CN1325407A

CN1325407A - 血小板衍生生长因子d、其编码dna及其应用

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Publication number: CN1325407A
Application number: CN99813133A
Authority: CN
Inventors: 乌尔夫·埃里克松; 卡琳·奥瑟; 安尼卡·蓬滕; 李旭日; 马尔科·于特拉; 卡里·阿利塔洛; 阿恩·厄斯特曼; 卡尔－亨里克·黑尔丁
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Licentia Oy; Ludwig Institute for Cancer Research New York
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2001-12-05
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: EP2151454A2; EP2151454B1; JP2002534061A; CN1261453C; EP1129110B1; WO2000027879A1; EP2151454A3; AU770899B2; ES2336731T3; US6706687B1; EP1129110A4; AU1613600A; DE69941791D1; ATE556090T1; NZ511379A; ATE451389T1; DK1129110T3; EP1129110A1; CA2349951A1

Abstract

本发明描述了生长因子PDGF/VEGF家族的一个新成员PDGF－D,以及编码PDGF－D的核苷酸序列,生产PDGF－D的方法,PDGF－D的抗体和其它拮抗剂,表达PDGF－D的转染和转化的宿主细胞,含有PDGF－D的药物组合物,以及PDGF－D在医疗和诊断中的用途。

Description

血小板衍生生长因子D、其编码DNA及其应用

本发明涉及表达新生长因子受体的细胞如内皮细胞、***细胞(如成纤维细胞)、肌成纤维细胞和神经胶原细胞的生长因子，本发明尤其涉及新的血小板衍生生长因子/血管内皮生长因子样生长因子，编码这种因子的多核苷酸序列，以及利用或衍生自这种因子的药物和诊断组合物和方法。

发明背景

在发育的胚胎中，初生血管网的形成是通过中胚层细胞原位分化实现的，这个过程称为血管发生。随后的所有涉及胚胎中新生血管的产生或者成体中新血管的生成的过程，都由已形成的脉管***中的毛细血管的出芽或者***过程决定，这个过程称为血管生成(Pepper et al.,Enzyme&Protein,1996 49 138-162；Breier et al.,Dev.Dyn.1995 204 228-239:Risau.Nature,1997 386 671-674)。血管生成过程不仅与胚胎发育和正常组织的生长、修复和再生相关，而且涉及雌性生物的生殖周期、妊娠的形成和保持和外伤与骨折的恢复过程。血管生成不仅在正常个体中发生，还与大量的病理过程相关，尤其与肿瘤的生长和转移相关，还与其它一些与血管增殖，尤其是微血管***增殖的病理过程相关，例如糖尿病引发的视网膜病、牛皮癣和关节炎。那么，抑制血管生成就有助于预防疾病的发生或者减轻疾病的症状。

另一方面，在一些需要进行血管化或者需要促进血管化的场合，例如在组织或者器官移植后，或者常见于冠心病、血栓性脉管炎中需要在组织梗塞或者狭窄的动脉旁建立侧支循环时，促进血管的生成过程又是希望进行的。

血管生成过程高度复杂，包括维持内皮细胞处于细胞周期，降解细胞外的基质，迁入并侵入周围的组织，最后形成脉管。血管生成过程复杂的分子机制还远远超出人们现在对它的认识。

由于血管生成在许多生理和病理过程中的重要作用，人们已经对参与控制血管生成相关的因子进行了细致的研究。许多生长因子被证明可以调控血管生成过程，这些生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转移生长因子α(TGFα)和肝细胞生长因子(HGF)。见Folkman et al.,J.Biol.Chem.,1992267 10931-10934(review)。

有人认为，内皮细胞特异性的生长因子家族中的特殊的一类，即血管内皮生长因子(VEGFs)，以及它们所对应的受体参与刺激内皮细胞的生长和分化，从而分化成为具有特定功能细胞。这些因子都属于PDGF家族，并且主要都是通过内皮受体酪氨酸激酶(RTKs)实现功能。

PDGF家族中的九种不同的蛋白质已经被确定，即两种PDGF(A和B)、VEGF，剩余的六个蛋白质和VEGF密切相关。

这六个与VEGF密切相关的成员是：VEGF-B，见国际专利申请PCT/US96/02957(WO96/26736)和美国专利5,840,693和5,607,918(路德维格癌症研究所和Helsinki大学)；VEGF-C，见Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298和Lee et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 93 1988-1992；VEGF-D，见国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)和Achen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548-553；胎盘生长因子(P1GF)，见Maglione et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267-9271；VEGF2，见国际专利申请PCT/US94/05291(WO95/24473)(人体基因组科学有限公司)和VEGF3，见国际专利申请PCT/US95/07283(WO96/39421)(人体基因组科学有限公司)。VEGF家族中的每个成员与VEGF相比较具有30％-45％氨基酸序列相同性。VEGF家族的成员都含有一个VEGF的同源结构域，该结构域含有由六个半胱氨酸残基构成的半胱氨酸结。VEGF家族的功能包括改变内皮细胞有丝***的程度、引起血管渗透性、血管生成和***生成。

血管内皮生长因子(VEGF)是同源二聚糖蛋白，可以从多种来源中分离。VEGF呈现对内皮细胞具有高度特异的促有丝***活性。在胚胎血管发生过程中形成新的血管或者在成体的血管生成过程中，VEGF都起着非常重要的调控作用(Carmeliet et al.,Nature,1996380 435-439；Ferrara et al.,Nature 1996 380 439-442；Freeara,Davis-Smyth,Endocrine Rev.,1997 18 4-25)。如果使一个VEGF的等位基因失活，胚胎就会因为脉管***无法发育而致死，可见VEGF所执行功能的重要性(Carmeliet et al.,Nature,1996 380 435-439；Ferrara etal.,Nature 1996 380 439-442)。此外，VEGF对单核细胞还具有很强的化学引诱作用，可以诱导内皮细胞中产生血纤维蛋白溶酶原激活剂和血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂，还可以促使微血管产生通透性。由于VEGF可以促使微血管产生通透性，所以常常也被称为血管渗透因子(VPF)。VEGF的分离方法和性质可以参见Ferrara et al.,J.Cellular Biochem.,1991 47 211-218和Connolly et al.,J.CellularBiochem.,1991 47 219-223。对单一VEGF基因进行可变mRNA剪切产生了五种VEGF同种型。

VEGF-B和VEGF相比，具有相似的血管生成和其它性质，但是在组织中的表达和分布不同。VEGF-B在心脏中大量表达，而在肺中很少表达，而VEGF恰恰相反。这表明，虽然VEGF-B和VEGF在许多组织中共表达，但是可能行使的功能有差异。

VEGF-B是通过酵母共杂交相互作用捕获筛选技术进行分离的。筛选可以和Ⅰ型细胞树脂状酸性结合蛋白(CRABP-Ⅰ)发生相互作用的细胞蛋白。具体的分离过程及其性质可见专利申请PCT/US96/02957和Olofsson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996 932576-2581。

VEGF-C是从培养PC-3***癌细胞系(CRL1435)的条件培养基中，根据是否可以对内皮细胞上特异的受体酪氨酸激酶VEGFR-3(Flt4)进行酪氨酸磷酸化这一现象进行筛选得到的。其中，VEGFR-3由转染的细胞系表达。再利用连有重组VEGFR-3的亲和层析柱对VEGF-C进行纯化，再将其从PC-3 cDNA文库中克隆出来。具体的分离过程和它的有关性质可见Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298。

VEGF-D可以从人类乳腺cDNA文库中分离得到，这个文库可以从Clontech直接购买。以人cDNA文库中的“Soares Breast3NbHBst”(Achen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998 95 548-553)这一表达序列标记作为杂交探针进行筛选。具体的分离过程和它的有关性质可见国际专利申请PCT/US97/14696(WO98/07832)。

VEGF-D基因在成人体内广泛表达，但当然也不是普遍表达。VEGF-D在心脏、肺和骨骼肌中大量表达。VEGF-D在脾、卵巢、小肠和结肠中等程度表达，在肾脏、胰腺、胸腺、***和睾丸中的表达程度低。而在脑、胎盘、肝或者外周血白细胞中检测不到VEGF-D的mRNA。

P1GF可以从足月的胎盘cDNA文库中分离得到。具体的分离过程和它的有关性质可见Maglione et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991 88 9267-9271。其具体的生物学功能目前尚不清楚。

VEGF2可以从高致瘤性不依赖***的人类乳腺癌细胞系中分离得到。VEGF2和PDGF具有22％的同源性，与VEGF具有30％的同源性。现在还没有方法可以分离编码VEGF2的基因，也没有VEGF2生物学活性的有关数据。

VEGF3可以从来源于结肠组织的cDNA文库中分离得到。VEGF3与VEGF相比，有36％相同性，66％相似性。现在还没有方法可以分离编码VEGF3的基因，也没有VEGF3生物学活性的有关数据。

两个蛋白的相似性是通过比较氨基酸序列和两个蛋白质之间保守氨基酸的取代决定的，而两个蛋白质的相同性只是比较氨基酸序列，而不比较两个蛋白质之间保守氨基酸取代。

PDGF/VEGF家族成员主要通过和酪氨酸激酶受体结合而起作用。现在已经发现有五种内皮细胞特有的酪氨酸激酶受体，分别命名为VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)、Tie和Tek/Tie-2。它们全都具有信号传导必须的酪氨酸激酶活性。在血管发生和血管生成中VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie和Tek/Tie-2起着非常关键和特异的作用，这已经通过在小鼠胚胎中通过定点突变使这些受体失活的试验得以证明。

现在所知的能和VEGFs结合的酪氨酸激酶受体为VEGFR-1VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1和VEGFR-2可以高特异的和VEGF结合，同时VEGFR-1还可以和VEGF-B和P1GF结合。VEGF-C是VEGFR-3的配体，同时也可以激活VEGFR-2(Joukov et al.,TheEMBO Journal,1996 15 290-298)。VEGF-D与VEGFR-2和VEGFR-3都可以结合。关于Tek/Tie-2的配体可以参见国际专利申请No.PCT/US95/12935(WO96/11269)(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)。Tie的配体至今仍然没有发现。

最近，一种新的VEGF同种型的特异受体已经被纯化并克隆，大小为130-135Kda(Soker et al.,Cell,1998 92 735-745)。这个VEGF受体可以通过外显子7编码的序列非常特异地和VEGF₁₆₅结合，但是它和肝素只有较弱的结合能力(Soker et al.,Cell,1998 92 735-745)。令人惊讶的是，这个受体与人类NP-1是相同的，NP-1是参与神经早期发生的一个受体。P1GF-2也可以和NP-1相互作用(Migdalet al.,J Biol.Chem.,1998 273 22272-22278)。

VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3由内皮细胞差异表达。VEGFR-1和VEGFR-2在血管内皮中表达(Oelrichs et al.,Oncogene,1992 8 11-18；Kaipainen et al.,J.Exp.Med.,1993 178 2077-2088；Dumont et al.,Dev.Dyn.,1995 203 80-92；Fong et al.,Dev.Dyn.,1996207 1-10)。VEGFR-3在成体组织的淋巴内皮中表达(Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sic.USA,1995 9 3566-3570)。VEGFR-3同时也可以在围绕肿瘤的血管中表达。

去除VEGFR基因会导致血管***发育异常，使得在妊娠中期胚胎死亡。通过对带有完全失活VEGFR-1基因的胚胎的分析显示这个受体在内皮功能性组织过程中是必须的(Fong et al.,Nature1995376 66-70)。但是,仅仅缺失了编码VEGFR-1的胞内酪氨酸激酶区域部分的基因却产生可以存活的具有正常血管***的小鼠(Hiratsukaet al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998 95 9349-9354)。上述差异的原因仍然有待解释，但是可以由此推测通过酪氨酸激酶进行的受体信号传导对于VEGFR-1的正常功能的实现并不是必须的。通过对具有失活的VEGFR-2基因的纯合体小鼠的研究表明，这个受体对于细胞增殖、血细胞生成和血管***的生成是必须的(Shalaby et al.,Nature,1995 376 62-66；Shalaby et al.,Cell,1997 89 981-990)。VEGFR-3的失活会造成心血管***的错误，因为这会使得大血管结构异常(Dumont et al.,Science,1998 282 946-949)。

虽然VEGFR-1主要在发育过程中在内皮细胞中表达，但是在胚胎发生早期在造血前体细胞中也产生(Fong et al.,Nature 1995 37666-70)。在成体中，单核细胞和巨噬细胞也表达这种受体(Barleon etal.,Blood,1996 87 3336-3343)。在胚胎中，VEGFR-1被绝大多数，但不是全部血管表达(Breier et al.,Dev.Dyn.,1995 204 228-239；Fong et al.,Dev.Dyn.,1996 207 1-10)。

受体VEGFR-3在胚胎发育早期在内皮细胞中广泛表达，但是随着胚胎发生的进程，它仅在静脉内皮和淋巴内皮中表达(Kaipainen etal.,Cancer Res.,1994 54 6571-6577；Kaipainen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995 92 3566-3570)。VEGFR-3在成体组织的淋巴内皮细胞中持续表达。这个受体在胚胎发生过程中对于血管发育是非常关键的。把小鼠的VEGFR-3基因进行定向的失活，由于带有缺陷腔体的大血管发生异常自组，会导致有缺陷的血管的形成，从而使得液体在心包腔中滞留，在***后9.5天心血管***发生功能障碍。根据这些发现，可以推测VEGFR-3在从初级血管网向更大的血管发育过程中是必须的。但是，VEGFR-3在***发育中的功能现在无法研究，因为上述的小鼠胚胎在淋巴***形成之前已经死亡。科学家们推测VEGFR-3在淋巴发生和成体中的淋巴内皮细胞中有一定的表达，从而对***发育和淋巴发生起作作用。这是根据在转基因小鼠的皮肤中发现VEGF-C的异位表达现象而作出的推测，得到的是一种VEGFR-3的配基，它的产生是由于真皮中淋巴内皮细胞的增殖和血管的增大。这个发现还进一步的显示，VEGF-C也许最基本的功能是它在淋巴内皮中的作用，另外辅助功能是与VEGF共同行使在血管生成中的作用，并且对血管渗透压进行调控(Joukov et al.,EMBO J.,1996 15 290-298)。

由于具有抗肿瘤组织血管发生的机制，一些VEGF和VEGF受体***的抑制剂可以抑制肿瘤的生长。见Kim et al.,Nature,1993 362841-844；Saleh et al.,Cancer Res.,1996 56 393-401。

由上述提及的内容，生长因子的VEGF家族是PDGF家族的成员。PDGF在***细胞、成纤维细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞的生长和运动方面均具有重要的作用(Heldin et al.,“Structureofplatelet-derived growth factor:Implications for functional properties”,Growth Factor,1993 8 245-252)。在成体中，PDGF可以促进创伤组织的愈合(Robson et al.,Lancet,1992 339 23-25)。结构上，PDGF是由二硫键连接的同源多肽链A或者B组成的同源二聚体(PDGF-AA或者PDGF-BB)或者异源二聚体(PDGF-AB)。

PDGF及其异构体是通过与靶细胞上两个结构相联系的受体酪氨酸激酶(RTKs)结合而实现其功能的。受体α和PDGF的A链、B链都能结合，而受体β只能和B链结合。这两种受体可以被许多体外培养的细胞系表达，但主要由体内的***表达。PDGFs可以在体外调控细胞增殖、细胞存活和对细胞的趋化性(可见综述Heldin et al.,Biochim Biophys Acta.,1998 1378 F79-113)。在体内，由于PDGFs在上皮细胞(PDGF-A)或者内皮细胞(PDGF-B)中表达，接近PDGFR表达的间质，所以PDGF可以以较快的方式发挥功效。在肿瘤细胞或者体外培养的细胞系中，PDGFs和PDGF受体的共表达会产生信号的自动传递环，这对细胞转型非常重要(Betsholtz et al.,Cell,1984 39 447-57；Keating et al.,J.R.Coil SurgEdinb.,1990 35 172-4)。PDGFs的过度表达在一些病理情况下被发现，包括恶性肿瘤、动脉硬化和纤维增殖病(Heldin et al.,TheMolecular and Cellular Biology of Wound Repair,New York:PlenumPress,1996,249-273)。

作为细胞增殖和细胞存活调控子的PDGFs的重要性在最近进行的小鼠相关基因的定向研究中被认识到，试验显示了除了不同的PDGFRs的配基之间会发生一些重叠之外，PDGFs和它们的受体在生理过程中所发挥的特有作用。具有两个无效突变的PDGF配基或者其受体的纯合体是无法存活的。大约50％的PDGF-A缺陷的纯合体小鼠具有早期致死表型，而剩余的存活的小鼠具有复杂的产后表现型，具体状况为由于缺少肺泡肌成纤维细胞而导致肺泡隔膜的异常形成，从而患有肺气肿(Bostrom et al.,Cell,1996 85 863-873)。另外，PDGF-A缺陷的小鼠还会具有表皮缺陷的表现型，特征为真皮组织较薄、畸形的毛囊和稀疏的毛发(Karlsson et al.,Development,1999 126 2611-2)。在少突神经胶质细胞的发育和中枢神经***的髓鞘形成的过程中也需要PDGF-A(Fruttiger et al.,Development,1999126 457-67)。PDGFR-α缺陷的表现型更容易发生早期胚胎死亡、头部非完全闭合、神经冠发育异常、心血管***缺陷和骨骼缺陷(Soriano et al.,Development,1997 124 2691-70)。PDGF-B和PDGFR-β缺陷的小鼠也具有与上述相似的表现型，特征常常为肾、血液和心血管***的异常(Leveen et al.,Genes Dev.,1994 8 1875-1887；Soriano et al.,Genes Dev.,1994 8 1888-96；Lindahi et al.,Science,1997277 242-5；Lindahi,Development,1998 125 3313-2)。其中肾和心血管***的异常至少部分上与缺乏壁细胞(心血管平滑肌细胞、外膜细胞或者肾小球膜细胞)的正确重组到血管相关(Leveen et al.,GenesDev.,1994 8 1875-1887；Lindahl et al.,Science,1997 277 242-5；Lindahlet al.,Development,1998 125 3313-2)。

本发明概述

本发明揭示了一种具有刺激和/或增强表达PDGF-D受体的细胞增殖或分化和/或生长和/或运动性活性的新的生长因子，这些细胞包括，但不仅仅限于，内皮细胞、***细胞、肌成纤维细胞和神经胶质细胞。另外，编码新的生长因子的分离的多核苷酸序列和用于诊断和/治疗的组合物都属于本发明的范畴。

本发明一方面提供了一种分离的及纯化的核酸分子，其包含的多核苷酸序列与图3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，图5所示序列(SEQ ID NO:5)的至少1～966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176～1288位核苷酸，或图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938～1288位核苷酸具有至少85％，优选至少90％，更优选至少95％的相同性。图3所示序列的至少1-600位核苷酸或图5所示序列的至少1-966位核苷酸的序列编码称为PDGF-D(先前称为“VEGF-G”)的5’截短的多肽，而图7所示序列的至少173-1288位核苷酸编码全长PDGF-D。PDGF-D在结构上与PDGF-A,PDGF-B,VEGF,VEGF-B,VEGF-C和VEGF-D同源。图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸序列编码PDGF/VEGF同源结构域的一部分，其是PDGF-D的生物学活性片段。此生物学活性片段还由图3所示序列的至少1～600位核苷酸序列，或图5所示序列的至少1～966位核苷酸序列编码。在优选的实施方案中，此核酸分子是一cDNA，其包含图3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1-600位核苷酸，图5所示序列(SEQ ID NO:5)的至少1-966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少173-1288位核苷酸，或图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸。本发明的此方面还涵盖了具有一序列的DNA分子，这样所述序列在严格条件下与图3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，图5所示序列的至少1-966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少173-1288位核苷酸，或图7所示序列的至少938-1288位核苷酸或它们的片段杂交。

本发明另一方面提供一种多肽，其具有刺激和/或增强表达PDGF-D受体的细胞增殖和/或分化和/或生长和/或运动性(motility)的能力，所述表达PDGF-D受体的细胞包括但非限于内皮细胞，***细胞，肌成纤维细胞和神经胶质细胞，该多肽包含相当于图4(SEQ ID NO:4)或图6(SEQ ID NO:6)或图8(SEQ ID NO:8)所示氨基酸序列或其片段或类似物的氨基酸序列，所述片段或类似物能刺激内皮细胞增殖，分化，迁移和/或***细胞(如成纤维细胞)的存活和/或生长和/或运动性。此多肽优选与图4(SEQ IDNO:4)或图6(SEQ ID NO:6)或图8(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列，或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物有至少85％，优选90％，更优选95％相同性，一优选的片段是包含PDGF-D的PDGF/VEGF同源结构域(PVHD)一部分的截短形式的PDGF-D。该部分PVHD是图8所示序列的255-371位残基，其中推定的蛋白酶解加工位点RKSK在255位残基(SEQ ID NO:8)开始。然而，PVHD自N末端延伸至图8序列(SEQ ID NO:8)的235位残基。在此PVHD被定义为截短的PDGF-D。截短的PDGF-D是PDGF-D的推定的活化形式。

本申请中所用的序列相同性百分比是使用Lasergene程序包的“MEGALIGN”序列对比工具(DNASTAR,Ltd.,Abacus House,ManorRoad,West Ealing,London W130AS Unified Kingdom)确定的。MEGALIGN基于J.Hein的方法(酶学方法，1990 183 626-645)。在成对方式序列对比中使用PAM250残基量表，其中缺口罚分为11和缺口长度罚分为3,K-tuple值为2。此序列对比然后人工校正并在适于对比的区域内估算相同性数目。

多肽或多核苷酸编码的多肽优选地能刺激一或多种表达PDGF-D受体的细胞的增殖，分化，运动性，存活或血管通透性，所述表达PDGF-D受体的细胞包括但非限于血管内皮细胞，***内皮细胞，***细胞(如成纤维细胞)，肌成纤维细胞和神经胶质细胞。此多肽或多核苷酸编码的多肽优选地能刺激伤口愈口。PDGF-D还能对细胞具有拮抗作用，但是包括在PDGF-D的生物学活性中。这些能力在后文称作“PDGF-D的生物学活性”，并通过本领域已知方法而易于测试。

本文所用术语“PDGF-D”统指图4(SEQ ID NO:4)，图6(SEQID NO:6)或图8(SEQ ID NO:8)所示多肽，及它们的具有上述PDGF-D生物学活性的片段或类似物，还指可编码PDGF-D或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物的多核苷酸。此多核苷酸可以是裸露的和/或在载体或脂质体中。

另一方面，本发明提供了具有PXCLLVXRCGGNCXC(SEQ IDNO:25)氨基酸序列的多肽，其是PDGF-D独有的而不同于生长因子的PDGF/VEGF家族的其它成员，因为在第3和第4个半胱氨酸之间***了3个氨基酸残基(NCG)(见图9-SEQ ID NO:10～18)。

包含保守氨基酸取代，***或缺失，但仍保留PDGF-D生物学活性的多肽在本发明范围之内。本领域技术人员熟知能方便用于产生这种多肽的方法，例如用定点诱变或特异酶切及连接。本领域技术人员还知道肽模拟化合物或其中一或多个氨基酸残基被非天然发生的氨基酸或氨基酸类似物置换的化合物仍可保留所需的PDGF-D生物学活性。这种化合物可易于产生并通过常规活性分析程序如成纤维细胞增殖分析而测试其呈现PDGF-D生物学活性的能力，这种化合物也在本发明范围内。

另外，PDGF-D多肽的可能变体形式及编码PDGF-D的核酸序列的天然发生的等位基因变体也涵盖在本发明范围之内，所述PDGF-D多肽的可能变体形式可得自可变剪切，如已知的发生在VEGF与VEGF-B中的剪切。本领域熟知等位基因变体，并相当于可变形式或含有一或多个核苷酸的取代，缺失或添加，但不引起编码的多肽有任何基本功能改变的核酸序列。

这种PDGF-D的变体形式可通过定向修饰PDGF-D多肽的非必需区域而制备。这些非必需区域预期在图9(SEQ ID NO:10-18)所示强保守的区域之外。尤其地，PDGF家族的生长因子包括PDGF-D都是二聚体的。PDGF-D与VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A和PDGF-B略有不同，因为其显示出在PVHD的8个半胱氨酸残基中只有7个是完全保守的(Olofsson等，美国科学院院报，1996 93 2576-2581；Joukov等，EMBO杂志，1996 15290-298)。这些半胱氨酸被认为参与分子内和分子间二硫键。由分子内二硫键形成的每个亚单位的环1,2和3参与与生长因子PDGF/VEGF家族受体的结合(Andersson等，生长因子，1995 12 159-164)。

本领域技术人员因此熟知这些半胱氨酸残基应保留在任何提出的变体形式中，且也应保留环1,2和3中存在的活性位点。然而，此分子的其它区域可预期是对生物学功能的重要性较小的，并因而允许适当的定向修饰。修饰的多肽通过常规活性分析程序如成纤维细胞增殖分析，而能易于测试其呈现PDGF-D生物学活性的能力。

可预期一些修饰的PDGF-D多肽具有与细胞上PDGF-D受体结合的能力，所述细胞包括但非限于内皮细胞，***细胞，肌成纤维细胞和/或神经胶质细胞，但不能刺激细胞增殖，分化，迁移，能动或存活，或不能诱导血管增殖，***发育或伤口愈合。这些修饰的多肽预期能作为PDGF-D多肽和PDGF/VEGF家族生长因子的竞争性或非竞争性抑制剂，并用于需要阻止或降低PDGF-D多肽或PDGF/VEGF家族生长因子作用的情况中。因此本发明也包括这种能结合受体但不促有丝***、不诱导分化、不诱导迁移、不诱导运动性、不促进存活、不促进***、不促进伤口愈合或不诱导血管增殖的PDGF-D多肽的变体，在此称为“结合受体但无其它活性的变体”。由于PDGF-D形成二聚体以激活其仅知的受体，预期一个单体包含结合受体但无其它活性的变体修饰的PDGF-D多肽，第二个单体包含野生型PDGF-D或PDGF/VEGF家族野生型生长因子。这些二聚体可结合其相应受体，但不能诱导下游信号。

还预期有其它能阻止野生型PDGF-D或VEGF/PDGF家族野生型生长因子与细胞上其相应受体结合的修饰的PDGF-D多肽，所述细胞包括但非限于内皮细胞，***细胞(如成纤维细胞)，肌成纤维细胞和/或神经胶质细胞。因此这些二聚体不能刺激内皮细胞增殖，分化，迁移，存活或诱导血管通透性，和/或刺激***细胞、肌成纤维细胞或神经胶质细胞的增殖和/或分化和/或运动性。这些修饰的多肽预期能作为PDGF-D生长因子或PDGF/VEGF家族生长因子的竞争性或非竞争性抑制剂，并用于需要阻止或降低PDGF-D生长因子或PDGF/VEGF家族生长因子作用的情况中。这种情况包括发生在肿瘤细胞通过原始或转移肿瘤形成而侵染正常细胞群期间的组织重塑。因此这种结合PDGF-D或PDGF/VEGF家族生长因子，但不促有丝***、不诱导分化、不诱导迁移、不诱导运动性、不促进存活、不促进***、不促进伤口愈合或不促进血管增殖的PDGF-D生长因子的变体也包括在本发明范围之内，并在此称为“形成PDGF-D生长因子二聚体但无其它活性或干扰变体”。

形成PDGF-D生长因子二聚体但无其它活性或干扰变体例如是具有阻止CUB结构域从蛋白质裂解的突变的PDGF-D。进一步预期可产生包含与CUB结构域连接的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-C,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF的单体，优选活化的单体的形成PDGF生长因子二聚体但无其它活性的变体，该CUB结构域具有阻止CUB结构域从蛋白质裂解的突变。上述形成PDGF-D生长因子但无其它活性的变体与连接有突变CUB结构域的单体形成的二聚体不能结合其相应受体。

此期望变体的一个变化是在VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-C,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF的活化的单体与突变CUB结构域的连接之间，***一蛋白酶解位点，所述突变CUB结构域是与活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,PDGF-D或P1GF单体二聚体化的。加入此蛋白酶解位点特异的蛋白酶将酶切CUB结构域，从而释放活化的二聚体，其随后能与其相应受体结合。在此方式中，可对活化的二聚体的释放加以控制。

根据本发明的第三方面，提供了编码上述本发明多肽或多肽片段的纯化的及分离的核酸。此核酸可以是DNA，基因组DNA,cDNA或RNA，且可以是单链或双链的。此核酸可以分离自细胞或组织来源，或是重组或合成起源的。由于遗传密码的简并，本领域技术人员意识到许多这样的编码序列是可能的，其中每个序列编码图4(SEQID NO:4)，图6(SEQ ID NO:6)或图8(SEQ ID NO:8)所示氨基酸序列，其生物学活性片段或类似物，其结合受体但无其它活性或部分失活的变体，或其形成PDGF-D二聚体但无其它活性或干扰变体。

本发明第四方面提供了包含本发明的cDNA或核酸分子的载体，及用本发明的核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。这些细胞可以是真核或原核细胞。这些细胞尤其适于表达本发明的多肽，其包括昆虫细胞如Sf9细胞，Sf9细胞得自美国典型培养物保藏中心(ATCC SRL-171)，并用杆状病毒载体转化，这些细胞还包括用适当表达质粒转染的人胚胎肾细胞系293-EBNA。本发明优选的载体是表达载体，其中本发明的核酸有效地连接于一或多个适当的启动子和/或其它控制序列，这样用载体转化或转染的适当的宿主细胞能表达本发明的多肽。其它优选的载体是那些适于转染哺乳动物细胞，或适于基因治疗的载体，如腺病毒载体，痘苗载体或逆转录病毒载体或脂质体。本领域已知许多这种载体。

本发明还提供了一种产生能表达由本发明核酸分子编码的多肽的载体的方法，包括如上述将核酸分子有效地与一或多个适当的启动子和/或其它控制序列连接。

本发明还提供了一种生产本发明多肽的方法，包括在宿主细胞中表达核酸分子或载体，并从宿主细胞或宿主细胞的生长培养基中分离多肽。

本发明另一方面提供了与本发明的多肽或多肽片段特异反应的抗体。此抗体包括特异于PDGF-D的变体、免疫反应片段、类似物及重组体的抗体。这种抗体用作PDGF-D的抑制剂或***并用作诊断剂以检测并定量PDGF-D。可使用多克隆或单克隆抗体。单克隆和多克隆抗体可以用本领域标准方法，通过针对本发明的多肽或其片段或类似物而产生。另外，此多肽可与表位标记如FLAG八肽(Sigma,St.Louis,Mo)结合，以助于亲和纯化。为了某些目的，例如单克隆抗体用于临床抑制PDGF-D的功效时，需要用人化或嵌合的单克隆抗体。这种抗体可以是通过加入胞毒性或细胞抑制性药物而进一步修饰的。本领域熟知生产这些抗体的方法，包括重组DNA方法。

本发明的抗体还包括识别PDGF-D并适当标记的抗体。

本发明的多肽或抗体可用可检测标志物标记以用于诊断目的。相似地，本发明这样标记的多肽可用于鉴别其体内相应受体。此多肽或抗体可共价或非共价地偶联于适当的超磁性的，顺磁性的，电子致密的，生态的或放射活性的试剂以显影。诊断分析可使用放射性或非放射性标记。放射性标记例如包括放射性原子或基团如125I或32P。非放射性标记例如包括酶标记如辣根过氧化物酶，或荧光性标记如异硫氰酸荧光素(FITC)。标记可以是直接或间接的，共价或非共价的。

本发明的临床应用包括诊断应用，加速组织或器官移植中血管生成，或刺激伤口愈合或***发育，或在梗塞组织或狭窄动脉情况下如冠状动脉疾病时建立侧支循环，及抑制癌症或糖尿病视网膜病变中的血管生成，并抑制发生在肿瘤细胞通过原发或转移肿瘤形成而侵染正常细胞群期间的组织重塑。PDGF-D在癌症活组织检查样品中的数量可用作进一步转移的危险指标。

PDGF-D还与各种肺系疾病相关。PDGF-D分析可用于诊断各种肺部疾病。PDGF-D还用于治疗肺部疾病以改良肺部血液循环和/或肺与血液之间的气体交换。相似地，PDGF-D可用于改良心脏病人的心脏血液循环及氧气的通透性。以相似的方式，PDGF-D可用于改善慢性阻塞性呼吸道疾病中的血液流动及气体交换。

因此，本发明提供了在需要这种治疗的哺乳动物体内刺激血管生成，***生成，神经发育，***发育和/或伤口愈合的方法，包括给哺乳动物施用有效量的PDGF-D，或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物。任选地，PDGF-D或其片段或类似物可与一或多个VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,FGF和/或肝素一起或缀合施用。

相反，PDGF-D拮抗剂(如抗体和/或二聚体形成及受体结合中PDGF-D结合的竞争性或非竞争性抑制剂)可用于治疗一些疾病，如充血性心脏病，包括由于血管通透性增加导致的肺内积液，可通过对血管通透性施加分流作用以抵销积液。施用PDGF-D可用于治疗肠道，肝或肾吸收不良综合征，使其血液循环增加及血管通透性提高。

因此，本发明提供了一种在需要这种治疗的哺乳动物体中抑制血管生成，***生成，神经发育，***发育和/或伤口愈合的方法，包括给此哺乳动物施用有效量的PDGF-D的拮抗剂。该拮抗剂可以是阻止PDGF-D作用的任何制剂，可通过阻止PDGF-D与其靶细胞上相应受体结合，或如用结合受体的PDGF-D变体阻止受体的作用而进行。适当的拮抗剂包括但非限于抗PDGF-D的抗体；PDGF-D与PDGF-D受体结合的竞争性或非竞争性抑制剂，如上述结合受体或形成PDGF-D二聚体但不促有丝***的PDGF-D变体；和如下述的反义核苷酸序列。

本发明提供了一种确定与活化的截短形式的PDGF-D结合的制剂的方法。此方法包括将活化的截短形式的PDGF-D与测试的制剂接触，并通过任何适当方法监测结合情况。制剂中包括化合物和其它蛋白质。

本发明提供了一种筛选***，以揭示与活化的截短形式的PDGF-D结合的制剂。此筛选***包括制备活化的截短形式的PDGF-D，将此活化的截短形式的PDGF-D暴露于测试制剂，并通过任何适当方式确定所述制剂与活化的截短形式的PDGF-D的结合数量。此筛选***还可用于鉴别抑制全长PDGF-D蛋白的蛋白酶裂解，从而阻止活化的截短形式的PDGF-D释放的制剂。为此，必须制备全长PDGF-D。

使用此筛选***可确定可以改变PDGF-D生物学功能的化合物。此筛选方法可适应大规模的自动程序如PANDEX^(Baxter-DadeDiagnostics)***，以充分高容量筛选潜在的治疗剂。

为了此筛选***，如本文所述制备活化的截短形式的PDGF-D或全长PDGF-D，优选用重组DNA技术制备。将一测试制剂如化合物或蛋白质导入含有活化的截短形式的或全长PDGF-D的反应容器中。通过任何适当方式确定测试制剂与活化的截短形式的或全长PDGF-D的结合情况，包括但非限于使用放射性或化学性标记的测试制剂。活化的截短形式的或全长PDGF-D的结合也可如美国专利5,585,277中所述方法进行。在此方法中，通过监测折叠的蛋白与未折叠蛋白的比率，确定测试制剂与活化的截短形式的或全长PDGF-D的结合情况。此监测例如可包括但非限于监测活化的截短形式的或全长PDGF-D对蛋白酶的敏感性，或监测抗折叠蛋白的特异抗体与蛋白质结合的性质。

本领域技术人员将意识到IC₅₀值取决于测试制剂的选择性。例如，IC₅₀小于10nM的制剂通常被认为是药物治疗的良好候选物。然而，对于特定靶具有低亲和性但有选择性的制剂可以是更好的候选物。本领域技术人员意识到关于特定制剂的结合潜能，抑制活性或选择性的信息对药物的开发是有用的。

在PDGF-D或PDGF-D拮抗剂用于治疗目的时，施用剂量和途径将依赖于患者的性质及要治疗的疾病而定，且随医生或兽医诊断而定。适当的施用途径包括口服，皮下注射，肌肉注射，腹膜内注射或静脉内注射，非肠道施用，局部应用，植入等，PDGF-D局部应用与VEGF的局部应用方式相同。在用于伤口愈合或增加血管生成是有利的情况下，施用于生物体的活化的截短形式的PDGF-D的有效量是在每公斤体重0.1～1000μg之间。

PDGF-D或PDGF-D拮抗剂可与适当的药物载体组合应用。所得组合物包括治疗有效量的PDGF-D或PDGF-D拮抗剂，及其药物可接受无毒性盐，和药物可接受固态或液体载体或佐剂。这种载体或佐剂例如包括但非限于盐水，缓冲盐水，Ringer’s溶液，矿物油，滑石，玉米淀粉，明胶，乳糖，蔗糖，微晶纤维素，高岭土，甘露糖醇，磷酸二钙，氯化钠，藻酸，葡萄糖，水，甘油，乙醇，增稠剂，稳定剂，悬浮剂及其组合。这种组合物可以是溶液，悬浮液，片剂，胶囊，乳剂，油膏，酏剂，糖浆，糊片包干药，软膏或其它常用形式。配方要适于施用方式。含有PDGF-D的组合物还可任选地进一步包含一或多种PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C,VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF和/或肝素。含有PDGF-D的组合物将含有大约0.1％～90％(重)的活性化合物，优选10％～30％的活性化合物。

为制备肌内注射剂，可将一无菌配方优选活化的截短形式PDGF-D的适当可溶性盐，如盐酸盐，溶解并于药物稀释剂如无热原水(蒸馏水)，生理盐水或5％葡萄糖溶液中施用。可制备适当的不溶形式的化合物，并于水性基质或药物可接受油性基质例如长链脂肪酸酯如油酸乙酯中形成悬浮液而施用。

本发明另一方面提供了典型地为测试试剂盒形式的诊断/预防装置。例如在本发明的一个实施方案中，提供了一种诊断/预防性测试试剂盒，其包括PDGF-D的抗体及检测更优选地评价抗体与PDGF-D之间的结合的手段。在本发明优选的一个诊断/预防性装置的实施方案中，提供了抗PDGF-D的抗体(一级抗体)的相同同种型和动物来源的抗体的二级抗体。此二级抗体直接或间接地与可检测标记偶联，然后未标记的一级抗体或PDGF-D结合底物，如此在一级抗体与PDGF-D结合，随后标记的二级抗体与一级抗体结合后，测定与底物结合的标记数量，可确定PDGF-D/一级抗体间的相互作用。在本发明尤为优选的实施方案中，提供的诊断/预防装置是常用的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。

在另一实施方案中，诊断/预防装置可包括聚合酶链反应手段，以确定测试个体PDGF-D的序列差异及对比此序列结构与本发明揭示的序列结构间的任何异常，以确定PDGF-D表达中的任何异常是否与给定的疾病相关。

另外，诊断/预防装置可包括限制性片段长度多态性(RFLP)产生手段，其是利用限制酶和测试个体的基因组DNA在凝胶上产生DNA条带模式，并对比此模式与本发明揭示的模式，以确定PDGF-D表达中的任何异常是否与给定疾病相关。

本发明另一方面提供了检测测试个体中PDGF-D基因结构中异常的方法，该基因结构异常与测试个体中给定疾病相关。此方法包括提供所述测试个体的DNA样品；将此DNA样品与有效地与聚合酶偶联的一系列特异于PDGF-D DNA的引物接触；通过聚合酶链反应选择性地扩增样品中的DNA；并将扩增的PDGF-D DNA的核苷酸序列与图3(SEQ ID NO:3)，图5(SEQ ID NO:5)或图7(SEQ ID NO:7)所示核苷酸序列相对比。本发明还提供了一种测试试剂盒，其包括有效与聚合酶偶联的一对特异于PDGF-DDNA的引物，从而所述聚合酶能选择性地扩增DNA样品中的PDGF-DDNA。

本发明还提供了一种检测生物样品中PDGF-D的方法，包括将此样品与能结合PDGF-D的试剂接触，并检测结合情况。优选的能结合PDGF-D的试剂是抗PDGF-D的抗体，尤其是单克隆抗体。在一优选的实施方案中，通过可检测的标记检测结合情况，适当的标记如上所述。

本发明另一方面提供一种包含PDGF-D多肽的蛋白质二聚体，尤其是二硫键连的二聚体。本发明的蛋白质二聚体包括PDGF-D多肽的同源二聚体、及PDGF-D与VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,P1GF,PDGF-A,PDGF-B或PDGF-C的异源二聚体。

本发明再一方面提供了分离PDGF-D的方法，包括将表达PDGF-D的细胞暴露于肝素，以促进细胞释放PDGF-D，并纯化这种释放的PDGF-D。

本发明另一方面提供了一种载体，其包含与编码PDGF-D或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物的DNA序列的至少一部分互补的反义核苷酸序列。另外，此反义核苷酸序列可以针对PDGF-D基因的启动子区或其它非编码区，其可以用于抑制或至少减轻PDGF-D表达。

根据本发明的另一方面，这种含有反义序列的载体可用于抑制或至少减轻PDGF-D表达。使用这类抑制PDGF-D表达的载体在PDGF-D表达与疾病相关的情况下是有利的，所述疾病例如肿瘤产生PDGF-D以提供血管生成，或在肿瘤细胞通过原发或转移肿瘤形成侵染正常细胞群期间发生的组织重塑。用含有反义核苷酸序列的载体转化这种肿瘤细胞将抑制或延迟血管生成，及抑制或延迟肿瘤或重塑组织的生长。

本发明的另一方面涉及的是发现全长PDGF-D蛋白似乎是潜伏生长因子，其需要通过蛋白酶加工释放活性PDGF/VEGF同源结构域而被激活。一推定的蛋白酶解位点发现在全长蛋白的255-258位残基，即RKSK残基(SEQ ID NO:9)。这是二碱性基序。推定的-RKSK-(SEQ ID NO:9)蛋白酶解位点也发现在PDGF-A,PDGF-B,VEGF-C和VEGF-D中。在这四种蛋白中，还发现推定的蛋白酶解位点就在PDGF/VEGF同源结构域的最小结构域之前。这些事实表明这是蛋白酶解位点。

优选的蛋白酶包括但非限于纤溶酶，因子X和肠激酶。N末端CUB结构域可作为抑制结构域，其可用于在一些胞外区室中保持PDGF-D处于潜伏形式，且当需要PDGF-D时，通过有限蛋白酶解将其除去。

本发明另一方面提供了生产活化的截短形式PDGF-D或调节PDGF-D结合受体的特异性的方法。这些方法包括表达含有编码具有PDGF-D生物学活性的多肽的多核苷酸的表达载体，并提供蛋白酶解量的至少一种酶加工表达的多肽以产生活化的截短形式PDGF-D。

本发明此方面还包括选择性活化具有生长因子活性的多肽的方法。此方法包括表达含有一种多核苷酸的表达载体，该多核苷酸编码具有生长因子活性，CUB结构域及多肽与CUB结构域之间的蛋白酶解位点的多肽，此方法并还包括提供蛋白酶解量的至少一种酶加工表达的多肽以产生具有生长因子活性的活化的多肽。

另外，本发明的此方面还包括分离编码具有PDGF-D生物学活性的多肽，或编码包含具有氨基酸序列RKSR(SEQ ID NO:9)或其相反结构氨基酸序列的多肽的核酸分子的方法。

本发明的此方面还包括一种分离的二聚体，其包含一活化的PDGF-D单体和一活化的与CUB结构域连接的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B,PDGF-C或P1GF单体，或者是包含活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF单体及与CUB结构域连接的活化的PDGF-D单体。此分离的二聚体可以包括或不包括在活化的单体与CUB结构域连接之间的蛋白酶解位点。

本发明的多核苷酸，如上述那些多核苷酸及其片段，及在严格条件下与那些多核苷酸的非编码链杂交的多核苷酸变体都可用于鉴别，纯化及分离编码其它非人类哺乳动物的PDGF-D的多核苷酸。因此，这种多核苷酸片段和变体也是本发明的一部分。严格杂交条件例如是如下所示：在42℃在5X SSC,20mM NaPO₄,pH6.8,50％甲酰胺中杂交；并在42℃用0.2×SSC洗涤，本领域技术人员知道根据杂交序列的长度及GC核苷酸碱基含量可对杂交条件加以改变，并且存在测定这种改变的公式。例如参见Sambrook等，“分子克隆实验手册”，第二版，P9.47-9.51，冷泉港，纽约：冷泉港实验室(1989)。

另外，纯化及分离的编码其它非人类哺乳动物PDGF-D的多核苷酸，及由其编码的多肽及与非人类PDGF-D变体特异免疫反应的抗体也是本发明的一部分。因此，本发明包括一种纯化及分离的哺乳动物PDGF-D多肽，还包括一种编码这种多肽的纯化的及分离的多核苷酸。

应清楚的是，本发明的核酸和多肽可通过合成方式或重组方式制备，或可从天然来源中纯化。

更应清楚的是本文所用术语“包含”是指“包括但非限于”之意。

附图简述

图1(SEQ ID NO:1)示出一个核苷酸序列，其包括编码人PDGF-D(hPDGF-D)C末端部分的cDNA序列。编码hPDGF-D部分片段的核苷酸是1～198位核苷酸。衍生自图1所示序列1-198位核苷酸的推导的部分hPDGF-D氨基酸序列(SEQ ID NO:2,66个氨基酸残基)示于图2。

图3(SEQ ID NO:3)示出编码hPDGF-D的部分人cDNA的延伸序列。翻译的cDNA序列是从1至600位核苷酸。衍生自图3的1～600位核苷酸的推导的部分hPDGF-D氨基酸序列(200个残基，SEQ ID NO:4)示于图4。

图5示出部分人cDNA的进一步延伸的核苷酸序列。编码5’截短的全长hPDGF-D的核苷酸是1～966位(SEQ ID NO:5)。衍生自图5的1～966位核苷酸的推导的部分hPDGF-D氨基酸序列(322个残基，SEQ ID NO:6)示于图6。

图7(SEQ ID NO:7)示出编码hPDGF-D的cDNA的完整核苷酸序列(1116bp)，由其编码的含有371个氨基酸残基的推导的全长hPDGF-D的氨基酸序列示于图8(SEQ ID NO:8)。

图9示出hPDGF-D中PDGF/VEGF同源结构域与VEGF/PDGF家族的一些生长因子(分别为SEQ ID NO:10-18)之间的氨基酸序列对比。

图10示出VEGF/PDGF家族的一些生长因子的***发育世系图。

图11提供了hPDGF-D中存在的CUB结构域(SEQ ID NO:19)和其它CUB结构域即人骨形态发生蛋白-1中存在的CUB结构域(hBMP-1,CUB1-3结构域)(分别为SEQ ID NO:20-22)和人neuropilin-1的2个CUB结构域(分别为SEQ ID NO:23-24)之间的氨基酸序列对比。

图12示出含有截短的PDGF-D的条件培养基刺激PAE-1细胞中的PDGFβ-受体的酪氨酸磷酸化。

图13示出含有截短的PDGF-D的条件培养基(CM)与PDGF-β受体竞争结合PDGF-BB同源二聚体而不与PDGF-α受体竞争结合PEGF-AA同源二聚体。

优选的实施方案详述

图1示出了编码称为PDGF-D(先前称为VEGF-G)的一种新生长因子的C末端部分的人cDNA核苷酸序列。PDGF-D是VEGF/PDGF家族的一个新成员。图1的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)衍生自位于华盛顿特区的NCBI的dbEST数据库中的人EST序列(id.A1488780)。图1(SEQ ID NO:1)的cDNA的1～198位核苷酸编码一个66个氨基酸的多肽(图2,SEQ ID NO:2)，该多肽与VEGF/PDGF家族的已知成员具有一些序列相似性。

由图1(SEQ ID NO:1)所示多核苷酸的1-198位核苷酸编码的多肽的氨基酸序列示于图2(SEQ ID NO:2)。

为产生更多的关于人PDGF-D的序列信息，用一个327bp的经聚合酶链反应(PCR)产生的探针，基于先前鉴别的EST序列筛选人胎肺λgt10 cDNA文库。该探针通过用衍生自鉴别的EST(AI488780)的两个引物经PCR扩增产生自商购的人胎肺cDNA文库(Clontech)的DNA。此二个引物是

5’-GTCGTGGAACTGTCAACTGG(正向)(SEQ ID NO:26)和

5’-CTCAGCAACCACTTGTGTTC(反向)(SEQ ID NO:27)。

扩增的327bp的片段克隆至pCR2.1载体中(Invitrogen)。对核苷酸测序检定***物相当于EST。此筛选鉴别了一些阳性克隆，将这些克隆中克隆5和克隆8的***物亚克隆至pBluescript中，并用内在的或载体特异性引物进行核苷酸测序。确定的核苷酸序列与上述二克隆相同，并示于图3(SEQ ID NO:3)。690bp的多核苷酸的编码区是编码除5’端之外大部分hPDGF-D的核苷酸1-600(SEQID NO:3)。hPDGF-D的此部分包括hPDGF-D的生物学活性片段。衍生自图3(SEQ ID NO:3)的1～600位核苷酸的推导的hPDGF-D的部分氨基酸序列(200个残基，SEQ ID NO:4)示于图4(SEQID NO:4)。

对从这一人胎肺cDNA文库的分离的人PDGF-D cDNA克隆的延伸的核苷酸进行测序，提供了另外的序列。图5(SEQ ID NO:5)示出了编码hPDGF-D的部分人cDNA(1934bp)的核苷酸序列。此1934bp多核苷酸的编码区是编码除5’最末端之外hPDGF-D多肽的1-966位核苷酸。衍生自图5(SEQ ID NO:5)1-966位核苷酸的推导的hPDGF-D的部分氨基酸序列(322个残基，SEQ ID NO:6)示于图6(SEQ ID NO:6)。

图7示出编码全长hPDGF-D的cDNA的多核苷酸序列。编码PDGF-D的区域是1116bp。全长hPDGF-D的推导的氨基酸序列是371个氨基酸残基(图8,SEQ ID NO:8)。

全长PDGF-D的5’端序列是用cDNA末端快速扩增(RACE)PCR和含有人心脏cDNA的克隆(Marathon-Ready^TM cDNA,Clontech,Cat#7404-1)获得的。这些eDNA克隆有一附着于每个克隆的5’端的衔接头序列，其包括称为衔接子引物1的位点(Clontech:5’9CCAT CCTAATACGACTCACTATAGGGC 3’9)(SEQ ID NO:28)。此引物和第二个引物5’AGTGGGATCCGTTACTGATGGAGAGTTAT3’(SEQ ID NO:29)用于扩增在PDGF-D5’端发现的序列。在PCR反应中，使用一种特殊的聚合酶混合物(Advantage＜＜-GC cDNAPCR试剂盒，Clontech,Cat#K1907-1)。反应混合物包括：

衔接子引物1 1μl

基因特异性引物 1μl

模板(人心脏cDNA) 5μl

GC-Melt(取自K1907-1试剂盒) 5μl

5×GC cDNA PCR反应缓冲液 10μl

50×dNTP混合物 1μl

无菌水 27μl

共计 50μl。

将PDGF-D的5’端扩增31个循环，5个循环包括在94℃变性45秒并在72℃延伸4分钟；另5个循环包括在94℃变性45秒并在70℃延伸4分钟；再5个循环包括在94℃变性45秒并在68℃延伸4分钟，且初始在94℃变性2分钟。从该PCR中获得大约790bp长的产物。将此产物置于1％琼脂糖凝胶中，并从此凝胶中纯化(QIA快速凝胶提取试剂盒，Qiagen,Cat#28706)及转化到大肠杆菌(E.coli)中。铺板转化的细菌并在37℃温育过夜。挑取单一克隆在新鲜培养基中生长过夜。制备质粒(QIAprep Spin微量制备试剂盒，Qiagen,Cat#27106)，并用质粒引物T7和M13R测序。测序结果是获得312bp的先前未知的PDGF-D序列。此序列的剩余部分(478bp)与先前从其它PDGF-D cDNA克隆中获得的序列相同。

图9示出PDGF-D的PDGF/VEGF同源结构域(发现在多肽的C末端区内)，与PDGF/VEGF家族成员VEGF₁₆₅,P1GF-2,VEGF-B₁₆₇,Pox Off VEGF,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A和PDGF-Br的PDGF/VEGF同源结构域(分别为SEQ ID NO:10-18)的氨基酸序列对比。在此图中VEGF-C和VEGF-D的N和C末端区域内缺失一些氨基酸序列。导入缺口以使序列对比最佳化。此序列对比是用基于J.Hein的方法(酶学方法，1990 183 626-45)的MEGALIGN序列对比工具产生的。在成对序列对比中，使用使用PAM250残基量表，其中缺口罚分为11和缺口长度罚分为3,K-tuple值为2。然后人工校正此序列对比，并确定在适于对比的区域内相同的数目。框内残基代表在二个相隔单位内与VEGF-D配对的氨基酸。

该序列对比示出PDGF-D具有期望的不变半胱氨酸残基模式一此家族成员的标志，但有二个例外。第一个例外发生在半胱氨酸3和4之间。正常情况下这二个半胱氨酸间隔2个残基，而PDGF-D有3个额外氨基酸(NCA)***。PDGF-D中此序列特点是出乎预料的。第二个例外是在PDGF/VEGF家族其它成员中发现的不变的第5个半胱氨酸在PDGF/VEGF中不是保守的。这一特征是PDGF-D中特有的。

基于图9的氨基酸序列对比，构建发育世系图并示于图10。数据示出PDGF-D的PVHD与VEGF-C和VEGF-D的PVHDs密切相关。

CUB结构域

图11的部分PDGF-D氨基酸序列的N末端区(54-171位残基)(SEQ ID NO:8)有称作CUB结构域(Bork和Beckmann，分子生物学杂志，1993 231,539-545)的第二个独特的蛋白质结构域。此大约115个氨基酸的结构域初始是在补体因子Clr/Cls中鉴别的，但近年来已在一些其它胞外蛋白质中鉴别，包括信号分子如骨形态发生蛋白1(BMP-1)(Wozney等，科学，1988 242,1528-1534)，以及一些受体分子如neuropilin-1(NP-1)(Soker等，细胞，1998 92 735-745)。CUB结构域的作用原理还不清楚，但它们参与蛋白质之间相互作用或与碳水化合物包括肝素硫酸粘蛋白相互作用。这些相互作用可发挥PDGF-D的蛋白酶解作用。

如图11所示，对比了一些含有CUB的蛋白质的氨基酸序列。结果示出人PDGF-D中的单一CUB结构域(SEQ ID NO:19)与大多数密切相关的CUB结构域明显一致。图中示出了具有3个CUB结构域(分别为SEQ ID NO:20-22)(CUB1-3)的人BMP-1序列，和具有2个CUB结构域(CUB 1-2)(分别为SEQ ID NO:23-24)的人neuropilin序列。此序列对比如上述产生。

实施例1:PDGF-D转录物的表达

为研究PDGF-D在一些人体组织中的表达，用商购的多重组织Northern印迹试剂盒(MTN,Clontech)进行Northern印迹。根据供应商的指导，用Express Hyb溶液在68℃将印迹杂交1小时(高度严格条件)，并用327bp的经PCR产生自人胎肺组织cDNA文库的探针(如上所述)探查。该印迹随后在50℃用含有0.05％SDS的2X SSC洗涤30分钟，并在50℃用含有0.1％SDS的1X SSC洗涤40分钟。然后将此印迹进行照相并在-70℃曝光。概括于表1的结果示出PDGF-D转录物在心脏，胰腺和卵巢是高度表达的，而在胎盘，肝，肾，***和睾丸是低表达的。人PDGF-D转录物长度大约为4kb。

表1：通过Northern印迹分析测定的PDGF-D转录物在一些人体组织中的相对表达水平

组织水平* 表达

心脏 +++++

脑 n.d.

胎盘 ++

肺 +

肝 ++

骨骼肌 n.d.

肾 ++

胰腺 ++++

脾 +

胸腺 +

*** ++

睾丸 +++

卵巢 +++++

小肠 ++

结肠 +

外周血白细胞 +

*条带的相对强度目视确定，最高表达(+++++)，最低表达(+),n.d代表未检测到。

实施例2：截短的PDGF-D的受体结合性质

为确定截短的PDGF-D与VEGF受体间的相互作用，对截短的PDGF-D结合含有人VEGFR-1,VEGFR-2,VEGFR-3的胞外结构域的可溶性Ig-融合蛋白的能力进行测试(Olofsson等，美国科学院学报，1998 95 11709-11714)。一种编码PDGF-D的PDGF/VEGF同源结构域的表达载体在载体pSecTag(Invitrogen)中产生。引物5’-CCCAAGCTTGAAGATCTTGAGAATAT 3’(正向)(SEQ ID NO:30)和5’TGCTCTAGATCGAGGTGGTCTT3’(反向)(SEQ ID NO:31)用于扩增编码图6(SEQ ID NO:6)的186-322位氨基酸残基的一个429bp的片段(图5的556-966位核苷酸)(SEQ ID NO:5)。此片段随后克隆入HindⅢ和XbaⅠ消化的表达载体中。用编码截短的PDGF-D的该表达载体或对照载体经磷酸钙沉淀转染COS细胞。表达的多肽包括C末端c-myc标记和6x His标志(均衍生自pSecTag载体)。

将称为VEGFR-1-Ig,VEGFR-2-Ig和VEGFR-3-Ig的Ig-融合蛋白在人293 EBNA细胞中瞬时表达。所有的Ig-融合蛋白都是人VEGFR。将细胞在转染后培育24小时，用含有0.2％小牛血清白蛋白(BSA)的Dulbeccos极限必需培养基(DMEM)洗涤并饥饿24小时。然后用蛋白质A-琼脂糖凝胶珠(Pharmacia)将融合蛋白从澄清的条件培养基中沉淀。将珠与100微升的10X结合缓冲液(5％BSA,0.2％Tween20和10μg/ml肝素)和900微升的条件培养基合并，该条件培养基制备自用截短的PDGF-D的表达载体或对照载体转染的COS细胞。细胞然后用³⁵S-半胱氨酸和甲硫氨酸(Promix,Amersham)代谢性标记4-6小时。在2.5小时后，在室温用结合缓冲液洗涤3次，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤1次，并在SDS-PAGE缓冲液中煮沸。对与Ig-融合蛋白结合的标记的蛋白在还原条件下进行SDS-PAGE分析。放射标记的蛋白用磷光显像分析仪和/或照相检测。在所有这些分析中，放射标记的PDGF-D未示出与任何VEGF受体的任何相互作用。这些结果表明分泌性截短的PDGF-D不与VEGF受体R1,R2和R3结合。

实施例3:PDGFβ-受体磷酸化

为测试PDGF-D是否导致PDGFβ-受体磷酸化增加，对截短的PDGF-D结合PDGFβ-受体和刺激磷酸化增加的能力进行测试。将稳定地表达人PDGFβ-受体的血清饥饿的猪动脉内皮-1(PAE-1)细胞(Eriksson等，EMBO杂志，1992 11 543-550)，在冰上与一种溶液保温90分钟，该溶液为条件培养基与等体积的含有1mg/ml BSA的PBS混合形成。此条件培养基制备自用PDGF-A或截短的PDGF-D的表达载体(如实施例1中构建)，或模拟对照载体转染的COS细胞。转染24小时后，将培养基用含有1mg/ml血清白蛋白的无血清培养基置换。另外培养48小时后收获条件培养基。在加入条件培养基60分钟后，细胞在裂解缓冲液(20mMTRIS-HCl,pH7.5,0.5％Triton X-100,0.5％脱氧胆酸，10mM EDTA,1mM正钡酸盐，1mM PMSF,1％抑肽酶)中裂解。PDGFβ-受体用抗人PDGFβ-受体的兔抗血清(Eriksson等，EMBO杂志，199211 543-440)从澄清的裂解物中免疫沉淀出来。此沉淀的受体施加于SDS-PAGE凝胶，在SDS凝胶电泳后，将沉淀的受体移至硝基纤维素滤膜，并将滤膜用抗磷酸酪氨酸抗体PY-20(转导实验室)探查。然后将此滤膜与辣根过氧化物酶缀合的抗鼠抗体保温。结合的抗体用增强的化学发光(ECL,Amershal Inc.)检测。然后将滤膜切成细条并用PDGFβ-受体兔抗血清再探查，受体的量通过与辣根过氧化物酶缀合的抗兔抗体保温而测定。结合的受体用增强的化学发光(ECL,Amersham Inc)检测。用PDGFβ-受体抗体探查滤膜证实在所有泳道中受体的量相等。用人重组PDGF-BB(100ng/ml)和未处理的细胞作对照实验。图11示出含有条件培养基的截短的PDGF-D刺激PDGFβ-受体酪氨酸磷酸化。这表明截短的PDGF-D是PDGFβ-受体的配体/***。

实施例4：竞争性结合分析

接下来测试截短的PDGF-D结合人PDGFβ-受体的能力，这通过分析其与PDGF-BB竞争结合PDGFβ-受体的能力进行。在分别稳定表达人PDGFα-和β-受体的猪动脉内皮1(PAE-1)细胞上进行结合试验(Eriksson等，EMBO杂志，1992 11 543-550)。基本如Heldin等所述(EMBO杂志，1988,7 1387-1393)进行结合试验。分别表达PDGF-A，截短的PDGF-D，或模拟对照物的细胞的条件培养基用等体积的BSA/PBS稀释，并与在结合缓冲液(含有1mg/ml BSA的PBS)中100ng/ml ¹²⁵I-PDGF-BB或¹²⁵I-PDGF-AA(α-受体的配体)混合。分析来自这些COS细胞的两套独立的条件培养基。条件培养基等份与在24孔培养皿中铺板的表达受体的PAE-1细胞在冰上保温90分钟。在用结合缓冲液洗涤3次后，结合的¹²⁵I-PDGF-BB或¹²⁵I-PDGF-AA通过在20mM Tric-HCl,pH7.5,10％甘油，1％Triton X-100中裂解细胞而提取。用γ计数仪测定细胞结合的放射性量。图12的结果示出含有截短的PDGF-D的条件培养基与PDGFβ-受体竞争结合PDGF-BB同源二聚体，而不与PDGFα-受体竞争结合PDGF-AA同源二聚体。

PDGF-D不与任何已知的VEGF受体结合。PDGF-D是目前唯一的能结合并提高PDGFβ受体的磷酸化的VEGF家族成员。这些特点表明截短的PDGF-D可能不是VEGF家族成员，而是一种新的PDGF。另外，其全长蛋白似乎是需要由蛋白酶解以释放活性PDGF/VEGF同源结构域而激活的潜伏生长因子。N末端CUB结构域可作为抑制结构域表达，其可用于将这一潜伏生长因子定位于一些胞外区室(如胞外基质)中，且其当需要时可通过限制性蛋白酶解而除去，如在胚胎发育，组织再生，组织重塑包括骨重塑，激活血管生成，肿瘤发展，肿瘤侵染，转移形成和/或伤口愈合期间。

确定PDGF-D功能的生物分析

进行分析以评判PDGF-D是否具有类似于PDGF-A,PDGF-B,VEGF,VEGF-B和/或VEGF-D在关于***细胞，成纤维细胞，肌成纤维细胞和神经胶质细胞的生长和/或运动性；及关于内皮细胞功能；关于血管生成及伤口愈合中的作用。也可根据受体结合分布研究结果进行进一步分析。

Ⅰ．PDGF-D对内皮细胞的促有丝***性

为测试PDGF-D对内皮细胞的促有丝***能力，将PDGF-D多肽导入含有5％血清的细胞培养基中，并施加于在含有10％血清的培养基中增殖的牛动脉内皮细胞(BAEs)中。在加入PDGF-D前一天，此BAEs预先以1000个细胞/孔的密度种植于24孔培养皿中。加入PDGF-D多肽3天后，将细胞用胰蛋白酶解离并计数。纯化的VEGF在本试验中用作阳性对照。

Ⅱ．PDGF-D对成纤维细胞的促有丝***性

为测试PDGF-D对成纤维细胞的促有丝***能力，将不同浓度的PDGF-DD或PDGF-AA(作对照)的截短的同源二聚体在0.2μmCi[3H]胸苷存在下加入血清饥饿的人***成纤维细胞中。然后将此成纤维细胞用1ml含有1mg/ml BSA的无血清培养基培养24小时。在经三氯乙酸(TCA)沉淀后，用β计数仪测定掺入DNA的[³H]胸苷的数量。此分析基本如Mori等，生物化学杂志，1991 266 21158-21164所述进行。

Ⅲ．分析内皮细胞功能

a)内皮细胞增殖

通过本领域熟知的方法进行内皮细胞生长分析，例如Frerrara和Henzel，自然，1989 380 439-443,Gospodarowicz等，美国科学院学报，1989 86 7311-7315，和/或Claffey等，生物化学生物物理杂志，1995 1246 1-9中所述方法。

b)细胞粘附分析

测试PDGF-D对多形核粒细胞粘附于内皮细胞的影响

c)趋化

标准Boyden室趋化性分析用于测试PDGF-D对趋化性的影响。

d)纤溶酶原激活物分析

用Pepper等，生物化学生物物理学研究通讯，1991 181 902-906的方法，测试内皮细胞以研究PDGF-D对纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活抑制剂物产生的影响。

e)内皮细胞迁移分析

f)如Montesano等，美国科学院学报，1986 83 7297-7301所述，分析PDGF-D刺激内皮细胞迁移及脉管形成的能力。或者，可使用Joukov等，EMBO杂志，1996 15 290-298所述的三维胶原凝胶分析或修改的Boyden室中的明胶化膜(Glaser等，自然，1980 288 483-484)。

Ⅳ．血管生成分析

如Leung等，科学，1989 246 1306-1309中所述，测试PDGF-D诱导鸡绒毛***中血管生成应答的能力。或者，可使用Rastinejad等，细胞，1989 56 345-355所述的鼠角膜分析；这是一种分析体内血管生成的认可方法，且此结果能易于移至其它体内***。

Ⅴ．伤口愈合

如Schilling等，外科学，1959 46 702-710所述，并利用Hunt等，外科学，1967 114 302-307所述方法，测试大多数临床相关模型中PDGF-D刺激伤口愈口的能力。

Ⅵ．造血***

本领域已知用造血***的特异细胞群进行的各种体外和体内分析，并在以下略述。特别常用的是用荧光激活细胞分选仪分选纯化的细胞的各种体外鼠干细胞分析：

a)再集群干细胞

这些是能再集群辐射致死鼠的骨髓的细胞，且具有Lin^-,Rh^h1,Ly-6A/E⁺,c-kit⁺表型。在单独这些细胞或与其它因子共培养的这些细胞上测试PDGF-D，随后通过掺入³H-胸苷测定细胞增殖。

b)晚期干细胞

这些是具有相对较小骨髓再集群能力，但能产生D13 CFU-S的细胞。这些细胞具有Lin^-,Rh^h1,Ly-6A/E⁺,c-kit⁺表型。将PDGF-D与这些细胞培养一段时间，注射至辐射致死的受体中，并计数D13脾集落数目。

c)祖细胞富集的细胞

这些是体外应答单一生长因子并具有Lin^-,Rh^h1,Ly-6A/E⁺,c-kit⁺表型的细胞。此分析将示出PDGF-D是否能直接作用于造血祖细胞。PDGF-D与这些细胞在琼脂培养基中培养，并计数7-14天后存在的集落数目。

Ⅶ．粥样硬化

平滑肌细胞在粥样硬化的发生或进展中起关键作用，要求其表型从收缩状态转变至舒张状态。巨噬细胞，内皮细胞，T淋巴细胞和血小板，通过影响平滑肌细胞的生长及表型调节而均在粥样硬化斑的进展中起作用。一种用修改的Rose室的体外分析，其中不同类型的细胞种植于相反盖片，测定了平滑肌细胞在多细胞环境中的增殖速度及表型调节，并用于确定PDGF-D对平滑肌细胞的影响。

Ⅷ．癌转移

PDGF-D抑制癌转移的能力可使用Lewis肺癌模型，例如用Cao等，实验医学杂志，1995 182 2069-2077的方法进行分析。

Ⅸ．平滑肌细胞的迁移

PDGF-D对平滑肌细胞和其它类型细胞迁移的影响可用Koyama等，生物化学杂志，1992 267 22806-22812的方法分析。

Ⅹ．趋化性

PDGF-D对成纤维细胞，单核细胞，粒细胞和其它细胞趋化性的影响可用Siegbahn等，临床研究杂志，1990 85 916-920的方法分析。

Ⅺ．其它类型细胞中的PDGF-D

PDGF-D对其它类型细胞如肝细胞，心肌细胞和内分泌细胞及成骨细胞的增殖，分化及功能的影响，可通过本领域已知方法如3H-胸苷由体外培养物而易于分析。

Ⅻ．PDGF-D变体及类似物的构建

PDGF-D是生长因子PDGF家族成员，其与PDGF家族其它成员呈高度同源性。PDGF-D含有7个保守的半胱氨酸残基，这是生长因子此家族的特点。这些保守的半胱氨酸残基形成产生半胱氨酸剔除结构的链内二硫键，和形成蛋白二聚体的链间二硫键，这些是生长因子PDGF家族成员的特点。PDGF-D与蛋白质酪氨酸激酶生长因子受体相互作用。

与对于蛋白质结构，受体结构所需的活性位点及随之的活性都了解很少或不了解的蛋白质相反，PDGF-D的活性突变体的设计，通过对生长因子PDGF家族成员的活性位点和重要氨基酸的大量认知而十分便利。

阐明生长因子PDGF家族成员的结构/活性关系的发表的文章包括：阐述PDGF的Oestman，生物化学杂志，1991 266 10073-10077；Andersson等，生物化学杂志，1992 267 11260-1266；Oefner等，EMBO杂志，1992 11 3921-3926；Flemming等，分子及细胞生物学，199313 4066-4076；阐述VEGF的Kim等，生长因子，1992 7 53-64；Potgens等，生物化学杂志，1994 269 32879-32885及Claffey等，生物化学生物物理学杂志，1995 1246 1-9。这些文章揭示由于有8个保守的半胱氨酸残基，因而生长因子的PDGF家族呈现特征化的打结的折叠结构及二聚体化，导致在二聚体化的分子的每个末端均形成三个曝露的环区，活性受体结合位点可预期位于此处。

基于此信息，本领域技术人员可设计高度保持PDGF活性的PDGF-D变体，这可通过保守负责打结的折叠和二聚体化的8个半胱氨酸残基，且也可通过保守或在蛋白质结构的环1,2,3区的可能的受体序列中只进行保守氨基酸取代而进行。

在蛋白质结构中特异定向的位点形成所需突变被认为是蛋白质学专家的一种标准技术(Kumkel等，酶学方法，1987 154 367-382)。这种用VEGF的定点诱变例如可见于Potgen等，生物化学杂志，1994269 32879-32885及Claffey等，生物化学生物物理学学报，1995 12461-9。事实上，定点诱变非常普通，其试剂盒可商购而简化这种程序(如Promega 1994-1995 Catalog,P142-145)。

PDGF-D突变体的***细胞，成纤维细胞，肌成纤维细胞及神经胶质细胞的生长和/或运动性活性，内皮细胞的增殖活性，血管生成活性和/或伤口愈合活性通过熟知的筛选方法可易于确定。例如，可使用类似于Claffey等所述的内皮细胞有丝***分析的方法(生物化学生物物理学学报，1995 1246 1-9)。同样，PDGF-D对其它类型细胞增殖，对细胞分化及人癌转移的影响用本领域熟知方法可测定。

前面的阐述及实施例只是举例说明而非限制本发明。由于本领域技术人员在本发明精神及原理范围内可对本发明所揭示的实施方案加以修改，因此本发明在所附权利要求书及其等价物的范围内可做各种改动。

序列表<110>乌尔夫·埃里克松

卡琳·奥瑟

李旭日

安尼卡·蓬滕

马尔科·于特拉

卡里·阿利塔洛

阿恩·厄斯特曼

卡尔-亨里克·黑尔丁<120>血小板衍生生长因子D，其编码DNA及其应用<130>乌尔夫·埃里克松等1064-44833PC<140><141><150>60/107,852<151>1998-11-10<150>60/113,997<151>1999-12-28<150>60/150,604<151>1999-08-26<150>60/157,108<151>1999-10-04<150>60/157,756<151>1999-10-05<160>31<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>360<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1aattgtggct gtggaactgt caactggagg tcctgcacat gcaattcagg gaaaaccgtg 60aaaaagtatc atgaggtatt acagtttgag cctggccaca tcaagaggag gggtagagct 120aagaccatgg ctctagttga catccagttg gatcaccatg aacgatgtga ttgtatctgc 180agctcaagac cacctcgata agagaatgtg cacatcctta cattaagcct gaaagaacca 240ttagtttaag gagggtgaga taagagaccc ttttcctacc agcaaccaga cttactacta 300gcctgcaatg caatgaacac aagtggttgc tgagtctcag ccttgctttg ttaatgccat 360<210>2<211>66<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Asn Cys Gly Cys Gly Thr Vel Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser1 5 10 15Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly

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355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr

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405 410 415Gln Met Ser<210>15<211>358<212>PRT<213>Homo sapiens<400>15Met Tyr Gly Glu Trp Gly Met Gly Asn Ile Leu Met Met Phe His Val1 5 10 15Tyr Leu Val Gln Gly Phe Arg Ser Glu His Gly Pro Val Lys Asp Phe

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195 200 205Arg Arg Ser Ile Gln Thr Pro Glu Glu Asp Glu Cys Pro His Ser Lys

210 215 220Lys Leu Cys Pro Ile Asp Met Leu Trp Asp Asn Thr Lys Cys Lys Cys225 230 235 240Val Leu Gln Asp Glu Thr Pro Leu Pro Gly Thr Glu Asp His Ser Tyr

245 250 255Leu Gln Glu Pro Thr Leu Cys Gly Pro His Met Thr Phe Asp Glu Asp

260 265 270Arg Cys Glu Cys Val Cys Lys Ala Pro Cys Pro Gly Asp Leu Ile Gln

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290 295 300Cys Cys Gln Lys His Lys Ile Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu305 310 315 320Asp Arg Cys Pro Phe His Thr Arg Thr Cys Ala Ser Arg Lys Pro Ala

325 330 335Cys Gly Lys His Trp Arg Phe Pro Lys Glu Thr Arg Ala Gln Gly Leu

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50 55 60Ala His Gly Val His Ala Thr Lys His Val Pro Glu Lys Arg Pro Leu65 70 75 80Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Ile Glu Glu Ala Val Pro Ala Val Cys

85 90 95Lys Thr Arg Thr Val Ile Tyr Glu Ile Pro Arg Ser Gln Val Asp Pro

100 105 110Thr Ser Ala Asn Phe Leu Ile Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Lys Arg

115 120 125Cys Thr Gly Cys Cys Asn Thr Ser Ser Val Lys Cys Gln Pro Ser Arg

130 135 140Val His His Arg Ser Val Lys Val Ala Lys Val Glu Tyr Val Arg Lys145 150 155 160Lys Pro Lys Leu Lys Glu Val Gln Val Arg Leu Glu Glu His Leu Glu

165 170 175Cys Ala Cys Ala Thr Thr Ser Leu Asn Pro Asp Tyr Arg Glu Glu Asp

180 185 190Thr Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu

195 200 205Lys Pro Thr

210<210>17<211>241<212>PRT<213>Homo sapiens<400>17Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Ser Leu Cys Cys Tyr Leu Arg1 5 10 15Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met

20 25 30Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu

35 40 45His Gly Asp Pro Gly Glu Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met

50 55 60Thr Arg Ser His Ser Gly Gly Glu Leu Glu Ser Leu Ala Arg Gly Arg65 70 75 80Arg Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu

85 90 95Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp

100 105 110Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln

115 120 125Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Ash Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr

130 135 140Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg145 150 155 160Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu

165 170 175Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Ser

180 185 190Pro Gly Gly Ser Gln Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Thr Arg Val

195 200 205Thr Ile Arg Thr Val Arg Val Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg

210 215 220Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Thr Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly225 230 235 240Ala<210>18<211>121<212>PRT<213>Homo sapiens<400>18Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp1 5 10 15Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile

20 25 30Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu

35 40 45Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Lys Leu

50 55 60Glu Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu65 70 75 80Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys

85 90 95Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp

100 105 110Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg

115 120<210>19<211>119<212>PRT<213>Homo sapiens<400>19Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln Ser Pro1 5 10 15Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr Trp Arg Leu

20 25 30His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn Gln Phe

35 40 45Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe Val Glu

50 55 60Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly Arg Trp Cys65 70 75 80Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asn Gln Ile

85 90 95Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys Pro Gly Phe

100 105 110Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu

115<210>20<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>20Cys Gly Glu Thr Leu Gln Asp Ser Thr Gly Asn Phe Ser Ser Pro Glu1 5 10 15Tyr Pro Asn Gly Tyr Ser Ala His Met His Cys Val Trp Arg Ile Ser

20 25 30Val Thr Pro Gly Glu Lys Ile Ile Leu Asn Phe Thr Ser Leu Asp Leu

35 40 45Tyr Arg Ser Arg Leu Cys Trp Tyr Asp Tyr Val Glu Val Arg Asp Gly

50 55 60Phe Trp Arg Lys Ala Pro Leu Arg Gly Arg Phe Cys Gly Ser Lys Leu65 70 75 80Pro Glu Pro Ile Val Ser Thr Asp Ser Arg Leu Trp Val Glu Phe Arg

85 90 95Ser Ser Ser Asn Trp Val Gly Lys Gly Phe Phe Ala Val Tyr Glu Ala

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20 25 30Val Ser Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile

35 40 45Glu Arg Met Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly

50 55 60His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys65 70 75 80Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val

85 90 95Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys

100 105 110<210>22<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>22Cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val

20 25 30Ala Pro Thr Gln Tyr Arg Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr

35 40 45Glu Gly Asn Asp Val Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly

50 55 60Leu Thr Als Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys65 70 75 80Pro Glu Val Ile Thr Ser Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Pro Lys

85 90 95Ser Asp Asn Thr Val Ser Lys Lys Gly Phe Lys Als His Phe Phe Ser

100 105 110Glu<210>23<211>113<212>PRT<213>Homo sapiens<400>23Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly1 5 10 15Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln

20 25 30Als Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe

35 40 45Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp

50 55 60Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile65 70 75 80Als Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe

85 90 95Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu

100 105 110Ile<210>24<211>119<212>PRT<213>Homo sapiens<400>24Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly1 5 10 15Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe

20 25 30Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu

35 40 45Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg

50 55 60Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg65 70 75 80Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile

85 90 95Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe

100 105 110Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu

115<210>25<211>15<212>PRT<213>Homo sapiens<400>25Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Asn Cys Xaa Cys1 5 10 15<210>26<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>26gtcgtggaac tgtcaactgg<210>27<211>20<212>DNA<213>Homo sapiens<400>27ctcagcaacc acttgtgttc 20<210>28<211>27<212>DNA<213>Homo sapiens<400>28ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>29<211>29<212>DNA<213>Homo sapiens<400>29agtgggatcc gttactgatg gagagttat 29<210>30<211>26<212>DNA<213>Homo sapiens<400>30cccaagcttg aagatcttga gaatat 26<210>31<211>22<212>DNA<213>Homo sapiens<400>31tgctctagat cgaggtggtc tt 22

Claims

1、一种分离的核酸分子，其包含的多核苷酸序列与图3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，图5所示序列(SEQID NO:5)的至少1-966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸具有至少85％相同性。

2、如权利要求1的分离的核酸分子，其中序列相同性至少为90％。

3、如权利要求1的分离的核酸分子，其中序列相同性至少为95％。

4、如权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸是cDNA。

5、如权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核酸是一种哺乳动物多核苷酸。

6、如权利要求5的分离的核酸分子，其中所述核酸是一种人类多核苷酸。

7、一种分离的核酸分子，其编码一种多肽分子或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物，该多肽分子包含的氨基酸序列与图4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，图6所示氨基酸序列(SEQID NO:6)，或图8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性。

8、如权利要求7的分离的核酸分子，其中氨基酸序列相同性至少为90％。

9、如权利要求7的分离的核酸分子，其中氨基酸序列相同性至少为95％。

10、一种分离的核酸分子，其编码包含氨基酸序列PSCLLVXRCGGNCXC(SEQ ID NO:25)的多肽。

11、一种分离的多核苷酸，其包含的多核苷酸序列与图3所示序列(SEQ ID NO:3)的至少1～600位核苷酸，图5所示序列(SEQID NO:5)的至少1～966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸有至少85％相同性，或在严格杂交条件下与所述DNA序列的至少一个杂交的多核苷酸。

12、一种包含权利要求1或11的核酸的载体，其核酸与启动子序列可操纵地连接。

13、权利要求12的载体，其中所述载体是真核载体。

14、权利要求12的载体，其中所述载体是原核载体。

15、权利要求12的载体，其中所述载体是质粒。

16、权利要求12的载体，其中所述载体是杆状病毒载体。

17、一种制备表达多肽或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物的载体的方法，所述多肽包含的氨基酸序列与图4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，图6所示氨基酸序列(SEQ ID NO:6)，或图8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性，此方法包括将权利要求1,7,10或11的分离的核酸以可操纵地连接于启动子的方式掺入所述载体中。

18、用权利要求12的载体转化或转染的宿主细胞。

19、权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

20、权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS细胞。

21、权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。

22、权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是293 EBNA细胞。

23、权利要求18的宿主细胞，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。

24、用含有权利要求1或11的可操纵地连接于启动子的核酸序列的载体转化或转染的宿主细胞，这样所述宿主细胞表达一种多肽或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物，所述多肽包含与图4所示氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，图6所示氨基酸序列(SEQID NO:6)或图8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性的氨基酸序列。

25、一种分离的多肽，其包含与图4所示氨基酸序列(SEQ IDNO:4)，图6所示氨基酸序列(SEQ ID NO:6)或图8所示氨基酸序列(SEQ ID NO:8)有至少85％相同性的氨基酸序列，或其具有PDGF-D生物学活性的片段或类似物。

26、权利要求25的分离的多肽，其中所述多肽是人类多肽。

27、权利要求25的分离的多肽，其中所述多肽具有刺激和/或增强表达PDGF-D受体的细胞的增殖和/或分化和/或生长和/或运动性的能力。

28、权利要求27的分离的多肽，其中细胞选自内皮细胞，***细胞，肌成纤维细胞和神经胶质细胞。

29、一种分离的多肽，其是通过表达包含与图3所示序列(SEQID NO:3)的至少1～600位核苷酸，图5所示序列的至少1～966位核苷酸，图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少176-1288位核苷酸，或图7所示序列(SEQ ID NO:7)的至少938-1288位核苷酸有至少85％相同性的多核苷酸序列的多核苷酸，或表达在严格条件下与所述DNA序列的至少一个杂交的多核苷酸而产生的。

30、一种分离的多肽，其包含特征性序列

PXCLLVXRCGGNCXC(SEQ ID NO:25)。

31、一种分离的多肽二聚体，其包含权利要求25或29的多肽。

32、权利要求31的分离的多肽二聚体，其中所述多肽二聚体是所述多肽的同源二聚体。

33、权利要求31的分离的多肽二聚体，其中所述多肽二聚体是所述多肽和VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF的异源二聚体。

34、权利要求31的分离的多肽二聚体，其中所述多肽二聚体是二硫键连接的二聚体。

35、一种药物组合物，其包含促进细胞增殖有效量的权利要求25、29或30的多肽，和选自VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF的至少一种另外的生长因子。

36、权利要求35的药物组合物，另外还包含肝素。

37、一种药物组合物，其包含促进细胞增殖有效量的权利要求25、29或30的分离的多肽，和至少一种药物载体或稀释剂。

38、权利要求37的药物组合物，还包含肝素。

39、一种药物组合物，其包含有效量的权利要求25、29或30的分离的多肽和肝素。

40、一种药物组合物，其包含PDGF受体刺激量的权利要求25、29或30的分离的多肽，和至少一种药物载体或稀释剂。

41、一种扩增测试样品中权利要求1或11的多核苷酸的手段，所述手段包括至少一对互补于权利要求1或11的核酸的引物。

42、一种扩增测试样品中权利要求1或11的多核苷酸的手段，所述手段包括聚合酶及至少一对互补于权利要求1或11的核酸的引物，以通过聚合酶链反应扩增此多核苷酸，从而促进对比该多核苷酸与权利要求1或11的核酸。

43、一种与权利要求25,29或30的多肽特异反应的抗体。

44、权利要求43的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。

45、权利要求43的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

46、权利要求45的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。

47、权利要求44,45或46的抗体，其中所述抗体是用可检测标记物标记的。

48、权利要求47的抗体，其中所述可检测标记物是放射性同位素。

49、权利要求45或46的抗体，其中抗体通过加入胞毒剂或细胞抑制剂而修饰。

50、一种生产权利要求25,29或30的多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

培养用一种载体转化或转染的宿主细胞，该载体包含与启动子序列可操纵地相连的编码所述多肽的多核苷酸，这样编码所述多肽的核酸序列被表达；及

从所述宿主细胞或从培养所述宿主细胞的生长培养基中分离所述的多肽。

51、一种刺激哺乳动物***生长或伤口愈合的方法，包括给所述哺乳动物施用有效刺激***或伤口愈合的量的权利要求25,29或30的多肽。

52、一种生产活化的截短形式PDGF-D的方法，包括表达包含编码权利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表达载体，并提供蛋白酶解量的至少一种酶以加工表达的多肽，从而产生活化的截短形式PDGF-D。

53、一种调节PDGF-D的受体结合特异性的方法，包括表达包含编码权利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表达载体，并提供蛋白酶解量的至少一种酶以加工表达的多肽，从而产生活化的截短形式的PDGF-D。

54、一种选择性激活具有生长因子活性的多肽的方法，包括表达包含编码具有生长因子活性的多肽、CUB结构域以及多肽与CUB结构域之间蛋白酶解位点的多核苷酸的表达载体，并提供蛋白酶解量的至少一种酶以加工表达的多肽，从而产生具有生长因子活性的活化的多肽。

55、权利要求25,29或30的分离的多肽，其包含一个具有氨基酸序列RKSK或其结构保守的氨基酸序列的蛋白酶解位点。

56、权利要求7的分离的核酸分子，其编码包含有氨基酸序列RKSK或结构保守的氨基酸序列的蛋白酶解位点的多肽。

57、一种分离的异源二聚体，其包含一个活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或PIGF单体，和一个与CUB结构域连接的活化的PDGF-D单体。

58、一种分离的异源二聚体，其包含一个活化的PDGF单体，和一个与CUB结构域连接的活化的VEGF,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,PDGF-D,PDGF-A,PDGF-B或P1GF单体。

59、权利要求57的分离的异源二聚体，另外还包含一个在活化的单体和CUB结构域连接之间的蛋白酶解位点。

60、权利要求58的分离的异源二聚体，还包含一个在活化单体和CUB结构域连接之间的蛋白酶解位点。

61、一种诱导PDGFβ-受体活化的方法，包括加入PDGFβ-受体刺激量的权利要求25,29或30的多肽。

62、一种抑制哺乳动物中表达PDGF-D的肿瘤的肿瘤生长的方法，包括给所述哺乳动物施用PDGF-D抑制量的PDGF-D拮抗剂。

63、一种鉴别特异类型人类肿瘤的方法，包括取肿瘤样品并测试PDGF-D的表达。

64、一种鉴别PDGF-D拮抗剂的方法，包括：

混合基本纯化的活化截短形式的PDGF制备物与测试制剂；并

通过任何适当方法监测PDGF-D生物学活性的抑制情况。

65、一种鉴别PDGF-D拮抗剂的方法，包括：

混合基本纯化的全长PDGF-D制备物与测试制剂；并

通过任何适当方法监测对CUB结构域从PDGF-D中裂解的抑制情况。

66、一种制备表达多肽的载体的方法，该多肽包含与图8(SEQ IDNO:8)的255～371位氨基酸残基有至少85％相同性的氨基酸序列，所述方法包括将编码所述氨基酸残基的分离的核酸分子掺入所述载体中以与启动子可操纵连接。

67、一种生产活化的截短形式PDGF-D的方法，包括表达包含编码权利要求25,29或30的多肽的多核苷酸的表达载体，并提供蛋白酶解量的至少一种酶以加工表达的多肽，从而产生活化的截短形式的PDGF-D。

68、一种在肿瘤细胞侵染正常细胞群期间抑制组织重塑的方法，包括给所述哺乳动物施用PDGF-D抑制量的PDGF-C拮抗剂。