CN1325511C

CN1325511C - 谷胱甘肽纯化分离方法

Info

Publication number: CN1325511C
Application number: CNB2005100024083A
Authority: CN
Inventors: 谭天伟; 丁轲
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2005-01-21
Filing date: 2005-01-21
Publication date: 2007-07-11
Anticipated expiration: 2025-01-21
Also published as: CN1807447A

Abstract

本发明提供了一种谷胱甘肽纯化分离方法，选择了含有-S-R基团或-S-S-R’基团的分离介质，将分离谷胱甘肽的介质进行预处理后，填装成层析柱，用pH值1.0～10.0的缓冲液平衡层析柱，调pH值为1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，用碱或酸洗脱，可得到只含谷胱甘肽的洗脱液。由于介质对谷胱甘肽的高度专一选择吸附，可以有效地将谷胱甘肽分离出来，实现从谷胱甘肽抽提液中一步分离就高度纯化，谷胱甘肽结晶后可以得到纯度为99%的产品。

Description

谷胱甘肽纯化分离方法

技术领域

本发明涉及一种谷胱甘肽(GSH)纯化分离方法，特别是用离子交换层析法分离谷胱甘肽，属于生物化工领域。

背景技术

谷胱甘肽是一种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸。谷胱甘肽的相对分子质量为307.33，熔点189～193℃(分解)，晶体呈无色透明细长柱状，等电点为5.93。它溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰胺，而不溶于醇、醚和丙酮。谷胱甘肽固体较为稳定，而水溶液在空气中则易被氧化。两分子还原型谷胱甘肽(GSH)的活泼巯基氧化缩合为二硫键，即得到氧化型谷胱甘肽(GSSG)。

酵母的谷胱甘肽粗提液浓度非常低，而且在谷胱甘肽的粗提液中常常含有很多杂质，如蛋白质、多糖、多肽、氨基酸、盐类等等，因此高纯度、高回收率的谷胱甘肽的工业化分离较困难。有报道的分离纯化谷胱甘肽的方法有以下七种：离子交换层析法，铜盐法，铜盐-离子交换耦合法，电渗析法，Q-琼脂糖凝胶柱层析，双水相结合温度诱导相分离法及金属汞亲和层析。其中有工业前景的方法主要有：

1)离子交换层析法：离子交换层析法具备离子交换与层析分离的双重特点，从而使谷胱甘肽不仅与杂质分离而且获得纯化，加之其具备连续操作的优点，离子交换层析法是分离谷胱甘肽最具前途的一种生物分离方法。离子交换层析法的关键是高选择性的离子交换树脂以及分离纯化条件的优化。在日本专利(JP58,028,299)中，将谷胱甘肽抽提液在25-35℃，pH2.0-3.5，经超滤膜除杂后，再由反渗透膜浓缩，既避免了传统硅藻土过滤除杂的不彻底性，而且还有效降低了还原型谷胱甘肽的分解，提供的一例中谷胱甘肽回收率比传统方法提高了15％。在日本Noguchi Sadao的专利(JP52100421)中把含有氨基酸、无机盐等杂质的谷胱甘肽溶液用HCl或H₂SO₄调节pH至3以下，用苯乙烯系树脂进行处理，再用洗脱剂进行洗脱，得到谷胱甘肽溶液，经浓缩，加入微量结晶剂，于冷藏室内结晶。经两次重结晶所得到的谷胱甘肽高纯物其纯度达到97.5％。日本文献(JP 62,246,594)均报道了离子交换层析再结合模拟移动床装置连续分离的方法。Maki Haruhiko(Maki H，Fukuda H，Morikawa H.The Separation of Glutathioneand Glutamic Acid Using a Simulated Moving-Bed Adsorber system[J].Journalof Fermentation Technology，1987，65：61-70)用大孔强酸性阳离子交换树脂作为吸附剂，以低浓度的酸溶液或碱溶液洗脱，利用模拟移动床来分离制备谷胱甘肽，谷胱甘肽的纯度为75％以上，回收率为60％。上述离子交换层析法分离谷胱甘肽时，由于谷胱甘肽与谷氨酸性质相近，谷氨酸作为谷胱甘肽合成的前体物质，在酵母细胞中的含量与谷胱甘肽相当，谷氨酸与谷胱甘肽的等电点接近，所以在一定的PH值范围内，所带电荷相同，故造成分离的难度增大，因此分离时不但需要严格控制液样PH值及洗脱液种类等工艺条件，且单柱的分离效率低，需经过反复分离。

2)金属汞亲和层析

谷胱甘肽是一种巯基化合物，由于巯基化合物具有很强的与汞化学亲和作用因此用含汞树脂提取含巯基化合物能取得良好的效果。报道用金属离子汞亲和层析分离谷胱甘肽的方法(王辉.含汞树脂分离提纯谷胱甘肽[J].华东理工大学学报，1996，22(6)：717-721；苑小林，等.鲜酵母中谷胱甘肽(GSH)分离纯化的初步研究[J].药物生物技术，1998，5(2)：89-91)。该方法先将对氨基苯汞乙酸-二乙烯基苯载体上，形成含汞树脂用于提取谷胱甘肽，提高树脂的选择性，其操作容量为每立升树脂吸附谷胱甘肽0.16mol，pH影响树脂对谷胱甘肽的吸附，适宜的pH为3-9。高浓度盐对洗脱有直接影响。树脂对其它物质也有不同程度的吸附，在高浓度盐的条件下，易使汞从树脂上断开，从而影响产品的纯度。当树脂用于提取酵母提取液中的谷胱甘肽时，控制pH在3.0-4.0时能得到很好的分离效果。其中，王辉等做得谷胱甘肽回收率为54.3％。虽然金属离子汞亲和层析制取谷胱甘肽有选择性好等优点，但存在汞污染，回收率低等缺点，尤其不适用于药用、食用谷胱甘肽的生产。

发明内容

本发明解决了离子交换层析法分离介质的高度专一性和选择性，从而提供了一种从谷胱甘肽抽提液中一步分离获得高纯谷胱甘肽的分离方法。

本发明的技术方案：包括：在层析柱中离子交换、一定PH值范围的缓冲液平衡及酸、碱洗脱过程，其中：层析分离介质是带有-S-R基团或-S-S-R’基团的树脂类、纤维素类、交联葡聚糖或交联琼脂糖类物质，其中R是氢原子(H)，二氨基甲基(CH(NH₂)₂) R’是吡啶基(C₅H₄N)、乙基(C₂H₅)等基团，将预处理后的分离介质填装成层析柱，用pH值1.0～10.0的缓冲液平衡层析柱，调pH值为1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，洗脱得到含谷胱甘肽的洗脱液。

上述类介质可以是苯乙烯系、丙乙烯系、甲基丙烯酸系、丙烯酸系、苯烯酸系、环氧系等带有-S-R基团或-S-S-R’基团的树脂。

上述缓冲液可以是磷酸氢二钠(钾、铵)-磷酸二氢钠(钾、铵)缓冲液，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，盐酸-磷酸氢二钠(钾、铵)缓冲液，巴比妥-盐酸缓冲液等。

本发明的洗脱过程为通常的酸、碱洗脱方法。带有-S-R基团或-S-S-R’基团的分离介质可以选择市售产品，如LSC-200牌号的苯乙烯系树脂，及LSC-400牌号的苯乙烯系树脂，也可以合成方法制备。

本发明的效果是：(1)采用了含有-S-R基团或-S-S-R’基团的分离介质，因而与含有-SH基的谷胱甘肽可以形成-S-S-键，对谷胱甘肽具有高度专一性和选择性，有效地将谷胱甘肽从其抽提液中分离出来，一步分离的谷胱甘肽就达到高度纯化，结晶后谷胱甘肽纯度可以达到99％。(2)由于该分离介质对谷胱甘肽的高度选择性，缓冲液PH值及洗脱控制条件范围宽，便于控制，树脂吸附谷胱甘肽后用碱或酸洗脱得到的溶液经HPLC检测主要成份为谷胱甘肽，仅含有很少量的杂质，并且具有浓缩效果，洗脱液体积减少45％，谷胱甘肽浓度增加近两倍，洗脱得率可达80～95％，实现从酵母抽提液中一步分离谷胱甘肽就达到高度纯化的效果，大大提高单柱分离效率。

具体实施方式：

实施例1：

将含有-SH基团的苯乙烯系树脂预处理后填装在1.0cm×40cm的层析柱中，用pH值7.0的0.2M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为7.0的GSH抽提液上样30ml(0.7mgGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.2M的氢氧化钠洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达92％，结晶后纯度达99％

实施例2：

将含有-S-S-C₅H₄N基团的苯乙烯系树脂预处理后填装在3.5cm×40cm的层析柱中，用pH值10.0的0.5M Tris-盐酸缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为10.0的GSH抽提液上样300ml(0.7mgGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.2M的盐酸洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达86％。结晶后纯度达99％。

实施例3：

将含有-SH基团的苯乙烯系树脂预处理后填装在7.0cm×40cm的层析柱中，用pH值4.0的0.1M乙酸-乙酸钠缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为4.0的GSH抽提液上样1300ml(0.7mgGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.1M～0.2M的氨水梯度洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达84％。

实施例4：

将含有-S-CH(NH₂)₂基团的苯乙烯系树脂预处理后填装在7.0cm×40cm的层析柱中，用pH值3.0的0.2M磷酸氢二铵-HCl缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为3.0的GSH抽提液上样1300ml(0.7mGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.1M～0.2M的氢氧化钠梯度洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达92％。结晶后纯度达99％。

实施例5：

将含有-S-S-C₅H₄N基团交联葡聚糖介质填装在1.0cm×40cm的层析柱中，用pH值3.0的0.2M磷酸氢二钠-HCl缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为3.0的GSH抽提液上样30ml(0.7mGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.15M的氢氧化钠洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达90％。

实施例6：

将含有-S-CH(NH₂)₂基团的交联琼脂糖介质填装在3.5cm×40cm的层析柱中，用pH值7.0的0.2M巴比妥-盐酸缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为7.0的GSH抽提液上样300ml(0.7mgGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.1M～0.2M的盐酸梯度洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达88％。

实施例7：

将含有-SH基团的甲基丙烯酸系树脂经过预处理树脂填装在7.0cm×40cm的层析柱中，用pH值1.0的0.2M磷酸氢二铵-磷酸二氢铵缓冲液平衡层析柱，然后用调pH值为1.0的GSH抽提液上样1300ml(0.7mgGSH/ml)，用同样的缓冲液冲洗后，用0.15M的氢氧化钠洗脱，可得到只含GSH的洗脱液，洗脱得率可达85％。

Claims

1、一种谷胱甘肽纯化分离方法，包括：在层析柱中离子交换、一定PH值范围的缓冲液平衡及酸、碱洗脱过程，其特征在于：层析分离介质是带有-S-R基团或-S-S-R’基团的树脂、纤维素、交联葡聚糖或交联琼脂糖，其中R是氢原子或二氨基甲基基团，R’是吡啶基或乙基基团，将预处理后的分离介质填装成层析柱，用pH值1.0～10.0的缓冲液平衡层析柱，调pH值为1.0～10.0的谷胱甘肽抽提液上样，用同样的缓冲液冲洗后，洗脱得到含谷胱甘肽的洗脱液。

2、根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：分离介质所用的树脂是带有-S-R基团或-S-S-R’基团的苯乙烯系树脂、丙乙烯系树脂、甲基丙烯酸系树脂、丙烯酸系树脂、苯烯酸系树脂或环氧系树脂。

3、根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于：缓冲液是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、盐酸-磷酸氢二钠缓冲液或巴比妥-盐酸缓冲液。