ES2336731T3 - Factor de crecimiento d derivado de plaquetas, adn codificante del mismo y sus usos. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o Figura 3 (SEQ ID NO: 3), o una molécula de ácido nucleico hibridable con la misma en condiciones restrictivas, en la que la molécula de ácido nucleico aislada (o complemento de la misma) codifica una proteína o polipéptido que tiene la capacidad de estimular uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales, pero excluyendo una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia del polinucleótido: **(Ver fórmula)**

Description

Factor de crecimiento D derivado de plaquetas, ADN codificante del mismo y sus usos.

Esta invención se refiere a factores de crecimiento para células que expresan receptores, a un nuevo factor de crecimiento que incluye células endoteliales, células de tejido conjuntivo (tales como fibroblastos), miofibroblastos y células gliales, y en particular a un nuevo factor de crecimiento de tipo factor de crecimiento derivado de plaquetas/factor de crecimiento endotelial vascular, una secuencia de polinucleótido que codifica el factor, y a composiciones farmacéuticas y de diagnóstico, y a procedimientos que lo usan o derivados del factor.

Antecedentes de la invención

En el embrión en desarrollo, la red vascular primaria se establece por diferenciación in situ de células mesodérmicas en un proceso llamado vasculogénesis. Se cree que todos los procedimientos posteriores que implican la generación de nuevos vasos en el embrión y la neovascularización en adultos, están gobernados por el brote o división de capilares nuevos a partir de la vasculatura preexistente en un proceso llamado angiogénesis (Pepper y col., Enzyme & Protein, 1996, 49, 138-162; Breier y col., Dev. Dyn. 1995, 204, 228-239; Risau, Nature, 1997 386 671-674). La angiogénesis no solo está implicada en el desarrollo embrionario y el crecimiento, reparación y regeneración de tejidos normales, sino que también está implicada en el ciclo reproductor femenino, establecimiento y mantenimiento de embarazo, y reparación de heridas y fracturas. Además de la angiogénesis que se produce en los individuos normales, los sucesos angiogénicos están implicados en una serie de procesos patológicos, en particular crecimiento tumoral y metástasis, y otras afecciones en las que la proliferación de vasos sanguíneos, en especial el sistema microvascular, aumenta, tal como en la retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. La inhibición de la angiogénesis es útil para prevenir y aliviar estos procesos patológicos.

Por otra parte, la promoción de la angiogénesis es deseable en situaciones en las que hay que establecer o extender la vascularización, por ejemplo, después de trasplante de órgano o tejido, o para estimular el establecimiento de la circulación colateral en el tejido infartado o estenosis arterial, tal como en la enfermedad cardiaca coronaria y tromboangeítis obliterante.

El procedimiento angiogénico es muy complejo e implica el mantenimiento de células endoteliales en el ciclo celular, degradación de la matriz extracelular, migración e invasión del tejido que lo rodea y finalmente, formación del tubo. Todavía queda mucho para entender los mecanismos moleculares que subyacen en los procesos angiogénicos complejos.

Debido a la función crucial de la angiogénesis en tantos procesos fisiológicos y patológicos, se han investigado intensamente los factores implicados en el control de la angiogénesis. Se ha mostrado que hay una serie de factores de crecimiento implicados en la regulación de la angiogénesis; estos incluyen los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF\alpha) y factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Para una revisión véase, por ejemplo, Folkman y col., J. Biol. Chem., 1992, 267, 10931-10934.

Se ha sugerido que una familia particular de factores de crecimiento específicos de células endoteliales, los factores de crecimiento endoteliales vasculares (VEGF) y sus correspondientes receptores, son los responsables principales de la estimulación del crecimiento y diferenciación celular endotelial, y para determinadas funciones de las células diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia de PDGF y parece que actúan principalmente a través de los receptores endoteliales tirosina quinasa (RTK).

Se han identificado 9 proteínas diferentes en la familia de los PDGF, en particular 2 PDGF (A y B), VEGF y 6 miembros que están estrechamente relacionados con el VEGF. Los 6 miembros estrechamente relacionados con el VEGF son: VEGF-B, descrito en la solicitud de patente internacional PCT/US96/02957 (WO 96/26736) y patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918 de Ludwig Institute for Cancer Research y La universidad de Helsinki; VEGF-C, descrito en Joukov y col., EMBO J., 1996, 15, 290-298 y Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 1988-1992; VEGF-D, descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/US97/14696 (WO 98/07832), y Achen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 548-553; el factor de crecimiento placentario (PIGF), descrito en Maglione y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 9267-9271; VEGF2, descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/US94/05291 (WO 95/24473) de Human Genome Sciences, Inc; y VEGF3, descrito en la solicitud de patente internacional Nº PCT/US95/07283 (WO 96/39421) de Human Genome Sciences, Inc. Cada miembro de la familia de VEGF tiene una identidad de secuencia de aminoácidos entre 30% y 45% con VEGF. Los miembros de la familia de VEGF comparten dominio de homología de VEGF que contiene los 6 restos cisteína que forman el patrón nudo de cisteínas. Las características funcionales de la familia de VEGF incluyen diferentes grados de mitogenicidad para las células endoteliales, la inducción de permeabilidad vascular y propiedades angiogénicas y linfangiogénicas.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una glicoproteína homodímera que se ha aislado de varias fuentes. El VEGF muestra una alta actividad mitogénicas específica para células endoteliales. El VEGF tiene importante funciones reguladoras en la formación de nuevos vasos sanguíneos durante la vasculogénesis embrionaria y en la angiogénesis durante la vida adulta (Carmeliet y col., Nature, 1996 380 435-439; Ferrara y col., Nature, 1996, 380, 439-442; revisado en Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev., 1997, 18, 4-25). La importancia de la función que tiene el VEGF se ha demostrado en estudios que muestran que la inactivación de un solo alelo del VEGF da como resultado la letalidad embrionaria debido al desarrollo fallido de la vasculatura (Carmeliet y col., Nature, 1996, 380, 435-439; Ferrara y col., Nature, 1996 380 439-442). Además, el VEGF tiene una fuerte actividad quimioatractora hacia los monocitos, puede inducir al activador del plasminógeno y al inhibidor del activador del plasminógeno en células endoteliales, y también puede inducir la permeabilidad microvascular. Debido a esta última actividad, a veces se denomina factor de permeabilidad vascular (VPF). Se ha revisado el aislamiento y propiedades del VEGF; véase Ferrara y col., J. Cellular Biochem., 1991, 47, 211-218 y Connolly, J. Cellular Biochem., 1991, 47, 219-223. La división alterante del ARNm de un solo gen de VEGF dio lugar a 5 isoformas del VEGF.

El VEGF-B tiene propiedades angiogénicas y otras propiedades similares a las de VEGF, pero está distribuido y se expresa en los tejidos de forma diferente al VEGF. En particular, el VEGF-B se expresa mucho en el corazón, y solo un poco en el pulmón, mientras que para el VEGF el caso es el inverso. Esto sugiere que el VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

El VEGF-B se aisló usando una técnica de selección de captura por interacción de co-híbridos de levadura, mediante la selección de proteínas celulares que pueden interaccionar con la proteína celular de tipo I de unión al ácido retinoico (CRABP-I). Su aislamiento y características se describen con detalle en el documento PCT/US96/02957 (WO 1996/26736) y en Olofsson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2576-2581.

El VEGF-C se aisló de medio condicionado de la línea celular de adenocarcinoma de próstata PC-3 (CRL1435) seleccionando la capacidad del medio de producir fosforilación de tirosina del receptor tirosina quinasa específico de células endoteliales VEGF-3 (Flt4), usando células transfectadas para expresar VEGFR-3. El VEGF-C se purificó usando cromatografía de afinidad con VEGFR-3 recombinante y se clonó a partir de una genoteca de ADNc de PC-3. Su aislamiento y características se describe con detalle en Joukov y col., EMBO J., 1996, 15, 290-298.

El VEGF-D se aisló de una genoteca de ADNc de mama humana, disponible en el comercio en Clontech, mediante selección con una secuencia marcadora expresada obtenida de una genoteca de ADNc humana denominada "Soares Breast 3NbHBst" como sonda de hibridación (Achen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 598-553). Su aislamiento y características se describen con detalle en la solicitud de patente internacional nº PCT/US97/14696 (WO98/07832).

El gen del VEGF-D se expresa ampliamente en el humano adulto, pero no se expresa de forma ubicua. Hay expresión alta de VEGF-D en el corazón, pulmón y músculo esquelético. Los niveles intermedios de VEGF-D se expresan en el bazo, ovario, intestino delgado y colon, y se encuentra expresión menor en el riñón, páncreas, timo, próstata y testículos. No se detectó ARNm de VEGF-D en el ARN del cerebro, placenta, hígado o leucocitos de la sangre periférica.

El PIGF se aisló de una genoteca de ADNc de placenta. Su aislamiento y características se describen con detalle en Maglione y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 92,67-9271. Actualmente no se entiende bien su función biológica.

El VEGF2 se aisló de una línea celular de cáncer de mama humana independiente de estrógenos, muy tumorigénica. Aunque se afirma que esta molécula tiene aproximadamente 22% de homología con el PDGF y 30% de homología con el VEGF, el procedimiento de aislamiento del gen que codifica el VEGF2 no está claro y no se ha descrito la caracterización de la actividad biológica.

El VEGF3 se aisló de una genoteca de ADNc derivada de tejido de colon. Se afirma que el VEGF3 tiene aproximadamente 36% de identidad y 66% de similitud con el VEGF. El procedimiento de aislamiento del gen que codifica el VEGF3 no está claro y no se ha descrito la caracterización de la actividad biológica.

La similitud entre dos proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y las sustituciones de aminoácidos conservadas de una de las proteínas con la secuencia de la segunda proteína, de modo que la identidad se determina sin incluir las sustituciones de aminoácidos conservadas.

Los miembros de la familia de PDGF/VEGF actúan principalmente por unión a los receptores tirosina quinasas. Se han identificado 5 receptores tirosina quinasas específicos de células endoteliales, en particular VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1), VEGFR-3 (Flt4), Tie y Tek/Tie-2. Todos estos tienen la actividad intrínseca de tirosina quinasa que es necesaria para la transducción de señales. La función esencial, específica en la vasculogénesis y angiogénesis de VEGFR-1, VEGF-2, VEGFR-3, Tie y Tek/Tie-2 se ha demostrado mediante mutaciones dirigidas que inactivan estos receptores en embriones de ratón.

Los únicos receptores tirosina quinasas que se sabe que se unen a los VEGF son VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. VEGFR-1 y VEGFR-2 se unen a VEGF con una alta afinidad y VEGFR-1 también se une a VEGF-B y PIGF. Se ha mostrado que VEGF-C es el ligando para VEGFR-3 (Joukov y col., The EMBO Journal, 1996, 15, 290-298). VEGFD se une tanto a VEGFR-2 como a VEGFR-3. Se ha descrito un ligando para Tek/Tie-2 en la solicitud de patente internacional nº PCT/US95/12935 (WO 96/11269) de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. El ligando para Tie todavía no se ha identificado.

Recientemente se ha purificado y clonado un nuevo receptor específico de la isoforma de VEGF de 130-135 kDa (Soker y col., Cell, 1998, 92, 735-745). Se ha encontrado que el receptor de VEGF se une específicamente a la isoforma VEGF_{165} por la secuencia codificada por el exón 7, que muestra una afinidad pequeña por la heparina (Soker y col., Cell, 1998, 92, 735-795). Sorprendentemente, se mostró que el receptor era idéntico a la neropilina-1 humana (NP-1), un receptor implicado en la etapa temprana de la neuromorfogénesis. Parece que también el PIGF-2 interacciona con NP-1 (Migdal y col., J. Biol. Chem., 1998, 273, 22272-22278).

VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 son expresados de forma diferente por las células endoteliales. Tanto VEGFR-1 como VEGFR-2 son expresados en el endotelio de los vasos sanguíneos (Oelrichs y col., Oncogene, 1992, 8, 11-18; Kaipainen y col., J. Exp. Med., 1993, 178, 2077-2088; Dumont y col., Dev. Dyn., 1995, 203, 80-92; Fong y col., Dev. Dyn., 1996, 207, 1-10) y VEGFR-3 es expresado principalmente en el endotelio linfático de tejido adulto (Kaipainen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 9, 3566-3570). El VEGFR-3 también se expresa en la vasculatura sanguínea que rodea los tumores.

La alteración de los genes de VEGFR da como resultado el desarrollo aberrante de la vasculatura conduciendo a la letalidad embrionaria en mitad de la gestación. El análisis de los embriones que llevan un gen de VEGFR1 completamente inactivado sugiere que este receptor es necesario para la organización funcional del endotelio (Fong y col., Nature, 1995, 376, 66-70). Sin embargo, la supresión del dominio de tirosina quinasa intracelular de VEGF-1 genera ratones viables con una vasculatura normal (Hiratsuka y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 9349-9359). Las razones que subyacen en estas diferencias siguen sin explicarse, pero sugieren que no es necesaria la señalización del receptor por la tirosina quinasa para la función adecuada del VEGFR-1. El análisis de ratones homocigotos con alelos inactivados de VEGFR-2 sugiere que este receptor es necesario para la proliferación celular endotelial, hematopoyesis y vasculogénesis (Shalaby y col., Nature, 1995, 376, 62-66; Shalaby y col., Cell, 1997, 89, 981-990). La inactivación de VEGFR-3 da como resultado la insuficiencia cardiovascular debido a la organización anormal de los vasos grandes (Dumont y col. Science, 1998, 282, 946-949).

Aunque VEGFR-1 se expresa principalmente en células endoteliales durante el desarrollo, también se puede encontrar en células precursoras hematopoyéticas durante las etapas tempranas de la embriogénesis (Fong y col., Nature, 1995 376 66-70). También se expresa en la mayoría, sino en todos los vasos en los embriones (Breier y col., Dev. Dyn., 1995, 204, 228-239; Fong y col., Dev. Dyn., 1996, 207, 1-10). En adultos, los monocitos y macrófagos también expresan este receptor (Barleon y col., Blood, 1996, 87, 3336-3393).

El receptor VEGFR-3 se expresa ampliamente en células endoteliales durante el desarrollo embrionario temprano, pero a medida que avanza la embriogénesis, se restringe al endotelio venoso y después al endotelio linfático (Kaipainen y col., Cancer Res., 1994, 54, 6571-6577; Kaipainen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 3566-3570). El VEGFR-3 sigue expresándose en células endoteliales linfáticas en adultos. Este receptor es esencial para el desarrollo de la vasculatura durante la embriogénesis. La inactivación dirigida de ambas copias del gen del VEGFR-3 en ratones daba como resultado la formación defectuosa de vasos sanguíneos, caracterizada por vasos anormalmente grandes organizados, con lúmenes defectuosos, que conducen a la acumulación de fluido en la cavidad pericárdica y a la insuficiencia cardiovascular el día 9,5 post-coital. Basándose en estos descubrimientos, se ha propuesto que el VEGFR-3 es necesario para la maduración de las redes vasculares principales en los vasos sanguíneos más grandes. Sin embargo, la función del VEGFR-3 en el desarrollo de la vasculatura linfática no se podía estudiar en estos ratones debido a que los embriones morían antes de que surgiera el sistema linfático. Sin embargo, se supone que el VEGFR-3 tiene una función en el desarrollo de la vasculatura linfática y la linfangiogénesis, dada su expresión específica en las células endoteliales linfáticas durante la embriogénesis y la vida adulta. Esto está apoyado por el descubrimiento de que la expresión ectópica del VEGF-C, un ligando para el VEGFR-3, en la piel de ratones transgénicos, daba como resultado la proliferación de células endoteliales linfáticas y agrandamiento de vasos en la dermis. Además, esto sugiere que el VEGF-C puede tener una función principal en el endotelio linfático, y una función secundaria en la angiogénesis y regulación de la permeabilidad que es compartida con el VEGF (Joukov y col., EMBO J., 1996, 15, 290-298).

Se ha mostrado que algunos inhibidores del sistema VEGF/VEGF-receptor previenen el crecimiento tumoral por un mecanismo antiangiogénico; véase Kim y col., Nature, 1993, 362, 841-844 y Saleh y col., Cancer Res., 1996, 56, 393-401.

Como se ha mencionado antes, la familia de VEGF de factores de crecimiento son miembros de la familia de PDGF. El PDGF tiene una función importante en el crecimiento y/o movilidad de las células de tejido conjuntivo, fibroblastos, miofibroblastos y células gliales (Heldin y col., "Structure of platelet-derived growth factor: Implications for functional properties", Growth Factor, 1993, 8, 245-252). En adultos, el PDGF estimula la curación de heridas (Robson y col., Lancet, 1992, 339, 23-25). Estructuralmente, las isoformas de PDGF son dímeros unidos por disulfuro de cadenas polipeptídicas A y B homólogas, dispuestas en forma de homodímeros (PDGF-AA y PDGF-BB) o un heterodímero (PDGF-AB).

Las isoformas de PDGF ejercen sus efectos en las células diana por unión a receptores tirosina quinasas estructuralmente relacionados (RTK). El receptor alfa se une tanto a las cadenas A como B del PDGF, mientras que el receptor beta se une solo a la cadena B. Estos dos receptores se expresan en muchas líneas celulares cultivadas in vitro, y se expresan principalmente en células mesenquémicas in vivo. Los PDGF regulan la proliferación celular, la supervivencia celular y la quimiotáxis de muchos tipos de células in vitro (revisado en Heldin y col., Biochim Biophys Acta., 1998, 1378, F79-113). in vivo , ejercen sus efectos de un modo paracrino, puesto que a menudo se expresan en células epiteliales (PDGF-A) o endoteliales (PDGF-B) en posición cercana a la mesénquima que expresa el PDGFR. En las células tumorales y las líneas celulares cultivadas in vitro, la coexpresión de los PDGF y los receptores, genera bucles autocrinos que son importantes para la transformación celular (Betsholtz y col., Cell, 1984, 39, 447-57; Keating y col., J. R. Coll Surg Edinb., 1990, 35, 172-4). La sobreexpresión de los PDGF se ha observado en varias afecciones patológicas, incluyendo tumores malignos, arteriosclerosis y enfermedades fibroproliferativas (revisado en Heldin y col., The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, New York: Plenum Press, 1996, 249-273).

La importancia de los PDGF como reguladores de la proliferación y supervivencia celulares se ha ilustrado bien en estudios recientes de reconocimiento génico en ratones, que han mostrado distintas funciones fisiológicas para los PDGF y sus receptores, a pesar del solapamiento de las especificidades de ligandos de los PDGFR. Las mutaciones nulas homocigóticas para cualquiera de los dos ligandos del PDGF o los receptores, son letales. Aproximadamente 50% de los ratones homocigotos deficientes en PDGF-A tienen un fenotipo letal temprano, mientras que los animales que sobreviven tienen un fenotipo postnatal complejo con enfisema pulmonar debido a la formación inadecuada del septo alveolar, debido a una falta de miofibroblastos alveolares (Boström y col., Cell, 1996, 85, 863-873). Los ratones deficientes en PDGF-A también tienen un fenotipo dérmico caracterizado por la dermis fina, folículos pilosos deformados y pelo fino (Karlsson y col., Development, 1999, 126, 2611-2). El PDGF-A también es necesario para el desarrollo normal de oligodendrocitos y posterior mielinización del sistema nervioso central (Fruttiger y col., Development, 1999, 126, 457-67). El fenotipo de los ratones deficientes en PDGFR-alfa es más grave, con muerte embrionaria precoz en E10, cierre cefálico incompleto, desarrollo deficiente de la cresta neural, defectos cardiovasculares, defectos del esqueleto, y odemas [Soriano y col., Development, 1997, 124, 2691-70). Los ratones deficientes en PDGF-B y PDGFR-beta desarrollan fenotipos similares que se caracterizan por anomalías renales, hematológicas y cardiovasculares (Levéen y col., Genes Dev., 1994, 8, 1875-1887; Soriano y col., Genes Dev., 1994, 8, 1888-96; Lindahl y col., Science, 1997, 277, 242-5; Lindahl, Development, 1998, 125, 3313-2), en los que los defectos renales y cardiovasculares, al menos en parte, se deben a la falta de reclutamiento adecuado de células murales (células musculares lisas vasculares, pericitos o células mesangiales) a los vasos sanguíneos (Levéen y col., Genes Dev., 1994, 8, 1875-1887; Lindahl y col., Science, 1997, 277, 242-5; Lindahl y col., Development, 1998, 125, 3313-2).

Resumen de la invención

La invención proporciona en general un nuevo factor de crecimiento aislado que tiene la capacidad de estimular y/o potenciar la proliferación o diferenciación, y/o el crecimiento y/o la movilidad de células que expresan un receptor de PDGF-D incluyendo, pero sin limitan, células endoteliales, células del tejido conjuntivo, células de miofibroblastos y gliales, una secuencia de polinucleótido aislada que codifica el nuevo factor de crecimiento, y composiciones útiles para el diagnóstico y/o aplicaciones terapéuticas.

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o Figura 3 (SEQ ID NO: 3), o una molécula de ácido nucleico hibridable con la misma en condiciones restrictivas, en la que la molécula de ácido nucleico aislada (o complemento de la misma) codifica una proteína o polipéptido que tiene la capacidad de estimular uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales, pero excluyendo una molécula de ácido nucleico, véase la base de datos NCBI db EST Record ur. AA488780, que consiste en la secuencia de polinucleótido

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En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico aislada es un ADNc.

La molécula de ácido nucleico aislada puede ser un polinucleótido de mamífero, preferiblemente un polinucleótido humano.

En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una proteína o polipéptido y comprende un sitio proteolítico que tiene la secuencia de aminoácido RKSK o una secuencia de aminoácidos estructuralmente conservada de la misma.

La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys (SEQ ID NO: 25).

En realizaciones preferidas, un vector que comprende el ácido nucleico está operativamente unido con una secuencia promotora.

El vector puede ser un vector eucariota, un vector procariota, un plásmido o un vector baculovirus.

La invención proporciona además una células huésped transformada o transfectada con un vector como se describe en el presente documento.

En realizaciones preferidas, la célula huésped es una célula eucariota y el vector es un vector eucariota. La célula huésped puede ser una célula COS.

En otra realización preferida, la célula huésped es una célula procariota y el vector es un vector procariota. La célula huésped puede ser una célula 293EBNA. La célula huésped puede ser una célula de insecto.

La invención también proporciona una proteína o polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico como se define en lo que antecede, o que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o una secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEQ ID NO: 4) o sustituciones conservativas de dicha secuencia de aminoácidos, o un fragmento de dicho polipéptido, teniendo la proteína, polipéptido o fragmento del mismo, la capacidad de estimular y/o potenciar uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales.

En realizaciones preferidas, la proteína o polipéptido aislado es un polipéptido humano.

La proteína o polipéptido aislado puede comprender un sitio proteolítico que tiene la secuencia de aminoácidos RKSK o una secuencia de aminoácidos estructuralmente conservada de la misma.

La invención proporciona además un polipéptido aislado que comprende la secuencia característica de Pro Xaa Cys Leu Leu Val Xaa Arg Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys (SEQ ID NO: 25).

La invención también proporciona un dímero de proteína o de polipéptido aislado que comprende una proteína o polipéptido como se describe en el presente documento.

En realizaciones preferidas, el dímero de proteína o polipéptido aislado es un homodímero de dicha proteína o polipéptido.

En otra realización preferida, el dímero de proteína o polipéptido aislado es un heterodímero de dicha proteína o polipéptido y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-A, PDGF-B o PIGF.

El dímero de proteína o polipéptido aislado puede ser un dímero unido por disulfuro.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz que promueve la proliferación celular, de una proteína o polipéptido de la invención, y al menos un factor de crecimiento adicional aislado del grupo que consiste en VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-A, PDGF-B o P1GF.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz que promueve la proliferación celular, de una proteína o polipéptido aislado como se describe en el presente documento, y al menos un vehículo o diluyente farmacéutico.

La composición farmacéutica puede comprender además heparina.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína o polipéptido como se describe en el presente documento, y heparina.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende una cantidad estimulante del receptor de PDGF, de una proteína o polipéptido aislado como se describe en el presente documento, y al menos un vehículo o diluyente farmacéutico.

La invención proporciona además un kit para amplificar una molécula de ácido nucleico de la invención, si está presente en una muestra de ensayo, y el kit comprende al menos un par de cebadores complementarios de un ácido nucleico como se describe en el presente documento.

El kit puede comprender además una polimerasa para amplificar el polinucleótido por la reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de facilitar una comparación de secuencias de los polinucleótidos con el ácido nucleico.

La invención proporciona también un anticuerpo reactivo específicamente con una proteína o polipéptido de la invención. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado.

En realizaciones preferidas, el anticuerpo se marca con un marcador detectable.

El marcador detectable puede ser un isótopo radiactivo.

El anticuerpo se puede modificar por adición de fármaco citotóxico o citostático.

La invención proporciona además un método para hacer una proteína o polipéptido de la invención, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

cultivar una célula huésped como se describe en el presente documento, de modo que exprese una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína o polipéptido; y aislar dicha proteína o polipéptido de dicha célula huésped o de un medio de cultivo en el que se cultiva dicho huésped.

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La invención también proporciona una proteína o polipéptido de la invención para usar como un medicamento.

La invención proporciona además el uso de una proteína o polipéptido de la invención, para fabricar un medicamento para acelerar la angiogénesis en la curación de heridas, trasplante de órganos o tejido, para el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria, cáncer, retinopatía diabética, trastornos pulmonares, insuficiencia cardiaca o enfermedad obstructiva crónica de las vías aéreas, síndromes de malabsorción del tracto intestinal, hígado o riñones, o para estimular la angiogénesis, linfangiogénesis y/o neovascularización.

La invención también proporciona un procedimiento para producir una forma truncada activada de una proteína o polipéptido como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de expresar un vector de expresión como se describe en el presente documento, y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado, para generar la forma truncada activada.

La invención proporciona además un procedimiento para regular la especificidad de unión al receptor de una proteína o polipéptido como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de expresar un vector de expresión como se describe en el presente documento, y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado, para generar la forma truncada activada.

La invención además proporciona un procedimiento para identificar un antagonista de una proteína o polipéptido de la invención, que comprende:

mezclar una preparación sustancialmente purificada de una forma truncada activada de una proteína o polipéptido como se describe en el presente documento, con un agente de ensayo; y

seguir, por cualquier medio adecuado, una inhibición en la actividad biológica de la proteína o polipéptido que tiene la capacidad de estimular y/o potenciar uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales.

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La invención también proporciona un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína o polipéptido de la invención, para usar como medicamento.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína o polipéptido de la invención, para fabricar un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, acumulación de fluidos o para inhibir la angiogénesis, linfangiogénesis y/o neovascularización.

La descripción incluye una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de identidad con al menos los nucleótidos 1 a 600 de la secuencia expuesta en la Figura 3 (SEQ ID NO:3), al menos los nucleótidos 1 a 966 de la secuencia expuesta en la Figura 5 (SEQ ID NO:5), al menos los nucleótidos 176 a 1288 de la secuencia expuesta en la Figura 7 (SEQ ID NO:7) o al menos los nucleótidos 938 a 1288 expuestos en la Figura 7 (SEQ ID NO:7). La secuencia de al menos los nucleótidos 1 a 600 de la secuencia expuesta en la Figura 3 o al menos los nucleótidos 1 a 966 de la secuencia expuesta en la Figura 5 codifica polipéptidos 5' truncados, denominados PDGF-D (formalmente denominados "VEGF-G"), mientras que al menos los nucleótidos 173 a 1288 de la secuencia expuesta en la Figura 7 (SEQ ID NO:7) codifican el PDGF-D de longitud entera. El PDGF-D es estructuralmente homólogo a PDGF-A, PDGF-B, VEGF, VEGF-B, VEGF-C y VEGF-D. La secuencia de al menos los nucleótidos 938 a 1288 expuesta en Figura 7 (SEQ ID NO:7) codifica una parte del dominio de homología de PDGF/VEGF, que es el fragmento bioactivo de PDGF-D. El fragmento bioactivo sería codificado también por la secuencia de al menos los nucleótidos 1 a 600 de la secuencia expuesta en la Figura 3 o al menos los nucleótidos 1 a 966 de la secuencia expuesta en la Figura 5. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico es un ADNc que comprende al menos los nucleótidos 1 a 600 de la secuencia expuesta en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), al menos los nucleótidos 1 a 966 de la secuencia expuesta en la Figura 5 (SEQ ID NO:5), al menos los nucleótidos 173 a 1288 de la secuencia expuesta en la Figura 7 (SEQ ID NO:7) o al menos los nucleótidos 938 a 1288 expuestos en la Figura 7 (SEQ ID NO:7). Este aspecto de la invención también abarca moléculas de ADN que tienen una secuencia de modo que hibrida en condiciones restrictivas con al menos los nucleótidos 1 a 600 de la secuencia expuesta en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), al menos los nucleótidos 1 a 966 de la secuencia expuesta en la Figura 5 (SEQ ID NO: 5), al menos los nucleótidos 173 a 1268 de la secuencia expuesta en la Figura 7 (SEQ ID NO:7) o al menos los nucleótidos 938 a 1288 expuestos en la Figura 7 (SEQ ID NO:7) o fragmentos de los mismos.

Los polipéptidos de la invención tienen la capacidad de estimular y/o potenciar la proliferación y/o diferenciación y/o crecimiento y/o movilidad de las células que expresan un receptor de PDGF-C, incluyendo, pero sin limitar, células endoteliales, miofibroblastos y células gliales, y comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 (SEQ ID NO:4) o Figura 6 (SEQ ID NO:6), o Figura 8 (SEQ ID NO:8), o un fragmento o análogo de la misma que tiene la capacidad de estimular la proliferación, diferenciación, migración y/o supervivencia de células endoteliales, y/o crecimiento y/o movilidad de células de tejido conjuntivo (tales como fibroblastos), miofibroblastos y células gliales. Preferiblemente, los polipéptidos tienen al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEQ ID NO:4) o Figura 6 (SEQ ID NO:6) o Figura 8 (SEQ ID NO: 8), o un fragmento o análogo de la misma que tiene la actividad biológica de PDGF-D. Un fragmento es una forma truncada de PDGF-D que comprende una parte del dominio de homología de PDGF/VEGF (PVHD) de PDGF-D. La parte de PVHD es de los restos 255-371 de la Figura 8, en la que el sitio de procesamiento proteolítico putativo RKSK empieza en el resto de aminoácido 255 (SEQ ID NO: 8). Sin embargo, el PVHD se extiende hacia el extremo N hasta el resto 235 de la Figura 8 (SEQ ID NO:8). En el presente documento, el PVHD se define como un PDGF-D truncado. El PDGF-D truncado es la forma activada putativa de PDGF-D.

Como se usa en esta solicitud, el porcentaje de identidad de secuencia se determina usando la herramienta de alineación "MEGALIGN" del paquete de Lasergene (DNASTAR, Ltd. Abacus House, Manor Road, West Ealing, London W130AS, Reino Unido. MEGALIGN se basa en el procedimiento de J. Hein (Methods in Enzymology, 1990, 183, 626-645). La tabla de pesos de 250 restos de PAM se usa con una penalización por hueco de 11 y una penalización por longitud de hueco de 3 y un valor de K-tuplas de 2 en los alineamientos en pares. El alineamiento después se refina manualmente, y se calcula el número de identidades en las regiones disponibles mediante una comparación.

El polipéptido o el polipéptido codificado por un polinucleótido puede tener la capacidad de estimular una o más de la proliferación, diferenciación, movilidad, supervivencia o permeabilidad vascular de células que expresan un receptor de PDGF-D incluyendo, pero sin limitar, células endoteliales vasculares, células endoteliales linfáticas, células de tejido conjuntivo (tales como fibroblastos), miofibroblastos y células gliales. El polipéptido o el polipéptido codificado por un polinucleótido puede tener la capacidad de estimular la curación de heridas. El PDGF-D también puede tener efectos antagonistas en células, pero están incluidos en las actividades biológicas del PDGF-D. Estas capacidades se denominan en lo sucesivo "actividades biológicas de PDGF-D" y se pueden ensayar fácilmente por procedimientos conocidos en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, el término "PDGF-D" se refiere de forma colectiva a polipéptidos de la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), Figura 6 (SEQ ID NO: 6) o Figura 8 (SEQ ID NO: 8), y fragmentos o análogos de los mismos que tienen actividad biológica de PDGF-D como se ha definido antes, y a un polinucleótido que puede codificar el PDGF-D, o un fragmento o análogo del mismo que tiene la actividad biológica de PDGF-D. El polinucleótido puede estar desnudo y/o en un vector o liposoma.

Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos:

PXCLLVXRCGGNCGC

(SEQ ID NO: 25)

que es única de PDGF-D y difiere de otros miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF/VEGF por la inserción de 3 restos de aminoácidos (NCG) entre la tercera y cuarta cisteínas (véase la Figura 9 - SEQ ID NO:
10-18).

Los polipéptidos pueden comprender sustituciones, inserciones o deleciones conservativas, pero los que todavía retienen la actividad biológica de PDGF-D se entiende claramente que están dentro del alcance de la invención. Los expertos en la materia serán conscientes de procedimientos que se pueden usar fácilmente para generar dichos polipéptidos, por ejemplo, el uso de mutagénesis dirigida o escisión y ligado enzimático específico. El experto en la materia también será consciente de que los compuestos peptidomiméticos o compuestos en los que uno o más restos de aminoácidos se sustituyen por un aminoácido no natural o un análogo de aminoácido, pueden retener los aspectos requeridos de la actividad biológica de PDGF-D. Dichos compuestos se pueden preparar fácilmente y se puede ensayar su capacidad para mostrar actividad biológica de PDGF-D mediante procedimientos de ensayo de actividad rutinarios, tales como un ensayo de proliferación de fibroblastos y también están dentro del alcance de la invención.

Además, las posibles formas variantes del polipéptido PDGF-D que pueden resultar del corte y empalme alternativos, como se sabe que ocurre con VEGF y VEGF-B, y variantes alélicas naturales de la secuencia de ácido nucleico que codifica el PDGF-D, están incluidas en el alcance de la invención. Las variantes alélicas son conocidas en la materia y representan formas alternativas o una secuencia de ácido nucleico que comprende sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, pero que no dan como resultado ninguna alteración funcional sustancial del polipéptido codificado.

Dichas formas variantes de PDGF-D se pueden preparar mediante localización de regiones no esenciales del polipéptido de PDGF-D para la modificación. Se espera que estas regiones no esenciales estén fuera de las regiones fuertemente conservadas indicadas en la Figura 9 (SEQ ID NOs: 10-18). En particular, los factores de crecimiento de la familia del PDGF, incluyendo PDGF-D, son dímeros. El PDGF-D difiere ligeramente de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, P1GF, PDGF-A y PDGF-B porque presenta conservación completa de solo 7 de los 8 restos cisteína en el PVHD (Olofsson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2576-2581; Joukov y col., EMBO J., 1996, 15, 290-298). Se cree que estas cisteínas están implicadas en la formación de enlaces disulfuro intra e intermoleculares. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad, que se forman por formación de enlace disulfuro intramolecular, están implicados en la unión de los receptores para la familia de factores de crecimiento PDGF/VEGF (Andersson y col., Growth Factors, 1995 12 159-164).

Los expertos en la materia son, por lo tanto, conscientes de que estos restos cisteína deben conservarse en cualquier forma variante propuesta, y que los sitios activos presentes en los bucles 1, 2 y 3 también deben conservarse. Sin embargo, se puede esperar que otras regiones de la molécula sean menos importantes para la función biológica, y por lo tanto ofrezcan dianas adecuadas para la modificación. En los polipéptidos modificados se puede ensayar fácilmente su capacidad para presentar actividad biológica de PDGF-D mediante procedimientos de ensayos de actividad rutinarios, tales como el ensayo de proliferación de fibroblastos.

Está contemplado que algunos polipéptidos de PDGF-D modificados tengan la capacidad de unirse a receptores de PDGF-D en células, incluyendo, pero sin limitar, células endoteliales, células del tejido conjuntivo, miofibroblastos y/o células gliales, pero no puedan estimular la proliferación, migración, movilidad o supervivencia celular o inducir proliferación vascular, desarrollo de tejido conjuntivo o curación de heridas. Se espera que estos polipéptidos modificados puedan actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de los polipéptidos de PDGF-D y factores de crecimiento de la familia de PDGF/VEGF, y ser útiles en situaciones en las que sea deseable la prevención o reducción de la acción del polipéptido PDGF-D o factores de crecimiento de la familia de PDGF/VEGF. Por lo tanto, también se describen dichas variantes del polipéptido de PDGF-D que se unen al receptor pero no mitogénicas, que no inducen diferenciación, no inducen migración, no inducen movilidad, no promueven supervivencia, no promueven tejido conjuntivo, no inducen la curación de heridas o la proliferación vascular, y se denominan en el presente documento "variantes que se unen al receptor aunque son inactivas". Debido a que el PDGF-D forma un dímero con el fin de activar su único receptor conocido, se contempla que un monómero comprende el polipéptido de PDGF-D modificado, variante que se une al receptor aunque es inactiva, y un segundo monómero comprende un PDGF-D intacto o un factor de crecimiento intacto de la familia de PDGF/VEGF. Estos dímeros se pueden unir a sus correspondientes receptores, pero no pueden inducir señalización secuencia abajo.

También está contemplado que hay otros polipéptidos de PDGF-D modificados que pueden prevenir la unión de un PDGF-D intacto o un factor de crecimiento intacto de la familia de PDGF/VEGF a su correspondiente receptor en células incluyendo, pero sin limitar, células endoteliales, células del tejido conjuntivo (tales como fibroblastos), miofibroblastos y/o células gliales. Por lo tanto, estos dímeros no podrán estimular la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o inducir la permeabilidad vascular de células endoteliales y/o estimular la proliferación y/o diferenciación y/o movilidad de células del tejido conjuntivo, miofibroblastos o células gliales. Se espera que estos polipéptidos modificados puedan actuar como inhibidores competitivos o no competitivos del factor de crecimiento PDGF-D o un factor de crecimiento de la familia de PDGF/VEGF, y ser útiles en situaciones en las que sea deseable la prevención o reducción de la acción del factor de crecimiento PDGF-D o factor de crecimiento de la familia de PDGF/VEGF. Dichas situaciones incluyen el remodelado de tejido que tiene lugar durante la invasión de células tumorales en una población de células normales por formación de tumor primario o metastático. Así pues, también se describen dichas variantes del factor de crecimiento PDGF-D que se unen al factor de crecimiento PDGF-D o la familia de PDGF/VEGF, pero no mitogénicas, que no inducen diferenciación, no inducen migración, no inducen movilidad, no promueven supervivencia, no promueven tejido conjuntivo, no inducen la curación de heridas o la proliferación vascular, y se denominan en el presente documento "variantes que interfieren o forman dímero con el factor de crecimiento PDGF-D aunque inactivas".

Un ejemplo de una variante que interfiere o forma dímero con el factor de crecimiento PDGF-D aunque inactiva, es cuando el PDGF-D tiene una mutación que evita la escisión del dominio CUB de la proteína. Se contempla además que se puede hacer una variante que interfiere o forma dímero con el factor de crecimiento PDGF-D aunque inactiva, que comprende un monómero, preferiblemente un monómero activado de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-C, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGFD o PIGF unido a un dominio CUB que tiene una mutación que previene la escisión del dominio CUB de la proteína. Los dímeros formados con las variantes que interfieren o forman dímero con el factor de crecimiento PDGF-D aunque inactivas mencionadas antes y los monómeros unidos al dominio CUB mutante, no serán capaces de unirse a sus correspondientes receptores.

Una variación que se contempla, sería insertar un sitio proteolítico entre un monómero activado de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-C, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGFD o PIGF y la unión al dominio CUB mutante, que dimeriza a un monómero activado de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-C, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGFD o PIGF. Una adición de la o las proteasas específicas para este sitio proteolítico escindiría el dominio CUB y liberaría así un dímero activado que después se puede unir a su receptor correspondiente. De esta forma, es posible la liberación controlada de un dímero activado.

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En el presente documento se describe un ácido nucleico aislado y purificado que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido. El ácido nucleico puede ser ADN, ADN genómico, ADNc o ARN, y puede ser monocatenario o bicatenario. El ácido nucleico se puede aislar de una célula o fuente de tejido, o de puede ser de origen recombinante o sintético. Debido a la degeneración del código genético, el experto en la materia apreciará que son posibles muchas de dichas secuencias codificantes, en las que cada secuencia codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4), Figura 6 (SEQ ID NO: 6) o Figura 8 (SEQ ID NO: 8), o un fragmento o análogo de la misma bioactivo, una variante que se une al receptor aunque inactiva o parcialmente inactiva o una variante del mismo que interfiere o forma dímero con el factor de crecimiento PDGF-D aunque inactiva.

En el presente documento se describen vectores que comprenden el ADNc de la invención o una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, y células huésped transformadas o transfectadas con moléculas de ácidos nucleicos o vectores de la invención. Estos pueden ser de origen eucariota o procariota. Estas células son particularmente adecuadas para la expresión del polipéptido de la invención, e incluyen células de insecto tales como células Sf9, que se pueden obtener en la American Type Culture Collection (ATCC SRL-171), transformadas con un vector baculovirus y la línea celular de riñón embrionario humano 293-EBNA transfectada por un plásmido de expresión adecuado. En el presente documento se describen vectores de expresión en los que un ácido nucleico de acuerdo con la invención se conecta operativamente a uno o más promotores adecuados y/u otras secuencias de control, de modo que las células huésped adecuadas transformadas o transfectadas con los vectores son capaces de expresar el polipéptido de la invención. Otros vectores son los adecuados para la transfección de células de mamífero, o para terapia génica, tal como vectores basados en adenovirus, vaccinia o retrovirus o liposomas. En la materia se conocen una variedad de dichos vectores.

En el presente documento se describe un procedimiento para hacer un vector capaz de expresar un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de conectar operativamente la molécula de ácido nucleico a uno o más promotores adecuados y/o secuencias de control, como se ha descrito antes.

También se describe en el presente documento, un procedimiento para hacer un polipéptido de acuerdo con la invención, que comprende las etapas de expresar un ácido nucleico o vector de la invención en una célula huésped y aislar el polipéptido de la célula huésped o del medio de cultivo de la célula huésped.

En el presente documento se describe un anticuerpo reactivo específicamente con un polipéptido de la invención o un fragmento del polipéptido. Esto incluye anticuerpos específicos para las formas variantes, fragmentos inmunorreactivos, análogos y recombinantes de PDGF-D. Dichos anticuerpos son útiles como inhibidores o agonistas de PDGF-D y como agentes de diagnóstico para detectar y cuantificar PDGF-D. Se pueden usar anticuerpos monoclonales y policlonales. Los anticuerpos monoclonales y policlonales se pueden preparar contra polipéptidos de la invención o fragmentos o análogos de los mismos, usando procedimientos estándar de la técnica. Además, el polipéptido se puede unir a un marcador de epítopo, tal como el octapéptido FLAG® (Sigma, St. Louis, MO), para ayudar a la purificación por afinidad. Para algunos propósitos, por ejemplo cuando se va a usar un anticuerpo monoclonal para inhibir los efectos de PDGF-D en una situación clínica, puede ser conveniente usar anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados. Dichos anticuerpos se pueden modificar más por adición de fármaco(s) citotóxico(s). Los procedimientos para producir estos, incluyendo los procedimientos de ADN recombinantes, son bien conocidos en la materia.

Esto también incluye un anticuerpo que reconoce el PDGF-D y está marcado de forma adecuada.

Los polipéptidos o anticuerpos se pueden marcar con un marcador detectable y usar con propósitos de diagnóstico. Igualmente, el polipéptido así marcado se puede usar para identificar su correspondiente receptor in situ. El polipéptido o anticuerpo se puede acoplar de forma covalente o no covalente a un agente de generación de imágenes supermagnético, paramagnético, de densidad de electrones, ecogénico o radiactivo. Para usar en ensayos de diagnóstico, se pueden usar marcadores radiactivos o no radiactivos. Los ejemplos de marcadores radiactivos incluyen un átomo o grupo radiactivo, tal como ^{125}I o ^{32}P. Los ejemplos de marcadores no radiactivos incluyen marcadores enzimáticos, tales como peroxidasa de rábano picante y marcadores fluorimétricos, tales como fluoresceína-5-isotiocianato (FITC). El marcaje puede ser directo o indirecto, covalente o no covalente.

Las aplicaciones clínicas descritas en el presente documento incluyen aplicaciones de diagnóstico, aceleración de la angiogénesis en trasplante de tejido u órgano, o estimulación de curación de heridas, o desarrollo de tejido conjuntivo, o para establecer la circulación colateral en tejido infartado o estenosis arterial, tal como la enfermedad arterial coronaria, e inhibición de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer o retinopatía diabética, e inhibición del remodelado de tejido que tiene lugar durante la invasión de células tumorales en una población de células normales por formación de tumores primarios o metastáticos. La cuantificación de PDGF-D en muestras de biopsia de cáncer, puede ser útil como indicador del riesgo metastático futuro.

El PDGF-D también puede ser importante para una variedad de afecciones de pulmón. Los ensayos de PDGF-D se podrían usar en el diagnóstico de trastornos pulmonares. El PDGF-D también podría usarse en el tratamiento de trastornos de pulmón para mejorar la circulación sanguínea en el pulmón y/o el intercambio gaseoso entre los pulmones y el torrente sanguíneo. Igualmente, el PDGF-D se podría usar para mejorar la circulación sanguínea al corazón y la permeabilidad del O_{2} gaseoso en casos de insuficiencia cardiaca. De una forma similar, el PDGF-D podría usarse para mejorar el flujo sanguíneo y el intercambio gaseoso en enfermedades obstructivas crónicas de las vías aéreas.

En el presente documento se describe un procedimiento de estimulación de la angiogénesis, linfangiogénesis, neovascularización, desarrollo de tejido conjuntivo y/o curación de heridas en un mamífero que necesite dicho tratamiento, que comprende la etapa de administrar una dosis eficaz de PDGF-D, o un fragmento o un análogo del mismo que tiene la actividad biológica de PDGF-D, a un mamífero. Opcionalmente, el PDGF-D o fragmento o análogo del mismo se puede administrar junto con o conjuntamente con uno o más de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, P1GF, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, FGF y/o heparina.

Por el contrario, se podrían usar los antagonistas de PDGF-D (p. ej., anticuerpos y/o inhibidores competitivos o no competitivos de la unión de PDGF-D tanto en la formación de dímero como en la unión al receptor) para tratar afecciones, tales como insuficiencia cardiaca congestiva, que implican la acumulación de fluido, por ejemplo, en el pulmón como resultado del aumento de la permeabilidad vascular, ejerciendo un efecto de compensación en la permeabilidad vascular, con el fin de contrarrestar la acumulación de fluido. La administración de PDGF-D podría usarse para tratar síndromes de malabsorción en el tracto intestinal, hígado o riñones, como resultado de sus actividades de aumento de la circulación sanguínea y aumento de la permeabilidad vascular.

En el presente documento, se describe un procedimiento para inhibir la angiogénesis, linfoangiogénesis, neovascularización, desarrollo del tejido conjuntivo y/o curación de heridas en un mamífero que necesite dicho tratamiento, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un antagonista de PDGF-D al mamífero. El antagonista puede ser cualquier agente que prevenga la acción del PDGF-D, previniendo la unión del PDGF-D a su correspondiente factor en la célula diana, o previniendo la activación del receptor, tal como usando variantes del PDGF-D de unión al receptor. Los antagonistas adecuados incluyen, pero sin limitar, anticuerpos dirigidos contra el PDGF-D; inhibidores competitivos o no competitivos de unión del PDGF-D al(los) receptor(es) del PDGF-D, tal como las variantes del PDGF-D que se unen al receptor o que forman dímero de PDGF-D pero no mitogénicas, a las que se ha hecho referencia antes; y secuencias de nucleótidos antisentido como se describe a continuación.

En el presente documento, se describe un procedimiento para determinar los agentes que se unen a una forma truncada activada del PDGF-D. El procedimiento comprende poner en contacto una forma truncada activada del PDGF-D con un agente de ensayo y hacer el seguimiento de la unión por cualquier adecuado. Los agentes pueden incluir tanto compuestos como otras proteínas.

También se describe un sistema de selección para descubrir agentes que se unen a una forma truncada inactivada del PDGF-D. El sistema de selección comprende preparar una forma truncada activada del PDGF-D, exponer la forma truncada activada del PDGF-D a un agente de ensayo, y cuantificar la unión de dicho agente a la forma truncada activada del PDGF-D por cualquier medio adecuado. Este sistema de selección también se puede usar para identificar agentes que inhiben la escisión proteolítica de la proteína de PDGF-D de longitud entera y por lo tanto, previene la liberación de la forma truncada activada del PDGF-D. Para este uso, se puede preparar el PDGF-D de longitud entera.

El uso del sistema de selección proporciona un medio para determinar compuestos que pueden alterar la función biológica del PDGF-D. Este procedimiento de selección se puede adaptar a procedimientos automáticos a gran escala, tales como un sistema PANDEX® (Baxter-Dade Diagnostics), que permite la selección eficaz de un alto volumen de potenciales agentes terapéuticos.

Para este sistema de selección, se prepara una forma truncada activada del PDGF-D o el PDGF-D de longitud entera como se describe en el presente documento, preferiblemente usando tecnología de ADN recombinante. Se introduce un agente de ensayo, p. ej., un compuesto o proteína en un recipiente de reacción que contiene la forma truncada activada o la de longitud entera del PDGF-D. La unión del agente de ensayo a la forma truncada activada o la de longitud entera del PDGF-D se determina por cualquier medio adecuado que incluye, pero sin limitar, el marcaje radiactivo o químico del agente de ensayo. La unión de la forma truncada activada o la de longitud entera del PDGF-D también se puede llevar a cabo por un procedimiento descrito en la patente de EE.UU. 5.585.277. En este procedimiento, la unión del agente de ensayo a la forma truncada activada o la de longitud entera del PDGF-D se evalúa siguiendo la relación de proteína plegada a proteína desplegada. Los ejemplos de este seguimiento pueden incluir, pero sin limitar, el seguimiento de la sensibilidad de la forma truncada activada o la de longitud entera del PDGF-D a una
proteasa, o de la facilidad de unión de la proteína por un anticuerpo específico contra el estado plegado de la proteína.

Los expertos en la materia reconocerán que los valores de CI_{50} dependen de la selectividad del agente ensayado. Por ejemplo, un agente con una CI_{50} que es menor que 10 nM, generalmente se considera que es un excelente candidato para la terapia de fármacos. Sin embargo, un agente que tiene una afinidad menor, pero es selectivo para una diana particular, puede ser un candidato incluso mejor. Los expertos en la materia reconocerán que cualquier información en relación con el potencial de unión, actividad inhibidora o selectividad de un agente particular, es útil frente al desarrollo de productos farmacéuticos.

Cuando se va a usar un PDGF-D o antagonista de PDGF-D para propósitos terapéuticos, la o las dosis y ruta de administración dependerán de la naturaleza del paciente y la afección que se va a tratar, y estarán determinados por el criterio del médico o veterinario que atiende. Las vías adecuadas incluyen la oral, inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, parenteral, aplicación tópica, implantes, etc. La aplicación tópica del PDGF-D se puede usar de una forma análoga al VEGF. Cuando se usa para curar heridas u otro uso en el que la angiogenesis potenciada es ventajosa, se administra una cantidad eficaz de la forma activa truncada del PDGF-D a un organismo que lo necesite, en una dosis entre aproximadamente 0,1 y 1000 \mug/kg de peso corporal.

El PDGF-D o antagonista de PDGF-D se puede usar en combinación con un vehículo farmacéutico adecuado. Las composiciones resultantes comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de PDGF-D o un antagonista de PDGF-D, y una sal del mismo no tóxica y farmacéuticamente aceptable, y un vehículo o adyuvante sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de dicho vehículo o adyuvante incluyen, pero no sin limitar, disolución salina, disolución salina tamponada, disolución de Ringer, aceite mineral, talco, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro sódico, ácido algínico, dextrosa, agua, glicerol, etanol, espesantes, estabilizantes, agentes de suspensión y combinaciones de los mismos. Dichas composiciones pueden estar en forma de disoluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, cremas, bálsamos, elixires, jarabes, obleas, pomadas u otras formas convencionales. La formulación se adecúa al modo de administración. Las composiciones que comprenden PDGF-D pueden comprender además opcionalmente uno o más de PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, VEGF, VEGFB, VEGF-C, VEGF-D, PIGF y/o heparina. Las composiciones que comprenden PDGF-D contendrán de aproximada-
mente 0,1% a 90% en peso del o de los compuestos activos, y más generalmente de aproximadamente 10% a 30%.

Para preparaciones intramusculares, una formulación estéril, preferiblemente una forma de sal soluble adecuada de la forma activa truncada del PDGF-D, tal como la sal de hidrocloruro, se puede disolver y administrar en un diluyente farmacéutico tal como agua exenta de pirógenos (destilada), disolución salina fisiológica o disolución de glucosa al 5%. Una forma insoluble adecuada del compuesto se puede preparar y administrar en forma de una suspensión en una base acuosa o una base de aceite farmacéuticamente aceptable, p. ej., un éster de un ácido graso de cadena larga, tal como oleato de etilo.

En el presente documento se describen dispositivos de diagnóstico/pronóstico normalmente en forma de kits de ensayo. Por ejemplo, un kit de ensayo de diagnóstico/pronóstico comprende un anticuerpo contra PDGF-D y un medio para detectar, y más preferiblemente evaluar, la unión entre el anticuerpo y el PDGF-D. En uno de dichos dispositivos de diagnóstico/pronóstico se proporciona un segundo anticuerpo (el anticuerpo secundario) dirigido contra anticuerpos del mismo isotipo y fuente animal que el anticuerpo dirigido contra el PDGF-D (el anticuerpo primario). El anticuerpo secundario se acopla directa o indirectamente a un marcador detectable, y después un anticuerpo primario no marcado o PDGF-D se une al sustrato, de forma que la interacción de PDGF-D/anticuerpo primario se puede establecer determinando la cantidad de marcador unido al sustrato por seguimiento de la unión entre el anticuerpo primario y el PDGF-D y la posterior unión del anticuerpo secundario marcado al anticuerpo primario. El dispositivo de diagnóstico/pronóstico se puede proporcionar en forma de un kit de ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA) convencional.

Un dispositivo de diagnóstico/pronóstico puede comprender medios para la reacción en cadena de la polimerasa para establecer diferencias de secuencia de un PDGF-D de un sujeto de ensayo, y comparar esta estructura de secuencia con la descrita en esta solicitud con el fin de detectar cualquier anomalía, con vista a establecer si alguna aberración en la expresión de PDGF-D está relacionada con un estado patológico dado.

Además, un dispositivo de diagnóstico/pronóstico puede comprender un medio de generación de polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) usando enzimas de restricción y ADN genómico de un individuo de ensayo para generar un patrón de bandas de ADN en un gel y comparar este patrón con el descrito en esta solicitud con el fin de detectar cualquier anomalía, en vista a establecer si alguna aberración en la expresión del PDGF-D está relacionada con un estado patológico dado.

En el presente documento también se describe un procedimiento para detectar aberraciones en la estructura génica del PDGF-D en un sujeto de ensayo, que puedan estar asociadas con un estado patológico en el sujeto de ensayo. Este procedimiento comprende proporcionar una muestra de ADN de dicho sujeto de ensayo; poner en contacto la muestra de ADN con un conjunto de cebadores específico de un ADN de PDGF-D operativamente acoplado a una polimerasa y amplificar selectivamente el ADN del PDGF-D de la muestra por reacción en cadena de la polimerasa, y comparar la secuencia de nucleótidos del ADN del PDGF-D amplificado de la muestra con las secuencias de nucleótidos mostradas en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3), Figura 5 (SEQ ID NO: 5) o Figura 7 (SEQ ID NO: 7). El kit de ensayo puede comprender además una pareja de cebadores específicos para el ADN del PDGF-D operativamente acoplado a una polimerasa, en el que dicha polimerasa es capaz de amplificar selectivamente el ADN del PDGF-D a partir de una muestra de ADN.

También se describe un procedimiento para detectar el PDGF-D en una muestra biológica, que comprende la etapa de poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de unirse al PDGF-D, y detectar la unión. Preferiblemente, el reactivo capaz de unirse al PDGF-D es un anticuerpo dirigido contra el PDGF-D, en particular un anticuerpo monoclonal. La unión y/o extensión de la unión se detecta mediante un marcador detectable; más adelante se discuten marcadores adecuados.

En el presente documento se describe un dímero de proteína que comprende el polipéptido del PDGF-D, en particular un dímero unido por disulfuro. Los dímeros de proteína pueden incluir tanto homodímeros del polipéptido de PDGF-D como heterodímeros de PDGF-D y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDGF-A, PDGF-B o PDGF-C.

En el presente documento se describe un procedimiento para aislar el PDGF-D, que comprende la etapa de exponer una célula que expresa el PDGF-D a heparina para facilitar la liberación del PDGF-D de la célula, y purificar el PDGF-D así liberado.

Un procedimiento adicional descrito en el presente documento, implica proporcionar un vector que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que es complementaria a al menos una parte de una secuencia de ADN que codifica el PDGF-D o un fragmento o análogo del mismo, que tiene la actividad biológica de PDGF-D. Además, la secuencia de nucleótidos antisentido puede ser de la región del promotor del gen del PDGF-D u otra región no codificante del gen que se pueda usar para inhibir, o al menos mitigar, la expresión del PDGF-D.

Dicho vector que comprende una secuencia antisentido se puede usar para inhibir, o al menos mitigar, la expresión del PDGF-D. El uso de un vector de este tipo para inhibir la expresión del PDGF-D está favorecido en casos en los que la expresión del PDGF-D está asociada con una enfermedad, por ejemplo, cuando los tumores producen PDGF-D con el fin de proporcionar angiogénesis, o el remodelado de tejido que tiene lugar durante la invasión de células tumorales en una población de células normales por la formación de tumor primario o metastático. La transformación de dichas células tumorales con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos antisentido suprimiría o retardaría la angiogénesis, y por lo tanto inhibiría o retardaría el crecimiento del tumor o remodelado de tejido.

También se describe en el presente documento el descubrimiento de que la proteína de PDGF-D de longitud entera es probable que sea un factor de crecimiento latente que necesita ser activado por procesamiento proteolítico para liberar un dominio de homología de PDGF/VEGF activo. Se encuentra un sitio proteolítico putativo en los restos 255-258 en la proteína de longitud entera, restos -RKSK- (SEQ ID NO: 9). Este es un patrón dibásico. El sitio proteolítico putatitvo de -RKSK- (SEQ ID NO: 9) también se encuentra en PDGF-A, PDGF-B, VEGF-C y VEGF-D. En estas 4 proteínas, el sitio proteolítico putativo también se encuentra justo antes del dominio mínimo para el dominio de homología de PDGF/VEGF. Estos hechos en conjunto indican que este es el sitio proteolítico.

Las proteasas incluyen, pero sin limitar, plasmina, Factor X y enteroquinasa. El dominio CUB N-terminal puede funcionar como un dominio inhibidor que se puede usar para guardar el PDGF-D en una forma latente en algún compartimento extracelular y que se elimina por proteolisis limitada cuando es necesario el PDGF-D.

En el presente documento se describe un procedimiento para producir una forma truncada activada del PDGF-D o para regular la especificidad de unión al receptor del PDGF-D. Estos procedimientos comprenden las etapas de expresar un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de PDGF-D y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado, para generar la forma truncada activada del PDGF-D.

Se describe un procedimiento para activar selectivamente un polipéptido que tiene una actividad de factor de crecimiento. Este procedimiento comprende la etapa de expresar un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de factor de crecimiento, un dominio CUB y un sitio proteolítico entre el polipéptido y el dominio CUB, y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado para generar el polipéptido activado que tiene una actividad de factor de crecimiento.

En el presente documento se describe el aislamiento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene la actividad biológica de PDGF-D y un polipéptido del mismo que comprende el sitio proteolítico que tiene la secuencia de aminoácidos RKSK (SEQ ID NO: 9) o una secuencia de aminoácidos estructuralmente conservada de la misma.

También se describe en el presente documento un dímero aislado, que comprende un monómero activado del PDGF-D y un monómero activado de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-D, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C o PIGF unido a un dominio CUB, o alternativamente, un monómero activado de VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-D, PDGF-A, PDGF-B o PIGF y un monómero activado de PDGF-D unido a un dominio CUB. El dímero aislado puede o no incluir un sitio proteolítico entre el monómero activador y la unión al dominio CUB.

Los polinucleótidos tales como los descritos antes, fragmentos de esos polinucleótidos y variantes de esos polinucleótidos con suficiente similitud con la cadena no codificante de esos polinucleótidos para hibridar con estos en condiciones restrictivas, son todos útiles para identificar, purificar y aislar polinucleótidos que codifican otras formas de mamífero, no humanas, del PDGF-D. Las siguientes son condiciones de hibridación restrictivas de ejemplo: hibridación a 42ºC en 5X SSC, NaPO_{4} 20 mM, pH 6,8, formamida al 50%; y lavado a 42ºC en 0,2X SSC. Los expertos en la materia entienden que es conveniente variar estas condiciones basadas empíricamente en la longitud y el contenido de bases de nucleótidos GC de las secuencias que van a hibridar, y que existen fórmulas para determinar dicha variación. Véase por ejemplo, Sambrook y col, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, páginas 9.97-9.51, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Además, los polinucleótidos aislados y purificados que codifican otras formas de PDGF-D de mamífero, no humanas, también son aspectos de la invención, como los son los polipéptidos codificados por ellos y anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con las variantes de PDGF-D no humanas. Por lo tanto, la invención incluye un polipéptido de PDGF-D de mamífero aislado y purificado y también un polinucleótido aislado y purificado que codifica dicho polipéptido.

Se entenderá claramente que los ácido nucleicos y polinucleótidos de la invención se pueden preparar por medios sintéticos o por medios recombinantes, o se pueden purificar de fuentes naturales.

Se entenderá claramente que para los propósitos de esta memoria descriptiva, la palabra "que comprende" significa "incluido pero no limitado". Se aplica el significado correspondiente a la palabra "comprende".

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Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 (SEQ ID NO: 1) muestra una secuencia de nucleótidos que incluye una secuencia del ADNc que codifica la parte C-terminal del PDGF-D humano (hPDGF-D). Los nucleótidos que codifican el fragmento parcial del hPDGF-D son del 1 al 198;

la fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos parcial deducida del hPDGF-D (66 restos de aminoácidos- SEQ ID NO: 2) derivada de los nucleótidos 1 al 198 de la figura 1;

la fig. 3 (SEQ ID NO: 3) muestra una secuencia extendida de un ADNc humano parcial que codifica el hPDGF-D. La secuencia de ADNc traducida es de los nucleótidos 1 al 600;

la fig. 4 muestra la secuencia de aminoácidos parcial deducida del hPDGF-D (200 restos de aminoácidos-SEQ ID NO: 4) derivada de los nucleótidos 1 al 600 de la figura 3;

la fig. 5 muestra también otra secuencia extendida de nucleótidos de un ADNc humano parcial. Los nucleótidos que codifican el hPDGF-D de longitud entera truncado en 5' son del 1 al 966 (SEQ ID NO: 5);

la fig. 6 muestra la secuencia de aminoácidos parcial deducida del hPDGF-D (322 restos-SEQ ID NO: 6) derivada de los nucleótidos 1 al 966 de la figura 5;

la fig. 7 (SEQ ID NO: 7) muestra la secuencia de nucleótidos completa del ADNc que codifica un hPDGF-D (1116 pb) y

la fig. 8 muestra la secuencia de aminoácidos deducida del hPDGF-D de longitud entera codificada por el mismo, que consiste en 371 restos de aminoácido (SEQ ID NO: 8);

la fig. 9 muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos del dominio de homología de PDGF/VEGF en el hPDGF-D con varios factores de crecimiento que pertenecen a la familia de PDGF/VEGF (SEQ ID NO: 10-18, respectivamente);

la fig. 10 muestra un árbol filogenético de varios factores de crecimiento que pertenecen a la familia de PDGF/
VEGF;

la fig. 11 proporciona el alineamiento de la secuencia de aminoácidos del dominio CUB presente en el hPDGF-D (SEQ ID NO: 19) y otros dominios CUB presentes en la proteína morfogénica ósea humana 1 (hBMP-1, dominios CUB CUB1-3) (SEQ ID NO: 20-22, respectivamente) y en la neuropilina humana (2 dominios CUB) (SEQ ID NO: 23-24, respectivamente);

la fig. 12 muestra que el medio condicionado (CM) que contiene el PDGF-D truncado estimula la fosforilación de la tirosina de los receptores beta del PDGF-D en células PAE-1; y

la fig. 13 proporciona una representación gráfica de los resultados que muestran que el medio condicionado (CM) que contiene el PDGF-D truncado compite por la unión con los homodímeros PDGF-BB para los receptores beta de PDGF-D, pero no con los homodímeros PDGF-AA para los receptores alfa del PDGF.

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Descripción detallada de realizaciones preferidas

La figura 1 muestra una secuencia de nucleótidos de ADNc humano que codifica una parte C-terminal de un nuevo factor de crecimiento, denominado en el presente documento PDGF-D (antes VEGF-G). El PDGF-D es un nuevo miembro de la familia de PDGF/VEGF. La secuencia de nucleótidos de la figura 1 (SEQ ID NO: 1) se obtuvo de una secuencia EST humana (id. AA488780) en la base de datos dbEST en el NCBI en Washington, DC. Los nucleótidos 1 a 198 del ADNc de la figura 1 (SEQ ID NO: 1) codifica un polipéptido de 66 aminoácidos (Figura 2-SEQ ID NO: 2) que muestra algo de similitud de secuencia con los miembros conocidos de la familia de PDGF/VEGF.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por los nucleótidos 1 a 198 del polinucleótido de la figura 1 (SEQ ID NO: 1) se muestra en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2).

Para generar más información de la secuencia del PDGF-D humano, se cribó una genoteca de ADNc de \lambdagt10 de pulmón fetal humano, usando una sonda generada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de 327 pb, basado en la secuencia de EST identificada originalmente. La sonda se generó a partir del ADN de una genoteca de ADNc de pulmón fetal humano disponible en el comercio (Clontech) que se amplificó por PCR usando 2 cebadores derivados del EST identificado (AI488780). Los cebadores eran:

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	5'-GTCGTGGAACTGTCAACTGG	(directo)	(SEQ ID NO: 26) y
	5'-CTCAGCAACCACTTGTGTTC	(inverso)	(SEQ ID NO: 27).

El fragmento de 327 pb amplificado se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen). La secuenciación de nucleótidos verificó que el inserto correspondía a EST. El cribado identificó varios clones positivos. Los insertos de 2 de estos clones, los clones 5 y 8, se subclonaron en pBluescript y se sometieron a secuenciación de nucleótidos usando cebadores internos o específicos del vector. Las secuencias de nucleótidos determinadas eran idénticas en ambos clones, y se muestran en la Figura 3 (SEQ ID NO: 3). La región codificante del polinucleótido de 690 pb son los nucleótidos 1-600 (SEQ ID NO: 3) que codifica una parte grande del hPDGF-D con excepción del extremo 5'. Esta parte del hPDGF-D incluye el fragmento bioactivo del hPDGF-D. La secuencia de aminoácidos parcial deducida de hPDGF-D (200 restos-SEQ ID NO: 4) derivada de los nucleótidos 1 a 600 de la Figura 3 (SEQ ID NO: 3) se muestra en la Figura 4 (SEQ ID NO: 4).

La secuenciación de nucleótidos extendida de los clones de ADNc del PDGF-D humano de esta genoteca de ADNc de pulmón fetal humano ha proporcionado una secuencia adicional. La Figura 5 (SEQ ID NO: 5) muestra una secuencia de nucleótidos de un ADN humano parcial (1934 pb) que codifica el hPDGF-D. La región que codifica el polinucleótido de 1934 pb son los nucleótidos 1 a 966 que codifican el hPDGF-D excepto el extremo 5' del polipéptido. La secuencia de aminoácidos parcial deducida del hPDGF-D (322 restos-SEQ ID NO: 6) derivada de los nucleótidos 1 a 966 de la Figura 5 (SEQ ID NO: 5) se muestra en la Figura 6 (SEQ ID NO: 6).

La Figura 7 (SEQ ID NO: 7) muestra la secuencia de polinucleótidos del ADNc que codifica un hPDGF-D de longitud entera. La región que codifica el PDGF-D tiene 1116 pb. La secuencia de aminoácidos deducida del hPDGF-D de longitud entera es de 371 restos de aminoácido (SEQ ID NO: 8).

La secuencia del extremo 5' del PDGF-D de longitud entera se obtuvo usando la PCR para amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), y clones que contenían ADNc de corazón humano (Marathon-ReadyTM cDNA, Clontech, nº cat. 7404-1). Estos clones de ADNc tienen una secuencia adaptadora unida al extremo 5' de cada clon, que incluye un sitio para el cebador llamado Cebador adaptador 1 (Clontech: 5'9 CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 3'9) (SEQ ID NO:_28). Este cebador y un segundo cebador 5' AGTGGGATCCGTTACTGA TGGAGAGTTAT 3' (SEQ ID NO: 29) se usaron para amplificar la secuencia encontrada en el extremo 5' del PDGF-D. En la reacción de la PCR se usó una mezcla de polimerasa especial (Advantage <<-GC cDNA PCR Kit, Clontech, nº cat. K1907-1). La mezcla de reacción incluía (en microlitros):

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El extremo 5' del PDGF-D se amplificó durante 31 ciclos, 5 ciclos consistían en 45 s de desnaturalización a 94ºC y 4 min de extensión a 72ºC, 5 ciclos consistían en 45 s de desnaturalización a 94ºC y 4 min de extensión a 70ºC, y 5 ciclos consistían en 45 s de desnaturalización a 94ºC y 4 min de extensión a 68ºC, y una etapa inicial de desnaturalización a 99ºC durante 2 min. A partir de esta PCR, se obtuvo un producto de aproximadamente 790 pb de longitud. Este producto se llevó a un gel de agarosa al 1%, se purificó (kit de gel de extracción QIAquick, Qiagen, nº cat. 28706) del gel, se clonó en un vector (kit de clonación TOPO TA, Invitrogen) y se transformó en bacterias (E. Coli). Las bacterias transformadas se cultivaron en placa y se incubaron a 37ºC durante la noche. Se cogieron colonias individuales y se cultivaron en medio de nueva aportación durante la noche. Los plásmidos se prepararon (kit QIAprep Spin Miniprep, Qiagen, nº cat. 27106) y se secuenciaron con los cebadores plasmídicos, T7 y M13R. El resultado de esta secuenciación fue que se obtuvieron 312 pb de secuencia de PDGF-D previamente desconocida. El resto de la secuencia (478 pb) era idéntica a la secuencia obtenida previamente a partir de otros clones de ADNc del PDGF-D.

La figura 9 muestra el alineamiento de secuencias de aminoácidos del dominio de homología de PDGF/VEGF del PDGF-D (encontrado en la región C-terminal del polipéptido) con los dominios de homología de PDGF/VEGF de miembros de la familia de PDGF/VEGF, VEGF_{165}, PlGF-2, VEGF-B_{167}, Pox Orf VEGF, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-A y PDGF-B (SEQ ID NO: 10-18, respectivamente). Algunas de las secuencias de aminoácidos en las regiones N y C-terminales en VEGF-C y VEGF-D se han suprimido en esta figura. Se introdujeron huecos para optimizar el alineamiento. Este alineamiento se generó usando la herramienta de alineamiento MEGALIGN basada en el procedimiento de J. Hein, (Methods Enzymol. 1990, 183, 626-45) La tabla de pesos PAM de 250 restos se usa con una penalización por hueco de 11 y una penalización por longitud de hueco de 3 y un valor de K-tuplas de 2 en los alineamientos en pares. El alineamiento después se refina manualmente, y se calcula el número de identidades en las regiones disponibles para una comparación. Los restos encuadrados indican aminoácidos que se corresponden con el VEGF-D en 2 unidades de distancia.

El alineamiento muestra que PDGF-D tiene el patrón esperado de restos cisteína invariantes, una marca de los miembros de esta familia, con 2 excepciones. La primera excepción ocurre entre la cisteína 3 y 4. Normalmente estas 2 cisteínas están separadas por 2 restos y con el PDGF-D hay una inserción de 3 aminoácidos extra (NCA). Esta característica de la secuencia en el PDGF-D fue inesperada. La segunda es que la quinta cisteína invariante encontrada en los otros miembros de la familia de PDGF/VEGF no se conservaba en el PDGF-D. Esta característica es única del PDGF-D.

Basándose en los alineamientos de secuencias de aminoácidos en la figura 9, se construyó un árbol filogenético y se muestra en la figura 10. Los datos muestran que el PVDH del PDGF-D está estrechamente relacionado con los PVDH del VEGF-C y VEGF-D.

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Dominio CUB

La región N-terminal de la secuencia de aminoácidos parcial del PDGF-D de la figura 11 (restos 54-171) (SEQ ID NO: 8) tiene un segundo dominio de proteína distinto que se denomina dominio CUB (Bork y Beckmann, J. Mol. Biol., 1993, 231, 539-545). Este dominio de aproximadamente 115 aminoácidos se identificó originalmente en factores de complemento Clr/Cls, pero recientemente se ha identificado en varias otras proteínas extracelulares incluyendo moléculas de señalización tales como la proteína morfogénica ósea 1 (BMP-1) (Wozney y col., Science, 1988 242, 1528-1534) así como en varias moléculas receptoras tales como neuropilina-1 (NP-1) (Soker y col., Cell, 1998, 92, 735-745). Las funciones de los dominios CUB no están claras pero podrían participar en interacciones de proteína-proteína o en interacciones con carbohidratos incluyendo proteoglucano de sulfato de heparina. Estas interacciones pueden tener una función en la activación proteolítica del PDGF-D.

Como se muestra en la figura 11, se alinearon las secuencias de aminoácidos de varias proteínas que contienen CUB. Los resultados muestran que el único dominio CUB en el PDGF-D humano (SEQ ID NO: 19) presenta una identidad significativa con los dominios CUB más estrechamente relacionados. Se muestran las secuencias de BMP-1, con 3 dominios CUB (CUB 1-3) (SEQ ID NO: 20-22, respectivamente) y la neuropilina-1 humana con 2 dominios CUB (CUB 1-2) (SEQ ID NO: 23-24, respectivamente). Este alineamiento se generó como se ha descrito
antes.

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Ejemplo 1 Expresión de transcritos de PDGF-D

Para investigar la expresión tisular del PDGF-D en varios tejidos humanos, se hizo una transferencia Northern usando una transferencia Multiple Tissue Northern (MTN, Clontech) comercial. Las transferencias se hibridaron de acuerdo con las instrucciones del proveedor usando disolución ExpressHyb a 68ºC durante 1 hora (condiciones de restricción alta), y se hibridaron con la sonda de 327 pb generada por PCR a partir de la genoteca de ADNc de pulmón fetal humano (véase la descripción anterior). Las transferencias posteriormente se lavaron a 50ºC en 2X SSC con SDS al 0,05% durante 30 minutos y a 50ºC en 0,1X SSC con SDS al 0,1% durante 40 minutos adicionales. Después las transferencias se pusieron sobre una película y se expusieron a -70ºC. Los resultados, resumidos en la tabla 1, mostraron que la expresión de los transcritos de PDGF-D eran más abundantes en el corazón, páncreas y ovario, mientras que se observaron niveles menores en la placenta, hígado, riñón, próstata y testículos. El transcrito de PDGF-D humano era aproximadamente de 4 kb de longitud.

TABLA 1 Niveles de expresión relativos de los transcritos de PDGF-D en varios tejidos humanos determinado por análisis de transferencia Northern

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Ejemplo 2 Propiedades de unión al receptor de un PGDF-D truncado

Para evaluar las interacciones entre un PDGF-D truncado y los receptores de VEGF, se ensayó la capacidad del PDGF-D truncado para unirse a proteínas de fusión con Ig solubles, que contenían los dominios extracelulares de VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 humanos (Olofsson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 11709-11714). Se generó un vector de expresión que codificaba el dominio de homología de PDGF/VEGF del PDGF-D en el vector pSecTag (Invitrogen). Se usaron los cebadores 5'-CCCAAGCTTGAAGATCTTGAGAATAT 3' (directo) (SEQ ID NO: 30) y 5'-TGCTCTAGATCGAGGTGGTCTT 3' (inverso) (SEQ ID NO: 31) para amplificar un fragmento de 429 pb (nucleótidos 556 a 966 en la Figura 5) (SEQ ID NO: 5) que codifica los restos de aminoácidos 186 a 322 de la Figura 6 (SEQ ID NO: 6). Posteriormente el fragmento se clonó en un vector de expresión hecho digerir con HindIII y XbaI. Se transfectaron células COS con el vector de expresión que codifica el PDGF-D truncado o un vector de control, usando precipitación con fosfato cálcico. El polipéptido expresado incluía un marcador c-myc C-terminal y un marcador 6X His (ambos derivados del vector pSecTag).

Las proteínas de fusión con Ig, denominadas VEGFR-1-Ig, VEGFR-2-Ig y VEGFR-3-Ig, se expresaron transitoriamente en células 293 EBNA humanas. Todas las proteínas de fusión con IG eran VEGFR humanos. Las células se incubaron durante 24 horas después de la transfección, se lavaron con medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,2% y se privaron de alimento durante 24 horas. Las proteínas de fusión después se hicieron precipitar del medio condicionado clarificado usando perlas de proteína A-Sepharosa (Pharmacia). Estas perlas se combinaron con 100 microlitros de 10X tampón de unión (BSA al 5%, Tween 20 al 0,2% y heparina 10 \mug/ml) y 900 microlitros de medio condicionado preparado a partir de células COS transfectadas con el vector de expresión para el PDGF-D truncado o el vector de control. Después, las células se marcaron metabólicamente con ^{35}S-cisteína y metionina (Promix, Amersham) durante 4 a 6 horas. Después de 2,5 horas, a temperatura ambiente, las perlas de Sepharosa se lavaron 3 veces con tampón de unión a 4ºC, una vez con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y se hirvieron en tampón de SDS-PAGE. Las proteínas marcadas que se habían unido a las proteínas de fusión con Ig se analizaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas radiomarcadas se detectaron usando un analizador PhosphorImager y/o sobre película. En todos estos análisis, el PDGF-D radiomarcado no mostró ninguna interacción con ninguno de los receptores de VEGF. Estos resultados indican que el PDGF-D truncado secretado no se une a los receptores de VEGF R1, R2 y R3.

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Ejemplo 3 Fosforilación del receptor beta del PDGF-D

Para ensayar si el PDGF-D produce aumento de fosforilación del receptor beta del PDGF-D, se ensayó la capacidad del PDGF-D truncado para unirse al receptor beta del PDGF-D y estimular la mayor fosforilación. Células endoteliales aórticas porcinas 1 (PAE-1) privadas de suero que expresaban establemente el receptor beta de PDGF-D humano Eriksson y col., EMBO J., 1992, 11, 543-550) se incubaron sobre hielo durante 90 minutos con una disolución de medio condicionado mezclado con un volumen igual de PBS complementado con BSA 1 mg/ml. El medio condicionado se preparó a partir de células COS transfectadas con vectores de expresión para PDGF-A o PDGF-D truncado (como se hace en el ejemplo 1), o un vector de control simulado. Veinticuatro horas después de transfección, el medio se sustituyó por medio exento de suero que contenía albúmina de suero 1 mg/ml. El medio condicionado se recogió después de 48 horas adicionales de incubación. Sesenta minutos después de la adición del medio condicionado, las células se lisaron en tampón de lisis (tris-HCl 20 mM pH 7,5, Triton X-100 al 0,5%, ácido desoxicólico al 0,5%, EDTA 10 mM, ortovanadato 1 mM, PMSF 1 mM, Trasilol al 1%). Los receptores beta del PDGF beta se hicieron inmunoprecipitar de los lisatos clarificados con antisuero de conejo contra el receptor beta de PDFG humano (Eriksson y col., EMBO J., 1992 11 543-550). Los receptores precipitados se aplicaron a un gel de SDS-PAGE. Después de la electroforesis en gel de SDS, los receptores precipitados se transfirieron a filtros de nitrocelulosa, y los filtros se hibridaron con anticuerpo antifosfotirosina PY-20 (Transduction Laboratories). Después, los filtros se incubaron con anticuerpos anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los anticuerpos unidos se detectaron usando quimioluminiscencia potenciada (ECL. Amesham Inc). Después, los filtros se separaron y se volvieron a hibridar con el antisuero de conejo de receptor beta de PDGF, y la cantidad de receptores se determinó por incubación con anticuerpos anti-conejo conjugados con peroxidasa de rábano picante. Los anticuerpos unidos se detectaron usando quimioluminiscencia potenciada (ECL. Amesham Inc). La hibridación de los filtros con anticuerpos del receptor beta del PDGF confirmó que había cantidades iguales del receptor en todas las calles. Las células humanas no tratadas y tratadas con PDGF-BB recombinantes (100 ng/ml) se incluyeron en el experimento como un control. La figura 11 muestra que el medio condicionado que contenía PDGF-D truncado, estimulaba la fosforilación de la tirosina del receptor beta del PDGF. Esto indicaba que el PDGF-D truncado es un ligando/agonista del receptor beta del PDGF-D.

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Ejemplo 4 Ensayo de unión competitivo

Después, se ensayó la capacidad del PDGF-D truncado para unirse al receptor beta de PDGF humano, analizando su capacidad para competir con PDGF-BB por la unión al receptor beta del PDGF. Los experimentos de unión se realizaron en células endoteliales aórticas porcinas 1 (PAE-1) que expresaban establemente los receptores alfa y beta del PDGF humano, respectivamente (Eriksson y col., EMBO J., 1992, 11, 543-550). Los experimentos de unión se hicieron esencialmente como en Heldin y col. (EMBO J., 1988, 7, 1387-1393). Se diluyó medio condicionado de células COS que expresaban PDGF-A, PDGF-D truncado, o control simulado, respectivamente, con un volumen igual de BSA/PBS y se mezclaron con 100 ng/ml de ^{125}I-PDGF-BB (ligando del receptor beta) o de ^{125}I-PDGF-AA (ligando del receptor alfa) en tampón de unión (PBS que contenía BSA 1 mg/ml). Se analizaron dos grupos separados de medios condicionados de estas células COS. Se incubaron partes alícuotas con las células PAE-1 que expresaban el receptor cultivadas en placas de cultivo de 24 pocillos en hielo, durante 90 minutos. Después de 3 lavados con tampón de unión, se extrajo el ^{125}I-PDGF-BB o ^{125}I-PDGF-AA unido a célula por lisis de las células en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%. La cantidad de radiactividad unida a células se determinó en un contador gamma. La figura 12 proporciona una representación gráfica de los resultados, que muestran que el medio condicionado que contenía PDGF-D truncado compite por la unión con los homodímeros de PDGF-BB por los receptores beta del PDGF, pero no con los homodímeros de PDGF-AA por los receptores alfa del PDGF.

El PDGF-D no se une a ninguno de los receptores de VEGF conocidos. El PDGF-D es el único miembro de la familia de VEGF, que puede unirse a y aumentar la fosforilación del receptor beta del PDGF. Estas características indican que la forma truncada del PDGF-D no puede ser un miembro de la familia de VEGF, sino que es un nuevo PDGF. Además, la proteína de longitud entera es probable que sea un factor de crecimiento latente que necesita ser activada por procesamiento proteolítico para liberar el dominio de homología de PDGF/VEGF activo. El dominio CUB N-terminal puede ser expresado como un dominio inhibidor que se puede usar para localizar este factor de crecimiento latente en algún compartimento extracelular (por ejemplo, la matriz extracelular), y que se escinde por proteolisis limitada cuando es necesario, por ejemplo, durante el desarrollo embrionario, regeneración de tejido, remodelado de tejido incluyendo remodelado óseo, angiogénesis activa, avance de tumor, invasión de tumor, formación de metástasis y/o curación de heridas.

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Bioensayos para determinar la función del PDGF-D

Se llevan a cabo ensayos para evaluar si el PDGF-D tiene actividades similares a PDGF-A, PDGF-B, VEGF, VEGFB, VEGF-C y/o VEGF-D, en relación con el crecimiento y/o movilidad de células de tejido conjuntivo, fibroblastos, miofibroblastos y células gliales; con la función de células endoteliales; con la angiogénesis; y con la curación de heridas. Se pueden llevar a cabo más ensayos dependiendo de los resultados de los estudios de distribución de unión del receptor.

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I. Mitogenicidad del PDGF-D para las células endoteliales

Para ensayar la capacidad mitógena del PDGF-D para las células endoteliales, el polipéptido del PDGF-D se introduce en medio de cultivo celular que contiene suero al 5% y se aplica a células endoteliales aórticas bovinas (BAE) propagadas en medio que contiene suero al 10%. Las BAE se sembraron previamente en placas de 24 pocillos con una densidad de 10.000 células por pocillo el día después de la adición del PDGF-D. Tres días después de la adición de este polipéptido, las células se disociaron con tripsina y se contaron. Se incluye VEGF purificado en el experimento como control positivo.

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II. Mitogenicidad del PDGF-D para fibroblastos

Para ensayar la capacidad mitógena del PDGF-D para fibroblastos, se añaden diferentes concentraciones de homodímeros truncados de PDGF-DD o PDGF-AA (como control) a fibroblastos de prepucio humano privados de suero, en presencia de [3H]timidina 0,2 \mumCi. Después, los fibroblastos se incuban durante 24 horas con 1 ml de medio exento de suero complementado con BSA 1 mg/ml. Después de precipitación con ácido tricloroacético (TCA), se determina la incorporación de [3H]timidina en el ADN usando un contador beta. El ensayo se realiza esencialmente como describen Mori y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 21158-21164.

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III. Ensayos de la función de células endoteliales a) Proliferación de células endoteliales

Se realizan ensayos de crecimiento de células endoteliales por procedimientos conocidos en la materia, p. ej., los de Ferrara y Henzel, Nature, 1989, 380, 439-443, Gospodarowicz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 7311-7315, y/o Claffey y col., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1246, 1-9.

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b) Ensayo de adhesión celular

Se ensaya el efecto del PDGF-D en la adhesión de granulocitos polimorfonucleares a células endoteliales.

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c) Quimiotaxis

Se usa el ensayo de quimiotaxis estándar de cámara de Boyden para ensayar el efecto del PDGF-D en la quimiotaxis.

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d) Ensayo del activador de plasminógeno

Se ensaya en las células endoteliales el efecto del PDGF-D en el activador del plasminógeno y producción de inhibidor del activador del plasminógeno, usando el procedimiento de Pepper y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991 181 902-906.

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e) Ensayo de migración de células endoteliales

Se ensaya la capacidad del PDGF-D para estimular las células endoteliales para migrar y formar tubos, como describen Montesano y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986 83 7297-7301. Alternativamente, se puede usar un ensayo de gel de colágeno tridimensional descrito por, Joukov y col., EMBO J., 1996, 15, 290-298 o una membrana gelatinizada en una cámara de Boyden modificada (Glaser y col., Nature, 1980, 288, 483-484).

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IV. Ensayo de angiogénesis

Se ensaya la capacidad del PDGF-D para inducir una respuesta angiogénica en membrana corioalantoica de pollo, como describen Leung y col., Science, 1989, 246, 1306-1309. Alternativamente, se puede usar el ensayo de cornea de rata de Rastinejad y col., Cell, 1989, 56, 345-355; este es un procedimiento aceptado para ensayar la angiogénesis in vivo, y los resultados se pueden transferir fácilmente a otros sistemas in vivo.

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V. Curación de heridas

Se ensaya la capacidad del PDGF-D para estimular la curación de heridas en el modelo clínicamente más relevante disponible, como describen Schilling y col., Surgery, 1959, 46, 702-710 y usado por Hunt y col., Surgery, 1967, 114, 302-307.

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VI. El sistema hematopoyético

Se conocen en la materia una variedad de ensayos in vitro e in vivo que usan poblaciones de células específicas del sistema hematopoyético, y se resumen a continuación. En particular, son particularmente convenientes una variedad de ensayos in vitro de células madre murinas que usan un separador de células activado por fluorescencia para purificar células

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a) Células madre repobladoras

Estas son células capaces de repoblar la médula ósea de ratones irradiados letalmente, y tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. El PDGF-D se ensaya en estas células solo o por coincubación con otros factores, seguido de medición de la proliferación celular por incorporación de ^{3}H-timidina.

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b) Células madres de fase tardía

Estas son células que comparativamente tienen poca capacidad de repoblar la médula ósea, pero pueden generar D13 CFU-S. Estas células tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. El PDGF-D se incuba con estas células durante un periodo de tiempo, se inyecta en receptores irradiados letalmente, y se cuenta el número de colonias D13 de bazo.

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c) Células progenitoras enriquecidas

Estas son células que in vitro responden a factores de crecimiento solos y tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. Este ensayo mostrará si el PDGF-D puede actuar directamente en células progenitoras homatopoyéticas. El PDGF-D se incuba con estas células en cultivos de agar, y se cuenta el número de colonias presentes después de 7-14 días.

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VII. Aterosclerosis

Las células musculares lisas tienen una función principal en el desarrollo o inicio de la aterosclerosis, requiriendo un cambio de su fenotipo de un estado contráctil a uno sintético. Los macrófagos, células endoteliales, linfocitos T y plaquetas tienen todos una función en el desarrollo de placas ateroscleróticas, influyendo en el crecimiento y modulaciones fenotípicas de la célula muscular lisa. Un ensayo in vitro que usa una cámara Rose modificada en la que se siembran diferentes tipos de células en cubreobjetos opuestos, mide la velocidad de proliferación y las modulaciones fenotípicas de las células musculares lisas en un entorno multicelular, y se usa para evaluar el efecto del PDGF-D en las células musculares lisas.

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VIII. Metástasis

La capacidad del PDGF-D para inhibir la metástasis se ensaya usando el modelo de carcinoma de pulmón de Lewis, usando, por ejemplo, el procedimiento de Cao y col., J. Exp. Med., 1995, 182, 2069-2077.

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IX. Migración de células musculares lisas

Los efectos del PDGF-D en la migración de las células musculares lisas y otros tipos de células, se ensayar usando el procedimiento de Koyama y col., J. Biol. Chem., 1992, 267, 22806-22812.

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X. Quimiotaxis

Los efectos del PDGF-D en la quimiotaxis de fibroblastos, monocitos, granulocitos y otras células se puede ensayar usando el procedimiento de Siegbahn y col., J. Clin. Invest., 1990, 85, 916-920.

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XI. PDGF-D en otros tipos de células

Los efectos del PDGF-D en la proliferación, diferenciación y función de otros tipos de células, tales como células de hígado, de músculo cardiaco y otras células, células endocrinas y osteoblastos, se puede ensayar fácilmente por procedimientos conocidos en la materia, tales como la absorción de ^{3}H-timidina por cultivos in vitro.

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XII. Construcción de variantes y análogos de PDGF-D

El PDGF-D es un miembro de la familia de PDGF-D de los factores de crecimiento que presenta un grado alto de homología con los otros miembros de la familia de PDGF. El PDGF-D contiene 7 restos cisteína conservados que son característicos de esta familia de factores de crecimiento. Estos restos de cisteína conservados forman enlaces disulfuro dentro de la cadena que producen la estructura de nudo de cisteína, y enlaces disulfuro entre cadenas que forman los dímeros de proteínas que son característicos de los miembros de la familia de PDGF de factores de crecimiento. El PDGF-D interacciona con un receptor del factor de crecimiento proteína tirosina quinasa.

A diferencia de las proteínas de las que se sabe poco o nasa sobre la estructura de la proteína y los sitios activos necesarios para la unión del receptor y por tanto la actividad, el diseño de mutantes activos del PDGF-D está facilitado en gran medida por el hecho de que se conoce mucho sobre sus sitios activos y los aminoácidos importantes de los miembros de la familia del PDGF de factores de crecimiento.

Los artículos publicados que elucidan las relaciones de estructura/actividad de los miembros de la familia del PDGF de factores de crecimiento incluyen para el PDGF: Oestman y col., J. Biol. Chem., 1991, 266, 10073-10077; Andersson y col., J. Biol. Chem., 1992, 267, 11260-1266; Oefner y col., EMBO J., 1992, 11, 3921-3926; Flemming y col., Molecular and Cell Biol., 1993, 13, 4066-4076 y Andersson y col., Growth Factors, 1995, 12, 159-164; y para VEGF: Kim y col., Growth Factors, 1992, 7, 53-64; Pötgens y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 32879-32885 y Claffey y col., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1246, 1-9. A partir de estas publicaciones, es evidente que debido a los 8 restos cisteína conservados, los miembros de la familia del PDGF de factores de crecimiento presentan una estructura de plegado en nudo y dimerización características, que da como resultado la formación de 3 regiones de bucle expuestas en cada extremo de la molécula dimerizada, en los que se puede esperar que estén situados los sitios activos de unión del receptor.

Basándose en esta información, un experto en biotecnología puede diseñar mutantes de PDGF-D con una probabilidad muy alta de retener la actividad de PDGF-D conservando los 8 restos cisteína responsables de la disposición de plegado en nudo y de la dimerización, y también conservando, o haciendo solo sustituciones de aminoácidos conservativas en las secuencias de receptor probables en la región del bucle 1, bucle 2 y bucle 3 de la estructura de proteína.

La formación de las mutaciones deseadas en los sitios específicamente dirigidos en una estructura de proteína se considera que es una técnica estándar en la química de las proteínas (Kunkel y col., Methods in Enzymol., 1987, 154, 367-382). Los ejemplos de dicha mutagénesis dirigida con VEGF se pueden encontrar en Pötgens y col., J. Biol. Chem., 1994, 269, 32879-32885 y Claffey y col., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1246, 1-9. Realmente, la mutagénesis dirigida es tan común que hay kits disponibles en el comercio para facilitar dichos procedimientos (p. ej. Promega catálogo 1994-1995, Páginas 142-145).

La actividad de crecimiento y/o movilidad de células del tejido conjuntivo, fibroblastos, miofibroblastos y células gliales, la actividad de proliferación de células endoteliales, la actividad de angiogénesis y/o la actividad de curación de heridas de los mutantes del PDGF-D se pueden confirmar fácilmente por procedimientos de selección bien establecidos. Por ejemplo, se puede usar un procedimiento análogo al del ensayo de células mitóticas endoteliales descrito por Claffey y col., (Biochem. Biophys. Acta., 1995, 1246, 1-9). Igualmente, se pueden ensayar los efectos del PDGF-D en la proliferación de otros tipos de células, en la diferenciación celular y en la metástasis humana, usando procedimientos conocidos en la materia.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el autor de la solicitud es sólo para la conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido mucho cuidado al recopilar las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza cualquier responsabilidad en este aspecto.

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<110> ERIKSSON, Ulf

\hskip1cm AASE, Karin

\hskip1cm LEE, Xuri

\hskip1cm PONTKN, Annica

\hskip1cm UUTELA, Marko

\hskip1cm ALITALO, Kari

\hskip1cm OESTMAN, Arne

\hskip1cm HELDIN, Carl-_Henrik

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<120> FACTOR DE CRECIMIENTO D DERIVADO DE PLAQUETAS, ADN QUE CODIFICA EL MISMO Y SUS USOS

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<130> Ulf Eriksson et al 1064-44833PC

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<140>

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<141>

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<150> 60/107.852

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<151> 1998-11-10

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<150> 60/113.997

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<151> 1999-12-28

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<150> 60/150.604

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<151> 1999-08-26

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<150> 60/157.108

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<151> 1999-10-04

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<150> 60/157.756

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<151> 1999-10-05

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<160> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 690

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1934

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(966)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2253

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (176)..(1288)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<212> prt

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\hskip1cm21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

28

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm50

Claims (47)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de polinucleótido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o Figura 3 (SEQ ID NO: 3), o una molécula de ácido nucleico hibridable con la misma en condiciones restrictivas, en la que la molécula de ácido nucleico aislada (o complemento de la misma) codifica una proteína o polipéptido que tiene la capacidad de estimular uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales, pero excluyendo una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia del polinucleótido:

51

\vskip1.000000\baselineskip

2. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico es un ADNc.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la que dicho ácido nucleico es un polinucleótido de mamífero, preferiblemente un polinucleótido humano.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína o polipéptido codificado por el ácido nucleico comprende un sitio proteolítico que tiene la secuencia de aminoácidos RKSK o una secuencia de aminoácidos estructuralmente conservada de la misma.

5. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 25.

6. Un vector que comprende un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, cuyo ácido nucleico está operativamente unido con una secuencia promotora.

7. Un vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector eucariota.

8. Un vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector procariota.

9. Un vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un plásmido.

10. Un vector según la reivindicación 6, en el que dicho vector es un vector de baculovirus.

11. Una célula huésped transformada o transfectada con un vector de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

12. Una célula huésped según la reivindicación 11, en la que dicha célula huésped es una célula eucariota y el vector es un vector eucariota.

13. Una célula huésped según la reivindicación 12, en la que dicha célula huésped es una célula COS.

14. Una célula huésped según la reivindicación 11, en la que dicha célula huésped es una célula procariota y el vector es un vector procariota.

15. Una célula huésped según la reivindicación 14, en la que dicha célula huésped es una célula 293EBNA.

16. Una célula huésped según la reivindicación 11, en la que dicha célula huésped es una célula de insecto.

17. Una proteína o polipéptido aislado codificado por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o que comprende una secuencia de aminoácidos de la Figura 2 (SEQ ID NO: 2) o una secuencia de aminoácidos de la Figura 4 (SEQ ID NO: 4) o una sustitución conservativa de dicha secuencia de aminoácidos, o un fragmento de dicho polipéptido, teniendo la proteína, polipéptido o fragmento de la misma, la capacidad de estimular y/o potenciar uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales.

18. Una proteína o polipéptido aislado según la reivindicación 17, en el que dicho polipéptido es un polipéptido humano.

19. Una proteína o polipéptido aislado según la reivindicación 17 o reivindicación 18, que comprende un sitio proteolítico que tiene la secuencia de aminoácidos RKSK o una secuencia de aminoácidos estructuralmente conservada de la misma.

20. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia característica del SEQ ID NO: 25.

21. Un dímero de proteína o polipéptido aislado que comprende una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19.

22. Un dímero de proteína o polipéptido aislado según la reivindicación 21, en el que dicho dímero de proteína o polipéptido es un homodímero de dicha proteína o polipéptido.

23. Un dímero de proteína o polipéptido aislado según la reivindicación 21, en el que dicho dímero de proteína o polipéptido es un heterodímero de dicha proteína o polipéptido y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-A, PDGF-B o PIGF.

24. Un dímero de proteína o polipéptido aislado según la reivindicación 21, en el que dicho dímero de proteína o polipéptido es un dímero unido por disulfuro.

25. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz promotora de la proliferación celular de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, y al menos un factor de crecimiento adicional seleccionado del grupo que consiste en VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF-A, PDGF-B o PIGF.

26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 25, que además comprende heparina.

27. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz promotora de la proliferación celular de una proteína o polipéptido aislado, de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, y al menos un vehículo o diluyente farmacéutico.

28. Una composición farmacéutica según la reivindicación 27, que además comprende heparina.

29. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y heparina.

30. Una composición farmacéutica que comprende un cantidad estimulante del receptor del PDGF de una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 y al menos un vehículo o diluyente farmacéutico.

31. Un kit para amplificar la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, si está presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el kit al menos una pareja de cebadores complementarios de un ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

32. Un kit según la reivindicación 31, que además comprende una polimerasa para amplificar el polinucleótido por reacción en cadena de la polimerasa, con el fin de facilitar la comparación de la secuencia de un polinucleótido con el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

33. Un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20.

34. Un anticuerpo según la reivindicación 33, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

35. Un anticuerpo según la reivindicación 33, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

36. Un anticuerpo según la reivindicación 33 o reivindicación 35, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

37. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, en el que dicho anticuerpo se marca con un marcador detectable.

38. Un anticuerpo según la reivindicación 37, en el que dicho marcador detectable es un isótopo radiactivo.

39. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 33, 35 ó 36, en el que el anticuerpo se modifica por adición de fármaco citotóxico o citostático.

40. Un procedimiento para hacer una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

cultivar una célula huésped de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, de modo que se exprese una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína o polipéptido; y

aislar dicha proteína o polipéptido de dicha célula huésped o de un medio de cultivo en el que se cultiva dicha célula huésped.

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41. Una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para usar como un medicamento.

42. El uso de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para la fabricación de un medicamento para acelerar la angiogénesis en la curación de heridas, trasplante de órgano o tejido, para el tratamiento de la enfermedad arterial coronaria, cáncer, retinopatía diabética, trastornos pulmonares, insuficiencia cardiaca o enfermedad obstructiva crónica de las vías aéreas, síndromes de malabsorción del tracto gastrointestinal, hígado o riñones, o para estimular la angiogénesis, linfoangiogénesis y/o neovascularización.

43. Un procedimiento para producir una forma truncada activada de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende las etapas de expresar un vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado, para generar la forma truncada activada.

44. Un procedimiento para regular la especificidad de unión al receptor de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que comprende las etapas de expresar un vector de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y suministrar una cantidad proteolítica de al menos una enzima para procesar el polipéptido expresado, para generar la forma truncada activada.

45. Un procedimiento para identificar un antagonista de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, que comprende:

mezclar una preparación sustancialmente purificada de una forma truncada activada de una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 con un agente de ensayo; y

seguir por cualquier medio adecuado una inhibición de la actividad biológica de la proteína o polipéptido que tiene la capacidad de estimular y/o potenciar uno o más de la proliferación, diferenciación, migración, supervivencia o permeabilidad vascular de células endoteliales.

\vskip1.000000\baselineskip

46. Un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para usar como un medicamento.

47. El uso de un anticuerpo específicamente reactivo con una proteína o polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, acumulación de fluido o para la inhibición de la angiogénesis, linfoangiogénesis y/o neovascularización.