JP2002534061A

JP2002534061A - 血小板由来増殖因子ｄ、それをコードするｄｎａ、及びその利用法

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Publication number: JP2002534061A
Application number: JP2000581056A
Authority: JP
Inventors: エリクソン，ウルフ; アーセ，カリン; ポンテン，アンニカ; リ，スリ; ウーテラ，マルコ; アリタロ，カリ; エストマン，アルネ; ヘルディン，カール‐ヘンリック
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ; ライセンティア・リミテッド
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2002-10-15
Also published as: EP2151454A2; CN1325407A; EP2151454B1; CN1261453C; EP1129110B1; WO2000027879A1; EP2151454A3; AU770899B2; ES2336731T3; US6706687B1; EP1129110A4; AU1613600A; DE69941791D1; ATE556090T1; NZ511379A; ATE451389T1; DK1129110T3; EP1129110A1; CA2349951A1

Abstract

(57)【要約】ＰＤＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の新規なメンバー、更に、それをコードするヌクレオチド配列、その製造方法、それに対する抗体及びその他のアンタゴニスト、それを発現するトランスフェクト及びトランスフォームされた宿主細胞、それを含む医薬用組成物、それらの医療及び診断用途に於ける利用、が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、内皮細胞、結合組織細胞（線維芽細胞等）、筋線維芽細胞、及びグ
リア細胞、を含む新規な増殖因子に対するレセプターを発現する細胞の増殖因子
、詳しくは、新規な血小板由来増殖因子／血管増殖因子様増殖因子、この因子を
コードするポリヌクレオチド配列、この因子を利用した又はこの因子から誘導さ
れる医薬用及び診断用組成物と方法、に関する。

【０００２】発明の背景発育中の胚に於いて、一次血管網状組織が、血管生成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ）と呼ばれるプロセスに於いて、中胚葉細胞のインサイチュ分化によっ
て確立される。胎児における新しい血管の生成と成体に於ける新血管新生（ｎｅ
ｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）とを含む、すべてのその後のプロセスは、
脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれるプロセスに於ける既存の血管
からの新しい毛細管の発芽又は***によって支配されているものと考えられてい
る（ペッパー（Ｐｅｐｐｅｒ）等、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ，１９９６４９１３８−１６２；ブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９
９５２０４２２８−２３９；リソー（Ｒｉｓａｕ）、Ｎａｔｕｒｅ，１９９
７３８６６７１−６７４）。脈管形成は、胚発達と正常な組織成長、修復及
び再生のみならず、女性の生殖サイクル、妊娠状態の確立及び維持、そして、損
傷及び破損の修復にも関連している。正常な個体に於いて行われる脈管形成の他
に、脈管形成現象は、多数の病理プロセス、特に腫瘍の増殖と転移、そして、糖
尿病網膜症、乾癬、及び関節疾患等のような血管増殖、特に微小血管系の増殖、
が増加する、その他の状態、に関連している。脈管形成の抑制は、これらの病理
的プロセスを防止又は軽減するのに有用である。

【０００３】他方、たとえば、組織又は器官移植後等、血管新生を確立又は拡張したり、或
いは、冠状動脈心臓疾患や血栓性閉塞性動脈炎等に於けるように、組織梗塞又は
動脈狭窄に於いて側副血行の形成を刺激する為、等の状況においては脈管形成を
促進することが望ましい。

【０００４】脈管形成プロセスは高度に複雑であって、細胞周期に於ける内皮細胞の維持、
細胞外マトリクスの分解、周囲の組織の遊走と浸潤、そして最後に管腔形成、に
関連している。これら複雑な脈管形成プロセスの背後の分子メカニズムはまだほ
とんど判っていない。

【０００５】脈管形成は非常に多くの生理的、および、病理的プロセスに重要な役割を果た
しているので、脈管形成の制御に関連している因子が集中的に研究されている。
多くの増殖因子が、脈管形成の調節に関連していることが示されている。これら
のものとしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧ
Ｆ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、及び肝細胞増殖因
子（ＨＧＦ）がある。たとえば、フォークマン（Ｆａｌｋｍａｎ）等、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２２６７１０９３１−１０９３４を参照。

【０００６】特定のファミリーの内皮細胞特異的増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
、それらに対応するレセプターが、内皮細胞の増殖と分化の刺激と、分化細胞の
或る種の機能とに主に寄与していることが示唆されている。これらの因子は、Ｐ
ＤＧＦファミリーのメンバーであって、主として内皮レセプターチロシンキナー
ゼ（ＲＴＫ）を介して作用しているように思える。

【０００７】ＰＤＧＦファミリー中に於いて９種類のタンパク質、即ち、二つのＰＤＧＦ（
Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連している６つのメンバー、が
同定された。ＶＥＧＦに密接に関連する前記６つのメンバーは、Ｌｕｄｗｉｇ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈとヘルシンキ大
学とによる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３
６）及び米国特許５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号とに記載のＶ
ＥＧＦ−Ｂと、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯＪ．，１９９６１５２９０−２９８及びリー（Ｌｅｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，１９９６９３１９８８−１９９２に記載のＶＥＧＦ−Ｃと、国
際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェ
ン（Ａｃｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９
８９５５４８−５５３に記載のＶＥＧＦ−Ｄと、マグリオン（Ｍａｇｌｉｏ
ｎｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１８８
９２６７−９２７１に記載の胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）と、ＨｕｍａｎＧｅｎ
ｏｍｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９１（Ｗ
Ｏ９５／２４４７３）に記載のＶＥＧＦ２と、ＨｕｍａｎＧｅｎｏｍｅＳ
ｃｉｅｎｃｅｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／
３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３とである。これら各ＶＥＧＦファミリーメンバ
ーは、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。こ
れらＶＥＧＦファミリーメンバーは、システイン・ノット・モチーフを形成する
６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦ相同性ドメインを共有している。ＶＥＧＦ
ファミリーの機能的特徴には、内皮細胞に対する種々の程度のマイトジェン活性
の誘発、血管透過性の誘発、及び脈管形成及びリンパ管形成、が含まれる。

【０００８】血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイ
マー糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイト
ジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胎児血管形成中の新しい血管の形成と、成体の
脈管形成とに於いて重要な調節機能を有する（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉ
ｅｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６３８０４３５−４３９；ファーララ（Ｆ
ｅｒｒａｒａ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６３８０４３９−４４２；ファー
ララ（Ｆｅｒｒａｒａ）およびデイヴィス‐スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）
，ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＲｅｖ．，１９９７１８４−２５によって検討され
ている）。ＶＥＧＦが果す役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子が不活性
化するだけで、血管の発達不全によって胎児が致死することを示す研究によって
示されている（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９
９６３８０４３５−４３９；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）等、Ｎａｔｕｒ
ｅ，１９９６３８０４３９−４４２）。更に、ＶＥＧＦは、単球に対する強
力な化学誘引活性を有し、内皮細胞に於いてプラスミノーゲンアクチベーターと
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターとを誘発することができ、又、微
小血管透過性を誘発することができる。その後者の活性に依り、それは、時とし
て、血管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦの単離と性質は既に研究さ
れている。ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）等、Ｊ．ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９９１４７２１１−２１８とコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）Ｊ
．ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍ．，１９９１４７２１９−２２３を参
照。一つのＶＥＧＦ遺伝子の選択的ｍＲＮＡスプライシングによってＶＥＧＦの
５つのアイソフォームが得られる。

【０００９】ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦに類似の血管形成及びその他の特性を有するが、そ
れは、ＶＥＧＦと異なる組織に分布し、発現される。具体的には、ＶＥＧＦ−Ｂ
は心臓に於いて非常に強力に発現されるが、肺に於いては弱くしか発現されない
。これに対して、ＶＥＧＦの場合はその反対である。これは、ＶＥＧＦとＶＥＧ
Ｆ−Ｂとは、それらが多くの組織に於いて同時発現されるという事実にも拘わら
ず、機能的な相違を有するものである可能性があることを示唆している。

【００１０】ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞質レチノイン酸結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢＰ−
Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質をスクリーニングすることによ
る酵母共ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング法（ｃｏ−ｈｙｂｒｉｄ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｔｒａｐｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅ）を使用して単離された。その単離と特徴は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７
と、オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，１９９６９３２５７６−２５８１とに詳細に記載されている。

【００１１】ＶＥＧＦ−Ｃは、ＰＣ−３前立腺腺癌細胞ライン（ＣＲＬ１４３５）の培養上
清から、ＶＥＧＦＲ−３を発現するべくトランスフェクトされた細胞を使用して
、この培地が内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌ
ｔ４）を生成する能力をスクリーニングすることによって単離された。ＶＥＧＦ
−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３でのアフィニティークロマトグラフィーを使用し
て精製され、ＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単
離と特徴とは、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯＪ．，１９９６１５２９０−２９８に詳述されている。

【００１２】ＶＥＧＦ−Ｄは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているヒト胸ｃＤＮＡライブ
ラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして“ＳｏａｒｅｓＢｒｅａ
ｓｔ３ＮｂＨＢｓｔ”と命名されているヒトｃＤＮＡライブラリーから得た発
現配列タグによるスクリーニングによって単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ）
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８９５５４８
−５５３）。その単離と特徴とは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６
（ＷＯ９８／０７８３２）に詳細に記載されている。

【００１３】前記ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は、成人ヒトに広く発現されるが、もちろん、遍在的
に発現されるものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓、肺及び骨格筋に於いて強力
に発現される。ＶＥＧＦ−Ｄは脾臓と、卵巣、小腸、及び結腸に於いて中レベル
で発現され、より低い発現が腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、及び精巣で発生する。
脳、胎盤、肝臓又は末梢血白血球からのＲＮＡにはＶＥＧＦ−ＤｍＲＮＡは検出
されなかった。

【００１４】ＰｌＧＦは、(妊娠の)満期胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された。その単
離と特徴とは、マグリオン（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１８８９２６７−９２７１に詳細に記載され
ている。現在に於いて、その生物学的機能はよく理解されていない。

【００１５】ＶＥＧＦ２は、高度に腫瘍生成的なエストロゲン非依存ヒト胸部ガン細胞ライ
ンから単離された。この分子は、ＰＤＧＦに対する約２２％の相同性と、ＶＥＧ
Ｆに対する３０％の相同性を有すると述べられているものの、ＶＥＧＦ２をコー
ドする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開
示されていない。

【００１６】ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＶＥＧ
Ｆ３は、ＶＥＧＦに対する約３６％の同一性と、６６％の類似性を有すると記載
されている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、そ
の生物学的活性の特徴付けは開示されていない。

【００１７】二つのタンパク質の間の類似性は、これらタンパク質の一方のアミノ酸配列と
保存アミノ酸置換を、第２のタンパク質の配列と比較することによって判定され
るのに対して、同一性は、保存アミノ酸置換を含めることなく判定される。

【００１８】ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーは、主として、レセプターチロシンキ
ナーゼに結合することによって作用する。５つの内皮細胞特的レセプターチロシ
ンキナーゼが同定されている。即ち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ
Ｒ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−２）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、ＴｉｅそしてＴ
ｅｋ／Ｔｉｅ−２である。これらの全ては、シグナル伝達に必要な内在性チロシ
ンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３、
Ｔｉｅ及びＴｅｋ／Ｔｉｅ−２の、血管形成及び脈管形成に於ける本質的で特異
的な役割は、マウス胎児に於いてこれらのレセプターを不活性化する標的化突然
変異によって示されている。

【００１９】ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼは、ＶＥ
ＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３だけである。ＶＥＧＦＲ−１と
ＶＥＧＦＲ−２とは、高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥ
ＧＦ−ＢとＰｌＧＦとにも結合する。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３のリガン
ドであることが示されており、これは、又、ＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ヨウ
コフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ，１９９６１５２９０−２９８）。ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の双
方に結合する。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（Ｗ
Ｏ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドは、まだ同定され
ていない。

【００２０】最近、新規な１３０−１３５ｋＤａＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプタ
ーが精製されクローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）等、Ｃｅｌｌ，１９
９８９２７３５−７４５）。このＶＥＧＦレセプターは、ヘパリンに対する
弱い親和性を示すエクソン７コード化配列を介してＶＥＧＦ₁₆₅アイソフォーム
に結合することが判った（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）等、Ｃｅｌｌ，１９９８９
２７３５−７４５）。驚くべきことに、前記レセプターは、ヒトニューロピリ
ン−１（ＮＰ−１）、初期段階の神経形態形成に関わるレセプター、と同一であ
ることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようである（ミグ
ダール（Ｍｉｇｄａｌ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８２７３２
２２７２−２２２７８）。

【００２１】ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３は、内皮細胞によって異な
る状態で発現される。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、共に、血管内皮に発
現され（エールリッヒス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２
８１１−１８；カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．，１９９３１７８２０７７−２０８８；デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）等
、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９５２０３８０−９２；フォン（Ｆｏｎｇ）等、
Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９６２０７１−１０）、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとん
ど、成体組織のリンパ内皮に発現される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）
等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５９３５６６
−３５７０）。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍周囲の血管にも発現される。

【００２２】ＶＥＧＦＲ遺伝子が崩壊すると、血管の発達の異常が起こり、妊娠期間中に未
熟致死となる。完全に不活性化されたＶＥＧＦＲ−１を有する胎児の分析は、こ
のレセプターが内皮の機能的組織化に必要であるということを示唆している（フ
ォン（Ｆｏｎｇ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５３７６６６−７０）。しかし
ながら、ＶＥＧＦＲ−１の細胞内チロシンキナーゼドメインの欠失は、正常な血
管を有する生育可能なマウスを作り出す（ヒラツカ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ）等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８９５９３４９−９
３５４）。これらの相違の理由は、今後の説明を必要とするが、これは、ＶＥＧ
ＦＲ−１の適切な機能の為にはチロシンキナーゼを介したレセプターシグナル伝
達が必要とされない、ということを示唆している。ＶＥＧＦＲ−２の不活性化対
立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析は、このレセプターが、内皮細胞増殖
、血球生成も及び血管形成のために必要であることを示唆している（シャラビー
（Ｓｈａｌａｂｙ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５３７６６２−６６；シャラ
ビー（Ｓｈａｌａｂｙ）等，Ｃｅｌｌ，１９９７８９９８１−９９０）。Ｖ
ＥＧＦＲ−３の不活性化によって、大きな血管の異常な組織化によって心血管不
全が起こる（デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８２８２９４６−９４９）。

【００２３】ＶＥＧＦＲ−１は、主として、発育中の内皮細胞に発現されるが、それは、又
、胚形成の初期段階における造血前駆細胞にも見い出される（フォン（Ｆｏｎｇ
）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５３７６６６−７０）。胚に於いて、それは、
ほとんどが、全部ではないにせよ、血管に発現される（ブライアー（Ｂｒｅｉｅ
ｒ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９５２０４２２８−２３９）；フォン（Ｆ
ｏｎｇ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９６２０７１−１０）。成体に於いて
、単球とマクロファージも、このレセプターを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌ
ｅｏｎ）等、Ｂｌｏｏｄ，１９９６８７３３３６−３３４３）。

【００２４】レセプターＶＥＧＦＲ−３は、初期の胚発育中に内皮細胞上に広く発現される
が、胚形成が進むにつれて、静脈内皮に徐々に限定され、その後、リンパ内皮に
限定される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅ）等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，
１９９４５４６５７１−６５７７、カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅ）等
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５９２３５６６
−３５７０）。ＶＥＧＦＲ−３は、成体に於いてリンパ内皮細胞に発現され続け
る。このレセプターは、胚形成中の血管発達のために必須である。マウスに於け
るＶＥＧＦＲ−３遺伝子の両方の複製を完全に不活性化したところ、性行後９．
５日に於いて、欠陥管腔を有する組織化が異常な大きな血管によって特徴付けら
れる欠陥血管形成が発生し、囲心腔に於いて体液が貯留し、心血管不全が発生し
た。これらの知見に基づき、ＶＥＧＦＲ−３は、一次血管網状組織がより大きな
血管に成熟するために必要であることが示唆されている。しかしながら、リンパ
管の発達に於けるＶＥＧＦＲ−３の役割は、胚がリンパ系が現れる前に死亡した
為、これらのマウスでは研究することができなかった。それにも拘わらず、ＶＥ
ＧＦＲ−３は、胚形成及び成体生涯に於けるリンパ内皮細胞でのその特異的発現
に依り、リンパ管系の発育とリンパ管形成に役割を果しているものと推定される
。これは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドであるＶＥＧＦ−Ｃのトランスジェニック
マウスの皮膚に於ける偏位発現によって、リンパ内皮細胞の増殖と真皮に於ける
血管の拡大が発生したという知見によってサポートされる。更に、これは、ＶＥ
ＧＦ−Ｃが、リンパ内皮に於いて一次機能を有し、ＶＥＧＦと共通する脈管形成
及び透過性調節に於いて二次機能を有している可能性があることを示唆している
（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯＪ．，１９９５１５２９０−２
９８）。

【００２５】ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプター系のインヒビターのいくつかは、抗脈管形成メ
カニズムを介して腫瘍の増殖を防ぐことが示されている。キム（Ｋｉｍ）等、Ｎ
ａｔｕｒｅ，１９９３３６２８４１−８４４及びサレー（Ｓａｌｅｈ）等、
ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１９９６５６３９３−４０１を参照。

【００２６】前述したように、ＶＥＧＦファミリーの増殖因子は、ＰＤＧＦファミリーのメ
ンバーである。ＰＤＧＦは、結合組織細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞及びグリ
ア細胞の増殖および／又は固有運動性に重要な役割を果す（ヘルディン（Ｈｅｌ
ｄｉｎ）等、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ
ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ，１９９
３８２４５−２５２）。成体に於いて、ＰＤＧＦは、損傷治癒を刺激する（
ロブソン（Ｒｏｂｓｏｎ）等、Ｌａｎｃｅｔ，１９９２３３９２３−２５）
。構造的には、ＰＤＧＦアイソフォームは、ホモダイマー（ＰＤＧＦ−ＡＡ及び
ＰＤＧＦ−ＢＢ）又はヘテロダイマー（ＰＤＧＦ−ＡＢ）として構成される、ホ
モロガスなＡ−及びＢ−ポリペプチド鎖のジスルフィド結合ダイマーである。

【００２７】ＰＤＧＦアイソフォームは、標的細胞に対して、二つの構造的に関連したレセ
プターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に結合することによってその作用を与える。
アルファー−レセプターは、ＰＤＧＦのＡ鎖とＢ鎖の両方に結合するのに対して
、ベーター−レセプターは、Ｂ鎖にのみ結合する。これらの二つのレセプターは
、多くのイン・ヴィトロ増殖細胞ラインによって発現され、主としてイン・ヴィ
ヴォで間葉系細胞によって発現される。ＰＤＧＦは、イン・ヴィトロにおいて細
胞増殖、細胞生存、及び多くの細胞タイプの走化性を調節する（ヘルディン（Ｈ
ｅｌｄｉｎ）等、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ．，１９９８１３７８Ｆ７９−１１３に於いて検討されている）。イン・ヴィヴォでは、それ
らは、多くの場合、ＰＤＧＦＲ発現間充織に近接並置する上皮（ＰＤＧＦ−Ａ）
又は内皮細胞（ＰＤＧＦ−Ｂ）に於いて発現されることから、パラクリンモード
で作用する。腫瘍細胞とイン・ヴィトロで増殖された細胞ラインに於いては、Ｐ
ＤＧＦと前記レセプターとの同時発現によって、細胞トランスフォーメーション
にとって重要な自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）ループが作り出される（ベトシ
ョルツ（Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ）等、Ｃｅｌｌ，１９８８３９４４７−５７；
キーティング（Ｋｅａｔｉｎｇ）等、Ｊ．Ｒ．ＣｏｌｌＳｕｒｇＥｄｉｎｂ
．，１９９０３５１７２−４）。悪性腫瘍、細動脈硬化、線維性増殖疾患を
含むいくつかの病理状態に於いてＰＤＧＦの過剰発現が観察されている（ヘルデ
ィン（Ｈｅｌｄｉｎ）等、ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＷｏｕｎｄＲｅｐａｉｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：
ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，１９９６，２４９−２７３に於いて検討されている
）。

【００２８】ＰＤＧＦの細胞増殖及び生存の調節因子としての重要性は、ＰＤＧＦＲのリガ
ンド特異性が重複しているにも拘わらず、ＰＤＧＦとそのレセプターの明瞭な生
理学的役割を示した最近の研究によって十分示されている。これら二つのＰＤＧ
Ｆリガンド又はレセプターのいずれかの同型接合体ヌル突然変異（ｈｏｍｏｚｙ
ｇｏｕｓｎｕｌｌｍｕｔａｔｉｏｎ）は致命的である。同型接合体ＰＤＧＦ
−Ａ欠損マウスの約５０％は、初期致死表現型を有するのに対し、生存マウスは
肺胞筋線維芽細胞の欠陥のために不適切な肺胞間中隔形成に依る肺気腫を有する
複雑な出生後表現型を有する（ボストレーム（Ｂｏｓｔｒｏｍ）等、Ｃｅｌｌ，
１９９６８５８６３−８７３）。ＰＤＧＦ−Ａ欠損マウスは、更に、薄い真
皮、奇形毛嚢、及び薄い毛によって特徴付けられる皮膚表現型を有する（カール
ソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９９１２６２
６１１−２）。ＰＤＧＦ−Ａは、又、乏枝神経膠細胞の正常な発達と、その後の
中枢神経系の髄鞘形成にも必要である（フルッティガー（Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ）
等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９９１２６４５７−６７）。ＰＤＧＦＲ
−α欠乏マウスの表現型は、Ｅ１０に於ける初期胎児死亡、不完全な頭部閉鎖、
神経堤発達障害、心臓血管欠陥、骨格欠陥、及びｏｄｅｍａｓを有しより深刻で
ある（ソリアノ（Ｓｏｒｉａｎｏ）等、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７１２４２６９１−７０）。ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰＤＧＦＲ−β欠損マウスも、腎臓
、血液及び心臓血管異常によって特徴付けられる類似の表現型を持つようになり
（レビーン（Ｌｅｖｅｅｎ）等、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１９９４８１８７
５−１８８７；ソリアノ（Ｓｏｒｉａｎｏ）等、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１９９
４８１８８８−９６；リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９７２７７２４２−５；リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ）、Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ，１９９８１２５３３１３−２）、そこで、腎臓及び心臓血管欠
陥は、少なくとも部分的には、壁細胞（血管平滑筋細胞、周皮細胞又は糸球体間
質細胞）の血管への適切な補充（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）の欠如に依るもので
ある（レビーン（Ｌｅｖｅｅｎ)等、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１９９４８１
８７５−１８８７；リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ）等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９
７２７７２４２−５；リンダール（Ｌｉｎｄａｈｌ），Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ，１９９８１２５３３１３−２）。

【００２９】発明の要旨本発明は、一般に、内皮細胞、結合組織細胞、筋線維芽細胞、及びグリア細胞
を非限定的に含む、ＰＤＧＦ−Ｄレセプターを発現する細胞の増殖又は分化およ
び／又は成長および／又は固有運動性を、刺激および／又は増強する能力を有す
る、単離された新規な増殖因子、この新規な増殖因子をコードする単離ポリヌク
レオチド配列、及び、診断および／又は治療用途に有用な組成物、を提供するも
のである。

【００３０】一態様に依れば、本発明は、図３に示された配列（配列識別番号３）の少なく
ともヌクレオチド１−６００、図５に示された配列（配列識別番号５）の少なく
ともヌクレオチド１−９６６、図７に示された配列（配列識別番号７）の少なく
ともヌクレオチド１７６−１２８８、、図７に示された配列（配列認識番号７）
の少なくともヌクレオチド９３８−１２８８に対して、少なくとも８５％、好ま
しくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポ
リヌクレオチド配列から成る単離され精製された核酸分子を提供する。図３に示
された配列の前記少なくともヌクレオチド１−６００又は図５に示された配列の
前記少なくともヌクレオチド１−９６６の配列とは、ＰＤＧＦ−Ｄ（以前には「
ＶＥＧＦ−Ｇ」と命名されていた）と称される５‘−切断ポリヌクレオチドをコ
ードし、これに対して、図７の配列（配列識別番号７）の少なくともヌクレオチ
ド１７３−１２８８は、全長ＰＤＧＦ−Ｄをコードする。ＰＤＧＦ−Ｄは、ＰＤ
ＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−
Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに対して構造的にホモロガスである。図７（
配列識別番号７）の少なくともヌクレオチド９３８−１２８８の配列は、前記Ｐ
ＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインの一部をコードし、これはＰＤＧＦ−Ｄの
生物活性フラグメントである。この生物活性フラグメントは、又、図３の配列の
少なくともヌクレオチド１−６００又は図５の配列の少なくともヌクレオチド１
−９６６によってもコードされるであろう。一好適実施例に於いて、前記核酸分
子は、図３に示された配列（配列識別番号３）の少なくともヌクレオチド１−６
００、図５に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌクレオチド１−９
６６、図７に知れされた配列（配列識別番号７）のヌクレオチド１７３−１２８
８、又は図７に示された配列（配列識別番号７）の少なくともヌクレオチド９３
８−１２８８を有するｃＤＮＡである。本発明のこの態様は、更に、図３に示さ
れた配列（配列識別番号３）の少なくともヌクレオチド１−６００、図５に示さ
れた配列（配列識別番号５）の少なくともヌクレオチド１−９６６、図７に示さ
れた配列（配列識別番号７）の少なくともヌクレオチド１７３−１２８８、又は
図７に示された配列（配列識別番号７）の少なくともヌクレオチド９３８−１２
８８、又はこれらのフラグメントとストリンジェント条件下に於いてハイブリダ
イズするような配列を有するＤＮＡ分子も含む。

【００３１】第２の態様に依れば、本発明の前記ポリペプチドは、内皮細胞、結合組織細胞
、筋線維芽細胞、及びグリア細胞を非限定的に含む、ＰＤＧＦ−Ｃレセプターを
発現する細胞の増殖又は分化および／又は成長および／又は固有運動性を、刺激
および／又は増強する能力を有し、図４（配列識別番号４）又は図６（配列識別
番号６）又は図８（配列識別番号８）のアミノ酸配列、或いは、そのフラグメン
ト又はアナログであって、結合組織細胞（線維芽細胞等）、筋線維芽細胞、及び
グリア細胞の内皮細胞の増殖、分化、遊走、および又は生存および／又は成長お
よび／又は固有運動性を、刺激する能力を有するものから成る。好ましくは、前
記ポリペプチドは、図４（配列識別番号４）又は図６（配列識別番号６）又は図
８（配列識別番号８）のアミノ酸配列、又は、ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有する
そのフラグメント又はアナログ、に対して少なくとも８５％、好ましくは少なく
とも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。好適なフラグ
メントは、ＰＤＧＦ−ＤのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメイン（ＰＶＨＤ）
の一部を有する切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｆｏｒｍ）のＰＤＧＦ−Ｄである
。そのＰＶＨＤの部分は、図８の残基２５５−３７１からであり、そこで、推定
タンパク質分解プロセシング部位ＲＫＳＫは、アミノ酸残基２５５（配列識別番
号８）から始まる。しかしながら、前記ＰＶＨＤは、Ｎ末端に向かって図８（配
列認識番号）８の残基２３５まで伸長している。ここで、ＰＶＨＤを切断ＰＤＧ
Ｆ−Ｄと定義する。切断ＰＤＧＦ−Ｄは、推定活性化型のＰＤＧＦ−Ｄである。

【００３２】本出願での使用に於いて、百分率配列同一性は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅパッケー
ジ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｌｔｄ．ＡｂａｃｕｓＨｏｕｓｅ，ＭａｎｏｒＲｏａ
ｄ，ＷｅｓｔＥａｌｉｎｇロンドンＷ１３０ＡＳＵ．Ｋ．）から市販されて
いる“ＭＥＧＡＬＩＧＮ”というアライメント・ツールを使用することによって
測定される。ＭＡＧＡＬＩＧＮは、Ｊ．Ｈｅｉｎ法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０１８３６２６−６４５）に基づく。ＰＡＭ２
５０残基ウェイトテーブルが、対アラインメントに於ける１１のギャップペナル
ティ、３のギャップ長さペナルティ、２のK−タプル値（K−ｔｕｐｌｅｖａｌ
ｕｅ）、で使用された。その後、アライメントを、手作業によって微調節し、同
一性の数は、比較可能な領域に於いて推定される。

【００３３】好ましくは、前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドからのコード化されたポ
リペプチドは、血管内皮細胞、リンパ内皮細胞、結合組織細胞（線維芽細胞等）
、筋線維芽細胞、及びグリア細胞を非限定的に含む、ＰＤＧＦ−Ｄレセプターを
発現する細胞の、増殖、分化、固有運動性、生存又は血管透過性のいずれか一つ
又はそれ以上を、刺激する能力を有する。好ましくは、ポリペプチド、ポリヌク
レオチドからの前記コード化ポリペプチドは、損傷治癒を刺激する能力を有する
。ＰＤＧＦ−Ｄは、更に、細胞に対するアンタゴニスト作用を有するが、それら
はＰＤＧＦ−Ｄの生物活性に含む。以後、これらの能力を、「ＰＤＧＦ−Ｄの生
物活性」と称し、それらは、公知の方法によって容易にテストすることができる
。

【００３４】ここでの使用に於いて、「ＰＤＧＦ−Ｄ」という語は、図４（配列識別番号４
）、図６（配列識別番号６）又は図８（配列識別番号８）のポリペプチドと、上
に定義したＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログと、
ＰＤＧＦ−Ｄをコード可能なポリヌクレオチド、又は、ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性
を有するそのフラグメント又はアナログとを総称するものである。前記ポリヌク
レオチドは、裸および／又はベクター又はリポソームに含まれたもの、とするこ
とができる。

【００３５】別の好適態様に於いて、本発明は、アミノ酸配列；ＰＸＣＬＬＶＸＲＣＧＧＮＣＸＣ（配列識別番号２５）をプロセッシングするポ
リペプチドを提供し、上記アミノ酸配列は、ＰＤＧＦ−Ｄに固有であって、第３
と第４のシステイン間の三つのアミノ酸残基（ＮＣＡ）の挿入に依り、ＰＤＧＦ
／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の他のメンバーと異なる（図９−配列識別番号
ＮＯ：１０−１８を参照）。

【００３６】保存された置換、挿入、又は欠失を含むが、前記ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を保
持しているポリペプチドも、本発明の範囲に含まれることは当然である。当業者
にとって、部位特異的突然変異、又は、特異的酵素開裂やライゲーション等の、
そのようなポリペプチドを作り出すのに容易に使用可能な方法は周知であろう。
当業者にとって、又、単数又は複数のアミノ酸残基が、非自然発生アミノ酸又は
アミノ酸アナログによって置換されたペプチドを模倣した（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉ
ｍｅｔｉｃ）化合物又は化合物が、前記ＰＤＧＦ−Ｄ生物活性の必要な側面を保
持することが可能である、ということも十分理解されるであろう。そのような化
合物は、公知の方法によって容易に製造し、線維芽細胞増殖アッセイ等のルーチ
ン的な活性アッセイ手法によってそのＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を示すそれらの能
力をテストすることができ、それらも、又、本発明の範囲に含まれる。

【００３７】更に、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとに於いて得られることが知られているような
選択的スプライシング及びＰＤＧＦ−Ｄをコードする前記核酸配列の自然発生対
立遺伝子バリアントによって得られるＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドの可能なバリア
ントも、本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子バリアントは周知であり、Ａｌｔ
ｅｒｎａｔｉｖｅｆｏｒｍ又は、単数又は複数のヌクレオチドの置換、欠失又
は付加を有するが、コードされたポリペプチドのいかなる機能的変化も起こらな
い核酸配列の別形態を表わすものである。

【００３８】ＰＤＧＦ−Ｄのそのようなバリアントは、改変のためにＰＤＧＦ−Ｄポリペプ
チドの非必須領域を標的化することによって調製することができる。これらの非
必須領域は、図９（配列識別番号１０−１８）に示された強力に保存された領域
の外側にあるものと予想される。具体的には、ＶＥＧＦを含むＰＤＧＦファミリ
ーの前記増殖因子は、ダイマーである。ＰＤＧＦ−Ｄは、前記ＰＶＨＤの前記八
つのシステイン残基の内の７つのみの完全な保存を示すことから、ＶＥＧＦ，Ｖ
ＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ，ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧ
Ｆ−Ｂと僅かに異なる（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３２５７６−２５８１；ヨウコ
フ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯＪ．，１９９６１５２９０−２９８）。
これらのシステインは、分子内及び分子間ジスルフィド結合に関連しているもの
と考えられる。分子内ジスルフィド結合によって形成される、各サブユニットの
ループ１，２及び３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子のレセプター
に対する結合に関連している（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）等、Ｇｒｏ
ｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，１９９５１２１５９−１６４）。

【００３９】従って、当業者にとって、これらのシステイン残基が、提案されるバリアント
のすべてに保存されるはずであり、ループ１，２及び３に保存される活性部位が
保存されるはずである、ことは周知である。しかしながら、前記分子の他の領域
は、その生物機能に関する重要性は低いものと予想され、従って、改変のための
好適な標的を提供する。改変ポリペプチドの、前記ＰＤＧＦ−Ｄ生物活性を示す
能力は、線維芽細胞増殖アッセイ等のルーチン的な活性アッセイ手法によって容
易にテストすることができる。

【００４０】いくつかの改変ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドは、内皮細胞、結合組織細胞、筋線
維芽細胞、および／又はグリア細胞、を非限定的に含む、細胞上でＰＤＧＦ−Ｄ
レセプターに結合する能力を有するが、細胞の増殖、分化、遊走、固有運動性又
は生存を刺激したり、血管増殖、結合組織の発達、損傷治癒を誘発させることは
できない、と勘案される。これらの改変ポリペプチドは、ＰＤＧＦ−Ｄポリペプ
チドとＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の競合又は非競合インヒビター
として作用することが可能であり、ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチド又はＰＤＧＦ／Ｖ
ＥＧＦファミリー増殖因子の阻止又は減少が望ましい状況に於いて有用であると
予測される。従って、そのようなレセプター結合性ではあるが、非マイトジェン
活性、非分化誘発性、非遊走誘発性、非固有運動性誘発性、非生存誘発性、非結
合組織発達促進性、非損傷治癒性又は非血管増殖誘発性のＰＤＧＦ−Ｄポリペプ
チドのバリアントも本発明の範囲に含まれ、これらを、ここで、「レセプター結
合性ではあるが、その他の点では不活性なバリアント」と称する。ＰＤＧＦ−Ｄ
は、その唯一の知られているレセプターを活性化するためにダイマーを形成する
ので、一つのモノマーは、前記レセプター結合性ではあるが、その他の点では不
活性なバリアント改変ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドから成り、第２のモノマーは、
野生型ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの野生型増殖因子から成
るものと勘案される。これらのダイマーは、その対応のレセプターに結合できる
が、下流側のシグナル伝達を誘発することはできない。

【００４１】又、内皮細胞、結合組織細胞（線維芽細胞等）、筋線維芽細胞、および／又は
グリア細胞を非限定的に含む、細胞上で、その対応するレセプターへの野生型Ｐ
ＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの野生型増殖因子の結合を阻止す
ることが可能なその他の改変ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドが存在するものと勘案さ
れる。従って、これらのダイマーは、内皮細胞増殖、分化、遊走、生存を刺激し
たり、血管透過性を誘発させたり、および／又は、結合組織細胞、筋繊維芽細胞
、又はグリア細胞の増殖および／又は分化、および／又は固有運動性を誘発させ
ることができないものとなるであろう。これらの改変ポリペプチドは、ＰＤＧＦ
−Ｄ増殖因子又は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の競合又は非競合
インヒビターとして作用することが出来、ＰＤＧＦ−Ｄ増殖因子又はＰＤＧＦ／
ＶＥＧＦファミリー増殖因子作用の阻止又は減少が望ましい状況において有用な
ものであると予測される。そのような状況としては、一次又は転移腫瘍形成によ
る腫瘍細胞の正常細胞集団への浸潤中に起こる組織再構築がある。従って、その
ようなＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリー増殖因子結合性であるが
、非マイトジェン活性、非分化誘発性、非遊走誘発性、非固有運動性誘発性、非
生存誘発性、非結合組織発達促進性、非損傷治癒性又は非血管増殖誘発性のＰＤ
ＧＦ−Ｄのバリアントも、本発明の範囲に含まれ、これらを、ここで、「ＰＤＧ
Ｆ−Ｄ増殖因子−ダイマー形成性であるが、その他の点では不活性又は干渉性の
バリアント」と称する。

【００４２】ＰＤＧＦ−Ｄ増殖因子−ダイマー形成性であるが、その他の点では不活性又は
干渉性のバリアントの一例は、ＰＤＧＦ−Ｄがタンパク質からのＣＵＢドメイン
の劈開を妨げる突然変異を有する場合である。更に、前記ＰＤＧＦ−Ｄ増殖因子
−ダイマー形成性であるが、その他の点では不活性又は干渉性のバリアントは、
ＣＵＢドメインのタンパク質からの劈開を妨げる突然変異を有する、ＣＵＢドメ
インにリンクされた、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，
ＰＤＧＦ−Ｃ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ又は
ＰｌＧＦの、モノマー、好ましくは活性化モノマー、から成るものとして作るこ
とが可能であろう。上述したＰＤＧＦ−Ｄ増殖因子−ダイマー形成性であるが、
その他の点では不活性又は干渉性のバリアントと、変異ＣＵＢドメインにリンク
されたモノマーとで形成されるダイマーは、それらに対応のレセプターに結合す
ることは出来ないであろう。

【００４３】この構成の一つのバリエーションは、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ
，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、
ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰｌＧＦの活性化モノマーと、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥ
ＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧ
Ｆ−Ｄ又はＰｌＧＦの活性化モノマーにダイマー化される変異ＣＵＢドメインリ
ンケージとの間に蛋白質分解部位を挿入する構成である。この蛋白質分解部位に
特異的なプロテアーゼ（単数又は複数）を付加することによって、ＣＵＢドメイ
ンが切り開かれ、これによって、その対応のレセプターに結合することができる
活性化ダイマーが遊離される。このようにして、活性化ダイマーの制御された遊
離が可能となる。

【００４４】第３の態様に依れば、本発明は、ポリペプチド又は上に定義した本発明のポリ
ペプチドフラグメントをコードする精製単離核酸を提供する。この核酸は、ＤＮ
Ａ，ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡとすることができ、これは、一本鎖又は
二本鎖とすることができる。この核酸は、細胞又は組織源（ｔｉｓｓｕｅｓｏ
ｕｒｃｅ）から単離することができ、又、組換え又は合成由来であってもよい。
遺伝コードの縮重に依り、当業者は、各配列が図４（配列識別番号４）、図６（
配列識別番号６）又は図８（配列識別番号８）に図示されたアミノ酸配列、その
生物活性フラグメント又はアナログ、そのレセプター結合性であるがその他の点
では不活性又は部分的に不活性なバリアント又は、そのＰＤＧＦ−Ｄ−ダイマー
形成性であるが、その他の点では不活性又は干渉性のバリアント、をコードする
、多くのそのようなコード化配列が可能であることを理解するであろう。

【００４５】本発明の第４の態様は、本発明の前記ｃＤＮＡ又は、本発明の前記第３態様に
依る核酸分子を有するベクターと、及び、本発明の核酸分子又はベクターでトラ
ンスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。これらは、原核
又は真核由来とすることができる。これらの細胞は、本発明のポリペプチドの発
現に特に好適であって、バキュロウイルスによってトランスフォームされた、Ａ
ｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可
能なＳｆ９細胞（ＡＴＣＣＳＰＬ−１７１）等の昆虫細胞、及び、適当な発現
プラスミドによってトランスフェクトされたヒト胎児腎臓細胞ライン２９３−Ｅ
ＢＮＡを含む。本発明の好適なベクターは、それらベクターによってトランスフ
ォーム又はトランスフェクトされた適当な宿主細胞が、本発明の前記ポリペプチ
ドを発現することが可能なように、本発明の核酸が、単数又は複数の適当なプロ
モーターおよび／又はその他の制御配列に作動可能に接続されている発現ベクタ
ーである。その他の好適なベクターは、アデノウイルス−、ワクシニア−、又は
レトロウイルス−ベースのベクター又はリポソーム等の、哺乳動物細胞のトラン
スフェクション、又は遺伝子療法に適したものである。そのような様々なベクタ
ーは公知である。

【００４６】本発明は、更に、本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現
可能なベクターを製造する方法であって、前記核酸分子を単数又は複数の適当な
プロモーターおよび／又は、上述したようにその他の制御配列に作動可能に接続
する工程を有する方法を提供する。

【００４７】本発明は、更に、本発明のポリペプチドを製造する方法であって、本発明の核
酸又はベクターを宿主細胞中で発現させる工程と、宿主細胞から、又は、その宿
主細胞の増殖培地から、前記ポリペプチドを単離する工程とを有する方法を提供
する。

【００４８】更に別の態様に於いて、本発明は、本発明のポリペプチド又はこのポリペプチ
ドのフラグメントに対して特異的に反応する抗体を提供する。本発明のこの態様
は、ＰＤＧＦ−Ｄのバリアント、免疫反応性フラグメント、アナログ、又は組換
型に対して特異的な抗体を含む。それらの抗体は、ＰＥＧＦ−Ｄのインヒビター
又はアゴニストとして、そして、ＰＤＧＦ−Ｄを検出し、量化する診断剤として
有用である。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。
モノクローナル又はポリクローナル抗体は、標準方法を使用して、本発明のポリ
ペプチド又は、そのフラグメント又はアナログに対して産生することができる。
更に、前記ポリペプチドは、アフィニティー精製を補助するべく、ＦＬＡＧ（登
録商標）オクタペプチド（ＳｉｇｍａＳｔ．ＬｏｕｉｓＭＯ）等の、エピト
ープ・タグに結合させることができる。いくつかの目的の為には、たとえば、臨
床状況に於いてＰＤＧＦ−Ｄの影響を抑制するためにモノクローナル抗体が使用
される場合、等、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体を使用することが望まし
いかもしれない。そのような抗体は、細胞傷害性又は細胞***抑制性薬剤（単数
又は複数）の追加によって更に改変することができる。組換えＤＮＡ法を含む、
これらを作り出す方法も周知である。

【００４９】本発明のこの態様は、更に、ＰＤＧＦ−Ｄを認識し、適当に標識された抗体を
含む。

【００５０】本発明のポリペプチド又は抗体は、検出可能標識によって標識して診断目的の
ために利用することができる。同様に、このように標識された本発明のポリペプ
チドは、その対応するレセプターをインサイチュで同定するのに使用することが
できる。前記ポリペプチド又は抗体は、画像化（ｉｍａｇｉｎｇ）のために、適
当な超磁性、常磁性、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）、又は
放射性物質と共有又は非共有結合させることが可能であろう。診断アッセイの目
的のためには、放射性又は非放射性標識を使用することができる。放射性標識の
具体例としては、¹²⁵Ｉや³²Ｐ等の放射性原子又は基がある。非放射性標識の具
体例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素標識や、フルオレ
シン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光標識がある。標識化は直接
的又は間接的、共有結合又は非共有結合とすることができる。

【００５１】本発明の臨床用途としては、診断用途、組織又は臓器移植における脈管形成の
加速、又は、損傷治癒の刺激、又は、結合組織の発達、或いは、冠状動脈疾患等
の組織梗塞又は動脈狭窄に於ける側副血行の形成、ガン又は糖尿病性網膜症の治
療に於ける脈管形成の抑制、一次又は転移腫瘍形成による腫瘍細胞の正常細胞集
団への浸潤中に起こる組織再構築の抑制、がある。ガン生検標本に於いてＰＤＧ
Ｆ−Ｄを定量化することは、将来の転移リスクのインジケーターとして有用であ
ろう。

【００５２】ＰＤＧＦ−Ｄは、更に、種々の肺状態にも関連している可能性がある。種々の
肺障害の診断にＰＤＧＦ−Ｄアッセイを使用することが出来るであろう。ＰＤＧ
Ｆ−Ｄは、又、肺の血液循環および／又は肺と血液流との間のガス交換を改善す
るための肺障害の治療にも使用することができるであろう。同様に、ＰＤＧＦ−
Ｄは、心不全の場合に、心臓に対する血液循環とＯ₂ガス透過性を改善するため
に使用することが可能であろう。同様に、ＰＤＧＦ−Ｄは、慢性閉塞性気道疾患
に於いて血液流とガス交換を改善するために使用することができるであろう。

【００５３】従って、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に於いて、脈管形成
、リンパ脈管形成、新血管新生、結合組織発達および／又は損傷治癒、を刺激す
る方法であって、その哺乳動物に対して、ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ−Ｄの生物
活性を有するそのフラグメント又はアナログを有効投与量投与する工程を有する
方法を提供する。オプションとして、前記ＰＤＧＦ−Ｄ又はそのフラグメント又
はアナログは、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧ
Ｆ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ，ＦＧＦおよび／又はヘパリン
のいずれか一つ又は複数と共に、或いは、それと結合させて投与することができ
る。

【００５４】反対に、ＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニスト（たとえば、抗体および／又はダイマー
形成とレセプター結合との両方に於けるＰＤＧＦ−Ｄの結合の競合又は非競合イ
ンヒビター）を、たとえば、血管透過性の増大から発生する肺等、その中での体
液の貯留に関連する、うっ血性心不全等の、状態を、その体液貯留を妨げるべく
血管透過性に対してオフセット作用（ｏｆｆｓｅｔｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）を
及ぼすことによって治療することに使用できるであろう。その血液循環の増大と
、血管透過性増大活性の結果としての、腸管、肝臓又は腎臓における吸収不良症
候群を治療するために、ＰＤＧＦ−Ｄの投与を使用することができるであろう。

【００５５】従って、本発明は、そのような治療を必要とする哺乳動物に於いて、脈管形成
、リンパ脈管形成、新血管新生、結合組織発達および／又は損傷治癒、を抑制す
る方法であって、その哺乳動物に対して、ＰＤＧＦ−Ｄのアンタゴニストを有効
投与量投与する工程を有する方法を提供する。このアンタゴニストは、標的細胞
上に於いてＰＤＧＦ−Ｄがその対応のレセプターに結合することを阻止すること
によって、或いは、レセプター結合ＰＤＧＦ−Ｄバリアントの使用等の、レセプ
ターの活性を阻止することによって、ＰＤＧＦ−Ｄの作用を阻止するいかなる作
用物質であってもよい。適当なアンタゴニストとしては、非限定的に、ＰＤＧＦ
−Ｃに対する抗体、上述したレセプター結合性又はＰＤＧＦ−Ｄダイマー形成性
ではあるが、非マイトジェン活性ＰＤＧＦ−Ｄバリアント等のＰＤＧＦ−ＤのＰ
ＤＧＦ−Ｄレセプターへの結合の競合又は非競合性インヒビター、および、後述
するアンチセンスヌクレオチド配列、が挙げられる。

【００５６】活性化切断型のＰＤＧＦ−Ｄに結合する作用物質を測定する方法が提供される
。この方法は、活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄをテスト作用物質に接触させる工程と
、結合を適当な手段によってモニターする工程とを有する。作用物質には、化合
物とその他のタンパク質との両方を含むことができる。

【００５７】本発明は、活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄに結合する物質を発見するためのスクリ
ーニングシステムを提供する。このスクリーニングシステムは、活性化切断型Ｐ
ＤＧＦ−Ｄを調製する工程と、この活性化切断型のＰＤＧＦ−Ｄをテスト作用物
質に対して露出させる工程と、適当な手段によって前記作用物質の前記活性化切
断型のＰＤＧＦ−Ｄに対する結合を量化する工程とを有する。このスクリーニン
グシステムは、又、全長ＰＤＧＦ−Ｄタンパク質のタンパク質分解劈開を抑制し
、これによって、前記活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄの遊離を阻止する作用物質を同
定するのにも使用することができる。この利用法の為には、全長ＰＤＧＦ−Ｄが
調製されなければならない。

【００５８】このスクリーニングシステムの使用は、ＰＤＧＦ−Ｄの生物学的機能を変化さ
せる可能性のある化合物を測定するための手段を提供する。このスクリーニング
法を、ＰＡＮＤＥＸ（登録商標）（Ｂａｘｔｅｒ−ＤａｄｅＤｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ）等の大規模自動化処理に適用して、潜在的に治癒作用を有する作用物質
の効率的で大量のスクリーニングを可能とすることができる。

【００５９】このスクリーニングシステムのために、好ましくは組換えＤＮＡ技術を使用し
て、ここに記載されるように、活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ−Ｄ
を調製する。テスト物質、たとえば化合物やタンパク質、を、前記活性化切断型
ＰＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ−Ｄを収納した反応容器に投入する。前記テスト
物質の活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ−Ｄに対する結合は、非限定
的に、前記テスト物質を放射性又は化学標識することを含む適当な手段によって
、測定される。前記活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ−Ｄの結合は、
ここに参考文献として合体させる米国特許第５，５８５，２７７号に記載の方法
によっても行うことができる。この方法に於いて、テスト物質の活性化切断型Ｐ
ＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ−Ｄに対する結合は、折りたたみ（ｆｏｌｄｅｄ）
タンパク質の折りたたみの解けた（ｕｎ−ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質に対する比
率をモニターすることによって評価される。このモニター法の具体例としては、
非限定的に、プロテアーゼに対する活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄ又は全長ＰＤＧＦ
−Ｄの感受性、又は、折りたたみ状態のタンパク質に対する特異的抗体によるタ
ンパク質に対する結合への従順性（ａｍｅｎａｂｉｌｉｔｙ）、をモニターする
ことが挙げられる。

【００６０】当業者は、ＩＣ₅₀値がテストされる作用物質の選択性に依存していることを認
識するであろう。たとえば、１０ｎＭ以下であるＩＣ₅₀を有する作用物質は、一
般に、薬剤治療のために極めて優れた候補であると見なされる。しかしながら、
親和性は低いが、特定の標的に対して選択的な作用物質のほうがより良い候補で
あるかもしれない。当業者は、特定の作用物質の結合潜在能力、抑制活性又は選
択性に関する情報が、医薬製品の開発のために有用であることを認識するであろ
う。

【００６１】治療目的の為にＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニストが使用される場
合には、その投与量又は投与経路は、患者の特性及び治療される状態に依存する
ものなり、それは、担当の医師又は獣医の裁量によるものとなるであろう。適当
な経路としては、経口、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射、非経口的、局所
投与、移植、等がある。ＰＤＧＦ−Ｄの局所投与は、ＶＥＧＦと同様に使用する
ことができる。脈管形成の増強が有利である損傷治療やその他の利用法に使用さ
れる場合、有効量の切断活性型ＰＤＧＦ−Ｄを、約０．１から１０００μｇ／ｋ
ｇ体重の投与量、それを必要とする生物に投与する。

【００６２】前記ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニストは、適当な医薬用担体と組
み合わせて使用することができる。それによって得られる組成物は、治療的有効
量のＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニストと、その薬用的に許容可能な
非毒性塩と、薬用的に許容可能な固体又は液体担体又はアジュバントとを有する
。そのような担体又はアジュバントの具体例としては、非限定的に、食塩水、緩
衝食塩水、リンゲル溶液、鉱物油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクト
ース、サッカロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、りん酸二
カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール
、エタノール、シックナー、安定剤、懸濁剤、及びこれらの組み合わせがある。
それらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、カプセル、クリーム、軟膏（ｓ
ａｌｖｅ）、エリキシル、シロップ、ウェハー、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）その
他の従来の形状のものとすることができる。その製剤形態は、投与の態様に適し
たものとされる。ＰＤＧＦ−Ｄを有する組成物は、更にオプションとして、ＰＤ
ＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−
Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦおよび／又はヘパリン1又は単数を含むことができ
る。ＰＤＧＦ−Ｄを有する組成物は、その活性化合物（単数又は複数種）を約０
．１％ないし９０％、より一般的には、約１０％ないし３０％含むものとされる
。

【００６３】筋肉内調合剤の場合、滅菌製剤、好ましくは、塩酸塩等の、適当な可溶性塩状
態の前記切断活性型ＰＤＧＦ−Ｄを、パイロジェンを取り除いた水（希釈）、生
理的食塩水又は５％グルコース溶液等に溶解させて投与することができる。前記
化合物の適当な不溶性状態のものは、水性又は薬用的に許容可能な油性、たとえ
ば、オレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸のエステル等、の懸濁液として調製し投与
することができる。

【００６４】更に別の態様に依れば、本発明は、典型的には、テストキット形状としての、
診断／予後徴候装置を提供する。たとえば、本発明の一実施例に於いて、ＰＤＧ
Ｆ−Ｄに対する抗体と、この抗体とＰＤＧＦ−Ｄとの間の結合を検出、より好ま
しくは、評価、するための手段とを有する診断／予後徴候装置が提供される。本
発明の前記診断／予後テストキットの一実施例に於いて、ＰＤＧＦ−Ｄに対する
前記抗体（一次抗体）と同じアイソタイプ及び動物由来の抗体に対する第２の抗
体（二次抗体）が提供される。この二次抗体は、検出可能標識に直接又は非直接
的に接続され、非標識一次抗体又はＰＤＧＦ−Ｄのいずれかを、基質結合させ、
ＰＤＧＦ−Ｄ／一次抗体の相互作用を、一次抗体とＰＤＧＦ−Ｄとの結合と、そ
の後の、標識二次抗体の一次抗体に対する結合の後で、基質に結合した標識の量
を測定することによって証明可能とする。本発明の特に好適な実施例に於いて、
前記診断／予後徴候装置は、従来式の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
キットとして提供することができる。

【００６５】別実施例に於いて、診断／予後徴候装置は、被験個体のＰＤＣＦ−Ｄの配列差
を形成し、この配列構造を、ＰＤＧＦ−Ｄ発現に於けるなんらかの異常が所与の
疾患状態と関連しているか否かを立証することを目的として、何らかの異常を検
出するべく、本出願に開示されたものと比較するためのポリメラーゼ連鎖反応手
段を有するものとすることができる。

【００６６】更に、診断／予後徴候装置は、制限酵素と、被験個体からのゲノムＤＮＡとを
利用してゲル上にＤＮＡバンドのパターンを生成し、このパターンを、ＰＤＧＦ
−Ｄ発現に於けるなんらかの異常が所与の疾患状態と関連しているか否かを立証
することを目的として、何らかの異常を検出するべく、本出願に開示されたもの
と比較する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）生成手段を有するものとすることができ
る。

【００６７】更に別の態様に依れば、本発明は、被験体における疾患状態に関連している可
能性のある被験体におけるＰＥＧＦ−Ｄ遺伝子構造の異常を検出する方法に関す
る。この方法は、前記被験体からのＤＮＡ又はＲＮＡサンプルを提供する工程と
、このＤＮＡサンプルまたはＲＮＡを、ポリメラーゼに作動可能接続されたＰＤ
ＧＦ−ＤＤＮＡに対して特異的なプライマーと接触させ、前記サンプルからの
ＰＤＧＦ−ＤＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応によって選択的に増幅する工程と
、前記サンプルからのその増幅されたＰＤＧＦ−ＤＤＮＡのヌクレオチド配列
を、図３（配列識別番号３）、図５（配列識別番号５）又は図７（配列識別番号
７）に示されたヌクレオチド配列と比較する工程を有する。本発明は、更に、ポ
リメラーゼに作動可能に接続されたＰＤＧＦ−ＤＤＮＡに対して特異的な一対
のプライマーを有し、これによって、前記ポリメラーゼが、ＤＮＡサンプルから
ＰＤＧＦ−ＤＤＮＡを選択的に増幅可能とされる、テストキットの提供を含む
。

【００６８】本発明は、更に、生物学的サンプル中のＰＤＧＦ−Ｄを検出する方法であって
、前記サンプルを、ＰＤＧＦ−Ｄに結合可能な試薬と接触させる工程と、その結
合を検出する工程とを有する方法を提供する。好ましくは、ＰＤＧＦ−Ｄに結合
可能な前記試薬は、ＰＤＧＦ−Ｄに対する抗体、特に好ましくは、モノクローナ
ル抗体、である。一好適実施例に於いて、前記結合および／又は結合の程度は、
検出可能な標識によって検出され、適当な標識は上述する。

【００６９】別の態様に於いて、本発明は、前記ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチド、特に、ジスル
フィド結合ダイマー、から成るタンパク質ダイマーに関する。本発明のこれらタ
ンパク質ダイマーとしては、ＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドのホモダイマーと、ＰＤ
ＧＦ−ＤとＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ，
ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ又はＰＤＧＦ−Ｃとのヘテロダイマーとの両方を含
む。

【００７０】本発明の更に別の態様に依れば、ＰＤＧＦ−Ｄの単離方法であって、細胞から
のＰＤＧＦ−Ｄの遊離を容易にするべくＰＤＧＦ−Ｄを発現するその細胞をヘパ
リンに対して露出する工程と、これによって遊離されたＰＤＧＦ−Ｄを精製する
工程とを有する方法が提供される。

【００７１】本発明の更に別の態様は、ＰＤＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有する
そのフラグメント又はアナログをコードするＤＮＡ配列の少なくとも一部に対し
て相補的なアンチセンスヌクレオチド配列を有するベクターの提供に関する。更
に、前記アンチセンスヌクレオチド配列は、ＰＤＧＦ−Ｄ発現を抑制、又は少な
くとも緩和するのに使用可能なＰＤＧＦ−Ｄ遺伝子のプロモーター領域、又は、
前記遺伝子のその他の非翻訳領域に対するものとすることができる。

【００７２】本発明の更に別の態様に依れば、アンチセンス配列を有するそのようなベクタ
ーは、ＰＤＧＦ−Ｄ発現を抑制、又は少なくとも緩和するのに使用可能である。
このＰＤＧＦ−Ｄ発現を抑制するためのこのタイプのベクターの利用は、ＰＤＧ
Ｆ−Ｄ発現が疾患に関連している場合、たとえば、脈管形成又は、腫瘍細胞が一
次又は転移腫瘍形成によって正常細胞集団に浸潤する間に起こる組織の再構築を
提供するために、腫瘍がＰＤＧＦ−Ｄを産生する場合、に好ましい。そのような
腫瘍細胞を、アンチセンスヌクレオチド配列を含むベクターでトランスフォーム
することによって、脈管形成の抑制、又は遅延および、その腫瘍の増殖又は組織
再構築が抑制、又は遅延されるであろう。

【００７３】本発明の更に別の態様は、前記全長ＰＤＧＦ−Ｄタンパク質は、活性ＰＤＧＦ
／ＶＥＧＦホモロジードメインを遊離するためにタンパク質分解プロセッシング
によって活性化させる必要がある潜在的増殖因子と思われるという発見に関係す
る。推定タンパク質分解部位は、前記全長タンパク質の残基２５５−２５８、残
基−ＲＫＳＲ−（配列識別番号９）、に見られる。これは二塩基モチーフである
。前記−ＲＫＳＲ−（配列識別番号９）推定タンパク質分解部位は、ＰＤＧＦ−
Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄにも見られる。これら４つの
タンパク質に於いて、前記推定タンパク質分解部位は、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ
ホモロジードメインの最小ドメインの直前にも見られる。これらの事実を総合す
ると、これがタンパク質分解部位であると示唆される。

【００７４】好適なプロテアーゼとしては、非限定的に、プラスミド、因子Ｘ、及びエンテ
ロキナーゼが挙げられる。前記Ｎ末端ＣＵＢドメインは、いくつかの細胞外コン
パートメントに於いてＰＤＧＦ−Ｄを潜在状態で保持するために使用されている
可能性があり、かつ、ＰＤＧＦ−Ｄが必要な時に限定蛋白質分解によって除去さ
れる抑制的なドメインとして作用するのかもしれない。

【００７５】本発明のこの態様に依れば、活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄを作る、又は、ＰＤＧ
Ｆ−Ｄのレセプター結合特異性を制御する方法が提供される。これらの方法は、
ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターを発現させる工程と、前記発現ポリペプチドをプロセッシング
して前記活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄを生成するための少なくとも一つの酵素をタ
ンパク質分解量供給する工程とを有する。

【００７６】この態様は、更に、増殖因子活性を有するポリペプチドを選択的に活性化する
方法を含む。この方法は、増殖因子活性を有するポリペプチドと、ＣＵＢドメイ
ンと、前記ポリペプチドと前記ＣＵＢドメインとの間のタンパク質分解部位をコ
ードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを発現させる工程と、前記発現ポ
リペプチドをプロセッシングして増殖因子活性を有する活性化ポリペプチドを生
成するための少なくとも一つの酵素をタンパク質分解量供給する工程とを有する
。

【００７７】更に、この態様は、ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するポリペプチドと、前記ア
ミノ酸配列ＲＫＳＲ（配列識別番号９）又はその構造的に保存されたアミノ酸配
列を有するタンパク質分解部位から成るそのポリペプチドをコードする核酸分子
、の単離を含む。

【００７８】この態様は、更に、ＰＤＧＦ−Ｄの活性化モノマーと、ＣＵＢドメインに結合
された、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ｄ
，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ又はＰｌＧＦの活性化モノマー、
又は、代わりに、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰＤ
ＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ，ＰＤＧＦ−Ｃ又はＰｌＧＦの活性化モ
ノマーと、ＣＵＢドメインに結合されたＰＤＧＦ−Ｄの活性化モノマーとを有す
る単離ダイマーを含む。この単離ダイマーは、前記活性化モノマーと前記ＣＵＢ
ドメインリンケージとの間にタンパク質分解部位を有するもの、又は、それを有
さないもの、とすることができる。

【００７９】上述したもののような本発明のポリヌクレオチド、それらポリヌクレオチドの
フラグメント、及びそれらポリヌクレオチドの非翻訳ストランドに対して、スト
リンジェント条件下でハイブリダイズするのに十分な類似性を有するそれらポリ
ヌクレオチドのバリアントは、他の非ヒト、哺乳動物型ＰＤＧＦをコードするポ
リヌクレオチドを同定、精製及び単離するのに有用である。従って、そのような
ポリヌクレオチドのフラグメント及びバリアントは、本発明の範囲に含まれるも
のである。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の具体例は次の通りで
ある。５ＸＳＳＣ、２０ｍＭＮａＰＯ₄，ｐＨ６．８，５０％ホルムアミド
で、４２℃でのハイブリダイゼーション、０．２ＸＳＳＣ４２℃で洗浄。当業
者は、これらの条件を、ハイブリダイズされる配列の長さ及びＧＣヌクレオチド
塩基含有量に基づいて変化させることが望ましいこと、又、そのような変化を決
定するための方式が存在すること、を理解するであろう。たとえば、サムブルッ
ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等、"ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ“，第二版、ｐ．９．４７−９．５１，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ニューヨーク；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）を参照。

【００８０】更に、その他の非ヒト、哺乳動物のＰＤＧＦ−Ｄ型をコードする精製単離ポリ
ヌクレオチドも本発明の態様であり、それらによってコードされるポリペプチド
と、前記非ヒトＰＤＧＦ−Ｄバリアントと特異的に免疫反応性である抗体も同様
である。従って、本発明は、精製単離哺乳動物のＰＤＧＦ−Ｄポリペプチドと、
更に、そのようなポリペプチドをコードする精製単離ポリヌクレオチドとを含む
。

【００８１】本発明の核酸分子及びポリペプチドは、合成手段又は組換え手段によって作る
ことができ、又、天然源から精製することができることは明白に理解されるであ
ろう。

【００８２】本明細書の目的の為に、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「
を含む、但し非限定的に」ということを意味している。「有する（ｃｏｍｐｒｉ
ｓｅｓ）」という語にも同様の意味が当てはまる。

【００８３】図面の簡単な説明図１（配列識別番号１）は、ヒトＰＤＧＦ−Ｄ（ｈＰＤＧＦ−Ｄ）のＣ末端部
をコードするｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列を示している。ｈＰＤＧＦ−Ｄの
前記一部フラグメントをコードするヌクレオチドは、１−１９８である。図１の
ヌクレオチド１−１９８から誘導されたｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸配列
（６６のアミノ酸残基−配列識別番号２）が図２に図示されている。

【００８４】図３（配列識別番号３）は、前記ｈＰＤＧＦ−Ｄの部分ヒトｃＤＮＡの伸長配
列を図示している。翻訳ｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド１−６００である。図３
のヌクレオチド１−６００由来のｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸配列（２０
０残基−配列識別番号４）が図４に図示されている。

【００８５】図５は、部分ヒトｃＤＮＡの更に別の伸長ヌクレオチド配列を図示している。
５‘切断された全長ｈＰＤＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチドは１−９６６（配
列識別番号５）である。図５のヌクレオチド１−９６６由来のｈＰＤＧＦ−Ｄの
推定部分アミノ酸配列（３２２の残基−配列識別番号６）が図６に図示されてい
る。

【００８６】図７（配列識別番号７）は、ｈＰＤＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡの完全ヌク
レオチド配列（１１１６ｂｐ）と、それによってコードされる３７１のアミノ酸
残基から成る全長ｈＰＤＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列（図８−配列識別番号８）
とを図示している。

【００８７】図９は、ｈＰＤＧＦ−ＤのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインとＶＥＧＦ
／ＰＤＧＦファミリーに属するいくつかの増殖因子（それぞれ、配列識別番号１
０−１８）とのアミノ酸配列アラインメントを図示している。

【００８８】図１０はＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに属するいくつかの増殖因子の進化系
統樹を示している。

【００８９】図１１は、ｈＰＤＧＦ−Ｄに存在するＣＵＢドメイン（配列識別番号１９）と
、ヒト骨形成タンパク質−１（ｈＢＭＰ−１，３つのＣＵＢドメインＣＵＢ１−
３）（それぞれ、配列識別番号２０−２２）と、ヒトニューロピリン−１（２つ
のＣＵＢドメイン）（それぞれ、配列識別番号２３−２４）とに存在するその他
のＣＵＢドメインとのアミノ酸配列アラインメントを提供している。

【００９０】図１２は、切断型ＰＤＧＦ−Ｄを含む培養上清（ＣＭ）が、ＰＡＥ−１細胞中
に於いてＰＤＧＦベータレセプターのチロシンリン酸化を刺激することを示して
いる。

【００９１】図１３は、切断型ＰＤＧＦ−Ｄを含む培養上清（ＣＭ）が、ＰＤＧＦベーター
レセプターとの結合に於いてＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーと競合するが、ＰＤＧ
Ｆアルファーレセプターとの競合に於いてＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーと競合し
ないことを示す結果のグラフによる説明を提供している。

【００９２】好適実施例の詳細な説明図１は、ここでＰＤＧＦ−Ｄ（以前にはＶＥＧＦ−Ｇ）と称する、新規な増殖
因子のＣ末端部分をコードするヒトｃＤＮＡのヌクレオチド配列を図示している
。ＰＤＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーの新規なメンバーである。図
１のヌクレオチド配列（配列識別番号１）は、ワシントンＤ．Ｃ．のＮＣＢＩの
ｄｂＥＳＴのヒトＥＳＴ配列（ｉｄ．ＡＩ４８８７８０）から得られた。図１の
ｃＤＮＡの前記ヌクレオチド１−１９８（配列識別番号１）は、ＶＥＧＦ／ＰＤ
ＧＦファミリーの公知にメンバーに対するいくらかの配列類似性を示す６６のア
ミノ酸ポリペプチド（図２−配列識別番号２）をコードする。

【００９３】図１（配列識別番号１）のポリヌクレオチドのヌクレオチド１−１９８によっ
てコードされる前記ポリペプチドのアミノ酸配列が図２（配列識別番号２）に図
示されている。

【００９４】ヒトＰＤＧＦ−Ｄに関してもっと配列情報を得るために、ヒト胎児肺λｇｔ１
０ｃＤＮＡライブラリーを、最初に同定されたＥＳＴ配列に基づき、３２７ｂｐ
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）−生成プローブを使用してスクリーニングした
。プローブは、市販のヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）か
らのＤＮＡから作られ、これは、同定されたＥＳＴ（ＡＩ４８８７８０）から得
られた二つのプライマーを使用したＰＣＲによって増幅された。これらプライマ
ーは以下であった。５‘−ＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧ（正方向）（配列識別番号２
６）、及び５‘−ＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＣＴＴＧＴＧＴＴＣ（逆方向）（配列識別番号２
７）。

【００９５】増幅された３２７ｂｐのフラグメントを、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）にクローニングした。ヌクレオチドシークエンシングによって、前
記インサートが前記ＥＳＴに対応していることを確認した。前記スクリーンでい
くつかの陽性クローンが同定された。これらクローンのうち、二つのクローン、
クローン５及び８からのインサートを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニ
ングし、内部又はベクター特異性プライマーを使用したヌクレオチドシークエン
シングを行った。決定されたヌクレオチド配列は、両クローンに於いて同一であ
ったが、これらを図３（配列識別番号３）に示す。前記６９０ｂｐポリヌクレオ
チドのコード化領域は、５‘末端を除いて、ｈＰＤＧＦ−Ｄの大きな部分をコー
ドするヌクレオチド１−６００（配列識別番号３）である。ｈＰＤＧＦ−Ｄのこ
の部分は、ｈＰＤＧＦ−Ｄの生物活性フラグメントを含む。図３（配列識別番号
３）のヌクレオチド１−６００から得られたｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸
配列（２００の残基−配列識別番号４）が図４（配列識別番号４）に図示されて
いる。

【００９６】このヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリーからの単離ヒトＰＤＧＦ―ＤｃＤＮＡク
ローンの伸長ヌクレオチドシークエンシングによって追加の配列を得た。図５（
配列識別番号５）は、ｈＰＤＧＦ−Ｄをコードする部分ヒトｃＤＮＡ（１９３４
ｂｐ）のヌクレオチド配列を示している。この１９３４ｂｐポリヌクレオチドの
コード化領域は、前記ポリヌクレオチドのｍｏｓｔ５‘末端を除いてｈＰＤＧ
Ｆ−Ｄをコードするヌクレオチド１−９６６である。図５（配列識別番号５）の
ヌクレオチド１−９６６から得られたｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸配列（
３２２の残基−配列識別番号６）が図６に図示されている。

【００９７】図７（配列識別番号７）は、全長ｈＰＤＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡのポリ
ヌクレオチド配列を図示している。ＰＤＧＦ−Ｄをコードする領域は１１１６ｂ
ｐである。全長ｈＰＤＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列は、３７１のアミノ酸残基（
図８−配列識別番号８）である。

【００９８】全長ＰＤＧＦ−Ｄの５‘末端の配列は、ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｃＤＮＡＥｎｄｓ（ＲＡＣＥ）ＰＣＲとヒト心臓からのｃＤＮＡ（Ｍａ
ｒａｔｈｏｎ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃７４０１０
１）を含むクローンとを使用して得た。これらのｃＤＮＡクローンは、アダプタ
ープライマー１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ：５’９ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ３‘９）（配列識別番号２８）と呼ばれるプライマーの
ための部位を含む、各クローンの５’末端に付着したアダプター配列を有する。
このプライマーと第２のプライマー５‘ＡＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＣＴＧＡ
ＴＧＧＡＧＡＧＴＴＡＴ３’（配列識別番号２９）とを使用して、ＰＤＧＦ−
Ｄの５‘末端に見つかった前記配列を増幅した。ＰＣＲ反応に於いて、特殊なポ
リメラーゼミックス（Ａｄｖａｎｔａｇｅ＜＜−ＧＣｃＤＮＡＰＣＲキット
、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃Ｋ１９０７−１）を使用した。この反応ミックス
は以下を含んでいた（マイクロリットル単位）：アダプタープライマー１１遺伝子特異的プライマー１テンプレート（ヒト心臓ｃＤＮＡ）５ＧＣ−Ｍｅｌｔ（Ｋ１９０７−１キットから）５５ｘＧＣｃＤＮＡＰＣＲ反応バッファー１０５０ｘｄＮＴＰミックス１無菌Ｈ２０２７トータル５０

【００９９】ＰＤＧＦ−Ｄの５‘末端を３１サイクル、９４℃で４５秒間の変性と７２℃で
４分間の伸長を５サイクル、９４℃で４５秒間の変性と７０℃で４分間の伸長を
５サイクル、そして９４℃で４５秒間の変成と６８℃で４分間の伸長を５サイク
ルと、９４℃で２分間の初期変性ステップ、増幅した。このＰＣＲから、約７９
０ｂｐ長の産物が得られた。その産物を、１％アガロースゲル上でランし、前記
ゲルから精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ、Ｑ
ｉａｇｅｎＣａｔ＃２８７０６）し、ベクターへクローニング（ＴＯＰＯＴ
Ａクローニングキット，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）し、バクテリア（Ｅ．Ｃｏｌｉ
）にトランスフォームした。トランスフォームされたバクテリアを、蒔き、３７
℃で一晩インキュベートした。シングルコロニーを取り出し、新しい培地で一晩
増殖させた。プラスミドを調製（ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ＃２７１０６）し、プラスミドプライマーＴ７
及びＭ１３Ｒでシークエンシングした。このシークエンシングの結果、従来知ら
れていない３１２ｂｐのＰＤＧＦ−Ｄ配列が得られた。この配列の残り部分（４
７８ｂｐ）は、他のＰＤＧＦ−ＤｃＤＮＡから以前に得られていた配列と同じ
であった。

【０１００】図９は、ＰＤＧＦ−ＤのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメイン（前記ポリペ
プチドのＣ末端領域に見られる）と、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーの
ホモロジードメイン、ＶＥＧＦ₁₆₅，ＰｌＧＦ−２，ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇，Ｐｏｘ
ＯｒｆＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−
Ｂ（それぞれ、配列識別番号１０−１８）とのアミノ酸配列アラインメントを示
している。この図では、ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−ＤとのＮ及びＣ末端のアミノ
酸配列のいくつかを省略している。前記アラインメントを最適化するためにギャ
ップを導入した。このアラインメントは、ジェイ・ハイン（Ｊ．Ｈｅｉｎ）の方
法（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９９０１８３６２６−４５）に基
づいて前記ＭＥＧＡＬＩＧＮアラインメントツールを使用して行われた。ＰＡＭ
２５０残基ウェイトテーブルを、対アラインメントに於ける１１のギャップペナ
ルティ、３のギャップ長さペナルティ、２のＫ−タプル値（Ｋ−ｔｕｐｌｅｖ
ａｌｕｅ）、で使用する。その後、アライメントを、手作業によって微調節し、
同一性の数は、比較可能な領域に於いて推定される。箱入りの残基、二つの離間
した単位内でＶＥＧＦ−Ｄと一致するアミノ酸を示している。

【０１０１】前記アラインメントは、ＰＤＧＦ−Ｄが、２つの例外を除いて、このファミリ
ーの特徴である、不変システイン残基の予想されたパターンを有していることを
示している。その第１の例外は、システイン３と４との間に起こる。通常、これ
ら二つのシステインは、２つの残基を介して離間しているのに対して、ＰＤＧＦ
−Ｄの場合には、三つの追加のアミノ酸（ＮＣＡ）の挿入がある。ＰＤＧＦ−Ｄ
における配列のこの特徴は、極めて予想外のものであった。第２は、ＰＤＧＦ／
ＶＥＧＦファミリーの他のメンバーに見られる不変の第５のシステインが、ＰＤ
ＧＦ−Ｄに於いては保存されていないことである。この特徴はＰＤＧＦ−Ｄに固
有のものである。

【０１０２】図９のアミノ酸アラインメントに基づき、進化系統樹を構築し、これを図１０
に示す。これらデータは、ＰＤＧＦ−ＤのＰＶＨＤがＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−
ＤとのＰＶＨＤに密接に関連していることを示している。

【０１０３】ＣＵＢドメイン図１１の前記部分ＰＤＧＦ−Ｄアミノ酸配列のＮ末端領域（残基５４−１７１
）（配列識別番号８）は、ＣＵＢドメインと称される（ボルク（Ｂｏｒｋ）とベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３２３１，
５３９−５４５）第２の別のタンパク質ドメインを有している。約１１５のアミ
ノ酸から成るこのドメインは、最初、補体因子Ｃｌｒ／Ｃｌｓに同定されたが、
最近では、骨形成タンパク質１（ＢＭＰ−１）（ウォズニー（Ｗｏｚｎｅｙ）等
、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８２４２，１５２８−１５３４）等のシグナル分
子や、ニューロピリン１（ＮＰ−１）（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）等、Ｃｅｌｌ，
１９９８９２７３５−７４５）等の複数のレセプター分子、を含む複数のそ
の他の細胞外タンパク質にも同定されている。ＣＵＢドメインの機能的役割は明
らかではないが、それらは、タンパク質−タンパク質相互作用又は、ヘパリン硫
酸プロテオグリカンを含む炭水化物との相互作用に関与している可能性がある。
これらの相互作用はＰＤＧＦ−Ｄのタンパク分解活性化の役割を果たしている可
能性がある。

【０１０４】図１１に示すように、複数のＣＵＢ含有タンパク質からのアミノ酸配列をアラ
インメントした。その結果は、ヒトＰＤＧＦ−Ｄの一つのＣＵＢドメイン（配列
識別番号１９）が、最も緊密に関連するＣＵＢドメインとかなりの同一性を示す
ことを示している。ヒトＢＭＰ−１からの、３つのＣＵＢドメイン（ＣＵＢ１−
３）（それぞれ、配列識別番号２０−２２）を有するヒトＢＭＰ−１と、２つの
ＣＵＢドメイン（ＣＵＢ１−２）（それぞれ、配列識別番号２３−２３）を有す
るヒトニューロピリン−１とからの配列が図示されているこのアラインメントは
、前述した要領で行われた。

【０１０５】例１：ＰＤＧＦ−Ｄ転写物の発現いくつかのヒト組織におけるＰＤＧＦ−Ｄの組織発現を調べるために、市販の
マルチプル組織ノーザンブロット（ＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔ
ｈｅｒｎｂｌｏｔ）（ＭＴＮ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してノーザンブロッ
トを行った。それらのブロットをＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液を６８℃で１時間使
用して（高ストリンジェント条件）供給業者の指示に従ってハイブリダイズし、
ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリー（前述）からの３２７ｂｐＰＣＲ−生成プロー
ブによって探索（ｐｒｏｂｅ）した。それらブロットを、その後、０．０５％Ｓ
ＤＳを含む２ｘＳＳＣ中で３０分間、５０℃で洗浄し、０．１％ＳＤＳを含む０
．１ｘＳＳＣ中で更に４０分間、５０℃で洗浄した。その後、これらブロットを
、フィルム上に置き、−７０℃に晒した。表１に要約されるその結果は、ＰＤＧ
Ｆ−Ｄ転写物の発現は、心臓、膵臓及び卵巣でもっとも多かったことを示してお
り、これに対して、胎盤、肝臓、腎臓、前立腺、及び精巣に於いては低いレベル
の発現が見られた。前記ヒトＰＤＧＦ−Ｄ転写物の長さは約４ｋｂであった。

【０１０６】

【表１】ノーザンブロット分析によって測定されたいくつかのヒト組織中に於けるＰＤＧＦ−Ｄ転写物の相対的発現レベル組織発現レベル＊心臓＋＋＋＋＋脳ｎ．ｄ．胎盤＋＋肺＋肝臓＋＋骨格筋ｎ．ｄ．腎臓＋＋膵臓＋＋＋＋脾臓＋胸腺＋前立腺＋＋精巣＋＋＋卵巣＋＋＋＋＋小腸＋＋結腸＋末梢血液＋リンパ球＊バンドの相対的強度は、視覚で測定された。（＋＋＋＋＋）最も高い発現そして（＋）最も低い発現；ｎ．ｄ．は無検出

【０１０７】例２：切断型ＰＤＧＦ−Ｄのレセプター結合特性切断ＰＤＧＦ−ＤとＶＥＧＦレセプターとの間の相互作用を評価するために、
切断ＰＤＧＦ−Ｄが、ヒトＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３
の細胞外ドメインを含有する可溶性Ｉｇ−融合タンパク質（オロフソン（Ｏｌｏ
ｆｓｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８９５１１７０９−１１７１４）に結合する能力をテストした。ＰＤＧＦ−Ｄの
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインをコードする発現ベクターを、ベクター
ｐＳｅｃＴａｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で生成した。プライマー５‘−ＣＣ
ＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＡＴＡＴ３’（正方向）（配列識別
番号３０）と５‘−ＴＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣＴＴ３’（逆方
向）（配列識別番号３１）とを使用して、図６（配列識別番号６）のアミノ酸残
基１８６−３２２をコードする４２９ｂｐのフラグメント（図５（配列識別番号
５）のヌクレオチド５５６−９６６）を増幅した。次に、このフラグメントを、
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ消化発現ベクターにクローニングした。ＣＯＳ細胞
を、、燐酸カルシウム沈殿を使用して切断ＰＤＧＦ−Ｄをコードする前記発現ベ
クター又は対照ベクターでトランスフェクトした。発現されたポリペプチドは、
Ｃ末端ｃ−ｍｙｃタグと、６ｘＨｉｓタグ（共に、ｐＳｅｃＴａｇベクター由来
）を含んでいた。

【０１０８】ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ、ＶＥＧＦＲ−２−Ｉｇ及びＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇと命
名する前記Ｉｇ融合タンパク質は、ヒト２９３ＥＢＮＡ細胞に一過性に発現され
た。トランスフェクション後、細胞を２４時間インキュベートし、０．２％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＥＭ）で
洗浄し、２４時間飢餓（ｓｔａｒｖｅ）させた。次に、前記融合タンパク質を、
プロテインＡ−セファローズビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して清澄培養
上清から沈降させた。前記ビーズは、１００マイクロリットルの１０ｘ結合バッ
ファー（５％ＢＳＡ，０．２％ツィーン２０及び１０μｇ／ｍｌのヘパリン）と
、前記切断ＰＤＧＦ−Ｄの発現ベクター又は前記対照ベクターでトランスフェク
トされた前記ＣＯＳ細胞から調製された９００マイクロリットルの培養上清とを
組み合わせた。次に、前記細胞を³⁵Ｓ−システインとメチオニン（Ｐｒｏｍｉｘ
，Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって４〜６時間、代謝標識化した。２．５時間後、室
温で、前記セファローズビーズを、結合バッファーで４℃にて３回、燐酸緩衝食
塩水（ＰＢＳ）で１回、洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー中で煮沸した。前
記Ｉｇ−融合タンパク質に結合した標識化タンパク質を、還元条件下でＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分析した。放射標識化タンパク質を、りん光分析器（ｐｈｏｓ
ｐｈｏｉｍａｇｅｒａｎａｌｙｚａｒ）を使用しておよび／又はフィルム上で
検出した。これらすべての分析に於いて、放射性標識化ＰＤＧＦ−Ｄは、前記Ｖ
ＥＧＦレセプターのいずれとも相互作用を示さなかった。これらの結果は、分泌
切断型ＰＤＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦレセプターＲ１，Ｒ２及びＲ３に結合しないと
いうことを示している。

【０１０９】例３：ＰＤＧＦベーター−レセプターリン酸化ＰＤＧＦ−ＤがＰＤＧＦベーターレセプターのリン酸化を増加させるか否かを
テストするために、切断型ＰＤＧＦ−Ｄが、ＰＤＧＦベーターレセプターに結合
し、リン酸化の増加を刺激する能力をテストした。ヒトＰＤＧＦベーターレセプ
ターを安定的に発現する血清飢餓（ｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅ）ブタ大動脈内皮
細胞−１（ＰＡＥ−１）細胞（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）等、ＥＭＢＯ
Ｊ，１９９２，１１，５４３−５５０）を、氷上で９０分間、１ｍｇ／ｍｌのＢ
ＳＡを添加した同量のＰＢＳと混合した培養上清の溶液とインキュベートした。
前記培養上清は、ＰＤＧＦ−Ａ又は切断型ＰＤＧＦ−Ｄの発現ベクター（例１と
同様に構成）、又はモック対照ベクター、とトランスフェクトされたＣＯＳ細胞
から調製された。トランスフェクションの２４時間後、前記培地を、１ｍｇ／ｍ
ｌの血清アルブミンを含有する無血清培地と交換した。培養上清を、更に４８時
間のインキュベーション後に収集した。前記培養上清の追加の６０分後、細胞を
、溶解バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．５％トリトン
Ｘ−１００，０．５％デオキシコール酸，１０ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭオルトバ
ナジン酸，１ｍＭＰＭＳＦ１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）中で溶解した。前記ヒト
ＰＤＧＦベーターレセプターに対するウサギ抗血清を使用して（エリクソン（Ｅ
ｒｉｋｓｓｏｎ）等、ＥＭＢＯＪ，１９９２１１５４３−５５０）、透明
溶解液からＰＤＧＦベーターレセプターを免疫沈降させた。沈降したレセプター
を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライした。ＳＤＳゲル電気泳動後、沈降したレ
セプターをニトロセルロースフィルターにトランスファーし、これらフィルター
を抗ホスホチロシン抗体ＰＹ−２０（ＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）によって探索（ｐｒｏｂｅ）した。フィルターを、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体とインキュベートした。結合した抗体
を、エンハンスド化学ルミネッセンス（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｃｅ）（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ）を使用して検出した
。次に、前記フィルターを、剥離し、ＰＤＧＦベーターレセプターウサギ抗血清
によって再探索し、レセプターの量は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標
識抗ウサギ抗体とのインキュベートによって測定した。結合した抗体をエンハン
スド化学ルミネッセンス（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ）を使用して検出
した。ＰＤＧＦベーターレセプター抗体による前記フィルターの探索（ｐｒｏｂ
ｉｎｇ）によって、同量のレセプターがすべてのレーンに存在していることを確
認した。ヒト組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）と未処理細胞とを、対
照として前記実験に含ませた。図１１は、培養上清に含まれる切断型ＰＤＧＦ−
ＤがＰＤＧＦベーターレセプターチロシンリン酸化を刺激したことを示している
。これは、切断型ＰＤＧＦ−ＤがＰＤＧＦベーターレセプターリガンド／アゴニ
ストであることを示している。

【０１１０】例４：競合結合アッセイ次に、切断型ＰＤＧＦ−Ｄが、前記ヒトＰＤＧＦベーターレセプターに結合す
る能力を、それが前記ＰＤＧＦベーターレセプターに対する結合に於いてＰＤＧ
Ｆ−ＢＢと競合する能力を分析することによってテストした。これら結合実験は
、それぞれ前記ヒトＰＤＧＦアルファ及びベーターレセプターを安定的に発現す
るブタ大動脈内皮−１（ＰＡＥ−１）細胞（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）等
、ＥＭＢＯＪ，１９９２，１１，５４３−５５０）に対して行われた。結合実
験は、実質的にヘルディン（Ｈｅｌｄｉｎ）等（ＥＭＢＯＪ，１９８８７
１３８７−１３９３）に従って行われた。それぞれ、ＰＤＧＦ−Ａ、切断ＰＤＧ
Ｆ−Ｄ又はモック対照を発現するＣＯＳ細胞からの培養上清を、同量のＢＳＡ／
ＰＢＳで希釈し、結合バッファー（１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有するＰＢＳ）中
の１００ｎｇ／ｍｌの¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（ベーターレセプターリガンド）
又は¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡ（アルファーレセプターリガンド）と混合した。こ
れらＣＯＳ細胞からの二つの別セットの培養上清を、分析した。アリコットを、
９０分間氷上で、２４ウェル培養皿に蒔種されたＰＡＥ−１細胞発現レセプター
とインキュベートした。結合バッファーでの３回の洗浄後、細胞結合¹²⁵Ｉ−Ｐ
ＤＧＦ−ＢＢ又は¹²⁵Ｉ−ＰＤＧＦ−ＡＡを、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ
７．５，１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００中での細胞の溶解によっ
て抽出した。細胞結合放射性の量を、ガンマーカウンターによって測定した。図
１２は、切断ＰＤＧＦ−Ｄ含有の調整培地は、ＰＤＧＦベーターレセプターに対
して、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーと結合競合するが、ＰＤＧＦアルファーレセ
プターに対してＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーとは競合しないことを示す結果のグ
ラフである。

【０１１１】ＰＤＧＦ−Ｄは、現時点に於いて、公知のＶＥＧＦレセプターのいずれとも結
合しない。ＰＤＧＦ−Ｄは、ＰＤＧＦベーターレセプターに結合し、それのリン
酸化の増加を刺激することができる唯一のＶＥＧＦファミリーメンバーである。
これらの特徴は、切断型のＰＤＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦファミリーメンバーではな
く、新規なＰＤＧＦである可能性があることを示している。更に、その全長タン
パク質は、活性ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインを放出するためにタンパ
ク質分解プロセシングによって活性化される必要のある潜在的増殖因子である可
能性がある。前記Ｎ末端ＣＵＢドメインは、何らかの細胞外コンパートメント（
たとえば、細胞外マトリクス）においてこの潜在的増殖因子を位置確認するため
に利用可能で、かつ、必要な場合、たとえば、胚成長、組織再生、骨組織再構築
を含む組織再構築、活性脈管形成、腫瘍進行、腫瘍浸潤、転移形成、および／又
は損傷治療、に限定された蛋白質分解によって除去される、抑制性ドメインとし
て発現されるかもしれない。

【０１１２】ＰＤＧＦ−Ｄの機能を判定するためのバイオアッセイＰＤＧＦ−Ｄが、結合組織細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、及びグリア細胞
の増殖および／又は遊走性、内皮細胞機能、脈管形成、損傷治療、との関係に於
いて、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃお
よび／又はＶＥＧＦ−Ｄに類似の活性を有するか否かを評価するためにアッセイ
を行う。レセプター結合分布研究の結果によっては、別のアッセイを行うことも
可能である。

【０１１３】Ｉ．ＰＤＧＦ−Ｄの内皮細胞に対するマイトジェン活性ＰＤＧＦ−Ｄの内皮細胞に対するマイトジェン活性をテストするために、ＰＤ
ＧＦ−Ｄポリペプチドを、５％の血清を含有する細胞培養培地に導入し、１０％
血清を含有する培地中で増殖されたウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥ）にアプライす
る。前記ＢＡＥは、ＰＤＧＦ−Ｄの添加の一日前に、ウェル当たり１０，０００
の細胞の密度で２４ウェルの皿に予め播種しておく。細胞に対するこのポリペプ
チドの添加の３日後に、細胞を、トリプシンによって解離し、計数した。精製Ｖ
ＥＧＦを、陽性対照として前記実験に加える。

【０１１４】ＩＩ．ＰＤＧＦ−Ｄの線維芽細胞に対するマイトジェン活性ＰＤＧＦ−Ｄの線維芽細胞に対するマイトジェン活性をテストするために、様
々な濃度の、ＰＤＧＦ−ＤＤ又はＰＤＧＦ−ＡＡ（対照として）の切断型ホモダ
イマーを、０．２μｍＣｉ［３Ｈ］チミジンの存在下で、血清飢餓ヒト内皮線維
芽細胞に添加した。次に、これら線維芽細胞を、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡを添加した
１ｍｌの無血清培地中で２４時間インキュベートする。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ
）沈殿後、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取り込みを、ベーターカウンターを使用
して測定する。アッセイは、実質的に、モリ（Ｍｏｒｉ）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，１９９１２６６２１１５８−２１１６４に記載されている要領で
行う。

【０１１５】ＩＩＩ．内皮細胞機能のアッセイａ）内皮細胞増殖内皮細胞増殖アッセイを、たとえば、ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）とヘンゼ
ル（Ｈｅｎｚｅｌ），Ｎａｔｕｒｅ，１９８９３８０４３９−４４３、ゴス
ポダケロウィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）等Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９８６７３１１−７３１５および／又はクラ
フィー（Ｃｌａｆｆｅｙ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１
９９５１２４６１−９等のような周知の方法で行う。

【０１１６】ｂ）細胞接着アッセイＰＤＧＦ−Ｄの多形核顆粒球の内皮細胞への接着に対する影響をテストする。

【０１１７】ｃ）走化性標準ボイデンチャンバ走化性アッセイ（Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒｃｈ
ｅｍｏｔａｘｉｓａｓｓａｙ）を使用してＰＤＧＦ−Ｄの走化性に対する影響
をテストする。

【０１１８】ｄ）プラスミノーゲンアクチベータアッセイペッパー（Ｐｅｐｐｅｒ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．，１９９１１８１９０２−９０６の方法を使用して、ＰＤＧＦ
−Ｄのプラスミノーゲンアクチベーター及びプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター産生に対する影響に関して内皮細胞をテストする。

【０１１９】ｅ）内皮細胞遊走アッセイＰＤＧＦ−Ｄが内皮細胞を遊走して管腔を形成するように刺激する能力を、モ
ンテサノ（Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，１９８６８３７２９７−７３１に記載の要領でアッセイする。或い
は、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯＪ．，１９９６１５２９０−
２９８に記載の三次元コラーゲンゲルアッセイ、又は、改変ボイデンチャンバ（
Ｂｏｙｄｅｎｃｈａｍｂｅｒ）中のゼラチン化膜（グレーザー（Ｇｌａｓｅｒ
）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９８０２８８４８３−４８４）を使用することも可
能である。

【０１２０】ＩＶ．脈管形成アッセイＰＤＧＦ−Ｄがニワトリ漿尿膜中において脈管形成反応を誘発させる能力を、
リョン（Ｌｅｕｎｇ）等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９２４６１３０６−１３
０９に記載の要領でテストする。或いは、ラスティネヤド（Ｒａｓｔｉｎｅｊａ
ｄ）等，Ｃｅｌｌ，１９８９５６３４５−３５５のラット角膜アッセイが使
用可能である。これは、イン・ヴィヴォ脈管形成をアッセイする一般に認められ
ている方法であり、その結果は、他のイン・ヴィヴォ系に容易に移すことが可能
である。

【０１２１】Ｖ．損傷治癒ＰＤＧＦ−Ｄが損傷治癒を刺激する能力を、シリング（Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ）
等，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９５９４６７０２−７１０に記載され、ハント（Ｈ
ｕｎｔ）等、Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９６７１１４３０２−３０７によって利用
されている、利用可能な最も臨床的に関連性の高いモデルでテストする。

【０１２２】ＶＩ．造血系造血系の特異的細胞集団を使用した様々なイン・ヴィトロ及びイン・ヴィヴォ
アッセイが知られており、これらの概要を以下に説明する。具体的には、精製細
胞に対して蛍光活性化セルソータを使用する種々のイン・ヴィトロマウス幹細胞
アッセイが特に便利である。

【０１２３】ａ）再増殖幹細胞これらは、致死的に放射線照射されたマウスの骨髄を再増殖させることが可能
な細胞であって、Ｌｉｎ^-，Ｒｈ^h1，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ⁺，ｃ−ｋｉｔ⁺表現型を有
する。これらの細胞に対してＰＤＧＦ−Ｄを単体で、或いは、他の因子との同時
インキュベーションによってテストし、その後、^-3Ｈ−チミジン取り込みによっ
て、細胞増殖を測定する。

【０１２４】ｂ）後期段階幹細胞これらは、骨髄再増殖能力は比較的少ないが、Ｄ１３ＣＦＵ−Ｓを生成する
ことが可能な細胞である。これらの細胞は、Ｌｉｎ^-，Ｒｈ^h1，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ⁺ ，ｃ−ｋｉｔ⁺表現型を有する。ＰＤＧＦ−Ｄを、一定時間これらの細胞とイン
キュベートし、致死放射線照射レシピエントに注入し、Ｄ１３脾臓コロニーの数
を計数する。

【０１２５】ｃ）前駆体増強細胞これらは、単一増殖因子に対してイン・ヴィトロで応答し、Ｌｉｎ^-，Ｒｈ^h1
，Ｌｙ−６Ａ／Ｅ⁺，ｃ−ｋｉｔ⁺表現型を有する細胞である。このアッセイによ
って、ＰＤＧＦ−Ｄが造血前駆体細胞に直接作用することが可能であるかが示さ
れる。ＰＤＧＦ−Ｄを、寒天培養中でこれらの細胞とインキュベートし、７−１
４日後に存在するコロニーの数を数える。

【０１２６】ＶＩＩ．アテローム性動脈硬化症平滑筋細胞は、アテローム性動脈硬化症の発達又は開始に重要な役割を果すが
、それはその表現型が収縮状態から合成状態へと変化することを必要とする。マ
クロファージ、内皮細胞、Ｔリンパ球、血小板、はすべて、平滑筋細胞の増殖と
表現型変化とに影響することによって、アテローム性動脈硬化症プラークの発達
に役割を果している。様々なタイプの細胞を、両側のカバーガラス上に播種する
改変ローズチャンバー（Ｒｏｓｅｃｈａｍｂｅｒ）を使用したイン・ヴィトロ
アッセイによって、多細胞環境に於ける平滑筋細胞の増殖速度と表現型変化とを
測定し、これを使用して平滑筋細胞に対するＰＤＧＦ−Ｄの影響を評価する。

【０１２７】ＶＩＩＩ．転移ＰＤＧＦ−Ｄが転移を抑制する能力を、たとえば、カオ（Ｃａｏ）等、Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９５１８２２０６９−２０７７の方法を使用して、ル
イス（Ｌｅｗｉｓ）肺ガンモデルを使用してアッセイする。

【０１２８】ＩＸ．平滑筋細胞の遊走ＰＤＧＦ−Ｄの、平滑筋細胞及びその他の細胞タイプの遊走に対する影響を、
コヤマ（Ｋｏｙａｍａ）等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２２６７２
２８０６−２２８１２の方法を使用してアッセイすることができる。

【０１２９】Ｘ．走化性繊維芽細胞、単球、顆粒球、およびその他の細胞の走化性に対するＰＤＧＦ−
Ｄの影響は、シーグバーン（Ｓｉｅｇｂａｈｎ）等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．１９９０８５９１６−９２０の方法を使用することによって評価するこ
とができる。

【０１３０】ＸＩ．他の細胞タイプにおけるＰＤＧＦ−Ｄ肝細胞、心筋及びその他の細胞、内分泌細胞、及び骨芽細胞等の、他の細胞タ
イプの増殖、分化及び機能に対するＰＤＧＦ−Ｄの影響を、イン・ヴィトロ培地
における³Ｈ−チミジン取り込み等の、公知の方法によって容易にアッセイする
ことができる。

【０１３１】ＸＩＩ．ＰＤＧＦ−Ｄバリアントとアナログの構築ＰＤＧＦ−Ｄは、ＰＤＧＦファミリーの他のメンバーに対して高度なホモロジ
ーを示すＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーである。ＰＤＧＦ−Ｄは、こ
のファミリーの増殖因子の特徴である７つの保存システイン残基を含んでいる。
これらの保存システイン残基は、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の特徴的である
システインノット構造を作り出す鎖内ジスルフィド結合と、タンパク質ダイマー
を形成する鎖間ジスルフィド結合とを形成する。ＰＤＧＦ−Ｄは、タンパク質チ
ロシンキナーゼ増殖因子レセプターと相互作用する。

【０１３２】レセプター結合及びその結果としての活性に必要なそのタンパク質構造及び活
性部位についてほとんど知られてないタンパク質とは対照的に、ＰＤＧＦ−Ｄの
活性変異体の構築は、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子の活性部位と重要なアミノ
酸とについては多くが知られているという事実によって非常に容易になる。

【０１３３】ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーの構造／活性関係を明らかにしてい
る刊行物としては、ＰＤＧＦに関しては、エストマン（Ｏｅｓｔｍａｎ）等、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１２６６１００７３−１００７７；アンダ
ーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２２６７１１２６０−１２６６；エフナー（Ｏｅｆｎｅｒ）等，ＥＭＢＯＪ．，１
９９２１１３９２１−３９２６；フレミング（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ）等、Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１９９３１３４０６６−
４０７６及びアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）等、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔ
ｏｒｓ，１９９５１２１５９−１６４、そしてＶＥＧＦに関しては、キム（
Ｋｉｍ）等、ＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ，１９９２７５３−６４；ペト
ヘンス（Ｐｏｅｔｇｅｎｓ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４２６９３２８７９−３２８８５及びクラフィー（Ｃｌａｆｆｅｙ）等、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５１２４６１−９がある。これらの
刊行物から、前記８つの保存システイン残基により、ＰＤＧＦファミリーの増殖
因子のメンバーが、特徴的なノット折りたたみ構造及びダイマー化とを示し、こ
れによって、ダイマー化された分子各端部に三つの露出ループ領域が形成され、
そこに活性レセプター結合部位が位置確認可能であると予想される、ということ
が明白である。

【０１３４】この情報に基づき、バイオテクノロジーの当業者は、前記ノット折りたたみ構
造とダイマーとの原因である前記８つのシステイン残基を保存すること、又、タ
ンパク質構造中のループ１、ループ２及びループ３領域の適当なレセプター配列
中に於いてのみ保存アミノ酸置換を保存又は形成することによって、ＰＤＧＦ−
Ｄ活性を保持している可能性が非常に高いＰＤＧＦ−Ｄ変異体を構築することが
できる。

【０１３５】タンパク質構造中の特異的に標的化された部位に於ける所望の変異の形成は、
タンパク質化学者の標準的技術であると見なされる（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）
等、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，１９８７１５４３６７−３
８２）。ＶＥＧＦによるそのような部位特異的突然変異の具体例は、ペトヘンス
（Ｐｏｅｔｇｅｎｓ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４２６９３２
８７９−３２８８５及びクラフィー（（Ｃｌａｆｆｅｙ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５１２４６１−９）に見られる。事実、
部位特異的突然変異は、非常に一般的であるのでそのような手順を容易にするた
めのキットが市販されている（たとえば、Ｐｒｏｍｅｇａ１９９４−１９９５
カタログ，ｐ１４２−１４５）。

【０１３６】ＰＤＧＦ−Ｄ変異体の、結合組織細胞、線維芽細胞、筋線維芽細胞、及びグリ
ア細胞増殖および／又は遊走活性、内皮細胞増殖活性、脈管形成活性および／又
は損傷治癒活性は、周知のスクリーニング法によって容易に確認することができ
る。たとえば、クラフィー（Ｃｌａｆｆｅｙ）等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５１２４６１−９）によって記載されている内皮細
胞有糸***アッセイに類似の方法を使用することができる。同様に、他の細胞タ
イプの増殖、細胞分化及びヒト転移に対するＰＤＧＦ−Ｄの作用は、周知の方法
を使用してテストすることができる。

【０１３７】以上の記載及び例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、限定的なものと
意図されたものではない。当業者は本発明の精神及び本質を含む開示された実施
例の改変が想到するであろうから、本発明は、添付の請求項の範囲に属するすべ
てのバリエーション及びそれらの均等物を広く含むものと解釈されるべきである
。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１（配列識別番号１）は、ヒトＰＤＧＦ−Ｄ（ｈＰＤＧＦ−Ｄ）のＣ末端部を
コードするｃＤＮＡを含むヌクレオチド配列を示している図。ｈＰＤＧＦ−Ｄの
前記一部フラグメントをコードするヌクレオチドは、１−１９８である。

【図２】図１のヌクレオチド１−１９８から誘導されたｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ
酸配列（６６のアミノ酸残基−配列識別番号２）を図示している図。

【図３】図３（配列識別番号３）は、前記ｈＰＤＧＦ−Ｄの部分ヒトｃＤＮＡの伸長配列
を図示している図。翻訳ｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド１−６００である。

【図４】図３のヌクレオチド１−６００由来のｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸配列（
２００残基−配列識別番号４）を図示している図。

【図５】部分ヒトｃＤＮＡの更に別の伸長ヌクレオチド配列を図示している図。５‘切断
された全長ｈＰＤＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチドは１−９６６（配列識別番
号５）である。

【図６】図５のヌクレオチド１−９６６由来のｈＰＤＧＦ−Ｄの推定部分アミノ酸配列（
３２２の残基−配列識別番号６）を図示している図。

【図７】図７（配列識別番号７）は、ｈＰＤＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡの完全ヌクレ
オチド配列（１１１６ｂｐ）と、それによってコードされる３７１のアミノ酸残
基から成る全長ｈＰＤＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列（図８−配列識別番号８）と
を図示している図。

【図８】図７（配列識別番号７）の、ｈＰＤＧＦ−ＤをコードするｃＤＮＡの完全ヌクレ
オチド配列（１１１６ｂｐ）によってコードされる３７１のアミノ酸残基から成
る全長ｈＰＤＧＦ−Ｄの推定アミノ酸配列を図示している図。

【図９】ｈＰＤＧＦ−ＤのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦホモロジードメインとＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ
ファミリーに属するいくつかの増殖因子（それぞれ、配列識別番号１０−１８）
とのアミノ酸配列アラインメントを図示している図。

【図１０】ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリーに属するいくつかの増殖因子の進化系統樹を示し
ている図。

【図１１】ｈＰＤＧＦ−Ｄに存在するＣＵＢドメイン（配列識別番号１９）と、ヒト骨形成
タンパク質−１（ｈＢＭＰ−１，３つのＣＵＢドメインＣＵＢ１−３）（それぞ
れ、配列識別番号２０−２２）と、ヒトニューロピリン−１（２つのＣＵＢドメ
イン）（それぞれ、配列識別番号２３−２４）とに存在するその他のＣＵＢドメ
インとのアミノ酸配列アラインメントを提供している図。

【図１２】切断型ＰＤＧＦ−Ｄを含む培養上清（ＣＭ）が、ＰＡＥ−１細胞中に於いてＰＤ
ＧＦベーターレセプターのチロシンリン酸化を刺激することを示している図。

【図１３】切断型ＰＤＧＦ−Ｄを含む培養上清（ＣＭ）が、ＰＤＧＦベーターレセプターと
の結合に於いてＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーと競合するが、ＰＤＧＦアルファー
レセプターとの競合に於いてＰＤＧＦ−ＡＡホモダイマーと競合しないことを示
す結果のグラフによる説明を提供している図。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月９日（２０００．６．９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１３７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１３７】以上の記載及び例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、限定的なものと
意図されたものではない。当業者は本発明の精神及び本質を含む開示された実施
例の改変が想到するであろうから、本発明は、添付のクレームの範囲に属するす
べてのバリエーション及びそれらの均等物を広く含むものと解釈されるべきであ
る。［配列表］ SEQUENCE LISTING <110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH HELSINKI UNIVERSITY LICENSING LTD., OY <120> PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR D, DNA CODING THEREFOR, AND USES THEREOF <130> 1064/44833PC <140> PCT/US99/26462 <141> 1999-11-10 <150> 60/107,852 <151> 1998-11-10 <150> 60/113,997 <151> 1998-12-28 <150> 60/150,604 <151> 1999-08-26 <150> 60/157,108 <151> 1999-10-04 <150> 60/157,756 <151> 1999-10-05 <160> 31 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aattgtggct gtggaactgt caactggagg tcctgcacat gcaattcagg gaaaaccgtg 60 aaaaagtatc atgaggtatt acagtttgag cctggccaca tcaagaggag gggtagagct 120 aagaccatgg ctctagttga catccagttg gatcaccatg aacgatgtga ttgtatctgc 180 agctcaagac cacctcgata agagaatgtg cacatcctta cattaagcct gaaagaacca 240 ttagtttaag gagggtgaga taagagaccc ttttcctacc agcaaccaga cttactacta 300 gcctgcaatg caatgaacac aagtggttgc tgagtctcag ccttgctttg ttaatgccat 360 <210> 2 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser 1 5 10 15 Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly 20 25 30 His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile 35 40 45 Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro 50 55 60 Pro Arg 65 <210> 3 <211> 690 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggaagatttc caacccgcag cagcttcaga gaccaactgg aatctgtcac aagctctgtt 60 tcagggtatc cctataactc tccatcagta acggatccca ctctgattgc ggatgctctg 120 gacaaaaaaa ttgcagaatt tgatacagtg gaagatctgc tcaagtactt caatccagag 180 tcatggcaag aagatcttga gaatatgtat ctggacaccc ctcggtatcg aggcaggtca 240 taccatgacc ggaagtcaaa agttgacctg gataggctca atgatgatgc caagcgttac 300 agttgcactc ccaggaatta ctcggtcaat ataagagaag agctgaagtt ggccaatgtg 360 gtcttctttc cacgttgcct cctcgtgcag cgctgtggag gaaattgtgg ctgtggaact 420 gtcaaactgg agtcctgcac atgcaattca gggaaaaccg tgaaaaagta tcatgaggta 480 ttacagtttg agcctggcca catcaagagg aggggtagag ctaagaccat ggctctagtt 540 gacatccagt tggatcacca tgaacgatgc gattgtatct gcagctcaag accacctcga 600 taagagaatg tgcacatcct tacattaagc ctgaaagaac ctttagttta aggagggtga 660 gataagagac ccttttccta ccagcaaccc 690 <210> 4 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Arg Phe Pro Thr Arg Ser Ser Phe Arg Asp Gln Leu Glu Ser Val 1 5 10 15 Thr Ser Ser Val Ser Gly Tyr Pro Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp 20 25 30 Pro Thr Leu Ile Ala Asp Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp 35 40 45 Thr Val Glu Asp Leu Leu Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu 50 55 60 Asp Leu Glu Asn Met Tyr Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser 65 70 75 80 Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp 85 90 95 Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg 100 105 110 Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu 115 120 125 Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Lys Leu Glu 130 135 140 Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val 145 150 155 160 Leu Gln Phe Glu Pro Gly His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr 165 170 175 Met Ala Leu Val Asp Ile Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys 180 185 190 Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg 195 200 <210> 5 <211> 1934 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(966) <400> 5 ttg tac cga aga gat gag acc atc cag gtg aaa gga aac ggc tac gtg 48 Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val 1 5 10 15 cag agt cct aga ttc ccg aac agc tac ccc agg aac ctg ctc ctg aca 96 Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr 20 25 30 tgg cgg ctt cac tct cag gag aat aca cgg ata cag cta gtg ttt gac 144 Trp Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp 35 40 45 aat cag ttt gga tta gag gaa gca gaa aat gat atc tgt agg tat gat 192 Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp 50 55 60 ttt gtg gaa gtt gaa gat ata tcc gaa acc agt acc att att aga gga 240 Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly 65 70 75 80 cga tgg tgt gga cac aag gaa gtt cct cca agg ata aaa tca aga acg 288 Arg Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr 85 90 95 aac caa att aaa atc aca ttc aag tcc gat gac tac ttt gtg gct aaa 336 Asn Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys 100 105 110 cct gga ttc aag att tat tat tct ttg ctg gaa gat ttc caa ccc gca 384 Pro Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala 115 120 125 gca gct tca gag acc aac tgg gaa tct gtc aca agc tct att tca ggg 432 Ala Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly 130 135 140 gta tcc tat aac tct cca tca gta acg gat ccc act ctg att gcg gat 480 Val Ser Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp 145 150 155 160 gct ctg gac aaa aaa att gca gaa ttt gat aca gtg gaa gat ctg ctc 528 Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu 165 170 175 aag tac ttc aat cca gag tca tgg caa gaa gat ctt gag aat atg tat 576 Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr 180 185 190 ctg gac acc cct cgg tat cga ggc agg tca tac cat gac cgg aag tca 624 Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser 195 200 205 aaa gtt gac ctg gat agg ctc aat gat gat gcc aag cgt tac agt tgc 672 Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys 210 215 220 act ccc agg aat tac tcg gtc aat ata aga gaa gag ctg aag ttg gcc 720 Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala 225 230 235 240 aat gtg gtc ttc ttt cca cgt tgc ctc ctc gtg cag cgc tgt gga gga 768 Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly 245 250 255 aat tgt ggc tgt gga act gtc aac tgg agg tcc tgc aca tgc aat tca 816 Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser 260 265 270 ggg aaa acc gtg aaa aag tat cat gag gta tta cag ttt gag cct ggc 864 Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly 275 280 285 cac atc aag agg agg ggt aga gct aag acc atg gct cta gtt gac atc 912 His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile 290 295 300 cag ttg gat cac cat gaa cga tgc gat tgt atc tgc agc tca aga cca 960 Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro 305 310 315 320 cct cga taagagaatg tgcacatcct tacattaagc ctgaaagaac ctttagttta 1016 Pro Arg aggagggtga gataagagac ccttttccta ccagcaacca aacttactac tagcctgcaa 1076 tgcaatgaac acaagtggtt gctgagtctc agccttgctt tgttaatgcc atggcaagta 1136 gaaaggtata tcatcaactt ctatacctaa gaatatagga ttgcatttaa taatagtgtt 1196 tgaggttata tatgcacaaa cacacacaga aatatattca tgtctatgtg tatatagatc 1256 aaatgttttt tttggtatat ataaccaggt acaccagagc ttacatatgt ttgagttaga 1316 ctcttaaaat cctttgccaa aataagggat ggtcaaatat atgaaacatg tctttagaaa 1376 atttaggaga taaatttatt tttaaatttt gaaacacaaa acaattttga atcttgctct 1436 cttaaagaaa gcatcttgta tattaaaaat caaaagatga ggctttctta catatacatc 1496 ttagttgatt attaaaaaag gaaaaaggtt tccagagaaa aggccaatac ctaagcattt 1556 tttccatgag aagcactgca tacttaccta tgtggactgt aataacctgt ctccaaaacc 1616 atgccataat aatataagtg ctttagaaat taaatcattg tgttttttat gcattttgct 1676 gaggcatcct tattcattta acacctatct caaaaactta cttagaaggt tttttattat 1736 agtcctacaa aagacaatgt ataagctgta acagaatttt gaattgtttt tctttgcaaa 1796 acccctccac aaaagcaaat cctttcaaga atggcatggg cattctgtat gaacctttcc 1856 agatggtgtt cagtgaaaga tgtgggtagt tgagaactta aaaagtgaac attgaaacat 1916 cgacgtaact ggaaaccg 1934 <210> 6 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val 1 5 10 15 Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr 20 25 30 Trp Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp 35 40 45 Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp 50 55 60 Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly 65 70 75 80 Arg Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr 85 90 95 Asn Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys 100 105 110 Pro Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala 115 120 125 Ala Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly 130 135 140 Val Ser Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp 145 150 155 160 Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu 165 170 175 Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr 180 185 190 Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser 195 200 205 Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys 210 215 220 Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala 225 230 235 240 Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly 245 250 255 Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser 260 265 270 Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly 275 280 285 His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile 290 295 300 Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro 305 310 315 320 Pro Arg <210> 7 <211> 2253 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (176)..(1288) <400> 7 cgctcggaaa gttcagcatg caggaagttt ggggagagct cggcgattag cacagcgacc 60 cgggccagcg cagggcgagc gcaggcggcg agagcgcagg gcggcgcggc gtcggtcccg 120 ggagcagaac ccggcttttt cttggagcga cgctgtctct agtcgctgat cccaa atg 178 Met 1 cac cgg ctc atc ttt gtc tac act cta atc tgc gca aac ttt tgc agc 226 His Arg Leu Ile Phe Val Tyr Thr Leu Ile Cys Ala Asn Phe Cys Ser 5 10 15 tgt cgg gac act tct gca acc ccg cag agc gca tcc atc aaa gct ttg 274 Cys Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile Lys Ala Leu 20 25 30 cgc aac gcc aac ctc agg cga gat gag agc aat cac ctc aca gac ttg 322 Arg Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His Leu Thr Asp Leu 35 40 45 tac cga aga gat gag acc atc cag gtg aaa gga aac ggc tac gtg cag 370 Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val Gln 50 55 60 65 agt cct aga ttc ccg aac agc tac ccc agg aac ctg ctc ctg aca tgg 418 Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr Trp 70 75 80 cgg ctt cac tct cag gag aat aca cgg ata cag cta gtg ttt gac aat 466 Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp Asn 85 90 95 cag ttt gga tta gag gaa gca gaa aat gat atc tgt agg tat gat ttt 514 Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp Phe 100 105 110 gtg gaa gtt gaa gat ata tcc gaa acc agt acc att att aga gga cga 562 Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly Arg 115 120 125 tgg tgt gga cac aag gaa gtt cct cca agg ata aaa tca aga acg aac 610 Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr Asn 130 135 140 145 caa att aaa atc aca ttc aag tcc gat gac tac ttt gtg gct aaa cct 658 Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys Pro 150 155 160 gga ttc aag att tat tat tct ttg ctg gaa gat ttc caa ccc gca gca 706 Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala Ala 165 170 175 gct tca gag acc aac tgg gaa tct gtc aca agc tct att tca ggg gta 754 Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly Val 180 185 190 tcc tat aac tct cca tca gta acg gat ccc act ctg att gcg gat gct 802 Ser Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp Ala 195 200 205 ctg gac aaa aaa att gca gaa ttt gat aca gtg gaa gat ctg ctc aag 850 Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu Lys 210 215 220 225 tac ttc aat cca gag tca tgg caa gaa gat ctt gag aat atg tat ctg 898 Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr Leu 230 235 240 gac acc cct cgg tat cga ggc agg tca tac cat gac cgg aag tca aaa 946 Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser Lys 245 250 255 gtt gac ctg gat agg ctc aat gat gat gcc aag cgt tac agt tgc act 994 Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys Thr 260 265 270 ccc agg aat tac tcg gtc aat ata aga gaa gag ctg aag ttg gcc aat 1042 Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala Asn 275 280 285 gtg gtc ttc ttt cca cgt tgc ctc ctc gtg cag cgc tgt gga gga aat 1090 Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly Asn 290 295 300 305 tgt ggc tgt gga act gtc aac tgg agg tcc tgc aca tgc aat tca ggg 1138 Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser Gly 310 315 320 aaa acc gtg aaa aag tat cat gag gta tta cag ttt gag cct ggc cac 1186 Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly His 325 330 335 atc aag agg agg ggt aga gct aag acc atg gct cta gtt gac atc cag 1234 Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile Gln 340 345 350 ttg gat cac cat gaa cga tgc gat tgt atc tgc agc tca aga cca cct 1282 Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro Pro 355 360 365 cga taa gagaatgtgc acatccttac attaagcctg aaagaacctt tagtttaagg 1338 Arg 370 agggtgagat aagagaccct tttcctacca gcaaccaaac ttactactag cctgcaatgc 1398 aatgaacaca agtggttgct gagtctcagc cttgctttgt taatgccatg gcaagtagaa 1458 aggtatatca tcaacttcta tacctaagaa tataggattg catttaataa tagtgtttga 1518 ggttatatat gcacaaacac acacagaaat atattcatgt ctatgtgtat atagatcaaa 1578 tgtttttttt ggtatatata accaggtaca ccagagctta catatgtttg agttagactc 1638 ttaaaatcct ttgccaaaat aagggatggt caaatatatg aaacatgtct ttagaaaatt 1698 taggagataa atttattttt aaattttgaa acacaaaaca attttgaatc ttgctctctt 1758 aaagaaagca tcttgtatat taaaaatcaa aagatgaggc tttcttacat atacatctta 1818 gttgattatt aaaaaaggaa aaaggtttcc agagaaaagg ccaataccta agcatttttt 1878 ccatgagaag cactgcatac ttacctatgt ggactgtaat aacctgtctc caaaaccatg 1938 ccataataat ataagtgctt tagaaattaa atcattgtgt tttttatgca ttttgctgag 1998 gcatccttat tcatttaaca cctatctcaa aaacttactt agaaggtttt ttattatagt 2058 cctacaaaag acaatgtata agctgtaaca gaattttgaa ttgtttttct ttgcaaaacc 2118 cctccacaaa agcaaatcct ttcaagaatg gcatgggcat tctgtatgaa cctttccaga 2178 tggtgttcag tgaaagatgt gggtagttga gaacttaaaa agtgaacatt gaaacatcga 2238 cgtaactgga aaccg 2253 <210> 8 <211> 370 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met His Arg Leu Ile Phe Val Tyr Thr Leu Ile Cys Ala Asn Phe Cys 1 5 10 15 Ser Cys Arg Asp Thr Ser Ala Thr Pro Gln Ser Ala Ser Ile Lys Ala 20 25 30 Leu Arg Asn Ala Asn Leu Arg Arg Asp Glu Ser Asn His Leu Thr Asp 35 40 45 Leu Tyr Arg Arg Asp Glu Thr Ile Gln Val Lys Gly Asn Gly Tyr Val 50 55 60 Gln Ser Pro Arg Phe Pro Asn Ser Tyr Pro Arg Asn Leu Leu Leu Thr 65 70 75 80 Trp Arg Leu His Ser Gln Glu Asn Thr Arg Ile Gln Leu Val Phe Asp 85 90 95 Asn Gln Phe Gly Leu Glu Glu Ala Glu Asn Asp Ile Cys Arg Tyr Asp 100 105 110 Phe Val Glu Val Glu Asp Ile Ser Glu Thr Ser Thr Ile Ile Arg Gly 115 120 125 Arg Trp Cys Gly His Lys Glu Val Pro Pro Arg Ile Lys Ser Arg Thr 130 135 140 Asn Gln Ile Lys Ile Thr Phe Lys Ser Asp Asp Tyr Phe Val Ala Lys 145 150 155 160 Pro Gly Phe Lys Ile Tyr Tyr Ser Leu Leu Glu Asp Phe Gln Pro Ala 165 170 175 Ala Ala Ser Glu Thr Asn Trp Glu Ser Val Thr Ser Ser Ile Ser Gly 180 185 190 Val Ser Tyr Asn Ser Pro Ser Val Thr Asp Pro Thr Leu Ile Ala Asp 195 200 205 Ala Leu Asp Lys Lys Ile Ala Glu Phe Asp Thr Val Glu Asp Leu Leu 210 215 220 Lys Tyr Phe Asn Pro Glu Ser Trp Gln Glu Asp Leu Glu Asn Met Tyr 225 230 235 240 Leu Asp Thr Pro Arg Tyr Arg Gly Arg Ser Tyr His Asp Arg Lys Ser 245 250 255 Lys Val Asp Leu Asp Arg Leu Asn Asp Asp Ala Lys Arg Tyr Ser Cys 260 265 270 Thr Pro Arg Asn Tyr Ser Val Asn Ile Arg Glu Glu Leu Lys Leu Ala 275 280 285 Asn Val Val Phe Phe Pro Arg Cys Leu Leu Val Gln Arg Cys Gly Gly 290 295 300 Asn Cys Gly Cys Gly Thr Val Asn Trp Arg Ser Cys Thr Cys Asn Ser 305 310 315 320 Gly Lys Thr Val Lys Lys Tyr His Glu Val Leu Gln Phe Glu Pro Gly 325 330 335 His Ile Lys Arg Arg Gly Arg Ala Lys Thr Met Ala Leu Val Asp Ile 340 345 350 Gln Leu Asp His His Glu Arg Cys Asp Cys Ile Cys Ser Ser Arg Pro 355 360 365 Pro Arg 370 <210> 9 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Arg Lys Ser Lys 1 <210> 10 <211> 192 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly 20 25 30 Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu 50 55 60 Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu 65 70 75 80 Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro 85 90 95 Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His 100 105 110 Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys 115 120 125 Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly 130 135 140 Pro Cys Ser Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln 145 150 155 160 Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg 165 170 175 Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 180 185 190 <210> 11 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Pro Val Met Arg Leu Phe Pro Cys Phe Leu Gln Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ala Leu Pro Ala Val Pro Pro Gln Gln Trp Ala Leu Ser Ala Gly 20 25 30 Asn Gly Ser Ser Glu Val Glu Val Val Pro Phe Gln Glu Val Trp Gly 35 40 45 Arg Ser Tyr Cys Arg Ala Leu Glu Arg Leu Val Asp Val Val Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Ser Glu Val Glu His Met Phe Ser Pro Ser Cys Val Ser Leu 65 70 75 80 Leu Arg Cys Thr Gly Cys Cys Gly Asp Glu Asp Leu His Cys Val Pro 85 90 95 Val Glu 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Ser 130 135 140 Glu Arg Gly Leu Asn Ala Arg Gly Pro His Glu Ala Ser Asn Pro Arg 145 150 155 160 Pro Arg Cys Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg Leu Glu Met Glu Thr 165 170 175 Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Cys 180 185 190 Tyr Ser Ala Ser Asn Ala Ser Pro Gly Leu Ser Glu Arg Leu Glu Gly 195 200 205 Leu Cys Tyr Ser Val Ala Leu Pro Arg Thr His Arg Gly Leu Gly Leu 210 215 220 Val Ala Leu Ala Ser Asn Val Ala Leu Ser Glu Arg Met Glu Thr Gly 225 230 235 240 Leu Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu 245 250 255 Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Ser Asn Gly Leu Tyr 260 265 270 Met Glu Thr Gly Leu Asn Ala Arg Gly Leu Glu Ser Glu Arg Pro His 275 280 285 Glu Val Ala Leu Gly Leu His Ile Ser Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Cys 290 295 300 Tyr Ser Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Pro Arg Ala Arg Gly 305 310 315 320 Pro His Glu Thr His Arg Thr His Arg Thr His Arg Pro Arg Pro Arg 325 330 335 Thr His Arg Thr His Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Pro Arg Pro 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Asp Val Lys Lys Asp Tyr Gly His Ile Gln Ser Pro Asn 1 5 10 15 Tyr Pro Asp Asp Tyr Arg Pro Ser Lys Val Cys Ile Trp Arg Ile Gln 20 25 30 Val Ser Glu Gly Phe His Val Gly Leu Thr Phe Gln Ser Phe Glu Ile 35 40 45 Glu Arg Met Asp Ser Cys Ala Tyr Asp Tyr Leu Glu Val Arg Asp Gly 50 55 60 His Ser Glu Ser Ser Thr Leu Ile Gly Arg Tyr Cys Gly Tyr Glu Lys 65 70 75 80 Pro Asp Asp Ile Lys Ser Thr Ser Ser Arg Leu Trp Leu Lys Phe Val 85 90 95 Ser Asp Gly Ser Ile Asn Lys Ala Gly Phe Ala Val Asn Phe Phe Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys Gly Gly Phe Leu Thr Lys Leu Asn Gly Ser Ile Thr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Trp Pro Lys Glu Tyr Pro Pro Asn Lys Asn Cys Ile Trp Gln Leu Val 20 25 30 Ala Pro Thr Gln Tyr Arg Ile Ser Leu Gln Phe Asp Phe Phe Glu Thr 35 40 45 Glu Gly Asn Asp Val Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Arg Ser Gly 50 55 60 Leu Thr Ala Asp Ser Lys Leu His Gly Lys Phe Cys Gly Ser Glu Lys 65 70 75 80 Pro Glu Val Ile Thr Ser Gln Tyr Asn Asn Met Arg Val Glu Pro Lys 85 90 95 Ser Asp Asn Thr Val Ser Lys Lys Gly Phe Lys Ala His Phe Phe Ser 100 105 110 Glu <210> 23 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly 1 5 10 15 Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln 20 25 30 Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe 35 40 45 Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp 50 55 60 Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile 65 70 75 80 Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe 85 90 95 Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu 100 105 110 Ile <210> 24 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly 1 5 10 15 Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe 20 25 30 Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu 35 40 45 Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg 50 55 60 Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg 65 70 75 80 Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile 85 90 95 Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe 100 105 110 Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu 115 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> UNSURE <222> (2) <223> Can be any amino acid residue <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Can be any amino acid residue <220> <221> UNSURE <222> (14) <223> Can be any amino acid residue <400> 25 Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Asn Cys Xaa Cys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gtcgtggaac tgtcaactgg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ctcagcaacc acttgtgttc 20 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 ccatcctaat acgactcact atagggc 27 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agtgggatcc gttactgatg gagagttat 29 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 cccaagcttg aagatcttga gaatat 26 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 tgctctagat cgaggtggtc tt 22

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｃ０８４ 48/00 9/04 ４Ｃ０８５Ａ６１Ｐ 3/10 11/00 ４Ｃ０８６ 9/04 11/08 ４Ｈ０４５ 11/00 27/02 11/08 27/06 27/02 35/00 27/06 35/04 35/00 43/00 １０５ 35/04 Ｃ０７Ｋ 14/49 43/00 １０５ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/49 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/96 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 5/10 21/08 9/96 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 33/531 ＢＣ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ 33/531 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号６０／１５０，６０４ (32)優先日平成11年８月26日(1999．8．26) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１５７，１０８ (32)優先日平成11年10月４日(1999．10．4) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／１５７，７５６ (32)優先日平成11年10月５日(1999．10．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (71)出願人ライセンティア・リミテッドフィンランド 00130 ヘルシンキエロッタヤンカトゥ 19 ビー５ (72)発明者エリクソン，ウルフスウェーデンエス‐171 77 ストックホルムルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 240 (72)発明者アーセ，カリンスウェーデンエス‐171 77 ストックホルムルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 240 (72)発明者ポンテン，アンニカスウェーデンエス‐171 77 ストックホルムルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 240 (72)発明者リ，スリスウェーデンエス‐171 77 ストックホルムルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 240 (72)発明者ウーテラ，マルコフィンランドエフアイエヌ‐00014 ヘルシンキユニバーシティ・オブ・ヘルシンキピー・オー・ボックス 26 (72)発明者アリタロ，カリフィンランドエフアイエヌ‐00014 ヘルシンキユニバーシティ・オブ・ヘルシンキピー・オー・ボックス 26 (72)発明者エストマン，アルネスウェーデンエス‐751 24 ウプサラルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 595 (72)発明者ヘルディン，カール‐ヘンリックスウェーデンエス‐751 24 ウプサラルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチピー・オー・ボックス 595 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA21 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 EA04 GA11 HA13 HA14 4B050 CC03 DD11 HH01 LL01 LL03 LL05 4B063 QA18 QQ08 QQ53 QQ79 QQ91 4B064 AG13 AG27 CA10 CA19 CA21 CB05 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA30 BD14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 AA16 CA53 NA14 ZA40 ZA59 ZA60 ZB21 ZB26 ZC35 4C085 AA14 CC23 DD62 EE01 4C086 AA01 AA02 EA27 NA14 ZA33 ZA36 ZA40 ZA59 ZB26 ZC35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA40 BA41 BA50 CA40 CA42 DA01 DA20 DA76 EA20 EA50 FA50 FA72 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図３に示された配列（配列識別番号３）の少なくともヌクレ
オチド１−６００、図５に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌクレ
オチド１−９６６、図７に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌクレ
オチド１７６−１２８８、図７に示された配列（配列識別番号７）の少なくとも
ヌクレオチド９３８−１２８８に対して、少なくとも８５％の同一性を有するポ
リヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
【請求項２】前記配列同一性は少なくとも９０％である、請求項１の単離
核酸分子。
【請求項３】前記配列同一性は少なくとも９５％である、請求項１の単離
核酸分子。
【請求項４】前記核酸はｃＤＮＡである、請求項１の単離核酸分子。
【請求項５】前記核酸は哺乳動物ポリヌクレオチドである、請求項１の単
離核酸分子。
【請求項６】前記核酸はヒトポリヌクレオチドである、請求項５の単離核
酸分子。
【請求項７】図４（配列識別番号４）のアミノ酸配列、図６（配列識別番
号６）のアミノ酸配列又は図８（配列識別番号８）のアミノ酸配列、又は、ＰＤ
ＧＦ−Ｄの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログ、に対して少なくと
も８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド分子をコードする
単離核酸分子。
【請求項８】前記アミノ酸配列同一性は少なくとも９０％である、請求項
７の単離核酸分子。
【請求項９】前記アミノ酸配列同一性は少なくとも９５％である、請求項
７の単離核酸分子。
【請求項１０】アミノ酸配列ＰＸＣＬＬＶＸＲＣＧＧＮＣＸＣ（配列認識番号２５）を有するポリペプチドを
コードする単離核酸分子。
【請求項１１】図３に示された配列（配列識別番号３）の少なくともヌク
レオチド１−６００、図５に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌク
レオチド１−９６６、図７に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌク
レオチド１７６−１２８８、又は図７に示された配列（配列識別番号７）の少な
くともヌクレオチド９３８−１２８８、又は、前記ＤＮＡ配列の少なくとも一つ
とストリンジェント条件下に於いてハイブリダイズするポリヌクレオチドに対し
て少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を有する単離ポリヌ
クレオチド。
【請求項１２】前記核酸はプロモーター配列に作動可能にリンクされてい
る、請求項１又は請求項１１の核酸を有するベクター。
【請求項１３】前記ベクターは真核ベクターである、請求項１２のベクタ
ー。
【請求項１４】前記ベクターは原核ベクターである、請求項１２のベクタ
ー。
【請求項１５】前記ベクターはプラスミドである、請求項１２のベクター
。
【請求項１６】前記ベクターはバキュロウイルスベクターである、請求項
１２のベクター。
【請求項１７】図４（配列識別番号４）のアミノ酸配列、図６（配列識別
番号６）のアミノ酸配列又は図８（配列識別番号８）のアミノ酸配列、又は、Ｐ
ＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログ、に対して少なく
とも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現するベク
ターを製造する方法であって、前記方法は、請求項１、請求項７、請求項１０又
は請求項１１の単離核酸をプロモーターとの作動可能なリンク状態で前記ベクタ
ーに組み込む工程を有する、ベクターを製造する方法。
【請求項１８】請求項１２のベクターとトランスフォーム又はトランスフ
ェクトされた宿主細胞。
【請求項１９】前記宿主細胞は真核細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２０】前記宿主細胞はＣＯＳ細胞である、請求項１８の宿主細胞
。
【請求項２１】前記宿主細胞は原核細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２２】前記宿主細胞は２９３ＥＢＮＡ細胞である、請求項１８の
宿主細胞。
【請求項２３】前記宿主細胞は昆虫細胞である、請求項１８の宿主細胞。
【請求項２４】宿主細胞は、図４（配列識別番号４）のアミノ酸配列、図
６（配列識別番号６）のアミノ酸配列又は図８（配列識別番号８）のアミノ酸配
列、又は、ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログ、に
対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを
発現する、作動可能にプロモーターにリンクされた請求項１又は請求項１１の核
酸分子を有するベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細
胞。
【請求項２５】図４（配列識別番号４）のアミノ酸配列、図６（配列識別
番号６）のアミノ酸配列又は図８（配列識別番号８）のアミノ酸配列、又は、Ｐ
ＤＧＦ−Ｄの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログ、に対して少なく
とも８５％の同一性を有する単離ポリペプチド。
【請求項２６】前記ポリペプチドはヒトポリペプチドである、請求項２５
の単離ポリペプチド。
【請求項２７】前記ポリペプチドは、ＰＤＧＦ−Ｄレセプターを発現する
細胞の、増殖および／又は分化および／又は増殖および／又は固有運動性を刺激
および／又は増強する能力を有する、請求項２５の単離ポリペプチド。
【請求項２８】前記細胞は、内皮細胞、結合組織細胞、筋線維芽細胞、及
びグリア細胞から成るグループから選択される、請求項２７の単離ポリペプチド
。
【請求項２９】図３に示された配列（配列識別番号３）の少なくともヌク
レオチド１−６００、図５に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌク
レオチド１−９６６、図７に示された配列（配列識別番号５）の少なくともヌク
レオチド１７３−１２８８、又は図７に示された配列（配列識別番号７）の少な
くともヌクレオチド９３８−１２８８、又は、前記ＤＮＡ配列の少なくとも一つ
とストリンジェント条件下に於いてハイブリダイズするポリヌクレオチドに対し
て少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレ
オチドの発現によって生成される単離ポリヌクレオチド。
【請求項３０】下記の特徴的配列ＰＸＣＬＬＶＸＲＣＧＧＮＣＸＣ（配列識別番号２５）を有する単離ポリペプチ
ド。
【請求項３１】請求項２５又は請求項２９のポリペプチドを有する単離ポ
リペプチドダイマー。
【請求項３２】前記ポリペプチドダイマーは前記ポリペプチドのホモダイマーである、請求項３１の単離ポリペプチドダイ
マー。
【請求項３３】前記ポリペプチドダイマーは、前記ポリペプチドと、ＶＥ
ＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−
Ｂ又はＰｌＧＦとのヘテロダイマーである、請求項３１の単離ポリペプチドダイ
マー。
【請求項３４】前記ポリペプチドダイマーは、ジスルフィド結合ダイマー
である、請求項３１の単離ポリペプチドダイマー。
【請求項３５】有効細胞増殖促進量の請求項２５、請求項２９又は請求項
３０のポリペプチドと、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ
、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ又はＰｌＧＦから成るグループから選択される少
なくとも一つの別の増殖因子とを有する医薬用組成物。
【請求項３６】更にヘパリンを有する、請求項３５の医薬用組成物。
【請求項３７】有効細胞増殖促進量の請求項２５、請求項２９又は請求項
３０の単離ポリペプチドと、少なくとも一つの医薬用担体又は希釈剤とを有する
医薬用組成物。
【請求項３８】更にヘパリンを有する、請求項３７の医薬用組成物。
【請求項３９】有効細胞増殖促進量の請求項２５、請求項２９又は請求項
３０の単離ポリペプチドと、ヘパリンとを有する医薬用組成物。
【請求項４０】ＰＤＧＦレセプター刺激量の請求項２５、請求項２９又は
請求項３０の単離ポリペプチドと、少なくとも一つの医薬用担体又は希釈剤とを
有する医薬用組成物。
【請求項４１】請求項１又は請求項１１のポリヌクレオチドをテストサン
プル中で増幅させるための手段であって、前記手段は、請求項１又は請求項１１
の核酸に対して相補的な少なくとも一対のプライマーを有する、請求項１又は請
求項１１のポリヌクレオチドをテストサンプル中で増幅させるための手段。
【請求項４２】請求項１又は請求項１１のポリヌクレオチドをテストサン
プル中で増幅させるための手段であって、前記手段は、ポリメラーゼと、請求項
１又は請求項１１の核酸に対して相補的な少なくとも一対のプライマーとを有し
て、前記ポリヌクレオチドと請求項１又は請求項１１の核酸との配列比較を容易
にするべく前記ポリヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する、請
求項１又は請求項１１のポリヌクレオチドをテストサンプル中で増幅させるため
の手段。
【請求項４３】請求項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドに
対して特異的に反応する抗体。
【請求項４４】前記抗体はポリクローナル抗体である、請求項４３の抗体
。
【請求項４５】前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項４３の抗体
。
【請求項４６】前記抗体はヒト化抗体である、請求項４５の抗体。
【請求項４７】前記抗体は、検出可能標識によって標識化される、請求項
４４又は４５又は４６の抗体。
【請求項４８】前記検出可能標識は放射性同位体である、請求項４７の抗
体。
【請求項４９】前記抗体は、細胞障害性又は細胞***抑制性物質の添加に
よって改変されている、請求項４５又は４６の抗体。
【請求項５０】請求項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドを
製造する方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸配列が発現されるようにプロモーター配列
に作動可能に結合された前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有す
るベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞を培養する
工程、そして前記ポリペプチドを、前記宿主細胞から、又は、前記宿主細胞が培養された増
殖培地から単離する工程を有する、請求項２５、請求項２９又は請求項３０のポ
リペプチドを製造する方法。
【請求項５１】哺乳動物に対して、有効結合組織又は損傷治癒刺激量の請
求項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドを投与する工程を有する、
哺乳動物の結合組織の増殖又は損傷治癒を刺激する方法。
【請求項５２】活性切断型のＰＤＧＦ−Ｄを製造する方法であって、請求
項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを有する発現ベクターを発現させる工程と、前記活性切断型ＰＤＧＦ−Ｄを生
成するため、発現されたポリペプチドをプロセシングするための少なくとも一つ
の酵素をタンパク質分解量供給する工程とを有する、活性切断型のＰＤＧＦ−Ｄ
を製造する方法。
【請求項５３】ＰＤＧＦ−Ｄのレセプター結合特異性を調節する方法であ
って、請求項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを有する発現ベクターを発現させる工程と、前記活性切断型ＰＤＧ
Ｆ−Ｄを生成するため、発現されたポリペプチドをプロセシングするための少な
くとも一つの酵素をタンパク質分解量供給する工程とを有する、ＰＤＧＦ−Ｄの
レセプター結合特異性を調節する方法。
【請求項５４】増殖因子活性を有するポリペプチドを選択的に活性化する
方法であって、増殖因子活性を有するポリペプチドと、ＣＵＢドメインと、前記
ポリペプチドと前記ＣＵＢドメイン間のタンパク質分解部位をコードするポリヌ
クレオチドを有する発現ベクターを発現させる工程と、増殖因子活性を有する活
性化ポリペプチドを生成するため、発現されたポリペプチドをプロセシングする
ための少なくとも一つの酵素をタンパク質分解量供給する工程とを有する、増殖
因子活性を有するポリペプチドを選択的に活性化する方法。
【請求項５５】アミノ酸配列ＲＫＳＫ又は、その構造的に保存されたアミ
ノ酸配列を有するタンパク質分解部位を有する、請求項２５、請求項２９又は請
求項３０の単離ポリペプチド。
【請求項５６】アミノ酸配列ＲＫＳＫ又は、その構造的に保存されたアミ
ノ酸配列を有するタンパク質分解部位を有するポリペプチドをコードする、請求
項７の単離核酸分子。
【請求項５７】ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、
ＰＤＧＦ−Ｄ，ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ又はＰｌＧＦの活性化モノマーと、
ＣＵＢドメインにリンクされたＰＤＧＦ−Ｄの活性化モノマーとを有する単離ヘ
テロダイマー。
【請求項５８】ＰＤＧＦ−Ｄの活性化モノマーと、ＣＵＢドメインにリン
クされた、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−
Ｄ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ又はＰｌＧＦの活性化モノマーとを有する単離
ヘテロダイマー。
【請求項５９】更に、前記活性化モノマーと前記ＣＵＢドメインリンケー
ジとの間のタンパク質分解部位を有する、請求項５７の単離ヘテロダイマー。
【請求項６０】更に、前記活性化モノマーと前記ＣＵＢドメインリンケー
ジとの間のタンパク質分解部位を有する、請求項５８の単離ヘテロダイマー。
【請求項６１】ＰＤＧＦベーターレセプター刺激量の請求項２５、請求項
２９又は請求項３０のポリペプチドを添加する工程を有する、ＰＤＧＦベーター
レセプター活性化を誘導する方法。
【請求項６２】哺乳動物に対して、ＰＤＧＦ−Ｄ抑制量のＰＤＧＦ−Ｄア
ンタゴニストを投与する工程を有する、哺乳動物においてＰＤＧＦ−Ｄ発現腫瘍
の腫瘍増殖を抑制する方法。
【請求項６３】腫瘍のサンプルを採取してＰＤＧＦ−Ｄの発現をテストす
る工程を有する、ヒト腫瘍の特定タイプを同定する方法。
【請求項６４】活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄの実質的に精製された調製物を
テスト物質と混合する、そして、適当な手段によって、ＰＤＧＦ−Ｄの生物活性
の抑制をモニターする、ＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニストを同定する方法。
【請求項６５】全長ＰＤＧＦ−Ｄの実質的に精製された調製物をテスト物
質と混合する、そして、適当な手段によって、ＰＤＧＦ−ＤからのＣＵＢドメイ
ンの開裂の抑制をモニターする、ＰＤＧＦ−Ｄアンタゴニストを同定する方法。
【請求項６６】図８（配列識別番号８）のアミノ酸残基２２５−３７１と
少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現す
るベクターを製造する方法であって、前記方法は前記アミノ酸残基をコードする
単離核酸分子を、プロモーターと作動可能にリンクされた状態で前記ベクターに
導入する工程を有する、ベクターを製造する方法。
【請求項６７】活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄを製造する方法であって、請求
項２５、請求項２９又は請求項３０のポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを有する発現ベクターを発現させる工程と、前記活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄを
生成するため、発現されたポリペプチドをプロセシングするための少なくとも一
つ酵素をタンパク質分解量供給する工程とを有する、活性化切断型ＰＤＧＦ−Ｄ
を製造する方法。
【請求項６８】哺乳動物に対してＰＤＧＦ−Ｄ抑制量のＰＤＧＦ−Ｃアン
タゴニストを投与する工程を有する、細胞の正常な集団への腫瘍細胞の浸潤中に
おける組織再構築を抑制する方法。