物质。
使用相同的酶***在单程***中进行试验作为膜试验。作为比较，表15a和b中显示膜***先于达到淀粉的最大溶出。
表13.回流液和透过物中干固体含量和糖组成
  样品   小时   反应器体积，L   ％DS   ％DP1   ％DP2   ％DP3   ％DP4
  反应器   3   207   16.1   75.3   10.3   2.6   11.5
  反应器   28   123   28.3   95.0   2.7   0.8   1.5
  反应器   53   123   31.4   95.2   3.4   0.5   0.9
  透过物   3   207   12.1   71.2   17.4   2.9   8.5
  透过物   28   123   21.8   94.9   2.9   0.8   1.3
表14.3、28、53和77小时时回流液中的干固体分布。
3小时 28小时 53小时 77小时
可溶性DS 16 28 31 39
总DS 38 37 42 45
表15a.膜***的葡萄糖理论产率与时间的关系
  小时     反应器中的总DS％     °BRIX    q＝(100-S％)/(100-°BRIX) cis％＝°Brix/S％ 理论产率sis＝cis*q*100/111％
  0     27.0     2.2    0.75 0.08  5
  24     35.9     27.3    0.88 0.76  73
  48     41.2     30.0    0.84 0.73  89
  72     41.2     33.1    0.88 0.80  98
  94     41.2     34.8    0.90 0.85  103
表15b.分批反应器***中的葡萄糖的理论产率与时间的关系。
   小时     反应器中的总DS％     °BRIX     q＝(100-S％)/(100-°BRIX)   cis％＝°Brix/S％ 理论产率sis＝cis*q*100/111％
    0     29.7     2.0     0.72   0.07 4
    24     29.7     25.6     0.95   0.86 74
    48     29.7     28.8     0.99   0.97 86
    72     29.7     29.8     1.00   1.00 91
    94     29.7     29.8     1.00   1.00 91
结论为：当在膜***中糖化过程中维持底物饱和时，溶解度与用于对生淀粉进行冷糖化的简单分批反应***相比得到改善。
实施例7
本实施例解释了在使用陶瓷组件的连续工作微滤膜反应器中同时进行的本发明冷液化和糖化过程。
使200L进料混合器罐通过反应器进料泵与带有温控的200L反应器罐连接。使用具有0-20I/小时容量的泵使来自反应器的混合物通过用于分离葡萄糖的APV陶瓷微量过滤组件再循环。孔大小为0.2微米且膜的面积为0.2m2。
反应器使用100KNU/kgDS CGT-ase T和300AGU/kg DS的葡糖淀粉酶的剂量工作约200小时。使用35-45小时的反应器中的平均保持时间，***以稳态运转整个期限而产生DP1＝93％葡萄糖浆，产率接近100％。
在搅拌下给反应器罐加载悬浮于140L 58℃城市自来水中的60kgCerestar Cx PHARM 03406型玉米淀粉。使用蒸汽加热的罩将温度调节至60℃。使用30％HCl使pH从6.1降至4.5。15分钟后再次检查pH(pH＝4.5)。在0小时时，加入酶CGTase T(100KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(300 AGU/kg淀粉)前立即取样用于测定在台式离心机中以3000rpm离心3分钟后的淤渣体积％。此外，使用折射计测定上清液中的BRIX。反应过程后定期如上所述测定淤渣体积和上清液中的BRIX。
给进料混合器罐加载186L冷城市自来水和80kg Cerestar Cx PHARM03406型玉米淀粉。保持对进料混合器的缓慢搅拌并用30％HCl将pH调节至4.5。使用冷却水将温度保持在7-8℃并加入酶CGTase T(100 KNU/kg淀粉)和葡糖淀粉酶(300 AGU/kg淀粉)。确保低温以便不发生反应。
连续突然开启(upstart)反应器至30小时后的°Brix-值稳定在27左右。然后使用0.15Bar的压降和确保这一压力的最大回流液流动启动微量过滤。使滤液再循环至反应器罐第一个5.7小时。此后在分离罐中收集滤液并将体积测定为时间的函数。在这一时间点处启动反应器进料泵并调节至流速等同于滤液流量(L/分钟)。通过实施该步骤使反应器罐内的体积保持恒定。
连续使淀粉浆进料，同时如上所述取样。此外，取滤液样品。通过增加回流液流量补偿任何滤液流量的下降，由此破碎膜上的滤饼。从而使压降也增加。将样品看作HPLC和BRIX滤液的时间的函数并测定收集的体积。同时从反应器中取样用于测定总DS、淤渣、°Brix并对糖组成进行HPLC。
本试验持续220小时。在该时间点时，压降增加至约0.4Bar。
作为加工时间函数测定的滤液流量(基于单次测定)和平均滤液流量值(积分的)显示由CGTase和葡糖淀粉酶组成的酶***在长加工时间内得到单独维持和确保稳定流量。这一结果强调了这种稳定***的潜在工业化优势。
将结果和物料衡算列在表16-18中。
表16.对收集的滤液的分析。
日期和时间   从开始的小时数    收集的滤液，L   ％DSw/w   密度，kg/L     DS的质量kg   平均流量mL/分钟
13/03/0216:05   30*    -   -   -     -   -
14/03/0216:50   55    142   25.8   1.12     41.1   95.6
16/03/0216:00   102    187   25.6   1.12     53.7   66.1
18/03/0213:02   147    200   28.7   1.14     65.2   74.0
19/03/0216:45   174    100   29.6   1.14     33.8   60.1
总体收集    629.0   27.3   1.13     193.7   -
*开始连续给反应器进料
表17.产生的糖浆的组成
    ％DP1     ％DP2     ％DP3     ％DP4
    93     5     1     2
表18.实施例7试验的物料衡算
  质量，kg     ％DS   DS的质量，kg DS*的产率％
    开启反应器
    淀粉   60     90   54 25
    水   140     0   0
    反应器开启   200     27.0   54 25
连续生产
淀粉消耗(t＝28.75小时-t＝174.5小时) 235.48     90     212     100
水消耗(t＝28.75小时-t＝174.5小时) 548.12     0     0
底物消耗 783.6     27.0     212     100
糖浆产量 629.0     27.3     172     81
结束时的反应器
总含量     200     35     70     33
未转化的淀粉     18     50     9     4
Mud，L     18     50     9     4
葡萄糖浆     164     30     49     23
*连续生产时的基本底物消耗。
与搅拌的简单罐中进行的分批试验相比，使用上述水解颗粒淀粉的设定值使反应时间得到显著减少。如果使用30％DS没有遇到粘度问题，那么认为使DS增加至40％，乃至45％高且仍然维持稳定操作是切实可行的。
实施例8
本实施例比较了用于从干磨碎的玉米形式的生淀粉Yellow Dent No.2生产燃料酒精或可饮用酒精的本发明方法和常规方法。
在250ml蓝盖烧瓶中用自来水制备干磨玉米的30％DS淤浆并用本发明方法使粗玉米淀粉同时接触冷液化和糖化。将该淤浆在磁性搅拌的水浴中加热至60℃，使用30％HCl将pH调节至4.5并加入CGTase T(75 KNU/kgDS)和葡糖淀粉酶(500 AGU/kg DS)。48小时后，将烧瓶在水浴中冷却至32℃。
使干磨玉米的30％DS淤浆在由预液化容器、喷射式蒸煮器、闪蒸器(flash)和液化后容器组成的常规连续工艺中预液化。在70-90℃下的预液化过程中加入芽孢杆菌α-淀粉酶(10KNU/kg DS)且在约85-90℃的液化后过程中再加入芽孢杆菌α-淀粉酶(20KNU/kg DS)。在115-120℃下进行喷射式蒸煮。在磁性搅拌下通过在水浴中的蓝盖烧瓶中将醪液加热至60℃进行预糖化。在使用30％HCl将pH调节至4.5后，加入剂量等于500AGU/kg DS的葡糖淀粉酶。48小时后，将烧瓶在水浴中冷却至32℃。
在安装了酵母锁的充入大豆油的蓝盖烧瓶中直接进行发酵。加入等于1千万/mL活酵母细胞的用量的Bakers酵母(啤酒糖酵母)并将0.25％脲形式的酵母营养物加入到每一烧瓶中。每次处理均按一式三份进行。
通过如在定期间隔称重烧瓶所测定的CO2消耗监测发酵。然后使用下列公式计算L EtOH/100kg谷物干物质(DS)：
Figure C0380398600271
醪液含有30％w/w谷物干物质。0.79g/mL为酒精密度。
表19和20中显示了一式两份的发酵结果，包括对两种类型预处理的粗物质的统计学计算(通过内推法估计的缺失结果)。
表19.使用CGTase T(75KNU/kg DS)和葡糖淀粉酶(500 AGU/kg DS)的本发明方法的发酵结果。
    小时     L EtOH/100kg谷物     STDEV
    0     -     -
    25.5     28.3     0.9
    48     35.4     0.6
    69     37.1     0.2
    79     *37.5     -
    97     38.3     0.2
*估计值
表20.使用芽孢杆菌α-淀粉酶(10+20KNU/kg DS)和葡糖淀粉酶(500AGU/kg DS)的常规方法的发酵结果
    小时     L EtOH/100kg谷物     STDEV
    0     -     -
    25.5     22.5     1.3
    48     33.9     0.7
    69     *37.2     -
    79     38.8     0.4
    97     40.5     0.5
*估计值
使用约48-70小时的间隔的模拟工业化发酵时间从本发明方法生产的醪液获得的酒精产率等于或高于可以从通过消耗更多能量的两步热淤浆预液化和喷射式蒸煮法生产的醪液获得的产率。
实施例9
本实施例解释了在60℃下使用CGTase、葡糖淀粉酶和酸性真菌α-淀粉酶将颗粒小麦和普通玉米淀粉转化成葡萄糖。
准备好含有33％DS普通玉米或小麦颗粒淀粉的烧瓶并如实施例1中所述保温。在0小时时对烧瓶给予表20中给出的酶活性。在24、48、72和96小时后抽取样品并如实施例1中所述分析样品。结果如表21和22中所示。
表20.所用的酶活性水平：
    CGTaseNU/g DS     葡糖淀粉酶AGU/g DS     酸性真菌α-淀粉酶AFAU/g DS
    100.0     0.2     0.05
表21.使用两种不同淀粉类型的可溶性干固体占总干物质的百分比。
    淀粉     24小时     48小时     72小时     96小时
    普通玉米     85.9     96.2     99.4     100.0
    小麦     95.7     98.9     99.6     100.0
表22.使用两种不同淀粉类型的可溶性水解产物的DX。
  淀粉 24小时 48小时 72小时 96小时
  普通玉米 76.2 89.2 93.4 94.7
  小麦 86.2 92.4 93.6 94.4
序列表
<110>诺维信公司(Novozymes)
<120>冷液化方法
<130>10270-WO
<160>6
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>706
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属
<220>
<221>mat_peptide
<222>(29)..()
<400>1
Val Phe Leu Lys Asn Leu Thr Val Leu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Ala
            -25                 -20                 -15
Leu Leu Leu Phe Ile Leu Leu Ser Leu Pro Thr Ala Ala Gln Ala Asp
        -10                 -5              -1  1
Val Thr Asn Lys Val Asn Tyr Thr Arg Asp Val Ile Tyr Gln Ile Val
5                  10                   15                   20
Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asp Pro Ser Asn Asn Pro Thr Gly Ala
                25                  30                  35
Ile Tyr Ser Gln Asp Cys Ser Asp Leu His Lys Tyr Cys Gly Gly Asp
            40                  45                   50
Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp Leu
        55                  60                  65
Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Tyr Ala
    70                  75                  80
Leu His Pro Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp
85                  90                  95                  100
Tyr Lys Arg Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asp Phe Ser Asp Phe Asp Arg
                105                 110                 115
Leu Met Asp Thr Ala His Ser Asn Gly Ile Lys Val Ile Met Asp Phe
            120                 125                 130
Thr Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Glu Thr Asp Pro Ser Tyr Ala
        135                 140                 145
Glu Asn Gly Ala Val Tyr Asn Asp Gly Val Leu Ile Gly Asn Tyr Ser
   150                  155                 160
Asn Asp Pro Asn Asn Leu Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser
165                 170                 175                 180
Ser Tyr Glu Asp Ser Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr
                185                 190                 195
Asp Leu Asn Asn Thr Val Met Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Lys
            200                 205                 210
Leu Trp Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys
        215                 220                 225
His Met Ser Glu Gly Trp Gln Thr Ser Leu Met Ser Asp Ile Tyr Ala
    230                 235                 240
His Glu Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Ser Gly Glu
245                 250                 255                 260
Val Asp Pro Gln Asn His His Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu
                265                 270                 275
Leu Asp Phe Gln Phe Gly Gln Thr Ile Arg Asp Val Leu Met Asp Gly
            280                 285                 290
Ser Ser Asn Trp Tyr Asp Phe Asn Glu Met Ile Ala Ser Thr Glu Glu
        295                 300                 305
Asp Tyr Asp Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp
    310                 315                 320
Met Ser Arg Phe Ser Phe Glu Gln Ser Ser Asn Arg His Thr Asp Ile
325                 330                 335                 340
Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr
                345                 350                 355
Gly Thr Glu Gln Tyr Leu Thr Gly Gly Asn Asp Pro Glu Asn Arg Lys
            360                 365                 370
Pro Met Ser Asp Phe Asp Arg Thr Thr Asn Ser Tyr Gln Ile Ile Ser
        375                 380                 385
Thr Leu Ala Ser Leu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Asn
    390                 395                 400
Thr Ser Glu Arg Trp Ile Asn Ser Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Ala
405                 410                 415                 420
Phe Gly Asp Ser Val Val Leu Thr Ala Val Asn Ser Gly Asp Thr Ser
                425                 430                 435
Tyr Thr Ile Asn Asn Leu Asn Thr Ser Leu Pro Gln Gly Gln Tyr Thr
            440                 445                 450
Asp Glu Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gly Asn Glu Ile Thr Val Asn Ser
        455                 460                 465
Asn Gly Ala Val Asp Ser Phe Gln Leu Ser Ala Asn Gly Val Ser Val
    470                 475                 480
Trp Gln Ile Thr Glu Glu His Ala Ser Pro Leu Ile Gly His Val Gly
485                 490                 495                 500
Pro Met Met Gly Lys His Gly Asn Thr Val Thr Ile Thr Gly Glu Gly
                505                 510                 515
Phe Gly Asp Asn Glu Gly Ser Val Leu Phe Asp Ser Asp Phe Ser Asp
            520                 525                 530
Val Leu Ser Trp Ser Asp Thr Lys Ile Glu Val Ser Val Pro Asp Val
        535                 540                 545
Thr Ala Gly His Tyr Asp Ile Ser Val Val Asn Ala Gly Asp Ser Gln
    550                 555                 560
Ser Pro Thr Tyr Asp Lys Phe Glu Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Ser
565                 570                 575                 580
Ile Arg Phe Ala Val Asn Asn Ala Thr Thr Ser Leu Gly Thr Asn Leu
                585                 590                 595
Tyr Met Val Gly Asn Val Asn Glu Leu Gly Asn Trp Asp Pro Asp Gln
            600                 605                 610
Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Met Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp
        615                 620                 625
Tyr Tyr Asp Ile Ser Val Pro Ala Glu Glu Asn Leu Glu Tyr Lys Phe
    630                 635                 640
Ile Lys Lys Asp Ser Ser Gly Asn Val Val Trp Glu Ser Gly Asn Asn
645                 650                 655                 660
His Thr Tyr Thr Thr Pro Ala Thr Gly Thr Asp Thr Val Leu Val Asp
                665                 670                 675
Trp Gln
<210>2
<211>705
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属
<220>
<221>mat_peptide
<222>(32)..()
<400>2
Met Leu Asn Lys Leu Ser Leu Lys Met Lys Ala Ile Ala Phe Phe Gly
    -30                 -25                 -20
Ile Val Phe Val Val Phe Leu Ala Leu Ala Asn Asp Val Tyr Ala Ala
-15                 -10                 -5              -1  1
Asn Gln Leu Asn Lys Val Asn Tyr Ala Lys Asp Thr Ile Tyr Gln Ile
            5                   10                  15
Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asp Pro Ser Asn Asn Pro Asp Gly
        20                  25                  30
Ala Leu Tyr Ser Glu Thr Asp Leu His Lys Tyr Met Gly Gly Asp Trp
    35                  40                  45
Lys Gly Ile Thr Glu Lys Ile Glu Asp His Tyr Phe Thr Asp Leu Gly
50                  55                  60                  65
Ile Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Tyr Ala Val
                70                  75                  80
His Pro Glu Gly Tyr Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Tyr
            85                  90                  95
Lys Lys Thr Asn Pro Phe Tyr Gly Asn Phe Asn Asp Phe Asp Glu Leu
        100                 105                 110
Ile Ser Thr Ala His Ser His Gly Ile Lys Ile Ile Met Asp Phe Thr
    115                 120                 125
Pro Asn His Ser Ser Pro Ala Leu Lys Thr Asp Ser Asp Tyr Val Glu
130                 135                 140                 145
Asn Gly Ala Ile Tyr Asp Asn Gly Ser Leu Ile Gly Asn Tyr Ser Asn
                 150                155                 160
Asp Leu Asp Ile Phe His His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Ser Tyr
            165                 170                 175
Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Tyr Asp Leu
        180                 185                 190
Gln Asn Gln Thr Ile Asp Gln Tyr Leu Lys Glu Ser Ile Glu Leu Trp
    195                 200                 205
Leu Asp Lys Gly Ile Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Val Lys His Met
210                 215                 220                 225
Ser Gln Gly Trp Gln Glu Thr Leu Thr Asn His Ile Tyr Ser Tyr Gln
                230                 235                 240
Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly Glu Asn Glu Ile Asp
            245                 250                 255
Pro Arg Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp
        260                 265                 270
Phe Gln Phe Gly Gln Gln Ile Arg Gly Val Leu Met Ser Gln Glu Asp
    275                 280                 285
Asp Trp Thr Asp Phe His Thr Met Ile Glu Asp Thr Ser Asn Ser Tyr
290                 295                 300                 305
Asn Glu Val Ile Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser
                310                 315                 320
Arg Phe His Lys Glu Asp Gly Ala Lys Thr Asn Thr Asp Ile Ala Leu
            325                 330                 335
Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Thr Ile Tyr Tyr Gly Thr
        340                 345                 350
Glu His Tyr Leu Thr Gly Glu Ser Asp Pro Glu Asn Arg Lys Pro Met
    355                 360                 365
Pro Ser Phe Asp Arg Ala Thr Thr Ala Tyr Gln Ile Ile Ser Lys Leu
370                 375                 380                 385
Ala His Leu Arg Gln Ser Asn Pro Ala Leu Gly Tyr Gly Thr Thr Thr
                390                 395                 400
Glu Arg Trp Leu Asn Glu Asp Val Tyr Ile Phe Glu Arg Lys Phe Gly
            405                 410                 415
Asp Asn Val Val Val Thr Ala Val Asn Ser Gly Glu Gln Ser Tyr Thr
        420                 425                 430
Ile Asn Asn Leu Gln Thr Ser Leu Leu Glu Gly Thr His Pro Asp Val
    435                 440                 445
Leu Glu Gly Leu Met Gly Gly Asp Ala Leu Gln Ile Asp Gly Lys Gly
450                 455                 460                 465
Gln Ala Ser Thr Phe Glu Leu Lys Ala Asn Glu Val Ala Val Trp Glu
                470                 475                 480
Val Thr Ala Glu Ser Asn Thr Pro Leu Ile Gly His Val Gly Pro Met
            485                 490                 495
Mal Gly Gln Ala Gly Asn Glu Ile Thr Ile Ser Gly Glu Gly Phe Gly
        500                 505                 510
Glu Gly Gln Gly Thr Val Leu Phe Gly Ser Asp Gln Ala Ser Ile Val
    515                 520                 525
Ser Trp Gly Asp Ser Glu Ile Val Val Asn Val Pro Asp Arg Pro Gly
530                 535                 540                 545
Asn His Tyr Asn Ile Glu Val Val Thr Asn Asp Asn Lys Glu Ser Asn
                550                 555                 560
Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Ile Leu Thr Asn Lys Leu Ile Pro Val Arg
            565                 570                 575
Phe Ile Val Glu Glu Ala Val Thr Asp Tyr Gly Thr Ser Val Tyr Leu
        580                 585                 590
Val Gly Asn Thr Gln Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Asp Lys Ala Ile
    595                 600                 605
Gly Pro Phe Phe Asn Gln Ile Ile Ala Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr
610                 615                 620                 625
Asp Ile Ser Val Pro Ala Asp Ser Thr Leu Glu Tyr Lys Phe Ile Lys
                630                 635                 640
Lys Asp Ala Leu Gly Asn Val Val Trp Glu Ser Gly Thr Asn Arg Ser
            645                 650                 655
Tyr Glu Thr Pro Thr Glu Gly Thr Asp Thr Leu Thr Ser Thr Trp Arg
        660                 665                 670
Asn
<210>3
<211>683
<212>PRT
<213>Thermoanaerobacter sp.
<220>
<221>mat_peptide
<222>(1).，(683)
<400>3
Ala Pro Asp Thr Ser Val Ser Asn Val Val Asn Tyr Ser Thr Asp Val
1               5                   10                  15
Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Leu Asp Gly Asn Pro Ser Asn
            20                   25                 30
Asn Pro Thr Gly Asp Leu Tyr Asp Pro Thr His Thr Ser Leu Lys Lys
        35                  40                  45
Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly
    50                  55                  60
Tyr Leu Thr Gly Met Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val
65                  70                   75                 80
Glu Asn Ile Tyr Ala Val Leu Pro Asp Ser Thr Phe Gly Gly Ser Thr
                 85                 90                  95
Ser Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Phe
            100                 105                 110
Phe Gly Ser Phe Thr Asp Phe Gln Asn Leu Ile Ala Thr Ala His Ala
        115                 120                 125
His Asn Ile Lys Val Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro
    130                 135                 140
Ala Ser Glu Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Gly Val Leu Leu Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Asn Gly Tyr Phe
                165                 170                 175
His His Tyr Gly Gly Thr Asn Phe Ser Ser Tyr Glu Asp Gly Ile Tyr
            180                 185                 190
Arg Asn Leu Phe Asp Leu Ala Asp Leu Asp Gln Gln Asn Ser Thr Ile
        195                 200                 205
Asp Ser Tyr Leu Lys Ala Ala Ile Lys Leu Trp Leu Asp Met Gly Ile
    210                 215                 220
Asp Gly Ile Arg Met Asp Ala Val Lys His Met Ala Phe Gly Trp Gln
225                 230                 235                 240
Lys Asn Phe Met Asp Ser Ile Leu Ser Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe
                245                 250                 255
Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Thr Asn Glu Val Asp Pro Asn Asn Thr Tyr
            260                 265                 270
Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln
        275                 280                 285
Lys Val Arg Gln Val Phe Arg Asp Asn Thr Asp Thr Met Tyr Gly Leu
    290                 295                 300
Asp Ser Met Ile Gln Ser Thr Ala Ala Asp Tyr Asn Phe Ile Asn Asp
305                 310                 315                 320
Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Tyr Thr Gly
                325                 330                 335
Gly Ser Thr Arg Pro Val Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser
            340                 345                  350
Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly
        355                 360                 365
Asn Gly Asp Pro Tyr Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asp Thr Thr
    370                 375                 380
Thr Thr Ala Tyr Asn Val Ile Lys Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser
385                 390                 395                 400
Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Lys Gln Arg Trp Ile Asn Asn
                405                 410                 415
Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Asn Asn Val Ala Leu Val
            420                 425                 430
Ala Ile Asn Arg Asn Leu Ser Thr Ser Tyr Tyr Ile Thr Gly Leu Tyr
        435                 440                 445
Thr Ala Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Met Leu Gly Gly Leu Leu
    450                 455                 460
Asn Gly Ser Ser Ile Thr Val Ser Ser Asn Gly Ser Val Thr Pro Phe
465                 470                 475                 480
Thr Leu Ala Pro Gly Glu Val Ala Val Trp Gln Tyr Val Ser Thr Thr
                485                 490                 495
Asn Pro Pro Leu Ile Gly His Val Gly Pro Thr Met Thr Lys Ala Gly
            500                 505                 510
Gln Thr Ile Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Thr Thr Ala Gly Gln
        515                 520                 525
Val Leu Phe Gly Thr Thr Pro Ala Thr Ile Val Ser Trp Glu Asp Thr
    530                 535                 540
Glu Val Lys Val Lys Val Pro Ala Leu Thr Pro Gly Lys Tyr Asn Ile
545                 550                 555                  560
Thr Leu Lys Thr Ala Ser Gly Val Thr Ser Asn Ser Tyr Asn Asn Ile
                565                 570                 575
Asn Val Leu Thr Gly Asn Gln Val Cys Val Arg Phe Val Val Asn Asn
            580                 585                 590
Ala Thr Thr Val Trp Gly Glu Asn Val Tyr Leu Thr Gly Asn Val Ala
        595                 600                 605
Glu Leu Gly Asn Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ilo Gly Pro Met Phe Asn
    610                 615                 620
Gln Val Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro
625                 630                 635                 640
Ala Gly Thr Thr Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asn Gly Ser Thr
                645                 650                 655
Val Thr Trp Glu Gly Gly Tyr Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Ser
            660                 665                 670
Gly Thr Ala Thr Val Ile Val Asp Trp Gln Pro
        675                 680
<210>4
<211>713
<212>PRT
<213>芽孢杆菌属
<220>
<221>mat_peptide
<222>(28)..()
<400>4
Met Lys Arg Phe Met Lys Leu Thr Ala Val Trp Thr Leu Trp Leu Ser
        -25                 -20                 -15
Leu Thr Leu Gly Leu Leu Ser Pro Val His Ala Ala Pro Asp Thr Ser
    -10                 -5              -1  1               5
Val Ser Asn Lys Gln Asn Phe Ser Thr Asp Val Ile Tyr Gln Ile Phe
                10                  15                  20
Thr Asp Arg Phe Ser Asp Gly Asn Pro Ala Asn Asn Pro Thr Gly Ala
            25                  30                  35
Ala Phe Asp Gly Ser Cys Thr Asn Leu Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Asp
        40                  45                  50
Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Gly Met
    55                  60                  65
Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Ile Tyr Ser
70                  75                  80                  85
Val Ile Asn Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Trp
                90                  95                  100
Ala Arg Asp Phe Lys Lys Thr Asn Pro Ala Tyr Gly Thr Met Gln Asp
            105                 110                 115
Phe Lys Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His Asn Ile Lys Val Ile
        120                 125                 130
Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Ser Asp Asp Pro
    135                 140                 145
Ser Phe Ala Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Asn Leu Leu Gly
150                 155                 160                 165
Gly Tyr Thr Asn Asp Thr Gln Asn Leu Phe His His Tyr Gly Gly Thr
                170                 175                 180
Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asn Gly Ile Tyr Lys Asn Leu Tyr Asp Leu
            185                 190                 195
Ala Asp Leu Asn His Asn Asn Ser Ser Val Asp Val Tyr Leu Lys Asp
        200                 205                 210
Ala Ile Lys Met Trp Leu Asp Leu Gly Val Asp Gly Ile Arg Val Asp
    215                 220                 225
Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Phe Met Ala Thr
230                 235                 240                 245
Ile Asn Asn Tyr Lys Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Gly
                250                 255                 260
Val Asn Glu Ile Ser Pro Glu Tyr His Gln Phe Ala Asn Glu Ser Gly
            265                 270                 275
Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Ala Gln Lys Ala Arg Gln Val Phe
        280                 285                 290
Arg Asp Asn Thr Asp Asn Met Tyr Gly Leu Lys Ala Met Leu Glu Gly
    295                 300                 305
Ser Glu Val Asp Tyr Ala Gln Val Asn Asp Gln Val Thr Phe Ile Asp
310                 315                 320                 325
Asn His Asp Met Glu Arg Phe His Thr Ser Asn Gly Asp Arg Arg Lys
                330                 335                 340
Leu Glu Gln Ala Leu Ala Phe Thr Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Ala
            345                 350                 355
Ile Tyr Tyr Gly Ser Glu Gln Tyr Met Ser Gly Gly Asn Asp Pro Asp
        360                 365                 370
Asn Arg Ala Arg Leu Pro Ser Phe Ser Thr Thr Thr Thr Ala Tyr Gln
    375                 380                 385
Val Ile Gln Lys Leu Ala Pro Leu Arg Lys Ser Asn Pro Ala Ile Ala
390                 395                 400                 405
Tyr Gly Ser Thr His Glu Arg Trp Ile Asn Asn Asp Val Ile Ile Tyr
                410                 415                 420
Glu Arg Lys Phe Gly Asn Asn Val Ala Val Val Ala Ile Asn Arg Asn
            425                 430                 435
Met Asn Thr Pro Ala Ser Ile Thr Gly Leu Val Thr Ser Leu Arg Arg
        440                 445                 450
Ala Ser Tyr Asn Asp Val Leu Gly Gly Ile Leu Asn Gly Asn Thr Leu
    455                 460                 465
Thr Val Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ser Asn Phe Thr Leu Ala Pro Gly
470                 475                 480                 485
Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Thr Asp Ala Thr Thr Pro Ile Ile
                490                 495                 500
Gly Asn Val Gly Pro Met Met Ala Lys Pro Gly Val Thr Ile Thr Ile
            505                 510                 515
Asp Gly Arg Gly Phe Gly Ser Gly Lys Gly Thr Val Tyr Phe Gly Thr
        520                 525                 530
Thr Ala Val Thr Gly Ala Asp Ile Val Ala Trp Glu Asp Thr Gln Ile
   535                  540                 545
Gln Val Lys Ile Pro Ala Val Pro Gly Gly Ile Tyr Asp Ile Arg Val
550                 555                 560                 565
Ala Asn Ala Ala Gly Ala Ala Ser Asn Ile Tyr Asp Asn Phe Glu Val
                570                 575                 580
Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe Val Ile Asn Asn Ala Thr
            585                 590                 595
Thr Ala Leu Gly Gln Asn Val Phe Leu Thr Gly Asn Val Ser Glu Leu
        600                 605                 610
Gly Asn Trp Asp Pro Asn Asn Ala Ile Gly Pro Met Tyr Asn Gln Val
    615                 620                 625
Val Tyr Gln Tyr Pro Thr Trp Tyr Tyr Asp Val Ser Val Pro Ala Gly
630                 635                 640                 645
Gln Thr Ile Glu Phe Lys Phe Leu Lys Lys Gln Gly Ser Thr Val Thr
                650                 655                 660
Trp Glu Gly Gly Ala Asn Arg Thr Phe Thr Thr Pro Thr Ser Gly Thr
            665                 670                 675
Ala Thr Val Asn Val Asn Trp Gln Pro
        680                 685
<210>5
<211>719
<212>PRT
<213>Bacillus stearothermophilus
<220>
<221>mat_peptide
<222>(34)..(719)
<400>5
Met Lys Lys Lys Thr Leu Ser Leu Phe Val Gly Leu Met Leu Leu Ile
             -30                -25                 -20
Gly Leu Leu Phe Ser Gly Ser Leu Pro Tyr Asn Pro Asn Ala Ala Glu
        -15                 -10                 -5
Ala Ser Ser Ser Ala Ser Val Lys Gly Asp Val Ile Tyr Gln Ile Ile
-1  1               5                   10                  15
Ile Asp Arg Phe Tyr Asp Gly Asp Thr Thr Asn Asn Asn Pro Ala Lys
                20                  25                  30
Ser Tyr Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Lys Ser Lys Trp Lys Met Tyr Trp
            35                  40                  45
Gly Gly Asp Leu Glu Gly Val Arg Gln Lys Leu Pro Tyr Leu Lys Gln
        50                  55                  60
Leu Gly Val Thr Thr Ile Trp Leu Ser Pro Val Leu Asp Asn Leu Asp
    65                  70                  75
Thr Leu Ala Gly Thr Asp Asn Thr Gly Tyr His Gly Tyr Trp Thr Arg
80                  85                  90                  95
Asp Phe Lys Gln Ile Glu Glu His Phe Gly Asn Trp Thr Thr Phe Asp
                100                 105                 110
Thr Leu Val Asn Asp Ala His Gln Asn Gly Ile Lys Val Ile Val Asp
            115                 120                 125
Phe Val Pro Asn His Ser Thr Pro Phe Lys Ala Asn Asp Ser Thr Phe
        130                 135                 140
Ala Glu Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Asn Gly Thr Tyr Met Gly Asn Tyr
    145                 150                 155
Phe Asp Asp Ala Thr Lys Gly Tyr Phe His His Asn Gly Asp Ile Ser
160                 165                 170                 175
Asn Trp Asp Asp Arg Tyr Glu Ala Gln Trp Lys Asn Phe Thr Asp Pro
                180                 185                 190
Ala Gly Phe Ser Leu Ala Asp Leu Ser Gln Glu Asn Gly Thr Ile Ala
            195                 200                 205
Gln Tyr Leu Thr Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Ala His Gly Ala Asp
        210                 215                 220
Gly Leu Arg Ile Asp Ala Val Lys His Phe Asn Ser Gly Phe Ser Lys
    225                 230                 235
Ser Leu Ala Asp Lys Leu Tyr Gln Lys Lys Asp Ile Phe Leu Val Gly
240                 245                 250                 255
Glu Trp Tyr Gly Asp Asp Pro Gly Thr Ala Asn His Leu Glu Lys Val
                260                 265                 270
Arg Tyr Ala Asn Asn Ser Gly Val Asn Val Leu Asp Phe Asp Leu Asn
            275                 280                285
Thr Val Ile Arg Asn Val Phe Gly Thr Phe Thr Gln Thr Met Tyr Asp
        290                 295                 300
Leu Asn Asn Met Val Asn Gln Thr Gly Asn Glu Tyr Lys Tyr Lys Glu
   305                  310                 315
Asn Leu Ile Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Ser Arg Phe Leu Ser
320                 325                 330                 335
Val Asn Ser Asn Lys Ala Asn Leu His Gln Ala Leu Ala Phe Ile Leu
                340                 345                 350
Thr Ser Arg Gly Thr Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met
            355                 360                 365
Ala Gly Gly Asn Asp Pro Tyr Asn Arg Gly Met Met Pro Ala Phe Asp
        370                375                  380
Thr Thr Thr Thr Ala Phe Lys Glu Val Ser Thr Leu Ala Gly Leu Arg
    385                 390                 395
Arg Asn Asn Ala Ala Ile Gln Tyr Gly Thr Thr Thr Gln Arg Trp Ile
400                 405                 410                 415
Asn Asn Asp Val Tyr Ile Tyr Glu Arg Lys Phe Phe Asn Asp Val Val
                420                 425                 430
Leu Val Ala Ile Asn Arg Asn Thr Gln Ser Ser Tyr Ser Ile Ser Gly
            435                 440                 445
Leu Gln Thr Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Ala Asp Tyr Leu Ser Gly
        450                 455                 460
Leu Leu Gly Gly Asn Gly Ile Ser Val Ser Asn Gly Ser Val Ala Ser
    465                 470                 475
Phe Thr Leu Ala Pro Gly Ala Val Ser Val Trp Gln Tyr Ser Thr Ser
480                 485                 490                 495
Ala Ser Ala Pro Gln Ile Gly Ser Val Ala Pro Asn Met Gly Ile Pro
                500                 505                 510
Gly Asn Val Val Thr Ile Asp Gly Lys Gly Phe Gly Thr Thr Gln Gly
            515                 520                 525
Thr Val Thr Phe Gly Gly Val Thr Ala Thr Val Lys Ser Trp Thr Ser
        530                 535                 540
Asn Arg Ile Glu Val Tyr Val Pro Asn Met Ala Ala Gly Leu Thr Asp
    545                 550                 555
Val Lys Val Thr Ala Gly Gly Val Ser Ser Asn Leu Tyr Ser Tyr Asn
560                 565                 570                 575
Ile Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ser Val Val Phe Thr Val Lys Ser Ala
                580                 585                 590
Pro Pro Thr Asn Leu Gly Asp Lys Ile Tyr Leu Thr Gly Asn Ile Pro
            595                 600                 605
Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Asp Thr Ser Gly Ala Val Asn Asn Ala
        610                 615                 620
Gln Gly Pro Leu Leu Ala Pro Asn Tyr Pro Asp Trp Phe Tyr Val Phe
    625                 630                 635
Ser Val Pro Ala Gly Lys Thr Ile Gln Phe Lys Phe Phe Ile Lys Arg
640                 645                 650                 655
Ala Asp Gly Thr Ile Gln Trp Glu Asn Gly Ser Asn His Val Ala Thr
                660                 665                 670
Thr Pro Thr Gly Ala Thr Gly Asn Ile Thr Val Thr Trp Gln Asn
            675                 680                 685
<210>6
<211>534
<212>PRT
<213>黑曲霉
<220>
<221>mat_peptide
<222>(25)..(534)
<400>6
Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly
                -20                 -15                  -10
Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser
            -5              -1  1               5
Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala
    10                  15                  20
Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser
25                  30                  35                  40
Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr Phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser
                45                  50                  55
Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu Val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr
            60                  65                  70
Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val
        75                  80                  85
Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu
    90                  95                  100
Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp
105                 110                 115                 120
Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile
                125                 130                 135
Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr
            140                 145                 150
Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln
        155                 160                 165
Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser
    170                 175                 180
Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser
185                 190                 195                 200
Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln
                205                 210                 215
Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe
            220                 225                 230
Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr
        235                 240                 245
Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp
    250                 255                 260
Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu
265                 270                 275                 280
Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser
                285                 290                 295
Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr
            300                 305                 310
Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu
        315                 320                 325
Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr
    330                 335                 340
Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr
345                 350                 355                 360
Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala
                365                 370                 375
Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala
            380                 385                 390
Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu
        395                 400                 405
Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr
    410                 415                 420
Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr
425                 430                 435                 440
Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly
                445                 450                 455
Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr
            460                 465                 470
Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr
        475                 480                 485
Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr
    490                 495                 500
Arg Ser Gly Met Ser Leu
505                 510

Claims (29)

1.用于生产可溶性淀粉水解产物的一步法，该方法包括使含水的颗粒淀粉浆在低于所述颗粒淀粉的起始胶凝温度的温度下进行下列酶的同时作用的步骤：
第一种酶为CGTase(EC 2.4.1.19)或生麦芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)：
和至少一种属于β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)的第二种酶。
2.权利要求1中所述的方法，其中淀粉浆含有20-55％的干固体颗粒淀粉。
3.上述权利要求1-2中任意一项所述的方法，其中将至少85％的颗粒淀粉干固体转化成可溶性淀粉水解产物。
4.上述权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为具有至少3.5微摩尔/分钟/mg的水解活性的CGTase。
5.上述权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为SEQ ID NO：3所示的CGTase。
6.上述权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中生麦芽糖α-淀粉酶来源于芽孢杆菌属。
7.上述权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为SEQ ID NO：5所示的生麦芽糖α-淀粉酶。
8.上述权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述的第一种酶为具有至少3.5微摩尔/分钟/mg的水解活性的生麦芽糖α-淀粉酶。
9.上述权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为大麦β-淀粉酶(E.C.2.4.1.2)。
10.上述权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为葡糖淀粉酶。
11.上述权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述的第二种酶为SEQ ID NO：6中所示氨基酸序列的葡糖淀粉酶。
12.上述权利要求1-11中任意一项所述的方法，其中存在第三种酶，所述的第三种酶为来源于芽孢杆菌属种类的α-淀粉酶。
13.上述权利要求1-12中任意一项所述的方法，其中存在第三种酶，所述的第三种酶为异淀粉酶或支链淀粉酶。
14.上述权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中所述的温度至少在58℃。
15.上述权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中所述的pH在3.0-7.0。
16.上述权利要求1-15中任意一项所述的方法，其中所述的可溶性淀粉水解产物的溶解的干固体中葡萄糖的百分比至少为94.5％。
17.上述权利要求1-16中任意一项所述的方法，其中可溶性淀粉水解产物主要由葡萄糖或麦芽糖组成。
18.上述权利要求1-17中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自块茎、根、茎或全谷物。
19.上述权利要求1-18中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自谷类。
20.上述权利要求1-19中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉获自玉米、玉米穗轴、小麦、大麦、黑麦、买罗高梁、西米、木薯、木薯淀粉、高梁、稻或马铃薯。
21.上述权利要求1-20中任意一项所述的方法，其中所述的颗粒淀粉通过干磨全谷物或湿磨全谷物得到。
22.上述权利要求1-21中任意一项所述的方法，其中该方法在超滤***中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
23.上述权利要求1-22中任意一项所述的方法，其中该方法在带有超滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
24.上述权利要求1-23中任意一项所述的方法，其中该方法在带有微滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉和水存在的循环中且其中透过物为可溶性淀粉水解产物。
25.上述权利要求1-24中任意一项所述的方法，还包括将可溶性淀粉水解产物转化成基于高果糖淀粉的糖浆。
26.上述权利要求1-25中任意一项所述的方法，还包括将可溶性淀粉水解产物发酵成酒精。
27.权利要求1-26所述的方法，所述方法包括将可溶性淀粉水解产物发酵成酒精，其中所述的发酵步骤与颗粒淀粉的水解步骤同时或分别/依次进行。
28.权利要求1-27中任意一项所述的方法，所述方法包括将可溶性淀粉水解产物发酵成酒精，其中该方法在超滤***中进行，其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
29.权利要求1-28中任意一项所述的方法，所述方法包括将可溶性淀粉水解产物发酵成酒精，其中该方法在带有超滤膜的连续膜反应器中进行且其中回流液保持在有酶、生淀粉、酵母、酵母营养物和水存在的循环中且其中透过物为含有酒精的液体。
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