CN1038126A - 双边条曲菌素:一种新型的双功能生长调节糖蛋白 - Google Patents
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Abstract
一种新的双边条曲菌素双功能细胞生长调节因
子,系极为亲水的糖白蛋,分子量22500道尔顿,具
有不寻常的生物活性,能有效抑制DNA在肿瘤细胞
中的合成,但可促进某些正常细胞的生长。用肿瘤促
进剂TPA处理MCF-7细胞时,表达并分泌出作用
相同结构相似的两种形式。双边条曲菌素基因已被
克隆,并用于构建在转化大肠杆菌细胞中能导引双边
条曲菌素生物活性表达的质粒。双边条曲菌素有广
泛的用途,包括创伤和癌症的治疗。
Description
本发明涉及一种新型生长调节剂糖蛋白双边条曲菌素的生产和应用。本发明的这种蛋白质有力地抑制几种肿瘤衍生细胞系的生长,同时促进其他几种细胞系细胞的生长。对这种双功能生长调节剂广泛的治疗应用作了介绍,包括但不限于伤口的处理和癌症的诊断及治疗。
细胞的生长和分化可认为是由刺激、抑制和协同因子和激素的多重性起动、促进、维持和调节的。细胞体内平衡机理的变更和/或破坏似乎是有关的疾病(包括瘤)生长的基本原因。生长调节因子牵涉到许许多多的病理和生理过程,包括信号转导变异、细胞传递、生长和发育、胚胎发生、免疫应答、血细胞生成、细胞存活和分化、炎症、组织的修复和重组、动脉粥样硬化和癌。完全有理由说,生长调节因子的功能机理的分析、表征和确定具有重要的意义,因为这种机理在癌症的诊断、预测和治疗中可能有用。而且,获得这些因子的知识将有助于理解正常生长控制后面的基本机理及其在癌细胞中的失控。
表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGFα)、血小板衍生生长因子(pDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、转换生长因子-β(TGFβ)、胰岛素生长因子Ⅰ和Ⅱ(IGFⅠ,IGFⅡ)、造血生长因子如红细胞生成素、群体刺激因子(CSF1和2)、间白细胞素(IL-1到6)、干扰素(IFNα,β,γ)、肿瘤坏死因子α和β(TNFα和β)、白边条曲菌素、制瘤素M和其他尚不明确的因子,都是在正常的生理条件下或随外源刺激由各种类型的细胞所产生的生长和分化调节蛋白质。这些因子的大部分看来是以自分泌和旁分泌的方式起作用。(参阅述评:Goustin,et al.,1986,Cancer Res.46:1015-1029;Rozengurt,1986,Science 234:161-66;Pardee,1987,Cancer Res.47:1488-1491;Sachs,1986,Sci.Amer.254:40-47;Marshall,1987,Cell 50:5-6;Melcher and Anderson,1987,Cell 30:715-720;Clemens and Mcnurlan,1985,Biochem.J.226:345-360;Nathan,1987,J.Clin.Invest.79:319-326;Sporn and Roberts,1986,J.Clin.Invest.78:329-332;Old,1987,Nature,326:330-331;Beutler and Cerami,1987,New Eng.J.Med.316:379-385;Weinstein,J.Cell.Biochem.,33:213-224;Zarling,et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:9739-9744;Sporn and Todaro,1985,N.Eng.J.Med.303:878-880;Sporn and Roberts,1985,Nature 313:745-747)。
具有生物活性的佛波醇的酯,如12-0-十四烷酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA),是体内烈性肿瘤启动子,在体内和体外都诱发和调节各种生物和生物化学反应(Blumberg,1981,Crit.Rev.Toxicol.9:153-197;Slaga,1983,Cancer Surv.2:595-612)。人们已经知道,有时TPA抑制人体乳腺腺癌细胞系MCF-7的生长。此外,TPA还改变MCF-7细胞的形态,因为TPA处理过的细胞呈现分泌细胞的形态学特性(Osborne,et al.,1981,J.Clin.Invest.67:943-951;Valette et al.,1987,Cancer Res.47:1615-1620)。
本发明涉及一种新型的细胞生长调节因子双边条曲菌素,它具有不寻常的双功能细胞生长调节作用。双边条曲菌素抑制肿瘤细胞的生长,而促进某些正常细胞的生长。它是一种亲水性极强的糖蛋白,平均分子量为22500道尔顿,以两种形式存在,这两种形式的功能等同,一种是截矩的形式,一种是较大的形式。除了在较大的形式中发现有另外六个N-末端残基外,这两种形式在氨基酸水平上是完全同系的(FIG.12)。本发明部分地根据申请人的发现,即TPA处理过的MCF-7细胞释放一种糖蛋白,它抑制A431表皮样癌细胞系和其他肿瘤细胞系的生长,而促进正常的人体成纤维细胞和某些其他细胞系的生长。
本发明通过一些实施例加以介绍,在这些实施例中,双边条曲菌素被鉴定、纯化到均一,并从结构和功能上对其作了详尽的说明。在其他一些实施例中,介绍了cDNA和双边条曲菌素前体的基因组克隆编码。这些克隆被用来制备表达媒介,它能够导向在转化细菌和转染真核的寄主细胞中高水平的合成具有生物活性的双边条曲菌素。
本发明包含有对这种独特因子广泛应用的介绍。
图表的简要说明
图1,透过和洗涤的制备反相HPLC。
图2,由图1得到的47-62集合馏分的半制备反相HPLC。
图3A,前面流程中得到的集合馏分Ⅰ的分析反相HPLC。
图3B,前面流程中得到的集合馏分Ⅱ的分析反相HPLC。
图4,图3A和图3B的馏分在Bio-Sil TSK 250柱上的凝胶渗透色谱。色谱法按下文所述的方法进行。(A).浓缩馏分35(图3A)的HPLC;(B).浓缩馏分36(图3A)的HPLC;(C).浓缩馏分37(图3A)的HPLC;(D).浓缩馏分41和42一起(图3B)的HPLC。
图5,纯化的AR和S-吡啶乙基化的AR(SPE-AR)在凝胶渗透HPLC Bio-Sil TSK250柱上的分析。色谱法按下文所述的方法进行,所用的分子量标记物为卵清蛋白,43KD;胰凝乳蛋白酶原A,25KD;核糖核酸酶,14KD;和胰岛素,6KD;(A).AR;(B).SPE-AR。
图6,AR和SPE-AR在反相微孔RPSC C3柱(4.6×75mm)上的分析。梯度在初始溶剂0.1%TFA和第二溶剂为含0.1%TFA的乙腈之间,在室温下以1ml/min的流速进行。每馏分收集1ml。(A).AR;(B)SPE-AR。
图7,AR蛋白质的SDS-PAGE分析。(A).有间歇缓冲***的15%SDS-PAGE凝胶(0.75mm×18Cm×15Cm,Bio-Rad)在30mA的恒定电流下进行。使用的分子量标记物为磷酸化酶B,92.5KD;BSA,66.2KD;卵清蛋白,43KD;碳酸酐酶,31KD;胰凝乳蛋白酶原A,25.7KD;大豆胰蛋白酶抑制剂,21.5KD;乳球蛋白,18.4KD;溶菌酶,14.4KD;抑胰肽酶6.2KD;和胰岛素亚基,3KD。道1:AR;道2:NG-AR;道3:SPE-AR;道4:NG-SPE-AR。(B).20%SDS-PAGE微型凝胶(0.75mm×10Cm×7Cm),在恒压200伏下进行。用与上文相同的分子量标记物。道1:AR;道2:NG-AR;道3:磷酯酶处理过的NG-AG,在rP HPLC上分离。
图8,125I-标记的AR的IEF分析。使用下面PI值为4.65-9.6之间的标准物:藻青甙,4.65;β-乳球蛋白B,5.1;牛碳酸酐酶,6.1;人体碳酸酐酶,6.5;马肌红蛋白,7.0;鲸肌红蛋白,8.05;α-胰凝乳蛋白酶,8.8;和胞色细胞C,9.6。
图9,(A).AR对125I-脱氧尿苷掺入A431细胞的DNA的抑制作用的剂量响应曲线;(B).AR对125I-脱氧尿苷掺入人体***成纤维细胞(Sadamoto)的刺激作用的影响。
图10,鼠的EGF和AR结合于固定的A431细胞或A431血浆膜的125I-EGF的竞争。结合试验按下文所述方法进行。对固定细胞或膜的试验分别在每池中用100μl或50μl样品。
符号 受体来源 竞争者
道20● 固定细胞 EGF
道21▲ 固定细胞 AR
道22○ 膜 EGF
道23△ 膜 AR
图11,AR和人体EGF(Kyte和Doolittle)的水疗法分析。(A).AR(残基1-84);(B).AR(残基44-84);(C).EGF(残基1-53);(D).AR前体(残基1-252);(E).人体AR(残基1-84)和EGF(1-53)的比较〔根据图13校准,半胱氨酸,对应于半胱氨酸的成熟AR的残基46,成熟EGF的残基6〕。
图12,成熟AR和截断的AR的氨基酸序列。所用氨基酸的标准单个字母编码为:丙氨酸(A);精氨酸(R);天冬酰氨(N);天冬氨酸(D);半胱氨酸(C);谷氨酰胺(Q);谷氨酸(E);甘氨酸(G);组氨酸(H);异亮氨酸(I);亮氨酸(L);赖氨酸(K);甲硫氨酸(M);苯丙氨酸(F);脯氨酸(P);丝氨酸(S);苏氨酸(T);色氨酸(W);酪氨酸(Y);和缬氨酸(V)。
图13,双边条曲菌素(AR)的氨基酸序列和EGF总科目的比较。
图14,(A).结合于纤维素(○-○)、变性DNA纤维素( )和天然DNA纤维素(△-△)的125I-AR。(B).结合于纤维素(○-○)和DNA-纤维素( )的125I-AR与结合于纤维素(△-△)和DNA-纤维素( - )的125I-EGF的比较。
图15,用固相技术生成合成双边条曲菌素肽。对应于残基166-184(259号)、108-130(264号)、31-50(279号)、71-90(280号)和221-240(281号)的五种肽用固相合成法生产,然后用反相HPLC纯化。
图16,cDNA克隆PAR1的核苷酸和推导出的氨基酸序列,对人体双边条曲菌素编码。
图17,人体双边条曲菌素基因组序列。
图18,与基因组序列有关的AR分子的外显子结构和蛋白质范围的图解。
图19,PDCHBAR1表达媒介的核苷酸序列。
图20,PTacApAR1的核苷酸序列。
图21,pTacAPHILE的核苷酸序列。
本发明涉及双边条曲菌素(AR)、AR和AR前体编码的核苷酸序列和由常规法或重组体DNA法制备AR。
AR是一种新型的细胞生长调节因子,它由TPA处理的MCF-7细胞表达和分泌出来,作为两种不同的但功能相等的形式。除了在较大的形式中有另外六个氨基末端残基外,这两种形式在结构上是相同的。AR对肿瘤细胞中DNA的合成表现有很强的抑制活性,因而有可能作为一种有效的抗肿瘤化合物。AR具有促进成纤维细胞和其他正常细胞生长的能力是有特殊意义的,由此可建议,AR可用在那些需要加速细胞生长的医疗中,如烧伤和伤口的治疗。
AR或它的片段或衍生物,在瘤形成的处理和检测中以及在伤口的处理中具有广泛的潜在医疗作用。AR在骨吸收的调节和免疫响应中,在花生四烯酸级联放大的刺激中,都可找到应用。双边条曲菌素基因和基因产品、它们的制备方法及其用途在以后的次级章节和实施例中作了比较详细的介绍。
双边条曲菌素的制备和纯化
双边条曲菌素是由人体乳腺癌细胞MCF-7用肿瘤起动剂12-0-十四烷酰-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)处理时分泌出来的。双边条曲菌素可以从这样培养的TPA处理过的MCF-7细胞的控制介质中分离出来,而后净化到很高的特殊活性。双边条曲菌素也可从其他具有诱导作用或不具诱导作用的细胞株中,通过用TPA或其他肿瘤起动剂处理分离出来。它还可用重组体DNA技术或固相肽合成的方法来制备。
双边条曲菌素可利用现有已知的各种方法和技术进行纯化,包括但不限于色谱法(如反相液体、凝胶渗透、液体交换、离子交换、筛析色谱和亲和色谱法)、离心分离、电泳法、分级溶解或用于净化蛋白的其他标准方法。
在本发明的一个具体实施方案中,MCF-7细胞用TPA处理48小时,而后在无血清的新鲜介质中生长4天。收集所得到的经过调节的这种介质,像下面描述的那样,用于制备粗制AR。反相液体色谱法同凝胶渗透色谱法相结合可用于净化AR到表观均一性,如下面描述的那样,从而得到对粗制的原始材料净化1842和2270次之间的AR。这个方法是可重复的,净化的AR制剂产品具有的比活性是2.7至3.4×106单位/mg蛋白质之间。
双边条曲菌素基因
双边条曲菌素的分离和纯系化
在实施本发明的方法中,人体双边条曲菌素的核苷酸编码序列或它的功能当量可用于产生重组体分子,这种重组体分子将直接表示人体双边条曲菌素产品。AR的核苷酸编码序列可从产生似AR活性的细胞源获得。例如,在一个具体实施方案中,人体乳腺癌细胞株MCF-7被用作AR核苷酸编码序列的源。该编码序列可通过cDNA纯系化由这样的细胞源分离和纯化的RNA或通过基因组纯系化获得。无论是cDNA还是克隆的基因组信息库,都可利用现有已知的技术从所产生的DNA片段来制备,这些技术包括但不仅限于限制酶的利用。
含AR基因的这种片段可用现有技术中许多已知的方法来鉴定。例如,AR氨基酸序列的一部分可用来推断DNA序列,而后这种DNA序列可用化学方法合成,可标记放射活性,并可用作杂化作用探测剂。
可用于分离AR基因的其他方法包括但不限于由某种已知的序列用化学方法合成该基因序列,例如,所说已知序列可来自于AR的氨基酸序列。另外,可采用选定mRNA的体外转译,并随之对这种转译产品进行功能或免疫试验。而后,可把这种鉴定和分离的基因引入到适当的纯系化媒介中。在现有技术中许多已知的媒介寄主***都可被采用。可能的媒介物包括但不限于质粒或变异病毒,该媒介***可同寄主细胞共存;这样的媒介物包括但不限于噬菌体,如λ衍生物,或质粒如PBR322或PUC质粒衍生物。重组体分子可通过转化、转染、感染、电极化等方法引入到寄主细胞中。
在一个具体的实施方案中,用MCF-7细胞表示的AR基因通过选定由TPA处理MCF-7细胞而产生的mRNA和在噬菌体λgt10中构成cDNA信息库进行纯系化。既然未经处理的MCF-7细胞显然不合成和分泌AR蛋白质,那末就可设想,在转录水平上也可以看到TPA对AR的诱导作用,而且这样的cDNA信息库具有相当丰富的含AR的序列。根据人的编码子的应用,用退化的和最好猜测的低聚核苷酸探测cDNA信息库(Lathe,1985,J.Mol.Biol.183:1-12和后文的介绍),导致AR和cDNA克隆的分离。而后,这些cDNA克隆被用于表征ARmRNA和AR基因。而且,这种AR cDNA的核苷酸序列(下文和图16)可被用于诱导AR的初级氨基酸序列。
由于核苷酸编码序列固有的简并性,编码基本上相同或功能上等同于氨基酸序列的其他DNA序列可用于本发明方法的实践中。AR核苷酸序列的这种变化包括不同核苷酸的缺失、附加和取代,结果导致编码相同或功能等同的基因产品序列。该基因产品包含这种序列内氨基酸残基的缺失、附加和取代,从而导致如此制备的生物活性产品的静息变化。这样的氨基酸取代可根据所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来进行。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;不带电荷的极性头端基或具有相同亲水性的非极性头端基的氨基酸包括白氨酸、异白氨酸、缬氨酸;甘氨酸、丙氨酸;天冬酰胺、谷酰胺;丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸。
AR cDNA可用于在TPA诱导的MCF-7细胞中检测AR mRNA的探试剂。AR mRNA的长度大约是1400bp。
如下面介绍的那样,AR cDNA可用来表征AR基因。人的AR基因染色体分配通过现场杂化用3H标记的AR cDNA到正常的中期染色体来决定,结果表明人的AR基因处在染色体4区4q13-21,这是一个被认为涉及到淋巴细胞分化的区段(见下文)。cDNA还可用于分离跨越整个AR基因包括5′调节区的基因组DNA。AR基因的长度大约是10kb,它被分割成六个外显子。5′调节区被并合到含启动子较少的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的表达媒介上。这种结构暂时引入到MCF-7细胞上时,能够刺激CAT基因的转录作用,由于附加了TPA,活性提高6-7倍(见下文)。在本发明的具体实施方案中,5′调节区可在表达媒介中使用,以控制AR基因和其他结构基因的转录作用。AR-CAT的嵌合结构还可以用在寻找调节AR表现度的因子,将在下文介绍。
含双边条曲菌素编码序列的表达
媒介的结构
为了表示AR的生物活性,即成熟形式,应当选择一种表达媒介/寄主***,它不仅提供高水平的转录和转译作用,而且提供该基因产品的正确加工过程。在所表现的结构中利用双边条曲菌素前体的整个编码序列时,这一点特别重要,因为双边条曲菌素的成熟形式可认为是经由细胞加工过程从其前体产物衍生出来的。例如,可以选择哺乳动物的寄主细胞***,因为它能够准确地将双边条曲菌素加工和分泌到细胞外环境。
具体来说,似乎有两种成熟形式的双边条曲菌素作为普通252氨基酸前体的中间部分被合成出来,这两种成熟的形式是通过另外的解朊加工过程从该氨基酸前体中释放出来的。另外,如果在最终产品中希望糖基化并发生酪氨酸-硫酸盐作用,可对双边条曲菌素这样做,这将进一步强调选定能够实施这些转译后改性的表达***的重要性。
各种动物/寄主表达媒介***(也就是说其媒介含有导致在适当的寄主细胞中AR编码序列的再现、转录和转译所必须的成分)可被熟练的技术人员同样好地使用。这些媒介包括但不限于病毒表达媒介/哺乳动物寄主细胞***(如细胞肥大病毒、菌苗病毒、腺病毒等);昆虫病毒表达媒介/昆虫细胞***(如杆状病毒)或来自哺乳动物细胞基因组的非病毒启动子表现***(如小鼠金属硫堇启动子)。
这些媒介的表达成分在强度和性质上是不同的。依据所使用的寄主/媒介***,可以采用许多适宜的转录和转译成分中的一个。例如,当在哺乳动物细胞***纯系化时,可采用从哺乳动物细胞基因组分离的启动子(如小鼠硫堇启动子)或从这些细胞培育的病毒中分离的启动子(如牛痘病毒7.5K启动子或莫洛尼鼠肉瘤病毒的长末端重复)。由重组体DNA或合成技术制成的启动子也可以用于提供嵌入序列的转录。
为充分地转译嵌入蛋白的编码序列,还需要特殊的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。在整个AR基因包括它自己的起始密码子和相邻序列都被嵌入到适当的表达媒介中的情况下,可以不需要附加的转译控制信号。但是,当这种编码序列只有一部分嵌入时,就必须提供外源转译控制信号,包括ATG起始密码子。而且,起始密码子必须与AR编码序列的解读***相同,以确保整个嵌段的转译。这些外源转译控制信号和起始编码子可以是各种各样的起源,包括天然的和合成的。表现效率可以通过内含转录衰减序列、强化因子等而增强。
前面介绍的将DNA片段嵌入某媒介物的任何一种方法都可用来构成包含AR基因和适当转录/转译控制信号的表达媒介。这些方法包括体外重组体DNA技术、合成技术和体内重组(基因重组)。
例如,在腺病毒被用作表达媒介的时候,AR编码序列可被并合到腺病毒转录/转译控制复体上,例如,后者的启动子和三分的前部序列。这种嵌合基因又可通过体外或体内重组***到该腺病毒基因组中。嵌入到病毒基因组的非基本区段(如E1或E3区段)将导致一种重组体病毒,它是有活力的,并能以受感染寄主的方式表现AR。同样,可以利用牛痘菌苗7.5K启动子。
可用来表现AR的另一种表达***是昆虫***。在一个这样的***中,苜蓿Y纹夜蛾核多角体病毒(ACNPV)被用作表达异种基因的一种媒介。这种病毒生长在草地夜蛾细胞中。AR编码序列可纯系化成该病毒的非基本区段(如多角体基因),并可置于AcNPV启动子(如多角体启动子)的控制之下。成功地嵌入AR编码序列将导致多角体基因的失活和非闭和重组体病毒的形成(也就是说,缺少蛋白质表层的病毒由多角体基因编码)。这些重组体病毒被用于感染表达这种嵌入基因的草地夜蛾细胞。
在嗜两栖类包封细胞株中制成的逆病毒媒介使得有可能高效表达许多细胞类型。这种方法允许人们去评价细胞类型的特殊加工过程、调节作用或嵌入蛋白质编码序列的功能。
此外,可被选择的寄主细胞株调节嵌入序列的表达、或以所希望的特殊方式改善并加工这种基因产品。在某些诱导物存在下,可提高由某些启动子表达(如金属硫堇启动子的锌和钙离子)。因此,可以控制用遗传工程的方法设计的AR的表达。如果纯系化异种基因的这种蛋白质产品致死寄主细胞、这一点就是重要的。而且,蛋白质产品的改进(如糖基化)和加工(如***)对于这种蛋白质的功能是重要的。不同寄主细胞对于蛋白质的转译后加工和改性具有特有和特殊的机理。可以选择适当的细胞株或寄主***、以确保所表达的异种蛋白的准确改性和加工处理。
按照本发明可采用的表达媒介包括但并不限于如下这些:
质粒PSV2Neo.质粒PSV2Neo在Southern等的论文(Southern et al.,(1982)J.Mol.Applied Genetics1,327-341)中作了介绍。
质粒PSV2dhfr.质粒PSV2dhfr(Subramani et al.,1981,Mol.Cell Biol.1,854-864)包含在SV40启动子控制下的小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)。
质粒PH3M.质粒PH3M(Aruffo et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,3365-3369)包含一种由人的细胞肥大病毒(CMV)AD169组成的嵌合启动子,上述病毒紧靠融合在HIV LTR位置-67到+80上的早期增强病毒。跟随LTR的是一种多衔接物,具有5′-到-3′位点:HindⅢ,XbaⅠ,XhoⅠ,BstxⅠ,XhoⅠ,PstⅠ,和XbaⅠ。这种来自PSV2和SV40重现源的小t抗源接头/多腺苷化信号处在该多衔接物的下方。后者能够使含有SV40大T抗原的细胞(如COS和WOP细胞)增强。抑制剂tRNA基因支持着PVX的生长,PVX以携带P3质粒(如MC1061/P3)的媒介和细菌为基质。
质粒PH3M/bonCM.质粒PH3M/bonCM由Najma Malik,Oncogen得到。它包含猴的TGF-β5′未转译的前沿序列,该序列是融合到在HindⅢ/XhoⅠ(被填充的)位点上嵌入PH3M的Oncostain M编码序列上的。TGF-β序列由在HindⅢ(起源于PSP65多衔接段)和邻近的PStⅠ位点(来自TGF-β cDNA)上开始的85bp5′未转译区段组成,随其后是87bp编码29氨基酸信号序列,正常情况下它在甘氨酸-亮氨酸二肽序列之间被切开。
质粒PH3ARP.质粒PH3ARP是一种为瞬时表达COS细胞中的AR前体而设计的PH3M基质媒介。它包含AR5′未转移区段的13bp以及整个编码区段和3′未转译序列。这个质粒是通过将由HindⅢ和XbaⅠ浸提的PH3M媒介的4Kb片段、低核苷酸EVSAL3和EVSAL4和凝胶净化的来自PAR1的1.1Kb HgaⅠ/Xba Ⅰ cDNA片段拼接在一起而形成的。EVSAL3和EVSAL4同5′HindⅢ、ECORV、SaⅡ和HgaⅠ位点是相容的。这个结构还保留着来自紧靠3′未转译区段的PEMBL18的ECoRⅠ至XbaⅠ多衔接位点。
ECoRV HgaI
HindIII SalI
EVSAL3 5′ AGCTTGATATCGTCGA
EVSAL4 3′ ACTATAGCAGCTGACGC
质粒PSVDR/boM.质粒PSVDR/boM是从Jeff Kallestad,Oncogen获得的。它是处在PSV2dhfr和PH3M/boM之间的融合体,除由SV40早期启动子启动的小鼠二氢叶酸还原酶基因外,它还提供一种具有cDNA并由PH3M的CMV/HIV启动子启动的媒介。上述PH3M处在TGF-β信号序列和SV40多腺苷化信号的两侧。它是通过拼接BamHI/NruI(填充的)浸提的PH3M/boM和BamHI浸提的PSV2dhfr而形成的。
质粒PHras.质粒PHras是由华盛顿大学药物系的Stan Mcknight研制出的一种哺乳动物表达媒介。它是一种PML作基质的媒介,包含754bp Harvey Ras LTR的EcoRI到TthIII片断,一种具有SmaI、BamHI、Sa1I、PStI、HindIII和C1aI的多衔接体,C1aI之后是小鼠DHFR cDNA和Hepatitis B病毒的3′未转译的/多腺苷化信号。从该多衔接体中的BamHI到DHFR的ATG的距离是54bp。
质粒PHLARGE.质粒PHLARGE是一种哺乳动物的表达结构,它包含由Harvey Ras LTR启动并继之以非功能的即非启动子的DHFR基因的10Kb AR基因组序列(SmaI到HindIII)。它是由以下片段通过三种拼接方式构成的:4.6Kb PHras SmaI/HindIII片段,6.0Kb来自PARH12的SmaI/HindIII AR基因组片段,6.4Kb来自PARH6的HindⅢ AR基因组片段。
质粒PHLARG1PCD。质粒PHLARG1PCD是一种多顺反子哺乳动物的表达结构。它包含AR前体cDNA序列,继该序列之后是由单位Harvey ras LTR启动的小鼠二氢叶酸还原酶基因。主要的转录是处在AR的终结密码子和dhfr的ATG起始密码子之间的74bp多顺反子信息,因而就使得核蛋白体重新起始和转译继续进行。PH3ARP用EcoRV浸提,就分离出700bp片段。这种片段包含着13bp AR5′未转译区段即完整的AR前体编码区段和21bp 5′未转译序列。这种片段同BamHI切割、填充和磷酸酯酶化的媒介PHras相拼接。
质粒PLOSNL.质粒PLOSNL从Dusty Miller,FredHutchison Cancer Research Center,Seattle,WA获得。设计这种逆病毒表达媒介是为获得高效价的在宽的寄主范围内能够感染但不重现的无病毒原种的嗜两栖类辅助因子。该媒介包括:突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒LTR,带有被消去的包封信号;PSi+序列;含两个XhoI位点的乌氨酸转氨甲酰酶(OTC)基因,这两个位点供嵌入cDNA并使OTC基因失活;SV2Neo,可选择的标志;3′LTR;PBR322 Amp抗性主链。
质粒PLARSNL.质粒PLARSNL是一种嗜两栖类的逆病毒表达结构,它包括AR前体cDNA的编码区段,缺少聚(A)尾,由病毒LTR启动。SV2Neo使得能够选择表达转染子。PLARSNL是由来自PHLARG1PCD的800bp Sa1I片段同7.7Kb XhoI浸提和磷酸酯酶化的PLOSNL媒介片段拼接而形成的。
表达双边条曲菌素基因产品的
转染子或转化体的鉴定
包含重组体AR编码序列并表达生物活性成熟产品的寄主细胞至少可由四种常规方法来鉴定:(a)DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-反义RNA杂交;(b)“标志”基因功能的存在或不存在;(c)评定在寄主细胞中由AR mRNA转录的表达而测定的转录水平;(d)检测由免疫测定以及最后由其生物活性测定的成熟基因产品。
在第一种方法中,嵌入在这种表达媒介中的人的AR编码序列的存在,可通过DNA-DNA杂交,利用含与人的AR编码序列类似的核苷酸序列的探试剂来检测。
在第二种方法中,该重组体表达媒介/寄主***可根据某些“标志”基因功能的存在或不存在来鉴定和选择(如腺嘧啶核甙激酶活性、抗生素抗性、氨甲蝶呤抗性、转移表型、在杆状病毒中咬合体的形成等)。例如,如果AR编码序列被嵌入到媒介的标志基因序列内,含AR编码序列的重组体就可通过无标志基因功能来鉴定。另外,标志基因可在用于控制AR编码序列表达的相同或不同启动子的控制下与AR序列串联放置。随诱导或选择而响应的这种标志的表达就表示AR编码序列的表达。
在第三种方法中,AR编码区段的转录活性可由杂化试验来评定。例如,多腺苷化的RNA可利用与AR编码序列或它的特定部分相类似的探试剂通过Northern印迹分析进行分离和分析。另外,寄主细胞的总核酸可被萃取出来,并可用于测定对这些探试剂的杂化作用。
在第四种方法中,成熟蛋白产品的表达可用免疫学的方法评定,例如,采用Western印迹分析、如放射免疫沉淀那样的免疫测定、酶连接的免疫测定等。但是,这种表达***成功的最后验定涉及到具有生物活性的AR基因产品的检测。在寄主细胞分泌基因产品的情况,从所培养的转染子寄主细胞得到的无介质细胞可被用来测定AR的活性。在不分泌基因产品的情况,细胞溶解产物可被用来测定这样的活性。在这两种情况下,生物测定法,如这里或其他地方介绍的生长抑制和刺激测定法,都是可以采用的。
双边条曲菌素的结构
经提纯的AR的氨基酸序列揭示,这种制品是由两种形式几乎相同而比例不等的AR的混合物组成的(见图12)。其中比较大的一种形式大致占这种制品的16%,另一种形式,即截断的AR,含剩余的制品的大多数,它与较大形式的不同仅仅在于它缺少氨基末端六肽,SVRVEQ。除此而外,这两种形式的氨基酸含量是完全相同的。
AR是一种亲水性极强的糖蛋白,平均相对分子量为22500道尔顿。排除N-连结糖的N-聚糖酶处理使AR作为单带游离出来,其相对分子量为14000,这与根据AR凝胶渗透色谱数据计算出的分子量很好的一致。在非还原条件下,AR同样游离出来,因此,这是一种单链糖蛋白。
AR的一级结构已同许多蛋白质序列进行了比较。这些比较表明,AR是一种独特的蛋白质,它与相比较的所有蛋白质在结构上无重要相似之处。但是,AR的一级结构与几种其他生长因子有关,这些生长因子的大部分属于EGF-总科。
既然它的某些结构特征非常类似于在EGF-家系蛋白质中发现的高度保存的结构特征,那么就有理由将其归类于这组蛋白质中的一员。例如,N-末端AR序列与TGFα、VGF和MGF的N-末端序列相似,相似之处在于这个区段具有丰富的脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基。AR像TGFs和VGF的N-末端前体区段那样,也具有N-连接糖蛋白的位点。AR与其他EGF类蛋白质具有进一步的序列相似性,它保存有涉及三个二硫键的六个半胱氨酸残基,这些二硫键决定着这些增长因子成熟形态的二级结构。但是,水疗法分析揭示,相似的AR和EGF序列之间有重要的差别,为进一步对AR和EGF总科的其他成员进行比较请参阅表1、图13和下文。
表Ⅰ
蛋白质 样品 区段#1 区段#2
EGF 人体 CLHDGVCMYIE CNCVVGYIGERC
TGF-α 人体 CFH-GTCRFLV CVCHSGYVGARC
VGF 牛痘 CLH-GDCIHAR CRCSHGYTGIRC
SGF Shope CLNNGTCFTIA CVCRINYEGSRC
因子Ⅸ 人体 CLNXGSCKDDI CWCPFGFEGKNC
因子Ⅹ 人体 CQNXGKCKDGL CTCLEGFEGKNC
因子Ⅻ 人体 CLHXGRCLEVE CHCPVGYTGPFC
蛋白质C 人体 CCGXGTCIDGI CDCRSGWEGRFC
AR 人体 CIH-GECKYIE CKCQQEYFGERC
区段1和区段2相似性的综合得分
EGF记分 Coag.记分 AR记分
生长因子科 >20 <20 <40
凝结因子 <25 >25 <40
双边条曲菌素亚科 <20 <20 >40
图12显示的双边条曲菌素氨基酸序列以及功能当量均属本发明的范围之内。例如,双边条曲菌素产品可包括在导致轻微变化并由此产生双生物活性产品的序列内氨基酸残基的缺失、附加和取代。这样的氨基酸取代可根据所涉及残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或双亲性的相似性来进行。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;具有相同亲水值的不带电荷的极性头端基氨基酸包括白氨酸、异白氨酸、缬氨酸;甘氨酸、丙氨酸;天冬酰胺、谷酰胺;丝氨酸、苏氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸。
双边条曲菌素的性质
AR是一种单链糖蛋白,平均分子量大约是22500道尔顿,对各种细胞的培养表现有双功能生长调节活性。从结构上说,AR与EGF科生长因子有关,此外,它可同这个科的其他成员共享功能上的相似性,AR能够同EGF对受体的结合有力地竞争说明了这一点。
AR是一种单节显性的蛋白质,其活性要求有链内二硫键,为保持它的生物活性不要求糖基化。在中等酸碱处理下它是稳定的,在56℃热处理30分钟时也是稳定的。当它被还原,或在100℃热处理5分钟,或用胰蛋白酶、内肽酶Lys-C、内肽酶Arg和内肽酶Glu浸提时,则完全失去其生物活性。
用磷脂酶D对AR进行蛋白水解***,似乎是将其转化成某一种或某些活性片段,它们的相对分子量大约是5600,这与根据SDS-PAGE分析推断的一样。AR的活性片段属于本专利申请范围之内,这在后面将进一步讨论。
AR对几种人体上皮起源的癌细胞株有显著的体外抗增生作用。例如,AR能有效地抑制阴门表皮癌A431、乳腺腺癌HTB132、颈部拟表皮癌CRL1550、卵巢***状腺瘤HTB75、卵巢畸胎癌HTB1572和乳腺腺癌HTB26细胞的DNA合成。在用0.13nM AR处理的A431细胞中,观察到的DNA合成抑制率是50%。
正常的大鼠肾脏NRK-SA6细胞一般不在软琼脂中形成细胞集落。但是,将加到这些细胞培养介质上的外源EGF和TGF-β相结合,则引起锚地独立生长,表示一种转化表现型。外源AR和TGF-β的结合还引起NRK-SA6细胞的锚地独立生长,虽然是在较低的水平上(见表Ⅴ),这也直接证明了AR和EGF在功能上是相关的。
AR同TGF-β的协同作用有力地表明AR在细胞生长的调节中作为一个重要因子。这样,本发明提供了以前所不曾有的研究工具,它可用来研究这种复合体,并揭示在正常细胞中的生长控制和在肿瘤细胞中特有的生长失控之事实。
AR还引起人的***成纤维细胞的增生(表Ⅳ)。在大约50PM的AR浓度,观察到在这些细胞中DNA的合成增加两倍。在近似5nM的浓度,出现大约是六倍的最大刺激作用。
AR信号细胞增生或生长受到抑制的机理尚不清楚。但是,旨在表征AR一受体结合能力的初步研究认为,AR或许是一种特殊的受体。为结合到EGF一受体上,AR同EGF相竞争;为结合到其他普通受体上,AR也同EGF相竞争,这表明AR本身可能是一种特殊受体。众所周知,配位体结合到EGF受体上,启动生长刺激信号,部分原因是由于活化的酪氨酸激酶的活性。AR结合到EGF受体上同样地引起增生响应,或者反过来说,通过限制用于结合EGF或其他信号产生配位体的EGF-受体的数目,可阻断增生信号的启动。
另外,AR抑制细胞生长的另一种机理可能存在,由表Ⅰ给出的数据可以看出。每个A431细胞都具有可变的EGF结合位点,这种细胞株的四种克隆被用来测试对AR抑制活性的灵敏度。在AR的灵敏性和每个细胞中EGF结合位点数之间没有发现相关关系,这说明由AR产生的生长抑制信号是由不涉及EGF受体的某种受体的结合作用引起的。这种过程可能对由其他生长因子(如TGF-α)产生的生长增生信号起反作用。因而,AR可能是通过具体地阻断细胞的致有丝***反应对TGF-α或其他自分泌生长因子施加它的抗增生作用。
AR是一种亲水性极强的蛋白质,其氨基酸序列产生一种独特的水疗法(hydropaty)剖面,它与其他的EGF科蛋白质(图11)外形没有什么相似性。AR属碱性蛋白质,PI为7.6-8.0。
由TPA诱导的AR表征
TPA对细胞诱发多向性反应,包括细胞形态的改变、细胞增生和分化、膜的迁移、受体-配体的相互作用、蛋白质的磷酸化和磷脂代谢作用。蛋白质激酶C(PKC)是Ca2+和对起着TPA受体作用的磷脂依赖蛋白质激酶。TPA向PKC上的结合引起很多基质的磷酸化,包括生长因子受体、细胞骨架蛋白质和转移-激活调节蛋白质。
C-AMP是一个主要通过CAMP-依赖蛋白质激酶A对细胞施加相反作用的调节分子。CAMP的细胞内含量由受体间型活性和腺苷酸环化酶抑制的结合来调节。某些研究表明,TPA和CAMP诱发的基因表达可归结作为一种共同的途径。为了研究AR基因表达的调节作用,我们决定考察这些调节途径的各种活性剂或抑制剂对AR特有的RNA在MCF-7细胞中生成的影响。
Forskolin是一种活化腺苷酸环化酶并导致胞内CAMP增加的药物。当以25μM的剂量供给MCF-7细胞4个小时时,就会看到AR mRNA的显著刺激作用,这说明CAMP途径在AR表达的调节中也起着作用。
与双边条曲菌素相关的
衍生物、类似物和肽
对与AR相关的衍生物、类似物和肽的制备和应用也作了予测分析,因此这些也属本发明的范围。这些具有生长调节活性的衍生物、类似物和肽可应用于各种肿瘤的诊断、予测和治疗。这些衍生物、类似物或肽与天然AR相比,生物活性可以增加,也可以减少。它们或许扩大或限制AR GIA-灵敏细胞的范围,仍然属本发明的范围。同样,与AR相关的并增大或减少生长调节活性的和/或扩大或限制对AR生长调节活性灵敏细胞范围的衍生物、类似物和肽的制备与应用可以找到有益的用途,包括但不仅限于伤口和烧伤的治疗。
与AR相关的本发明的衍生物、类似物和肽可用现有技术中已知的方法来制备,在基因和蛋白质水平上的生产工艺和操作属本发明范围。
在蛋白质水平上,通过现有已知的技术,许多化学改性的方法可用来生产类似AR的衍生物、类似物或肽。这些方法包括但不限于由内肽酶(如溴化氰、胰蛋白酶、Chmotripsin、V8蛋白酶等)、肽链端解酶、乙酰基化、甲酰基化、氧化等而进行的特殊化学***。抗双边条曲菌素抗体的生产
能识别双边条曲菌素或有关蛋白质的多克隆和单克隆抗体的生产也属本发明的范围。
在现有技术中已知的各种生产工艺可用于生产AR抗原决定基的多克隆抗体。为生产抗体,各种寄主动物,包括但不限于兔、小鼠、大鼠等,可通过注射AR蛋白质或合成AR肽使其免疫。依不同的寄主动物,各种辅药可用来增加免疫响应,包括但不限于弗洛因德辅药(完全的和不完全的)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性剂如溶血卵磷脂、普鲁兰尼克多元醇、聚阴离子、Peotides、油乳化液、Keyhole Lympet白兰蛋白、二硝基苯酚和潜在可用的人的辅药如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌菌苗。
抗AR抗原决定基的单克隆抗体可利用由连续细胞株培养生产抗体分子的任一种方法来制备。这些方法包括但不限于最初由Kohler和Milstein(1975,Nature 256,495-497)介绍的杂交瘤技术以及最近提出的人的B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.,1983,Immunology Today 4:72)和EBV杂交瘤技术(Cole et al.,1985,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,PP.77-96)。
包含该分子个体基因型的抗体片段可由已知的技术生产。例如,这些片段包括但不限于:由胃蛋白酶消化该抗体分子可产生的F(ab′)2片段;由还原F(ab′)2片段的二硫桥可产生的Fab′片段;由木瓜蛋白酶和还原剂处理该抗体分子可产生的两个Fab或Fab片段。
AR抗体可用于成熟AR及其前体和亚组分形态的定性和定量检测、AR蛋白质的亲和净化以及对AR生物合成、代谢作用和功能的解释。AR抗体还可用作诊断和治疗剂。
双边条曲菌素的应用
AR的双功能性提供了在体外和体内的广泛应用。包括AR、或它的具有生长抑制活性和/或生长刺激活性的片段和衍生物在内的任何化合物,可以单独或与其他生物活性生长因子、抑制剂或免疫调节剂一起,用于本发明的实践和方法中。
AR基因定位于涉及淋巴细胞分化的区段表明,AR可能在造血细胞的生长、活化或免疫抑制中起作用。这种功能还可由AR3未转译区段和其他胞质的类似区段间的同源性获得支持。
标题化合物可用于调节血管形成、骨吸收作用、免疫响应、联合神经效应器功能。AR还可以用以调节花生四烯酸级联。花生四烯酸的酶氧化导出大量的重要化合物,如***素、血栓素、前列环素和白细胞素。这些产品对许多生理效应是有效的随遇剂,例如,肌肉收缩、血小板聚集、白细胞迁移和胃分泌。AR、与AR有关的分子和它们的组合物在伤口的治疗和癌的诊断与治疗中特别有用。
伤口的治疗
AR可以以某种方式用于处理伤口,如皮肤伤口、角膜伤口和其他各种上皮及基质损伤,如慢性溃疡、烧伤、外科切口、创伤和衬有上皮的中空器官的伤口,如食管、胃、大小肠、口腔、生殖和泌尿***。采用什么方式决定于在生理上可接受的载体中对包括AR在内的医疗药品的局部应用。
本发明的药品(组合物)可用于处理各种各样的伤口,基本包括所有的皮肤伤、角膜伤和人体衬有上皮的中空器官的伤口。适于处理的伤口包括由创伤如烧伤、擦伤、刀伤等造成的伤口以及由外科手术如外科刀口和植皮造成的伤口。适于用本发明的组合物治疗的其他疾病包括一些慢性病,如慢性溃疡、糖尿病溃疡和其他非治愈性(营养性)疾病。
AR可被输入到生理上可接受的载体中以用于被作用的区域。载体的性质变化范围很大,决定于打算应用的位置。对于皮肤的应用,一般优先选用乳剂或软膏基质。适宜的基质包括羊毛脂、Silvadene(Marion)(特别适于烧伤的处理)、Aquaphor(Duke Laboratories,South Norwalk,Connecticut)等。如果需要的话,将含AR的组合物加入绷带或其他伤口包扎用品中也是可能的,这样可使伤口连续地与肽相接触。喷雾敷用药也可找到应用。
在治疗组合物中AR的浓度是不重要的,但应足以引起上皮细胞的增生。该组合物可局部地用于被治疗的部位,有代表性的是用于眼睛的眼滴剂和用于皮肤的乳剂和软膏。在眼疾治疗中,希望多次处理,一般每隔4小时或更短处理一次。对于皮肤病,则希望在治疗期间把治疗组合物连续地敷用在被治疗部位,每天敷用两到三次或更多。
标题多肽的用量随给药方法和其他活性化合物的使用等而变化,一般的范围大约是1-100μg。标题多肽可同生理上可接受的载体如盐水、磷酸盐缓冲的盐水等共同使用。使用量根据体外细胞响应和实验动物对标题多肽或含标题多肽的配方的响应凭经验决定。
AR化合物可单独使用,也可用其他生长因子、抑制剂或免疫调节剂一块使用。
肿瘤的诊断和治疗
本发明的组合物可用于各种瘤形成的诊断、予测和治疗。
AR及其有关分子被设想有许多诊断方面的应用。在本发明的实践中,可把标题多肽连接到某种标记物上,如放射性同位素、酶、荧光剂、化学发光剂、酶片段、颗粒等。这些化合物可用来在细胞上滴定许多AR受体。AR受体的鉴定是该细胞对AR和相关分子生物效应的可能反应的标志。AR、AR相关的分子和/或它们的抗体,可用于竞争测定法用来检测介质中特别是生理介质中的AR。现有技术中所多已知的诊断测试都可使用。
AR在体液和组织中的存在和水平可直接或相反地关系到某些癌的存在和扩散。对AR能够检测和/或定量化的试验可用于癌症的诊断和予测(见上文)。
本发明还涉及AR mRNA的检测。利用核酸探试剂检测包含全部或部分已知基因序列的序列,这种试验在现有技术中是众所周知的,因此可被采用。AR mRNA的水平可表明出现或存在有肿瘤,因此,能够对AR mRNA含量定量的试验是一种重要的诊断手段。
此外,表达AR受体的恶性细胞,可利用在受体结合试验中标记的AR或AR相关的分子,或是利用AR受体抗体本身来检测。按照AR受体的存在和密度可将细胞区分开来,因而,就为予测这些细胞对AR生物活性的灵敏度提供了手段。
AR还可用作抗肿瘤化合物。就体内使用而论,标题组合物可用不同的方式投药,包括但不限于注射、输注、局部封闭、不经消化道带进体内等。给药可在任意生理可接受的载体中,包括磷酸盐缓冲盐水、盐水和消毒水等。AR和相关的分子还可封装在脂质体中,也可连结到识别并结合到肿瘤或特殊抗原细胞的抗体上,因此,提供了达到本发明组合物目标的方法。
AR可在体内用于诱发肿瘤细胞的最终分化。这样的细胞已背离正常细胞特有的普通细胞分化过程,能够继续增生。相反,在大多数情况下,正常细胞分化成不能进一步发生***的细胞。这样,AR就能在肿瘤中重新激活正常细胞的分化,并最终阻止肿瘤的继续生长。这种能力在肿瘤治疗养生法中会找到非常重要的应用。
激酶敏感性癌可损害许多的器官,如肺、***、***、结肠等。在这种癌的治疗中,AR和它相关的衍生物、类似物和肽可单独使用或至少与一种其他的抗增生化合物一起使用。例如,这些抗增生化合物包括干扰素、TGF-β1、TGF-β2、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子α等。激酶敏感性癌症还可以通过在这种癌细胞中诱发生成AR的方法进行治疗。诱发剂包括但不限于***如17-B***、具有***活性的化合物、具有抗***活性的化合物如三苯氧胺。这些化合物任意的组合也可用作诱发剂。
本发明的化合物可在体外用来抑制对AR敏感的细胞或细胞株的生长,因此同对AR不敏感的细胞区分开来。这样,在异质混合物或细胞中不希望有的细胞对AR的生长抑制活性敏感的场合,就可分离出这种不希望有的细胞。例如,本发明的化合物可离体用于消除骨髓中的恶性细胞以进行自体骨髓移植。还可在血液重新输入前消除或抑制血液中恶性细胞的增生。
AR用于抑制一定细胞增生的最有效浓度可通过把不同浓度的AR加入到所测试的肿瘤细胞中并检测细胞增生的抑制量来确定。单个诱发剂和/或诱发剂结合物的最有效浓度可通过检测AR在这种癌细胞中的产生量来确定。
实施例:人体双边条曲菌素的生产、
提纯和鉴定
下文中将描述用TPA处理过的MCF-7细胞生产制造的双边条曲菌素的纯化和鉴定。
材料和方法
使用下面的步骤在MCF-7细胞中诱导AR的合成并制备和鉴定基本上纯净的AR。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
按照描述过的(Laemmli,1970,Nature 227:680-685)在SDS-PAGE板凝胶上(标准的或小型的Bio-Rad体系)分析蛋白质,并通过银染色检测蛋白质(Merril等,1981,Science 211:1437-1439)。
等电聚焦
基本上按照Isolab技术资料报的描述,对Resolve IFF凝胶进行等电聚焦。简单地说,把样品放在预制的琼脂糖凝胶上(85×100mm,PH3~10),并使该样品在一个使用Bio-Rad型3000Xi计算机控制的电泳电源的Resolve型FR-2500等电聚焦设备上进行聚焦。Bio-Rad IFF标样与样品并排地进行聚焦,染色,并使用发光的加有增感屏的Dupont Cronex使干凝胶在Kodak X-Omat AR胶片上曝光。
蛋白质的碘化作用
使用氯胺T方法(Barridge,1978,Methods Enzymol50:54~65)用125I标记蛋白质。
蛋白质测定
通过在不同波长(210到280nm)上的吸收测定蛋白质的浓度。使用Lowry(Lowry等,1951,J.Biol.Chem.193:265~275)和Bradford(1976,Anal.Biochem.72:248-252)方法,用牛血清清蛋白作为标样。
125I-EGF结合测定
当使用新生长的和/或***固定的A431细胞时,如同描述的(Carpenter等,1979,J.Biol.Chem.254,4484-4891;Shoyab等,1979,Nature 279:387-391;Delarco等,1980,J.Biol.Chem.255:3685-3690)该结合测定或在48-井组织培养板中完成,或在96-井聚氯乙烯板上通过将质膜固定来完成,如同描述过的(Kimball和Warren,1984,Biochem.Biophys.Acta 771:82-88)。
双边条曲菌素的生产
从TPA处理的MCF-7细胞中
收集条件培养基
在T150 Corning组织培养烧瓶中,在总体积为25ml的50%IMDM(Iscove′s改性的Dulbecco′s培养介质)+含有0.6μg/ml胰岛素的50%DMEM和15%热失活的胎牛血清(MCF-7完全培养基)里培养MCF-7细胞。每个烧瓶大约有1×106细胞,并在37℃下5%CO2的条件下培养。在第6天时,除去所有的培养基,并把20ml新鲜的含100μg/ml TPA的MCF-7完全培养基加到每个烧瓶中。48小时后除去培养基,用15ml的50%IDMM+50%DMEM(无血清培养基)冲洗每个烧瓶,并把25ml新鲜的无血清培养基加到每个烧瓶中,在37℃下,5%CO2的条件下培育。四天后收集条件无血清培养基,离心除去碎块,在-20℃时贮存。烧瓶中再加入25ml无血清培养基,且每第三天或第四天收集条件无血清培养基。测定每次收集中的条件培养基等分试样在A431人体表皮癌细胞上的生长抑制活性(GIA)。通常从每批TPA处理的MCF-7细胞中收集条件培养基3到4次。
粗AR的分离
融化约4500ml条件培养基,并在4℃下以3500rpm离心15分钟。4℃时,在一个用YM10膜(Amicon)的Amicon 2升浓缩器里浓缩上层清液。当保留物体积变成约200ml时,加入1000ml冷的Mili-E-Q水,并将这个混合物再浓缩到200ml。
移出浓缩物,将其转移到一个予冷过的250ml Corning离心瓶中。搅拌下慢慢加入浓乙酸直到乙酸的最终浓度为1M。将该混合物在4℃时放置1小时,并在4℃时,在一个Sorval RC-5B离心器内以40,000×g离心20分钟。移出上层清液并于4℃下贮存。将剩下的片状物悬浮在30ml 1M的乙酸中,并按照上文描述的再次离心,将上层清液再小心地移出,并与第一次的上层清液合并,然后在3号光谱孔隙(Spectrapore)渗析管中对17升0.1M乙酸进行渗析(切断约3000分子量)。两天内,改变三次渗析缓冲液。将保留物冻干。移出干燥的材料,合并,称重并在-20℃下贮存直到下一步再使用。我们称此材料为粗粉沫。
AR的提纯
反相液相色谱法
把950mg粗粉沫(来自约9升无血清条件培养基)悬浮在300ml0.1%TFA(三氟乙酸)中,并以7,000×g离心20分钟。小心地移出上层清液并将它加到用0.1%TFA水溶液平衡的制备C18柱上(2.54Cm×27Cm;55~105微米;Waters),把色谱支持物悬浮在带有0.1%TFA的乙腈(MeCN)里,将该淤浆注进一个直径为2.54Cm的柱中,用400ml带有0.1%TFA的MeCN洗涤柱子,然后用600ml0.1%TFA的水溶液平衡。流速是4ml/min,且该色谱分析在室温下进行。柱子用650ml0.1%TFA的水溶液洗涤。将透过物和洗涤物收集在一起。然后如下进行分步洗脱:(1)650ml带有0.1%TFA的20%MeCN/H2O,(2)650ml带有0.1%TFA的40%MeCN/H2O,(3)650ml带有0.1%TFA的60%MeCN/H2O和(4)650ml带有0.1%TFA的100%MeCN。从每一馏分中取出等分试样测试GIA。在透过物和洗涤物馏分中出现大约整个GIA活性的77%。
把透过物和洗涤物馏分同时注入到一个连在高性能液相色谱(HPLC)体系(Waters)上的制备Partisil10 ODS-3柱上(10微米,2.2×50Cm,Whatman)。流速定在4ml/min。一旦有样品通过柱子,就用250ml0.1%TFA水溶液洗涤柱子,在基本溶剂(0.1%TFA的水溶液)和辅助溶剂(含0.1%TFA的乙腈)之间产生线性梯度。该梯度条件是:0到15%10分钟,15到15%30分钟,15到25%150分钟,25到65%100分钟,65到100%10分钟。所有溶剂都是HPLC级的。收集每种馏分14ml,并且用等量的每一馏分测定GIA。发现两个活性宽峰(图1)。对最早的洗脱峰(在20~23%乙腈间洗脱的)进一步提纯和鉴定。
合并47到62的馏分。把224ml0.1%的TFA水溶液加到该合并馏分中。将混合物在室温下以2ml/min的流速同时注入到一个半制备的μ-Bondapak-C18柱上(7.8×300mm,Waters)。线性梯度条件是0到17%10分钟,17到17%30分钟,17到25%320分钟,25到100%40分钟。在梯度期间流速是1ml/min,并且收集4ml馏分。取等分试样测定GIA。在用大约20%和21%浓度的乙腈洗脱时,分别观察到两个主要的活性峰(图2)。
合并49-53馏分。把20ml0.1%的TFA加到该合并馏分中。在室温下以1ml/min的流速把该混合物同时加到一个μ-Bondapak-C18柱上(3.9×300mm,Waters)。梯度条件是0~18%10分钟,18~18%30分钟,18~25%280分钟,25~100%20分钟。流速是0.4ml/min,并收集2ml的馏分。当乙腈浓度约为21.5%时,从柱中排出大部分活性(图3A)。合并54-59馏分(图2),并完全按照上面图3A中的描述进行色谱分离。以大约22.2%的乙腈浓度从柱子中洗脱出大部分活性(图3B)。凝胶渗透色谱法
用一个Speed-Vac浓缩器(Savant)分别将35到38的馏分(图3A)浓缩至约70μl,向其中加入等体积的含有0.1%TFA的乙腈。把这个140μl的样品注入一前一后联接的两个Bio-Sil Tsk-250柱上(每个7.5×300mm,Bio-Rad)。在室温下用一种带有0.1%TFA的50%乙腈/水的流动相同时进行洗脱。流速是0.4ml/min,记录纸速度是0.25Cm/min,收集0.4ml的馏分,取等分试样测定GIA。在图4A、4B和4C中分别表示馏分35、36和37(图3A)的色谱图。
合并馏分41和42(图3B),并浓缩至70μl,然后使其进行如上描述的凝胶渗透色谱分析。图4D给出该谱图。
细胞生长测定
用125I-脱氧尿苷掺入DNA
进行细胞生长调节的测定
在96平面井板(Falcon 3072)上进行测定。人体阴门细胞表皮癌(A431)用作生长抑制活性(GIA)的测试细胞,人体***成纤维细胞(Sadamoto)作为生长刺激活性(GSA)的指示细胞。把在加有5%热失活的胎牛血清(FBS)、青霉素/链霉素(PS)和谷酰胺(试验培养基)的50μl的DMEM中的3.5×104细胞放在除了四周的所有井中。四周的井中放入50μl PBS。三小时后,把50μl存在于试验培养基中的测试样品加到每个井中,同时对照井中仅加入50μl的试验培养基。对于每种浓度的试样使用三个井。板在37℃下培养2-3天。这之后把100μl125I-碘代-2′-125I-脱氧尿苷溶液〔4Ci/mg-0.5m Ci/ml(2μl/ml试验培养基中)〕加到每个井中,并在37℃下培育板。4~6小时后从井中吸出培养基,用200μl PBS洗涤一次,然后把200μl甲醇加到每个井中,在室温下将板培育10分钟并通过抽吸除去甲醇。把200μl 1M的氢氧化钠加到每个井中,在37℃下将板培育30分钟,用titertek管塞(Flow Labs)移出氢氧化钠。该管塞移进12×75mm的塑料管中,并用一个γ-计数器计算以确定125I-IUdR的掺入量。
软琼脂菌落测定
把0.5ml含有10%热失活FBS的DMEM中的0.5%琼脂(琼脂Noble;Difco实验室,Detroit,Michigan),基层加到24井Costar组织培养板上,把0.5ml含同样培养基-FBS混合物的0.3%琼脂,5~10×103试验细胞和将要以各种浓度被测试的因子铺盖在琼脂基层上。37℃下,在含5%CO2的空气潮湿大气中培育板,七天后加入0.5ml0.3%的含同样培养基和浓度的试验材料的琼脂进行鉴定,不固定、未染色地计算菌落数,在7至14天之间计算出大于20细胞的菌落数。
细胞生长抑制的测定
在24井Costar培养板(约2Cm2/井)上,将A431细胞以在0.3ml培养基(带有10%FBS,P/S,谷氨酰胺的DMEM)中有2.1×104细胞的量铺敷在每个井中,并在37℃下培育2小时。然后将在0.3ml培养基中各种浓度的试样一式两份导入每个井中。对照井中加入没有任何样品的培养基。在37℃下把板培育72小时。然后吸出培养基,用1ml PBS/井洗涤细胞,用0.5ml的胰蛋白酶(0.5%)-EDTA(0.5mM)分离细胞,并用Coulter计数器计数。
AR基本结构的分析
还原作用和S-吡啶乙基化作用
在1.5ml聚丙烯微量驱除(microfuge)管中干燥AR(20~30μg),把它悬浮在100μl的于0.05M TRIS-Hcl中的3M的尿素里,PH值为7.5,把4μl 2-巯基乙醇加到该混合物里,混合各成份,用氮气吹洗,并在25℃下培育。2.5小时后,把4.5μl新蒸馏的4-乙烯基吡啶加到该混合物中,把该管再用氮气吹洗,在25℃下培育2小时。用10%的TFA将反应混合物酸化至PH2.0。通过rP HPLC用μ-Bondapak C18柱(3.9×300mm,Waters)纯化S-吡啶基乙基化的AR。在55分钟过程中,乙腈的浓度线性增加(1%/min),流速为1ml/min。基本溶剂是0.1%的TFA,用浓度大约26.5%的乙腈洗脱S-吡啶基乙基化的AR(SPE-AR),与未处理的AR相比,乙腈浓度大约高4%。
N-聚糖酶处理
在1.5ml聚丙烯微量驱除(microfuge)管内干燥AR或S-吡啶基乙基化的AR(10~20μg),把它悬浮在80μl PH5.5的0.1M磷酸盐缓冲剂中,加10~20μl的N-聚糖酶(0.25单位/μl,Genzyme),将混合物在37℃下培育16小时,并把0.9ml0.2%的TFA加到该反应混合物中,将样品以1ml/min的流速注射到预先用基本溶剂0.1%的TFA平衡的超孔(ultrapore)RpsC C3rpHPLC柱上(4.6×75mm,Altex)。带有0.1%TFA的乙腈用作辅助溶剂。室温下在85分钟的期间内乙腈浓度线性增加(0.4%/min)。分别用浓度近似为16.5和20.5%的乙腈洗脱出N-脱糖基化的AR和N-脱糖基化的S-吡啶基乙基化的AR。
N-聚糖酶处理的S-吡啶
基乙基化的AR的酶裂解
25℃下,在PH8.0的60μl0.1M TRIS-乙酸缓冲剂中用肽链内切酶Lys-C的裂解进行16小时。酶/底物比是1到5(W/W)。37℃下,在80μl PH8.0的0.05M TRIS-Hcl和0.1M碳酸氢铵中,肽链内切酶-Arg和S.aureus V8蛋白酶的分解进行16小时。酶/底物比也是1到5。
化学裂解
对于在蛋氨酸残基上的CNBr裂解,在1.5ml聚丙烯微量驱除(microfuge)管上干燥5μg的N-聚糖酶处理过的S-吡啶基乙基化的AR,把它悬浮在75μl70%的甲酸中,然后加入25μl的CNBr溶液(25mg/ml,70%的HCOOH中),混合,用氮气吹洗管子,反应在25℃下黑暗处进行22小时。用水稀释反应混合物到1.1ml,并在一个Speed-Vac浓缩器中干燥。把干燥的试样悬浮在20μl的2-氨基乙醇内,在22℃下使其放置10分钟,然后真空干燥。将混合物悬浮于0.9ml0.2%的TFA中。
肽的分离
在连接到HPLC体系(Waters)上的一个反相HPLC C3柱中(4.6×100mm,Whatman)分离肽。以1minml的流速将酸化的试样(PH2.0)加到一个用0.1%TFA(基本溶剂)平衡的柱上,然后柱子进一步用约15ml的0.1%TFA冲洗。在基本溶剂和带有0.1%TFA的乙腈辅助溶剂之间使用线性梯度。梯度条件是0到50%125分钟,流速为0.5ml/min。
氨基酸分析
在减压下,105℃时,在一个Taflon-封闭的玻璃水解球(Pierce)内用含有1%(V/V)酚的恒沸Hcl(5.7M,Pierce)水解干燥的试样16小时。在一个Speed Vac浓缩器(Savant Instruments)里干燥水解产物,并在室温下用苯基异硫氰酸酯衍生物20分钟。通过rp HPLC,在一个十八烷基柱(4.5×250mm,IBM)上分析苯基硫代氨基甲酰基氨基酸衍生物。在38℃下以1ml/min的流速。完成基本溶剂(0.15M PH6.4的乙酸钠、用乙酸滴定到PH6.4的0.05%三乙胺)和辅助溶剂(60%的乙腈)之间的线性梯度层析。
氨基酸顺序的确定
按照描述过的(Hewick等,1981,J.Biol.Chem.256:7990-7997)用一种施用生物***模式475气相顺序分析仪确定肽链顺序。对每一试验过程施用样品之前先进行三次Edman降解预循环。使用25%的TFA把***啉衍生物转化成苯基乙内酰硫脲氨基酸。按照描述过的(Hunkapiller和Hood,1983,Science 219:650-659)在120A型PTH分析仪上(施用生物体系)联机进行苯基乙内酰硫脲氨基酸的鉴定。
各种处理
50~100单位的半纯净的(半制备rp C18步)或看起来纯净的AR用于这些实验(表1)。N-聚糖酶和0-聚糖酶来自Genzyme Corp.,Boston;所有其它的酶来自Boehringer Mannheim Biochemicals或Worthington Biochemicals。各种处理在50~200μl的适当缓冲剂中进行。使用过量的酶,通常为底物浓度的5~20%(W/W)。处理完后,通过各种分析手段除去干扰物质,分析样品的GIA。在多数情况下,用10%TFA将样品PH调至大约2。将样品加到一个用0.1%TFA平衡的反相超孔Rpsc C3柱(4.6×75mm,Altex)上。柱子进一步用基本溶剂0.1%的TFA冲洗。然后用带有0.1%TFA的乙腈作为辅助溶剂开始洗脱。该梯度条件是0到50%0.2分钟,50到50%19.8分钟。流速是0.5ml/min,收集2ml的馏分,取等分试样测定GIA。AR活性通常在馏分4中洗脱出来。
DNA结合的研究
按照描述过的(Herick和Alberts,1971,Method in Enzymology 21:198)完成AR对天然牛胸腺DNA纤维素、变性牛胸腺DNA和纤维素的结合。在500μl负载的缓冲剂(20mM Tris PH7.4,10%甘油,1mM EDTA,1mM β-巯基乙醇、100μg/ml BSA和50mM Nacl)中再水合纤维素(10mg)。在一个1.5ml装有300μl(填充体积)用负载缓冲剂洗涤5次的水合纤维素样品的eppendorf管中进行反应,一式两份。然后将在250μl负载缓冲剂中的0.2ng125I-AR(特异活性425μ Ci/ng)或其它125I-标记的蛋白质加到每个管中。把样品混合,并在4℃下伴随周期性的振荡培育20分钟,然后每次用200μl的负载缓冲剂洗涤5次。依次用Nacl浓度为0.1M、0.15M、0.25M、0.6M、1M和2M的负载缓冲剂进行洗脱(5次,每个浓度200μl)。特殊键合的材料定义为以0.25M Nacl或更高浓度洗脱的材料。以0.15M Nacl或更低浓度洗脱的材料看作是非特定键合的材料。
结果
通过TPA处理的MCF-7细胞生产AR
生长在塑料底物上的MCF-7细胞表现出典型的上皮样特征:细胞小且是多边形。在一个与剂量有关的方法中TPA引起了显著的形态变化。下述的TPA处理,即MCF-7细胞丢掉了它们的好的限定的形态的,变成了圆形的,并且扩展了。TPA引出在细胞数目上与剂量有关的降低和在细胞体积上与未处理的细胞相比有所增加。
来自MCF-7细胞中的无血清条件培养基不含有任何A431细胞的可确定生长抑制活性。然而发现从用TPA处理2-3天的MCF-7细胞中收集来的无血清上层清液能抑制A431表皮癌细胞的增生。抑制活性的最佳诱导作用是在25到100ng/ml TPA浓度之间观察到的。即使除去TPA之后,经TPA处理过的MCF-7细胞,在无血清培养基中隐藏这种活性至少可达8天。尽管已注意到在TPA除去后,随着时间生长抑制活性在降低,但是上述结果指明AR在已用TPA处理过的MCF-7细胞中会诱导或增加表现。
最初的鉴定
表Ⅰ概括了在AR抗增生活性上各种物理的、化学的和酶的处理效果。AR的GIA(生长抑制活性)对1M乙酸、1M氢氧化铵、6M脲素、0.01M偏高碘酸钠的处理、56℃时加热30分钟、和用神经氨酸苷酶、N-聚糖酶、O-聚糖酶、脂酶、磷脂酶A2、C或D的处理具有抵抗力。但是活性对于100℃加热10分钟是敏感的,对于还原和4-乙烯吡啶的处理是敏感的,以及对用蛋白酶如胰蛋白酶、肽链内切酶Lys-C、肽链内切酶-Arg和肽链内切酶-Glu(V-8)的消化也是敏感的。这些结果提出AR是一种在二硫化物键合中含半胱氨酸的蛋白质,这种键合对于其生物活性是必要的。这种蛋白质可以含低聚糖和/或亲脂部分,它们对生物活性不是必须的。
表Ⅱ
关于AR的GIA各种处理效果
处理 控制百分数
4℃ 1M乙酸2小时 102
4℃ 1M NH4OH 2小时 97
50°30分钟 96
100°10分钟 5
6M尿素(25℃ 2小时) 82
0.2M2-巯基乙醇(25℃ 2.5小时) 6
2-巯基乙醇+4-乙烯基吡啶
(25℃ 2.5小时)+(25℃ 2小时) 1
0.01M偏高碘酸钠(暗处4℃6小时) 86
TPCK-胰蛋白酶(37℃ 6小时) 3
TPCK-胰蛋白酶+大豆胰蛋白酶抑制剂
(37℃ 6小时) 82
大豆胰蛋白酶抑制剂(37℃ 6小时) 109
肽链内切酶Lys-C(25℃ 20小时) 5
肽链内切酶Arg(37℃ 16小时) 4
肽链内切酶Glu(37℃ 16小时) 6
神经氨(糖)酸苷酶(37℃ 16小时) 103
N-聚糖酶(37℃ 16小时) 90
O-聚糖酶(37℃ 16小时) 102
神经氨(糖)酸苷酶+N-聚糖酶
(37℃ 16小时) 94
表Ⅱ(续)
神经氨(糖)酸苷酶+O-聚糖酶
(37℃ 16小时) 105
磷脂酶A2(37℃ 6小时) 82
磷脂酶C(37℃ 6小时) 95
磷脂酶D(37℃ 6小时) 80
脂酶(37℃ 6小时) 111
AR的提纯
表Ⅲ表明了AR提纯的概要。TSK250-Ⅰ馏分获得5.1%产率的1,842一倍的提纯。TSK250-Ⅱ馏分得到1.7%产率的2,270一倍的提纯。该方法是可重复的。我们在4种不同的场合提纯AR有类似的结果。提纯过的AR的特异活性在2.7~3.4×106单位/mg蛋白质的范围内。从TSK-250-I柱中得到的具有大约3.0×106的特异活性的纯化AR被用于结构的测定和其它生物化学的研究。
HPLC分析AR和S-吡啶基乙基化
的AR(SPE-AR)
图5A和5B分别表示在一个TSK250柱(7.5×600mm,Bio-Rad)上AR和SPE-AR的凝胶渗透色谱。该活性随蛋白质峰(5A)共洗脱。由图5的数据确定AR和SPE-AR的分子量,它们分别是14,000和17,000。由图12表示的截断的AR和AR结构计算的分子量分别约为8500和9100道尔顿。
AR和SPE-AR作为对称的单峰从一个超微孔RPSC C3rP.HPLC柱(4.6×75mm,Altex)中洗脱(图6A和B)。GIA随蛋白质峰共洗脱(图6A),洗脱SPE-AR的乙腈浓度约是21%。该乙腈浓度比洗脱未处理的蛋白质高大约4%。这些结果表明在被4-乙烯基吡啶改性的半胱氨酸残基中AR是富集的。因而使得AR更加疏水,能在较高浓度的乙腈下伴随着洗脱下来。
AR的SDS-PAGE分析
图7A表示在还原条件下,15%丙烯酰胺中,AR、N-聚糖酶处理过的AR(NG-AR)、SPE-AR和N-聚糖酶处理过的SPE-AR(NG-SPE-AR)的分析(图7A)。AR和SPE-AR以宽的扩散的单带在凝胶中移动,该扩散的单带在20000到25000范围(1到3道)内具有中间相关分子量22500。用N-聚糖酶处理SPE-AR和AR引起这些蛋白质较快的移动。NG-AR和NG-SPE-AR以单带移动,它们分别具有14,000和14,500道尔顿的中间分子量。当在非还原条件下,蛋白质在15%凝胶中移动时,观察到了类似的结果(没有表明数据)。用神经氨(糖)酸苷酶、O-聚糖酶处理AR,或者用神经氨(糖)酸苷酶和O-聚糖酶一起处理AR,无论是在还原还是非还原条件下,在凝胶中都不改变其电泳迁移率。因此,AR是一种含N-连接低聚糖链的单链糖蛋白,体外AR的GIA不需要该低聚糖链。
用磷脂酶D(PLD)(卷心菜)处理NG-AR或AR导致GIA减少到对照物的80%。使PLD处理过的NG-AR在一个C3柱上进行rP-HPLC处理,并用20%的SDS-PAGE分析提纯过的活性峰(图7B),观察到一个Mr5600的单带。这些结果表明PLD或在该PLD制备中一些污染的蛋白酶把AR转变成了活性的片段。
AR的等电聚焦(IEF)分析
如同在上文中描述过的那样进行125I-标记过的AR IEF分析。AR聚焦成一个其PI在7.6和8之间的单的宽带(图8)。NG-AR聚焦成一个其PI约为8.05的单带。因此,AR是一种基本单链N-连接的糖蛋白。
生物特性
在图9A中给出了用不同浓度的经提纯的AR对125I-脱氧尿苷掺入A431细胞的DNA的抑制作用。以近似0.2ng/井的浓度观察到了DNA合成抑制作用的50%。因此,可以认为以纯蛋白质约为0.13nM的浓度可达到在A431人体表皮癌细胞中DNA合成抑制作用的50%。然而,应该注意到AR的GIA依赖于各种实验条件,例如细胞/井的数目(细胞密度)、因子应用时间、处理时间、血清浓度和其它变量等。
当A431细胞生长在存在和不存在各种AR浓度的条件下时,通过直接细胞计数监视细胞的生长。我们发现,在一种与剂量有关的方法中AR抑制了A431的增生(没表明数据)。因此,125I-脱氧尿苷掺入DNA的程度是细胞生长的很好的量度。
图9B表明通过各种提纯过的AR浓度对125I-脱氧尿苷掺入人体***成纤维细胞(Sadamoto)的DNA的刺激作用。在近似0.7ng/ml或0.05nM的AR时,观察到2倍的125I-脱氧尿苷掺入的刺激作用。最大的响应值是近似6倍的125I-脱氧尿苷掺入这些成纤维细胞的刺激作用。因此,AR是一种人体成纤维细胞的生长因子,甚至存在有5%的FBS。
关于125I-脱氧尿苷掺入到各种肿癌和非肿癌人体细胞系和一些非人体细胞系的DNA中的作用,对AR的作用进行了研究。数据在表Ⅳ中给出。AR抑制了A431细胞的各种细胞系、人体***癌细胞HTB132、人体卵巢畸胎细胞HTB1575、人体子宫细胞CRL155的表皮癌、人体卵巢细胞HTB75的乳腺癌和人体***细胞HTB26腺癌的生长。对种种细胞(表3)没有表现出任何有价值的作用。AR刺激125I-脱氧尿苷掺入到几种人体成纤维细胞系、人体垂体癌细胞CRL7386、人体卵巢癌细胞HTB77,African Green Monkey(非洲绿猴)肾细胞BSC1和老鼠肾细胞SA6中。AR明显地不影响T.B或内皮细胞的增生。AR不抑制人体生育或细胞毒素T细胞在混合的白血球培养基反应(MLC)中的响应。
AR是一种单节显性蛋白质,为了活性它需要内链二硫化物键,不需要糖基化作用,在中等强度的酸和碱处理下是稳定的。并且在56℃下加热处理30分钟时是稳定的。当还原时,当在100℃加热5分钟时,当用胰蛋白酶、肽链内切酶Lys-C、肽链内切酶ARG或肽链内切酶GLU消化时,AR丧失全部的生物活性。
表Ⅳ
AR对细胞增生的作用a
C 指示细胞 生长抑制 生长刺激
活性(单位)b活性(单位)
人体 阴门A431表皮癌 125
人体 ***HTB132腺癌 240
人体 宫颈CRL1550表皮癌 28
人体 卵巢HTB75***腺癌 19
人体 卵巢HTB1572畸胎癌 55
人体 ***HTB26腺癌 5
人体 黑素瘤A375 N.D. N.D.
人体 ***ZR7530腺癌 N.D. N.D.
人体 ***MCF-7腺癌 N.D. N.D.
人体 肺A549腺癌 N.D. N.D.
人体 ***PC3腺癌 N.D. N.D.
人体 克隆H3347癌 N.D. N.D.
人体 淋巴母细胞(T细胞)CEM N.D. N.D.
人体 EBV转化的B细胞 N.D. N.D.
人体 喉Hep 2表皮癌 N.D. N.D.
表Ⅳ(续)
人体 颈癌CRL1594 N.D. N.D.
人体 卵巢HTB77畸胎癌 25
人体 ***成纤维细胞(Sadamoto) 225
人体 ***成纤维细胞(Goodwin) 70
牛 胎心脏内皮细胞 N.D. N.D.
鼠 Balb/3T3 N.D. N.D.
猴 非洲绿猴肾BSC-1 65
老鼠 肾SA645
a.把125单位(在A431细胞上的GIA)的AR悬浮在250μl试验培养基中,连续地用试验培养基稀释5个倍数。对每个细胞使用上述六种稀释液。测定馏分的生长调节活性,计算GIA和GSA的单位。
b.一个GIA单位定义为抑制125I-脱氧尿苷掺入细胞达50%所需要的因子数量。
c.一个GSA单位定义为增加125I-脱氧尿苷掺入细胞达100%所需要的因子数量。
N.D.=未观察到
在软琼脂中,在没有和有TGE-β存在的条件下,进行AR和EGF对NRK-SA6细胞菌落形成的作用。结果表示在表Ⅴ中。在与剂量有关的方法中,在有TGF-β的存在下,EGF引起了SA6细胞的锚地独立生长,由此发现AR在软琼脂中是一种很弱的SA-G菌落生成的诱导物(表Ⅴ)。
表Ⅴ
在软琼脂中AR和EGF对
NRK-SA6细胞菌落生成的作用
添加物 菌落的数量
(每ml) 每6个区块
无添加物 0
TGF-β(1ng) 0
AR(2ng) 0
AR(4ng) 0
AR(2ng)+TGF-β(1ng) 7
AR(4ng)+TGF-β(1ng) 8
EGF(2ng) 0
EGF(4ng) 6
EGF(2ng)+TGF-β(1ng) 30
EGF(4ng)+TGF-β(1ng) 114
按照文中的描述进行测定。
菌落定义为至少6个细胞的群集。
AR对于将EGF结合到其特定
受体上的作用
现已发现AR抑制125I-EGF向A431细胞的结合及向A431质膜的结合(图10)。分别以约1.1nM和1.8nM EGF的浓度时,观察到50%的125I-EGF结合到固定的细胞和膜上的抑制作用,而分别以1.8nM和5.7nM AR的浓度时,观察到EGF结合到细胞和膜上减少了50%。在两种情况中,在较高浓度下没有标记的EGF完全抑制125I-EGF受体的相互作用。但是对于向细胞和膜的结合,与AR的最大竞争分别是75%和50%。AR与EGF的竞争曲线也不是平行的。这些结果说明对于EGF受体,AR表现出较EGF低的亲和力。再者,AR可能具有与EGF受体密切相关的特定受体。
选择对AR抑制作用变化敏感的几种A431细胞系,观察到AR敏感性和每个细胞EGF受体或KD的数目之间没有相互关系(表Ⅵ)。
表Ⅵ
在各种A431细胞系的AR敏感
性和EGF-受体的KD数目之间
没有相互关系
EGF结合参数 对AR的相关敏感性
A431细胞系 每个细胞结合位置 KD(NM) (GIA)
A-3 4.6×1051.80 34
F-8 9.0×1053.13 20
A-2 5.1×1051.38 11
A-8 5.3×1053.18 1
选择在软琼脂中生长的各种A431细胞系。按照文中的描述进行EGF结合。从Scatchard图表计算KD和结合位置的数目(Scatchard等,1949,Ann.N.y.Acad.Sci.51:660~672)。
AR的化学结构
AR氨基酸顺序由S-吡啶基乙基化的蛋白质(SPE-AR)的微顺序分析和通过肽链内切酶Lys C、金黄色葡萄球菌V8和肽链内切酶Arg形成的断片导出。截短了的蛋白质和含有六个附加氨基酸蛋白质的顺序如下所示:
截短的AR
1 10
V V K P P Q N K T E S E N T S D K P
20 30
K R K K K G G K N G K N R R N R K K
40 50
K N P C N A E F Q N F C I H G E C K
60 70
Y IE H L E A V T C K C Q Q E Y F G
78
E R C G E K
较大的AR
1 10
S V R V E Q V V K P P Q N K T E S E
20 30
N T S D K P K R K K K G G K N G K N
40 50
R R N R K K K N P C N A E F Q N F C
60 70
I H G E C K Y I E H L E A V T C K C
80 84
Q Q E Y F G E R C G E K
上述顺序对每种氨基酸使用标准的一个字母的氨基酸缩写。在园括号里表示对其特性存在怀疑的氨基酸残基。字母“X”表示未知特性的氨基酸。已发现较大的AR的量约是截短的AR量的16%。
将AR蛋白质顺序与在国际生物医学研究基本数据(PIR13)中,遗传顺序处理库(Genetic Sequence Data Bank)(Bolt Beranek and Newman,Inc.,Los Alamos National Laboratory;Release #50)中和欧洲分子生物学实验室DNA顺序库(Release γ #12)中的所有蛋白质进行比较。这些研究揭示了AR是一种新的蛋白质,是生长因子EGF总科的一分子。该科包括EGF(小鼠、人、大鼠、牛等)、TGF-α、病毒生长因子(牛痘、粘液和Shope纤维瘤)、人血纤维蛋白溶酶原活化剂、牛因子Ⅸ、人因子Ⅹ、LDL受体、牛蛋白质C、人蛋白聚糖核心蛋白质、Drosophila Notch基因的产物,C.elegans lin 12基因的产物和海胆S.Purpuratus细胞谱系特性基因的产物。带有EGF总科蛋白质结构的AR结构的组合揭示了AR象EGF总科的其它分子一样,含有六种基本的半胱氨酸残基标志,保持了半胱氨酸残基恒定间隔、并含有一些特有的和高度保存的氨基酸。显然,AR落在了象EGF、TGF的生长因子科分子和象MGF、SFGF那样的生长因子科分子之间,尤其以天门冬酰胺的使用来表示。例如,在位置2上(第一个半胱氨酸=1)所有的TGFs和EGFs有脯氨酸,VGF有甘氨酸,以及MGF、SFGF和AR有天门冬酰胺。同环节中,在位置7上,EGFs、VGFs有甘氨酸、TGFs有谷氨酰胺,以及MGF、SFGF和AR有天门冬酰胺。然而在第三个环节上,AR在位置34上没有保存的β转角(在MGF、SFGF中是天门冬酰胺,在所有其它分子中是甘氨酸),而有一个谷氨酸(低的β-转角位)。对于可能影响受体结合的高度易保存的第三环节,AR有不同的结构。在生长因子结构内AR不具有可能作为糖基化作用点使用在MGF和SFGF中的天门冬酰胺残基。
AR顺序的N-端有些相似于TGFs、VGF和MGF顺序的N-端,其中富集了脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸,并且象TGFs和VGF一样具有潜在的N-连接糖基化位置(事实上有一个这样的位点)以及在这个富集丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸的部分有O-连接糖基化的可能性。在TGF前体的N-端和VGF的N-端之间,这个区域是易保存的,并且显然它是一种易糖基化的区域。
AR是一种非常亲水的蛋白质,尤其是在含有氨基酸8到45的区域(图2)。AR的水疗法分布图显示出与EGF科中其它分子很小的相似性。AR的C-端部分的水疗法分布图,尽管结构上与EGF科其它分子有关,但它不同于该科其它分子的分布图(图11B和C)。
AR特异性结合DNA
使用上文描述的测定方法,测试125I-AR结合纤维素、变性DNA纤维素和天然DNA纤维素的能力。图14A给出的结果表明AR特异性地结合变性的和天然的DNA纤维素,但不结合纤维素。结合天然DNA的能力比结合变性DNA大3到4倍。
AR的特异性结合DNA的能力将AR区别于EGF总科的所有其它分子。例如,EGF不能结合DNA纤维素(图14B)。该结果强烈地表明AR的亲水的45氨基酸N-端区域,不存在于EGF中或EGF科的其它分子中的,可以是一种把AR作为核目标的核定位顺序,在此因子与DNA相互作用。
实施例:对AR的抗体
在下文中描述了对AR、和合成的AR及AR前体肽的抗体的生产。
材料和方法
固相肽合成
按照上文描述的生产和提纯AR。相应于AR基本结构(图15)的残基31-50(279号),71~90(280号)108-130(264号)、166-184(259号)和221-240(281号)的五种肽,基本上按照描述过的(Merrifield,1963,J.Amer.Chem.Soc.85:2149),通过固相技术在一个Applied Biosystems Inc.自动肽合成仪上合成。使用一种高HF***方法(Tam等,1988,J.Amer.Chem.Soc.105:6442)从树脂支持物中把合成的肽断裂。通过反相HPLC提纯合成的肽。
抗体生产
在幼年新西兰白兔上制备以化学连接到关键穴 形血清蛋白(KLH)上的对成熟AR和合成AR-肽多克隆的抗血清。将如同描述过的(Ishikawa等,1983,Immunoassay 4:235)合成肽连到KLH上;成熟的AR不偶联。
用Ribi辅剂体系(Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)乳化AR或肽结合体。对每支兔子给药总剂量为1ml:在每支后腿的两处肌肉给药0.8ml,在1处皮下给药0.2ml。为了对成熟的AR生成抗血清,把30μg成熟的AR用于最初的接种,15μg用于随后的辅助剂注射。为了对合成的AR-肽生成抗血清,把100μg结合的肽用于最初的接种,50μg用于随后的辅助剂。每3到4周进行辅助剂接种,辅助剂注射后兔子失血10到14天。
免疫沉淀
使用氯胺T的方法用125I放射标记AR(Barridge,1978,Methods Enzymol,50:54~65)。将10μl多克隆血清(或在PBS中的稀释剂)与10μl125I-AR(50μg/ml,特异活性425μ Ci/ng)和30μl PBS混合,并基本上按照描述过的方法(LeBier等,1982,J.Immunol.129:2287-2292)进行测定。
放射免疫测定
多克隆血清以1∶50的比例在PBS中稀释。用TNEN/0.1%BSA(20mM Tris PH7.4,5mM EDTA,150mM Nacl,0.05%NP-40,0.1%BSA)以1∶200的比例稀释125I-AR(1μg/ml,特异活性425μ Ci/μg)。使10μl未标记的AR(1mg/ml)、10μl稀释过的多克隆血清和30μl稀释过的125I-AR混合,并在室温下培育45分钟。如下制备蛋白质A-琼脂糖溶液:用1.4ml PBS再水合200mg干的Pharmacia蛋白质A-琼脂糖,用含有100mM Tris PH8.1,150mM Nacl,0.5%Triton X-100,2mM PMSF,1% Aprotinin和0.5ng/ml Levpeptin的溶液洗涤80μl的再水合物,并稀释到400μl。然后把20μl蛋白质-A溶液加到该混合物中并使其再培育30分钟。把该琼脂糖珠用500μl TNEN/0.1%BSA洗涤2次,悬浮到50μlSB(80mM Tris PH6.8,3%SDS,15%乙二醇,0.01%溴酚兰,5%β-巯基乙醇)中并在100℃加热5分钟。离心分离样品并用一个γ计算器测定上层清液的放射活性,该方法检测量与100Pg AR同样小。
酶连接的免疫吸着剂测定
根据序号为740124的美国专利(1985年5月30日申请)修改固相微量-ELISA方法。通过向每一个井中加入5μlAR合成的肽来制备Terasaki微量盘,将其用PBS稀释成各种浓度,然后使该溶液在室温下干燥过夜。将5%的Blotto PBS液加到板上并使其在室温下放置1小时。随后,把10μl多克隆抗体溶液的稀释液(用PBS/1%Blotto/0.05%Triton X-100稀释)加到每个井中,在室温下培育1小时,然后用PBS洗涤4次。将5μl用PBS/1% Blotto/0.05%Triton X-100按1∶1000稀释的过氧化物酶结合的山羊抗兔IgG(Cappel)加到每个井里,在室温下培育1小时,然后用PBS洗涤6次。加入以1∶20稀释的10μl MicroEIA Chromogan Solution(Genetic Systmes Corp.),然后根据Genetic***微-EIA草案在20分钟和40分钟后在OD492处读出吸收率。
WESTERN印迹
将样品在一个15%聚丙烯酰胺凝胶上或在一个16% tricine聚丙烯酰胺凝胶和一个BioRad微凝胶装置上电泳。
然后把该凝胶放在靠近的硝化纤维板上,并夹在盒子之间使该硝化纤维位于阴极一侧。以恒定功率用400mA的电流使蛋白质传递30分钟。然后除去硝基纤维并在4℃时在2.5%Blotto/PBS/0.2%NP-40中浸泡过夜。
然后,在一个振动的台子上,使硝化纤维滤板在室温下暴露在用2.5%Blotto/PBS/0.2%NP-40反应缓冲液稀释的抗血清中90分钟,随后用2.5%Blotto/PBS/0.2%NP-40洗涤4次(每次洗涤5分钟)。
然后把用2.5%Blotto/PBS/0.25%NP-40按1∶500稀释的碱性磷脂酶结合的蛋白质A(Cappel)加到硝化纤维板上,并在一个振动的盘上,在室温下培育60分钟。然后用PBS/0.2%NP-40把滤板洗涤4次(每次洗涤3分钟),随后用“APS”缓冲剂洗涤5分钟(100mM Tris PH9.5,100mM Nacl,5mM Mgcl2)。滤板
显色试剂中展开(40ml APS缓冲剂,12mg 5-溴-4-溴-3-indoyl磷酸酯(Sigma),6.8mg氮蓝四唑(Sigma),使用前配制并通过一个0.2μm过滤器过滤),用水洗涤然后在空气中干燥。
AR抗体的鉴定
通过放射免疫沉淀作用、放射免疫测定、ELISA和Western印迹对对成熟的AR和合成的AR-肽引起的多克隆血清进行鉴定。在表Ⅶ中给出结果。
表Ⅶ
对AR和合成AR-肽抗体的鉴定
多克隆 测定方法
血清 RIP RIA ELISA WB
成熟AR 1:256a1:250 ND 1:250
(.100Pb)b(1ng)
肽259 1:256 ND ND ND
肽264 1:256 1:250 1:100 1:100
(.100pb) (5ng) (0.1ng)
1:500
(1ng)
肽279 ND ND 1:100 ND
(5ng)
肽280 ND ND 1:100 ND
(5ng)
肽281 ND ND 1:100 -
(5ng)
a:所需抗血清的稀释度。
b:括号值表明方法的灵敏性。
RIP=放射免疫沉淀作用。
RIA=放射免疫测定。
ELISA=酶连接免疫吸着剂测定。
WB=Western印迹。
ND=未观察到。
实施例:双边条曲菌素前体的cDNA克隆
下面的例子描述了来自经TPA处理过的MCF-7人乳癌细胞编码双边条曲菌素前体的cDNA的克隆和分析。
材料和方法
RNA的制备
RNA是从在T150组织培养瓶中生长的或是用如Chirgwin(1979,Biochemistry,18,5294)所描述的Guanidinum方法从新鲜冷冻组织样品分离出的。出自四个T150的细胞在PBS中洗涤,经过胰蛋白酶处理,再于PBS中洗涤,并让片状物再悬浮于8ml 4M异硫氰酸胍盐溶液中。使上述溶液通过一个18标准针将DNA切断,样品在Beckman SW41Ti试管中涂在2.4ml 5.7M CsCl上,并在32,000rpm,20℃条件下离心20小时,片状物再悬浮在300μl 2.5M Cscl中,并用2倍体积EtoH在室温下沉淀,片状物再次被悬浮在300μl H2O中,然后加35μl 3M醋酸钠(PH5.2)和800μl EtoH,并在-70℃沉淀RNA。重复沉淀,并使RNA简单地干燥,再悬浮于100μl H2O中,于OD260下定量,并在-70℃贮存。
用32P-TTP随机搀入标记
AR编码区的特异片段从低凝胶温度琼脂糖(BioRad)中切除,并且用Feinberg(1983,Anal,Biochem.,137,266)开发的随机搀入方法用32P-TTP(NEN,3000Ci/mmol)标记。不结合的脱氧核糖核苷酸通过1.5ml交联葡聚糖(Sephadex)50柱层法除去,特异活性典型值是0.5-2.5×109Cpm/μg。
RNA凝胶和NORTHERN印迹分析
对10或20μg全部RNA在1.2%琼脂糖/甲醛凝胶上进行电泳移动作Northern印迹分析。在40mM N-吗啉代丙磺酸(MOPS),PH7.0/1mM EDTA/10mM醋酸钠/2/2M去离子甲醛(PH5.6)中于带冷冻平板的IBIVCV凝胶仪中制备琼脂糖/甲醛凝胶。RNA在65℃,用50%甲酰胺在同样的缓冲液中变性,并在1×MOPS,20-30mA下操作3-5小时。该胶在10×SSC中冲洗30分钟,并转移到Hybond-N膜上(Amersham),用UV-交联(1200μ Joules),在5×SSPE(1×SSPE是0.18M Nacl/10mM磷酸钠,PH7.7,0.1mM EDTA),5×Denhardt′s,0.5%SDS,中予杂交或杂交,并以20μg/ml变性鲑(鱼)***DNA作载体。杂交是在42℃下,用2×106Cpm/ml的32P-ARBP1进行16小时。杂交物用0.1%SDS的2×SSC在室温下洗涤几次,然后用1×SSC/0.1%SDS于65℃下洗涤几次,并在-70℃下于带两个Dupont Lightning Plus增光屏的Kodak X-OMAT上曝光。如果经过一夜曝光后谱带清晰可见,标为(+),如果三天曝光后可见,则标为(+/-),如果6小时后可见,则标为(++)。
cDNA克隆
RNA用100μg/ml的12-O-四癸酰基沸波醇-13-乙酸酯(TPA)处理24,40和72小时后收获得MCF-7细胞。Poly(A)+RNA从这些样品汇集起来的部分中分离出来,并用作双链cDNA合成的模板,基本上如(Gubler and Hoffman,1983,Gene 25:263)所述。G-结尾的cDNA用BR1寡核苷酸结合体连接到λgt10的ECO RI位点(Rose et al.,1986,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83:1261-1265)。
具体说,5μg TPA处理过的MCF-7 Poly(A)+RNA被加热变性,并在一个45μl反应体积内使用100U反转录酶处理用5μg寡(dT)装满。第二单链的合成是用4U RNaseH和115UE.Coli DNA Pol Ⅰ进行。10μg T4DNA聚合酶用于除去3′粘末端,产生平末端,整个6.8μg的双链cDNA通过Sephadex G50柱按大小排列,以挑选500bp以上的cDNA,之后150ng cDNA用末端脱氧核苷酸转移酶加dG-末端。dG-末端的cDNA用BR1结合体(AATTCCCCCCCCCCCC)与λg 10的Eco RI位点连接。连接的DNA在体外包装(Grosveld et al.,1981,Gene 13:227-237)并用板固定在E.coli C600 rk-mk hfl上,效率为106重组体/μg cDNA。重复的硝化纤维素升液器放在2.5×105重组体上,并且过滤物用〔32P〕-标记的最佳推测进行筛选,变性的寡核苷酸探针(下面表Ⅷ)从AR主要的序列中获得。如用还原-处理和S-吡啶基乙基化AR的自动Edman退化所测定的(如上述)。
限制酶分析表明在pAR1的cDNA***中缺少位点,有BsmⅠ,Eco RV,HgaⅠ,NaeⅠ,PvuⅡ,SmaⅠ,和SstⅠ单位点,和SspⅠ的两个位点。而在***内Bam HI,ClaⅠ,Eco RI,HindⅢ,KpnⅠ,PstⅠ,PvuⅠ,SphⅠ,StuⅠ,和XbaⅠ切不动。一个170bp BsmⅠ到PvuⅡ的片段被分离出,并用于探测基本上如上述方法制备出的100,000重组体的第二个cDNA文库。13个阳性克隆被鉴定出有300bp到1.3kb范围的***片段,其中6个要比1kb大,5个含有一个单SstⅠ位点,该位点已知位于从PAR15′末端开始的100bp之内,后5个***中的4个被亚克隆(PAR3,PAR5,PAR9,PAR13)以用于进一步限制和序列分析。所有这些克隆有基于BsmⅠ,Eco RV,PvuⅡ,SstⅠ,和SmaⅠ的相同的限制图谱,除了有一个100bp的3′截断的PAR9外,后来发现它是从一个A5径迹产生,估计用寡(dT)引发是足够的。
AR cDNA克隆子的核苷酸序列分析
采用双脱氧链-终止法(Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467)用准确的寡核苷酸引物来确定1230bp的pAR1克隆子的双股序列。克隆子pAR1的全部核苷酸和推想的氨基酸序列如图16。一个965bp的开放阅读框架开始于核苷酸第一号位置。第一个AUG处在位置210上,但由于在位置-3缺少一个嘌呤,对于翻译起始位点并不与Kozak最适宜交感相一致。(Kozak,1984,Nucleic Acids Research 12:857-872;Kozak,1986,Cell 44:283-292)。然而,这样的AUG三连密码子能够做为起始密码子,正如Kozak在大约3%的检测过的信息观察到的那样,并且在所有这些“较少受惠”的AUGs和AR的mRNA内的-1位置存在一个腺(嘌呤核)苷可能是重要的。尽管第二个蛋氨酸是处在与起始物交感序列相符合的核苷酸378位置,但第一个AUG被认为是一个真正的翻译起始点,这是因为它后面是被信号肽序列中有代表性的3个脯氨酸所间断的疏水残基占优势的予计19个氨基酸的伸展。(Heijne,1983,J.Biochem.133:17-21)
用蛋氨酸开始的最长的开放阅读框架编码一个包括19个残基的信号肽252氨基酸多肽。这个编码序列是在5′端不翻译序列的209个核苷酸之后,其后面跟着一个翻译终止信号TAA和3′-端不翻译序列的262核苷酸。一个潜在Poly(A)附加信号序列AATAA是处在来自一个伸展的15个腺(嘌呤核)苷酸残基64个核苷酸上游处,可能是Poly(A)的尾部。AR的3′不翻译区包括四个ATTTTA序列的复制品。这个序列也存在于某些淋巴细胞活素,细胞素和原(致)癌基因内,在GM-CSF内这个序列协调RNA的去稳定作用和降介作用(Shaw,1986,Cell 46:659-667)。在功能上类似分子中的这种特色的守恒性说明AR可能与这类淋巴细胞活素有关。
除了氨基酸位置113(图15)用蛋白质测序分析为天冬氨酸(D),并推断为来自cDNA克隆子的天冬酰胺(AAT=N)外,cDNA序列证实了成熟AR肽序列(如上述)。已检测的5个cDNA中,在PAR1序列的第一个25bp之内全部有5′末端。
用最好的推测探针比较cDNA序列,显示出74%(ARK41)和77%(ARK31)完全同系现象。没有一个探针有多于8个连续bp匹配,但总的来说,在相当低的严格条件下,与ARK41相匹配67个核苷酸中的50个核苷酸产生一个可测的信号。AR的mRNA序列所使用的密码子与Lathe(Lathe,1985,J.Mol.Biol.183:1-12)报道的使用频率有相当程度的差异,从而解释了为什么在这个实例中变性的寡核苷酸提供更强的信号。从cDNA和蛋白质序列,9772和9173分子量的两个蛋白质予计为基于cDNA(图16)和蛋白质(如上述)序列的成熟AR的两种形式。AR前体的水疗法断面图如图11D。
这个AR前体有3个潜在的N-糖基化位点,一个是在N-末端区(图16位置30),2个在成熟的AR亲水区(位置113和119)。认为糖基化(作用)使10-12Kd有助于达到成熟AR的分子量,并且可能在亲水区内,在这些位置上的一个或两个位点从碳水化合物的加成作用中发生。
基于酸性残基(转换-诱导氨基酸)的存在,及缺少可能导致空间位阻现象的残基,AR前体(图15)的N-末端富丝氨酸区包含处于Y81,Y83,Y87的三个潜在的酪氨酸硫酸盐化作用位点。(Huttner,1987,TIBS 12:301-303)。多数硫酸盐化的酪氨酸蛋白质是解离(Secetory)蛋白质。酪氨酸-硫酸盐化作用的变异作用被认为与激活作用,运输作用,或前体蛋白的蛋白水解过程有关。AR的富丝氨酸区可能也含O-键合的糖链,它在这个分子的这个区域内给予丰富的丝氨酸/苏氨酸残基(81中的23),是这类键的位点。在这一方面,EGF族的另一个成员的O-糖基化形式(TGF-α)已被确定(Ignotz et al.,1986,PNAS,83,6307-6311)。
在AR前体中没有一个丝氨酸残基适合于对依赖-CAMP激酶的磷酸化作用位点的交感序列(Grima,et al.,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:617-621),也没有任何酪氨酸残基呈现与已知的磷酸酪氨酸残基相似的侧翼序列。
成熟AR蛋白质的亲水区是许多带正电的氨基酸(37残基中的16个是赖氨酸或精氨酸)组成的,包括4-5个碱性带电残基中的两个连续伸展,SV40大T抗原的核酸靶信号相似于AR的这个区,并包含一个特征化的KKKRK序列,在其之前是可能允许形成α-螺旋结构(Burglin et al.,1987,EMBO 6:2617-2625;Dingwall,et al,1987,EMBO 6:69-74)的小的氨基酸(甘氨酸,丙氨酸,脯氨酸)。突变分析确定了作为SV40核定位序列(Lanford,1984,Cell,37,801-813)主要特点的四个连续碱性残基。其他认为与核靶有关的碱性氨基酸相似伸展的核蛋白包括核原生质、多瘤病毒大T,组蛋白和C-myc。对鸡丙酮酸激酶,清蛋白,免疫球蛋白,铁蛋白和β-半乳糖苷酶的基因,各种核信号序列的融合导致对于核的这些不同的细胞质蛋白的定位(Moreland,1987,Mol.Cell.Biol.7:4048-4057)。不论AR的亲水性序列是否参与靶中,这个核的生长调节剂尚未证实,然而AR特异结合DNA能力意味着AR在核内具有功能性作用。在这方面,AR可能调节DNA合成,细胞周期或许多其它核过程。
这个TGF-α前体包含在C-末端细胞质区内的多个半胱氨酸,其中某些经历共价棕榈酸附着作用(Bringman,1987,Cell,48,429-440)。相反,AR前体缺少在其细胞质区内的任何半胱氨酸,因此就不能期望其含有棕榈酸残基,尽管棕榈酸附着作用的生物学功能还不知,然而这表示在AR和EGF超科的其它成员之间存在另一种差异。
双边条曲菌素合成的细胞起源
用α32P-标记的AR cDNA片段的Northern印迹分析(Thomas,1980,PNAS,77,5201)显示对从许多正常人体组织和肿瘤细胞系中的一个单一1.4Kb RNA种的杂交,应用或AREB1(包含成熟AR和一部分的N-末端前体和跨膜区的全部编码区的PAR1的一个480bp BstEⅡ-PvuⅡ片段)或AR170(包含只有成熟AR的C-末端一半的PAR1的170bp BsmⅠ-PvuⅡ片段)作为标记探针,可以在Northern印迹分析上看见一个单一的带。列在下表Ⅸ中的结果显示AR RNA的低水平表达(+)在正常成人肺和胰脏组织内被观察到,而可测的表达(+/-)在正常肾、肝和脑组织内被观察到。
表Ⅸ
正常人组织 AR RNA
肺 +
肝 +/-
胰脏 +
肾 +/-
脾 -
脑 +/-
胎盘 -
胎儿的肠 -
由于AR最初是从TPA处理的MCF-7细胞分离的,因之测定这些细胞内AR RNA的TPA诱导的时间进程是有意义的。MCF-7细胞用TPA处理0,1,3,6,18,24和48小时,全部RNA被分离,并使10μg在1.2%的甲醛琼脂糖凝胶的每个系列上操作、再转移到尼龙膜上,并用与成熟的AR全部编码区互补的ARBP1探针筛选出。TPA处理后的仅1小时,在1.4Kb AR RNA种中就可明显看出,在18到24小时之间到达的最大水平。随后的Northern印迹分析,用32P-ARBP1探测显示在其它乳癌细胞系内的TPA-刺激的AR RNA的合成,尽管其最大水平不如TPA诱导的MCF-7细胞高。
一组肿瘤细胞系在TPA诱导24小时之前和24小时后同时测试AR RNA水平。结果总结在下表Ⅹ内。除了一些例外,可测定的AR RNA唯一来源是在TPA处理过的人乳癌系内。这样的一个例外是Caki-1,即人的清晰肾癌系细胞,其与TPA诱导的MCF-7细胞中所见到的数量相比较,基本地表达高水平的AR RNA。所有检测过的TPA处理的乳癌细胞系都显示出AR-特异杂交。
AR明显地在成人的肺、胰脏、肾、肝和脑内起着某种功能性作用,很可能参与许多广泛的过程变化,包括愈伤恢复、组织再生和神经元细胞的维持。
表Ⅹ
人的细胞系 起源 AR RNA水平
未诱导的 TPA诱导的
MCF-7(HTB22) 乳腺癌 + ++++
HBL-100(HTB124) 正常*** - +
BT-474(HTB20) ***管癌 - +
MDA-MB-157(HTB24) 胸脊髓癌 + ++
MDA-MB-361(HTB27) 乳腺癌 + ++
脑转移
SK-BR-3(HTB30) 乳腺癌 - +
BT-476 ***癌 - +
JEG-3(HTB36) 绒毛膜癌 - +/-
Caki-1(HTB46) 肾清除细胞 +++ +++
皮肤转移
SK-HEP-1(HTB52) 肝腺癌 - -
G-401(CRL1441) 维耳姆斯氏瘤 - -
HEPM(CRL1486) 胚胎腭间质 - +/-
A-431(CRL1555) 表皮样瘤 - -
HBL-299(CCL137) 胚胎肺 - -
HUF ***纤维细胞 - +/-
实施例:双边条曲菌素基因的基因
组克隆和分析
下面的实例描述了人的双边条曲菌素基因的基因组克隆、其结构和内含子/外显子的组织。也讨论与生长因子的EGF超科有关的功能和进化的含意。
材料和方法
SOUTHERN 印迹分析
从T150细胞培养瓶的亚汇合细胞中分离全部基因组DNA(Maniatis,1982,In Molecular cloning:A Laboratory Manual)。20μg DNA按照说明用限制性内切酶消化,在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳,用20×SSC本底缓冲液(Southern,1975,J.Mol Bio.,98,503-517)印迹到Hybond-N(Amersham)上,并且DNA通过用1200μ Joules短波紫外曝光键合。过滤物在每ml含2×106Cpm的32P-标记的AR特异片段的杂交缓冲液中(6×SSC,5×Denhardt′s溶液,0.5%SDS和20μg/ml剪断变性的鲑鱼***DNA)于65℃杂交过夜。探针按5-25×108Cpm/μg的特异活性作随机搀入的标记。过滤物在1×SSC,65℃条件下充分地清洗,并在-37℃自动放射显影过夜。
基因文库的建立
噬菌体λL47.1被选为克隆载体,并使用BamHI,EcoRI和HindⅢ消化后制备好磷酸(酯)酶处理过的臂。MCF-7细胞中的高分子量DNA用HindⅢ消化,在0.8%低凝胶温度琼脂糖上(BioRad)进行电泳,并进行大小排列。对于予期限制片段最大浓度的琼脂糖部分在65℃熔化,用酚和NaOAc提取DNA,然后用乙醇沉淀,并在25-100μg/ml中再悬浮。
文库的建立包括于14℃100ngλ噬菌体L47.1臂和40ng提取的大小分开DNA在5μl反应体积内,用T4 DNA连接酶(Biolabs)进行过夜连接。重组体噬菌体在体外通过用E.coli菌株BHB2688 N205 recA-(Lambda imm434CIts b2 red3 Eam4 Sam7),和BHB2690 N205 recA-(Lambda imm434Its b2 red3 Daml5 Sam7)制备的提取物(Grosveld,1981,Gene,13,227-237)进行包装。文库在E.coli LE 392上测效价。用AR特异的DNA探针以在原位噬菌斑杂交(Benton,1977,Science 196,180-182)筛选出基因组克隆子,从噬菌斑提纯的阳性克隆子中(Huynh,1985,In DNA Cloning techniques:a Practical approach,D.Glover,ed.(Oxford:IRL Press),PP.49-78)分离DNA。HindⅢ***被切去,并亚克隆到PEMBL18上以备限制性内切酶分析和繁殖。
引物伸展测定
如上面所描述的那样从MCF-7细胞分离RNA。在对AR cDNA序列中从核苷酸40到60(ARAP)和76到97(ARCP)互补的合成寡核苷酸是用T4聚核苷酸激酶标记32P-末端达到2-5×108Cpm/μg的特异活性。被标记的寡核苷酸的一百万Cpm基本上如上面所述的那样,在50μg MCF-7RNA上被用来引发第一条cDNA链的合成。产物用RNaSe A处理,用酚和氯仿提取,用乙醇沉淀,在80%甲酰胺中于100℃热变性5分钟,并在标准的8%聚丙烯酰胺-7M尿素序列凝胶上进行电泳分析。
CAT检测
MCF-7细胞如上述那样被培养。对每次检测,1-2×106个细胞被涂布在100mm的盛10ml培养基的碟子上。24小时后,20μg磷酸钙沉淀的超螺旋质粒DNA被加到该细胞中(Southern and Berg,1982),转染后的4小时用新鲜的培养基漂洗细胞,并进行90秒25%甘油冲击。细胞再次被漂洗,并用包含0或100ng/ml TPA的20ml新鲜培养基涂布。甘油冲击后40小时清洗并收集细胞,在100μl 0.25M Tris-Hcl(PH7.8)中通过超声波作用进行细胞溶解。基本上按Gorman et al.,(1982)详述的那样检测CAT活性。细胞提取物(3-50μl)于有0.5M Tris(PH7.8)0.5mM乙酰辅酶A的150μl反应体积内被加入到2.5mci14C-氯霉素(NEN)中。反应于37℃保温2小时,用1ml乙酸乙酯提取,并在硅胶薄层色谱(TLC)板上展开,展开剂为氯仿∶1-丁醇(95∶5),干燥TLC板,并自动放射显影。乙酰化和未乙酰化的14C-氯霉素通过在Optifluor上通过计算删除的黑点定量。CAT酶活力单位是通过在细胞提取物内每μg蛋白质每小时被乙酰化的氯霉素的μg数计算的。
染色体原位杂交
质粒PAR9是用3H-TTP作随机搀入的标记,并在500-800带阶段对从植物凝集素-刺激的末梢血液淋巴细胞制备的正常人体中期细胞用以杂交。这个探针与一个大量缺少3′-不翻译区的AR cDNA相当,并***PEMBL 18的Eco RI位点。
杂交是按以前描述(Le Beau,1985,PNAS,82,6692-6696),用每ml2、4、20和40ng探针的杂交混合物进行。自动放射显影用Kodak NTB-2核径迹乳液制备,载玻片曝光7-60天,染色体带通过用奎吖因芥子气染色来观察。
AR基因的染色体定位
人AR基因的染色体排布是用3H-标记的AR RNA对人通常中期染色体的在原位杂交测定的。银粒在带30%的分布4q13-4q21带上的非随机的50个中期细胞展开上被计数。结果由只含人染色体4的仓鼠/人体细胞杂种DNA上的聚合酶链反应(PCR)所证实。从AR外显子3和侧翼内含子衍生的寡核苷酸引物产生只在人DNA内的一个220bp PCR片段及包含染色体4的杂种DNA,而仓鼠DNA是阴性的。
染色体区4q13-4q21也包含gro或黑素瘤生长刺激活性的基因(Anisowicz,A.,et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7188-7192;Richmond,A.,et al.,1988,EMBO J.7,2025-2033),C-kit受体(Yarden et al.,1987,EMBO J.6,3341-3351),血小板因子4(PF4)(Griffin et al.,1987,Cytogenetic Cell Genet.,45,43-73),γ-干扰素诱导因子IP-10(Luster,A.D.,et al.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,1868-1871),VD结合蛋白(特异成分族)(Cooke,N.E.et al.,1986,Human Genetics 73,225-229;McCombs J.L.et al.,1986,Cytogenet Cell Genet,42,62-64),and Statherin,一个钙调节唾液蛋白(Sabatini L.M.et al.,1987,Am.J.Hum.Genet.,41,1048-1060)。EGF基因定位在4q25末端。
Gro、IP-10和PF4属于结构上相关一类的肽,它可能构成簇集在染色体4上的生长因子族。C-kit编码一个细胞表面受体,其结构上和功能上可能与包含酪氨酸-特异激酶活性,包括EGF受体、Neu致癌基因、PDGF受体和胰岛素受体的几种生长因子受体有关。一般来说,基因的配位和它们的受体定位到各别的染色体,但有一些已定位到共同的染色***置上(Groffin,1983,Nucl.Acids Res.11:6331-6339;Pettenati,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:2970-2974)。C-kit的配体还没有确定,而AR一定要测试这种活性。
特异的移位在许多恶性肿瘤中可见。在先天性急性淋巴母细胞白血病中(ALL),t(4;11)(q21;q23)最经常报道的细胞遗传畸变包括AR已被定位的那个区域(Heim,S.et al.,1987,Leukemia,1,16-23)。ALLs现已用法国-美国-英国合作组织(FAB)定义的形态学,B和T细胞标记,及染色体分析进行分类,这些分类作为诊断、予测和治疗ALL的基础。三分之一的ALL病例包括特异转位,t(4;11)对应于不足16个月的婴儿高发的予后不良组,其中等存活不到1年(Kocova et al.,1985,Cancer Genetics andCytogenetics 16,21-32)。包括4q21区的转位在T-淋巴瘤(Levine,E.G.et al.,1986,Cancer Res,466481-6488)和一例急性骨髓胚细胞白血病(AML)中(Selypes,A.et al.,1987,Human Genet,76,106-108)也已报道。这个区也包含牙发育不良综合症和“两色混杂”的特性基因、一个遗传混乱,它是由于缺乏成黑素细胞迁移和分化,导致不规则的皮肤色素引起的(Hoo,J.J.,et al.,1986,Human Genet.,73,230-231)。
在AR和定位于染色体4q13-4q21遗传混乱之间的连续研究,将允许我们测定这种共定位的重要性。现在的细胞遗传分析表明4q21区包含参与淋巴细胞分化的基因。最终这些结合可能暗示进一步生物活性或对这种生长调节分子的应用。
基因组克隆
用HindⅢ,Eco RI或Bam HI消化的MCF-7DNA的Southern印迹分析(如上述)表明:当用包含AR基因5′端部分的830bp探针(32P-Labeled PvuⅡ/BsmⅠ消化的PAR1)杂交时,分别显示12kb,8kb和20kb单一带并暗示AR是单复制基因。从成熟AR3′-末端的一个170bp探针(AR170,BsmⅠ-PvuⅡ),包括跨膜和细胞质区的编码区,杂交到相同的HindⅢ,Eco RI和Bam HI片段,而且也杂交到一个另外的7.5kb的HindⅢ片段,说明大部分的AR编码区在两个HindⅢ片段12和6.5kb之间断开。相同带可以从人胎盘,脑,黑素瘤(SK-MEL28),乳癌(HTB36),表皮样癌(A431)和肺癌DNA的消化液的Southern印迹分析中看到,且提示AR基因还没有经历过整个重排或扩增。
申请人从MCF-7DNA中选择克隆两个HindⅢ片段,因为它们可能存在大多数的(如果不是所有的)AR基因和它的侧翼序列。HindⅢ消化的MCF-7DNA被按大小分级,并将适当的级分连入到λL47.1中去。在许多的阳性中,两个克隆子,(λARH12和λARH6)被选择以便更详细地描述。12和6.4kb***被亚克隆到PEMBL18中,并绘制了几个限制位点。用精确的寡核苷酸引物和直接用各种小的亚克隆子测序,所有外显子和其内含子结合的序列被测定出,显示出与cDNA序列没有差异。
AR5′端调节区特性
AR的基因组克隆导致了在12kb HindⅢ片段中的5′端侧翼序列的6.5kb的分离。在外显子中(cDNA中位置40),从外显子1的第一个EcoRI位点5′到SmaI位点的688bp片段在双链上被亚克隆和测定序列。数据见图17。
用2个分开的寡核苷酸从外显子1将MCF-7RNA进行引物延长。被两个寡核苷酸确定的主要转录起始位点被定位在1bp5′端到最长的cDNA克隆。两个次要的位点在cDNA序列中位置+1和+2观察到,这证明了很多cDNA克隆几乎是完整长度。为了从功能上证实AR基因的调节区,我们构建一个嵌合基团(PXARE1CAT),它含有688bp EcoRI到SmaI AR5′端侧翼区(序列648到+40,和+1是主要转录起始点),驱动氯霉素乙酰转移酶(CAT)启动基因缺乏的表达。当瞬时地引入MCF-7细胞中时,该构建体能刺激CAT基因的转录,并且由于加进了TPA,其活性可增至6-7倍。这就从结构上和功能上都证实了:我们已经克隆了AR基因的5′末端。然后我们再构建一系列5′端CAT缺乏突变体,它在同一载体中含AR序列-539到+40(Ela),-387到+40(Elb),-277到+40(Elc),-148到+40(Eld),-77到+40(Ele),-79到+40(Elg),或+19到+40bp(Elh)。当删除超过部分-77时,便失去了基本活性,即Elh显不出可测量的活性,并当用100ng/ml的TPA处理40小时时,所有这些构建体都表现出增大3.5-7倍的表达。这些构建物也能用于瞬时检测以估计任何形态发生、***素、生长因子、药物或粗发酵提取物对于AR表达的调节的影响,能使人鉴别新的治疗剂。
核苷酸脱落试验显示出在对TPA反应中,AR增加了3-5倍的转录,这说明增加启动基因的活性至少部分地引起TPA诱导AR。在存在或缺少放线菌素D情况下,对用TPA处理的MCF-7细胞进行的Northern分析可确认出AR是相对稳定的RNA,其半寿期大于4小时。因之在对TPA反应中诱导AR表达是多小平面,包括十分稳定mRNA的增加转录。
AR基因的内含子/外显子组织,
AR蛋白质区、进化及功能含意
人完整的双边条曲菌素基因组序列画在图17内,并外显子和AR分子的蛋白质区之间的关系以图解法表示于图18中。
AR mRNA的引物延长分析及使用嵌合基因AR/CAT启动子(CAT=氯霉素乙酰转移酶,一个标记基因)构建体的研究在64bp5′端到最长的cDNA克隆末端内定位了一个功能启动子。然而在cDNA序列5′末端的上游存在交感TATA单元29bp。该基因的3′端之前是一个交感多聚腺苷酸化信号序列,其在cDNA中来自聚(A)尾部的(Poly(A)tail)64核苷酸。AR基因的原发转录本大约是10.2kb。
六个外显子编码人的AR前体并横跨基因组DNA的10.2kb。AR外显子长度范围从112到270bp,并在1.25kb和2.1kb之间被内含子间断。AR的五个内含子间断了该编码的序列,其中很多蛋白质区是单个外显子的产物。外显子1编码不翻译的5′端和信号肽区,外显子2编码N-末端的前体,外显子5包含细胞质的区,和外显子6代表3′端不翻译的区域。外显子3和4一起编码成熟的AR蛋白质,包括亲水和类似的EGF两个序列,以及被称为跨膜区。外显子3和4之间结合出现在类似EGF区域的第二和第三环之间。
当外显子的结合覆盖在AR、EGF和TGF-α的氨基酸序列的组合上时,可明显看出:所有这些蛋白质都是用两个外显子编码的,并且间断的内含子是处于同一位置。然而每一个3′端外显子也编码相应前体蛋白质的跨膜的区。相反,类似EGF区域包含在所有其它哺乳动物EGF同源染色体中一个单个外显子上,为此这种外显子结构已被测定:包括在EGF前体中的九个类似EGF重复单元(Gray,1983,Nature,303,722-725);和在LDL受体中的三个重复单元(Yamamoto,1984,Cel,39,27-38);及在小鼠的粘连蛋白中的一个重复单元(Patel1987,Embo J.,6,2565-2572)以及人的凝固因子Ⅻ(Cool,1987,J.Biol.Chem.,262,13662-1373)。中的一个重复单元。无脊椎动物同源染色体如Drosophilia Notch基因和来自C.elegans的lin-12也含多重的类似EGF重复单元(Kidd,1986,Molec.Cell.Biol.,6,3094-3108;Greenwald,1985,Cell,43,583-590)。不同于哺乳动物的基因,Notch中的大部分类似EGF重复单元被包含单独编码区中,三十六个型主(motif)中的仅有四个是被干扰序列***。很明显,这四个中的两个显示与AR比与Notch重复交感更强的组合,并一个在如EGF、TGF-α和AR相同的CXC序列上甚至被内含子所间断。线虫lin-12基因至少含十一个类似EGF单元,其中的九个含在第一个外显子上,并剩下的两个和在内含子侧翼的完整类似EGF单元一起含于分开的外显子上。
不同生物体的编码类似EGF重复单元的外显子在结构上的差常说明:它们可能有不同的起源。一组含被内含子结合的类似EGF的型主,另一组,其中有AR段,有一个被间断的型主。两组之间序列相似可能是由于趋同进化或是由于从共同祖传基因的趋异后的内含子的***。
在EGF、TGF-α、AR和一个Notch重复单元的相同CXC序列内的内含子位置表明共同的起源。但更仔细检查发现了不同的内含子定相。内含子的定相是指内含子是否间断了在密码子的第一(Ⅰ)、第二(Ⅱ)或第三(O)核苷酸后的阅读的框架。定相被确信有进化的重要性,这是因为它允许在不同蛋白质中含外显子的功能区发生混合。EGF和TGF-α在类似EGF单元内有相Ⅱ内含子,而AR和Notch有相Ⅰ内含子。一种核苷酸的类似的移位在补体因子B及弹性蛋白酶的蛋白酶区域之内在倒数第二个内含子中被观察到(Cambell,1983,PNAS,80,4464;Swift,1984,J.Biol.Chem.259,14271)。这些内含子的非随机位置可能暗示:在这些基因中存在着特殊内含子***序列。另外可能已存在着划分在此位点上的编码区的选择压力。比较人的EGF、TGF-α、AR和第一个Notch重复单元的类似EGF单元内的外显子-内含子接合位点处的序列,揭示了不存在如用可转座成分时所常见的那种直接重复单元。但是全部四个都有边界接合的‘gtaagt’序列。在这种内含子起源或剪接中,这种序列可能起某些作用。
病毒的EGF同源染色体不含内含子,但是VGF、EGF、TGF-α和AR之间的组合显示了伸展贯穿跨膜区域的同源性,而粘液瘤和Shope病毒的生长因子在此疏水区前终止。最近的研究证明:TGF-α前体是作为跨膜的蛋白质被合成,并且不同的蛋白(分解)的酶切导致较大类型的分泌作用,这种类型可能是特殊的细胞类型(Teixido,1987,Nature,326,883-885)。
其它含跨膜区域的EGF同源染色体包括凝固因子、LDL及同源异型基因Notch和Lin-12,尽管其中没有一个接近于类似EGF重复单元。在某些膜结合前体中,EGF型主的存在表明:在某些情况下,它们可能作为分泌过的生长因子被加工,或者可能和膜仍有联系,并且在细胞间和/或细胞内的传递中起一定的作用。
某些AR同源染色体包括无脊椎动物的同源异型基因。同源异型基因产物参与细胞发育的调节。例如Notch基因产物协调外胚层细胞正确地进入成神经细胞或成皮细胞的进程。在Notch突变体中,所有这些细胞都变成神经元,并且其后代全部脑细胞而无皮肤细胞都死亡。同源异型基因能以autocrine方式起作用,以建立或维持在表达基因产物的细胞中的确定状态,并且可能通过细胞-细胞间的相互作用,参与调节邻近细胞中的这种状态。AR是否也具有调节某些细胞类型的发育状态的功能应进行研究。
成熟的双边条曲菌素的加工
AR cDNA的特性揭示:AR中的78和84氨基酸类型是作为252氨基酸跨膜前体的中间部分,被合成的(Section 8.2,Supra)。可能会导致释放出成熟的AR蛋白质(分解)酶切的位点不适用于任何已知蛋白酶的酶切位点。在N-终端,该位点是Asp-Asp/Ser-Val和Glu-Gln/Val-Val,而C-终端位点是Glu-Lys/Ser-Met。AR的两种类型看来从共同前体开始的交替蛋白质(分解)加工的结果,因为在此区域内,所有的cDNA和基因组克隆都显示出相同的序列。有趣的是内含子处于两个N-终端酶切位点之间,并且很可能“内含子滑动”也可说明这些不同的原因。
MCF-7细胞以较大的84氨基酸类型产生80%它们的AR,而绒毛膜瘤细胞系,HTB-36以较小的78氨基酸类型产生80%它的AR。为了确定这种差别是否在DNA水平上和变体有关,我们使用聚合酶链反应技术(Scharf,1986,Science,233,1076-1078)来分离MCF-7细胞和HTB-36细胞中的AR外显子3,它是一种在组成上产生高水平ARmRNA的系。来自外显子3编码区的AR内含子特异的“正义”寡核苷酸和“反义”寡核苷酸特别被用作扩增来自两个DNA源的AR基因的***220bp片段。直接序列分析在这两种人的DNA源之间,在内含子一外显子接合处,或在外显子3编码序列中都不显出偏离,这进一步表明:AR的两种类型是用该前体交替蛋白质(分解)酶切的结果。
AR和类似EGF生长因子的结构比较
AR清楚地表明与其它类似EGF蛋白质的序列同源性,保留了包括在定义为成熟的生长因子的二级结构三个二硫化物键中的6个半胱氨酸。上述的(计算机协同)氨基酸的序列比较导致了将类似EGF型主分类为两个不同的组:生长因子和血凝因子(见图13)。我们选择了两个序列图式以便与AR和其它已知DNA或蛋白质序列进行比较。这种选择是基于这些序列区别两组蛋白质的明显的能力,并且因为作最优的排列需要很少的缝隙。准确的序列列于表1中。第一区相当于EGF的第二环的头11个氨基酸,并第二区相应于EGF的第三个半胱氨酸环。从每组生长因子和血凝因子选择四个代表物以便在很好建立起的功能及结构的同源性基础上产生交感序列。只要可能总是选择人的序列,因为我们最终是想要将它们和人的AR进行比较。生长因子包括:人的EGF、TGF-α、VGF和Shope生长因子;凝血因子包括:人的因子Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ和蛋白质C。AR也可与这两个同源性区的基本数据比较进行评价。交感的序列根据残基在一定位置上出现的频率来权衡。
各种TGF-α、VGF和EGF衍生物的结构-功能分析,最近已导致了对于这些生长因子的生物学活性所必须的几个残基的认别。重组体蛋白质、合成蛋白质、特殊位点化学衍生物和蛋白质(分解)降解作用对于产生改变的分子全是有用的。某些通则包括(位置涉及图15的排列):6个半胱氨酸(位置为1、19、15、26、28和37)及它们的二硫化物环(1-15、9-26、28-37)对于生物学活性是需要的,N-终端的延长对活性有很小的影响,芳香残基(F、Y)在位置8上是需要的,Y32、D41或L42的非保留变化导致在受体结合或自我磷酸化作用的活性丧失和/或引入注目的丧失。
除了确定对于EGF受体结合和/或有丝***活性所必须的残基最后两个标准以外,AR适用于所有其它通则。成熟的AR正好在D41前截断,并完全缺少这个及“关键的”亮氨酸42,然而它仍竞争EGF受体结合,并在某些有丝***试验中代替EGF。但是这些不同可以说明不饱和受体结合动力学及其某些试验中不同于EGF明显功能差异,如TGF-β协同作用,对于选择的A431亚克隆、交联、磷酸化试验及其结合DNA能力不同影响。在成熟的ARN-终端上极为亲水性的伸长也可能在受体结合或生物学活性方面传递某些这种差异。
EGF超科的AR亚类
根据图13的组合和基于表1(P.25)的计算机分析,我们计算了进化距离的基体。这种基体被用来导出EGF超科的树叉图。研究要求半胱氨酸的存在并为与权衡过的交感序列相应的每个残基加一个点。这种进化树予示:根据结构及功能的同源性,AR归于类似EGF生长因子的新亚类。这样的模型予示:这种生长因子家族中的其它成员可能存在,并且根据下述三个标准它们能用与上述序列图式的同源性加以识别:即大于20的两个生长因子区结合的比数,小于20的结合凝固因子区的比数,及大于20的结合AR区的比数。适合于这些标准的所有新的分子都可期待有与EGF、TGF-α、VGF或AR一致的某些功能的同源性。结合AR区比数大于40的分子可以分类作为在EGF超科内AR家族的一个成员,并且是在本发明的范围之内。
实例:双边条曲菌素的细菌表达
材料和方法
1.质粒的构建
质粒PARD1质粒PARD1含PEMBL18中的1.4kb EcoRI cDNA片段(PAR1),其中在cDNA的核苷酸位置532上带有T-C的改变,这相应于在成熟AR的氨基末端缬氨酸-缬氨酸的序列。这种碱基的变化被位点突变所完成并且被序列分析所证实。该构建体通过产生DdeⅠ位点(CTAAG)允许进入AR氨基末端前体结构区和亲水性区域之间的接合处。
质粒PARSTOP质粒PARSTOP是用于制备AR分泌载体的中间构建体。PARD1用SspⅠ和XbaⅠ消化,编码成熟AR的羧端基9氨基酸,跨膜的和细胞质的区和3′端不转译的区域的515bp片段被分离。含AR cDNA中余留的氨基末端部分的4.7kb(SspⅠ-XbaⅠ)的片段用凝胶提纯并与激酶化的、退火的、互补的寡核苷酸ARSTOP1及ARSTOP2连接(如下述)。这些寡核苷酸有和SspⅠ位点相一致的5′平整末端,其后是编码成熟AR序列中羧端基9氨基酸,TAA终止子和Eco RV及XbaⅠ位点的序列。
Y F G E R C G E K * EcoRV/XbaI
ARSTOP1 5′ ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT
ARSTOP2 3′ TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC
质粒PbAR 质粒PbAR含连于AR的成熟78氨基酸结构的缺失启动子TGF-β前导。它是用PARSTOP的240bp DdeⅠ到XbaⅠ片段连接寡核苷酸bLARN3和bLARN4,进入到EcoRI/XbaⅠ消化了的PEMBL18中构建的。bLARN3及blARN4是互补的,产生了5′端EcoRⅠ和3′端DdeⅠ粘末端以及与TGF-β前导序列中的一个邻近的羧端基一致的单独的内部NaeⅠ位点。连接将破坏DdeⅠ位点并在成熟AR的氨基末端再生出正确的氨基酸序列缬氨酸-缬氨酸。
SstII
A G V V K P P Q N K T E S E
PHIL1 5′ GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA
PHIL2 3′ CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT
N T S D K P K R K K K G G
PHIL1 5′ AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG
PHIL2 3′ TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC
EcoRI
K N G K N R R N R K K K N
PHIL1 5′ CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG
PHIL2 3′ GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA质粒pDCHBARⅠ 质粒pDCHBARⅠ是为了AR中的被加工的成熟78氨基酸结构的分泌作用而设计的哺乳动物的表达载体(图19)。它含有从被CMV/HIV启动子驱动的pbAR来的TGF-β前导/成熟AR序列,并且以SV40多聚腺苷酸化信号做侧翼。该载体在同一转录方向上也含有SVzdhfr,PSVDR/bOM用NaeⅠ和XbaⅠ消化,并且6kb载体从切除的OncoM编码序列中提纯出来。phAR也用NaeⅠ和XbaⅠ消化,分离出编码为TGF-β信号序列中的羧端基5个氨基酸的260bp片段,和78氨基酸成熟AR序列后面是终止密码子及Eco RV和XbaⅠ位点。接合被序列分析所证实。
质粒pDCHBPHILE 质粒pDCHBPHILE是哺乳动物的表达载体,其设计是为了嵌合的AR/EGF蛋白质的分泌作用。该质粒也被构型成便利于AR亲水区和其它生长因子之间的未来的融合构建体。此构建体用连接6.5kb SstⅡ/XbaⅠ消化pDCHBAR1载体片段,含合成的人的EGF基因的175bp EcoRI/XbaⅠ片段及寡核苷酸PHIL1和PHIL2的方法产生。这些寡核苷酸与5′端SstⅡ和3′端EcoRI延长互补,并且编码TGF-β信号序列和完整的AR亲水区的最后残基。pDCHBAR1提供了CMV/HIV启动子,所有的除最后的氨基酸以外的TGF-β信号序列以及SV40多聚腺苷酸化序列。EGF片段从Dr.Timothy M.Rose(Oncogen)处得到,并包括未来操作的便利位点。
pTAC载体的制备
质粒Tac Pak/EGF从Dr.Timothy M.Rose(Oncogen)处得到,并且由以下单元组成:从表达载体P135-1作为BglⅡ/Bam HI片段分离出的trp-Lac杂种启动子和Cro基因Shine-Delgarno序列,表达载体P135-1又是从pDR540(Pharmacia)中得到的;从合成的寡核苷酸Tacpak1和Tacpak2(Dr.Rose,Oncogen)中得到的碱性磷酸酯酶信号序列;从质粒pBM22/PAK/EGF中穿梭出的合成EGF序列;转录的终端区域;全部从质粒P135-1衍生的带有新霉素抗基因的PBR322主链。Tacpak/EGF用Bam HI消化,2-碱基用dATP和dGTP填充产生和填充了SalⅠ的2-碱基一致的位点,然后再用PvuⅠ消化。这种消化作用除掉了合成的EGF基因及大部分的碱性磷酸酯酶信号序列,但使Tac启动子、Shine-Delgarno序列和最初的ATG留下完整无损。2.8kb片段用凝胶提纯。
修饰双边条曲菌素cDNA片段的制备
质粒pARSTOP用填充了TTP和dCTP的2-碱基的SalⅠ消化,产生和BamHI 2-碱基填充的(dATP,dGTP)延长一致的位点,然后再用DdeⅠ和BglⅠ消化。后来的消化对于从所需的242bp片段中除掉共迁移的DNA是必须的,242bp编码以VKPP开始,以CGEK终止,跟随着用合成法引入的终止密码的成熟AR的短结构。243bp片段用凝胶提纯。
ALKPAR1和ALKPAR2
合成寡核苷酸的制备
互补的合成寡核苷酸ALKPAR1和ALKPAR2是用和Tacpak/EGF PvuⅠ/BamHI-部分的填充的片段相一致的5′端PvuⅠ粘末端及和PARSTOP DdeⅠ/SalⅠ-部分的填充的片段相一致的3′端DdeⅠ延长进行设计的。它们在应用生物***寡核苷酸合成仪上合成并用丙烯酰胺凝胶提纯。磷酸盐被加入到有T4激酶的寡核苷酸中,并用等摩尔量通过加热变性后慢冷而退火。
PvuI
5 I A L A L L P L L
ALKPAR1 5′ CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTG
ALKPAR2 3′ TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGAC
DdeI
F T P V T K A V V
TTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3′
AAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5′
pTacAPAR1的连接和分离
243bp DdeⅠ到SalⅠ-部分的填充的AR片段,2.8kb PvuⅠ/BamHI-部分的填充的Tacpak/EGF载体片段和激酶处理过的、退火的ALKPAR1+2寡核苷酸使用DNA连接酶连接,转化到感受态的E.Coli JM109细胞并在LB/新霉素碟子上被选择。用限制消化及DNA序列测定来证实正确的构建体。pTacAPAR的序列在图20中画出。
嵌合AR亲水性区/EGF
基因片段的制备
质粒pDCHBPHILE用SstⅡ及XbaⅠ消化,产生286bp片段,它编码TGF-β信号序列(AG)的最后2个残基,AR的亲水区的37残基(VVKP…RKKK)以及成熟的人的EGF序列中的53残基合成序列(NSDS…WELR)。286bp片段用凝胶提纯。
APAREGF1和APAREGF2
合成寡核苷酸的制备
互补的合成寡核苷酸APAREGF1和APAREGF2是由和pTacAPAR1 PvuⅠ/XbaⅠ片段相一致的5′端PvuⅠ粘末端及和pDCHBPHILE SstⅡ/XbaⅠ片段相一致的3′端SstⅡ延长进行设计的。寡核苷酸在应用生物***寡核苷酸合成仪上合成并用丙烯酰胺凝胶提纯。磷酸盐加入到有T4激酶的寡核苷酸中,并用等摩尔量通过加热变性后慢冷而退火。
PvuI
I A L A L L P L L
APAREGF1 5′ CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGC
APAREGF2 3′ TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACG
SstII
F T P V T K
TGTTCACTCCAGTGACACC 3′
ACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5′
pTACAPHILE的连接和分离
编码连接于成熟的EGF序列的AR的亲水结构区的286bp SstⅡ/XbaⅠ片段,2.8kb PvuⅠ/XbaⅠpTacAPAR1载体片段,和激酶处理过的、退火的APAREGF1+2寡核苷酸用DNA连接酶连接,转化到感受态的E.Coli JM109中并在LB/新霉素碟子上选择。用限制消化和DNA序列测定来证实正确的构建体。pTacAPHILE的核苷酸序列如图21所示。所期望的翻译产物应在恰好跟随着碱性磷酸酯酶信号序列的二肽Ala-Gly之间被切开,因之将一另外的残基(甘氨酸)加入到AR亲水区中。不同于正常人序列的核苷酸残基以粗体字表示(图20)。
重组体双边条曲菌素的提纯
质粒pTacAPAR1和pTacAPHILE被转化到感受态的E.Coli JM109并于37°在10ml LB中生长成汇合直到A600为0.17。然后培养物用100uM IPTG诱导并允许生长24-72小时。培养物以5000rpm离心两次,每次15分钟,留下沉淀物,将上清液继续纯化。样品在备有YM5膜(5000MW Cutoff)的Amicon超滤仪中浓缩10倍。浓缩液用5倍体积的Milli Q水稀释并重组成十分之一的原培养物体积。冰醋酸加入到1M,将样品于4℃放置2-24小时,于4℃下将样品放于Oakridge试管中,在SS34转子中以19,000rpm离心20分钟。沉淀物用20ml 1M的醋酸提取,并将上清液合并,然后将澄清的上清液对着0.1M醋酸渗析两天,冷冻干燥并于-20℃下贮存。
细胞沉淀物和粗的干燥的上清液用对于AR蛋白质的免疫印迹分析和生长抑制试验(GIAS)的方法测试。将来自50μl汇合培养物的细胞沉淀物或100-200μl的干燥的上清液通过16%的麦黄酮(Tricine)聚丙烯酰胺凝胶,用Fast Green染色,并转至硝化纤维素。按上文所述进行Western印迹分析。
结果和讨论
来自携带pTacAPAR1的转化细胞的细胞沉淀物显示了在10KD时大量的免疫反应蛋白质迁移以及某些降解产物和很可能的二聚体,上清液含大约100-200ng/ml的分泌的具有免疫反应的AR。与经提纯的天然AR标准进行比较,上清液上的GIA测出在A431-A3指示剂细胞系上以大约150ng/ml AR的活性。在此体系中产生了大量的免疫反应蛋白质,其大部分仍聚集在细胞内。对周质的制剂和上清液的化验显示了生长2-3天后活性蛋白质的分泌作用。
pTacAPHILE提供了一种将AR的亲水区附着到任何克隆基因的N-末端的便利的方法。这个区域可能将变化了的键合特性传给配合体的正常受体,起核定位序列作用,连接到DNA上,或者允许迁移横跨通常对于该附着的因子不能透过的脂类或其它膜。
微生物的寄存
以下微生物已寄存于the Agricultural Research Culture Collection,Northern Regional Research Center(NRRL),并给予下列的编号:
微生物 质粒 编号
Escherichia coli HB101 pAR1 B-18438
Escherichia coli HB101 pARA12 B-18439
Escherichia coli HB101 pARH6 B-18440
Escherichia coli JM109 pTacAPAR1 B-18441
Escherichia coli JM109 pTacAPHILE B-18442
本发明不限于所寄存的细胞系或者作为本发明一个方面单一的例证在此披露的实施例的范围之内。任何功能上的等同物都在本发明范围之内。事实上对于熟悉上述技术的人员来说,除了本文所公开的或描述的之外,其它各种的改进是显而易见的。这些改进纳入附加的权利要求的范围之内。
还有一点须了解:对于核苷酸和肽所给定的所有碱基对,和氨基酸残余的数目及大小均是近似的,并仅用于说明的目的。
Claims (51)
1、含有下列氨基酸序列的蛋白质:
1 10
V V K P P Q N K T E S E N T S D K P
20 30
K R K K K G G K N G K N R R N R K K
40 50
K N P C N A E F Q N F C I H G E C K
60 70
Y I E H L E A V T C K Q Q E Y Y F G
78
E R C G E K。
2、权利要求1的蛋白质,其分子量为大约8500-25000道尔顿。
3、权利要求1的蛋白质,其PI范围为大约7.6-8.0。
4、权利要求1的糖基化的蛋白质。
5、权利要求1的未糖基化的蛋白质。
6、含有下列氨基酸序列的蛋白质:
1
S V R V E Q V V K P P Q N K T E S E
20 30
N T S D K P K R K K K G G K N G K N
40 50
R R N R K K K P C N A E F Q N F C I
60 70
H G E C K Y I E H L E A V T C K C Q
80 84
Q E Y F G E R C G E K .
7、权利要求6的蛋白质,其分子量为大约9100-25000道尔顿。
8、权利要求6的蛋白质,其PI范围为大约7.6-8.0。
9、权利要求6的糖基化的蛋白质。
10、权利要求6的未糖基化的蛋白质。
11、权利要求1的蛋白质或肽或其片段,它们抑制上皮源的人体癌细胞系的生长。
12、权利要求11的蛋白质,其中上皮源的人体癌细胞系包括阴门A431表皮癌或乳腺HTB132腺癌。
13、权利要求1的蛋白质或肽或其片段,它们促进体外培养的人体***成纤维细胞的生长。
14、权利要求13的蛋白质,其中人体***成纤维细胞包括sakamoto或Goodwin细胞系。
15、含双功能细胞生长调节剂的权利要求1的蛋白质或肽或其片段,它们抑制上表源的人体癌细胞系的生长并促进体外培养的人体***成纤维细胞的生长。
16、权利要求15的蛋白质,其中上皮源的人体癌细胞系包括阴门A431表皮癌或乳腺HTB132腺癌。
17、权利要求15的蛋白质,其中人体***成纤维细胞包括Sadamoto或Goodwin细胞系。
18、权利要求11、12、13、14、15、16或17的蛋白质任意一种肽或其片段,其中细胞生长的抑制或促进用下面的试验测定:
(a).将在50μl试验培养基中含有3.5×104个细胞的各微量滴定井培养3小时,试验培养基中含有DMEM,还补充有5%加热失活的胎儿牛血清(FBS)、青霉素/链霉素和谷酰胺;
(b).将含有双边条曲菌素的50μl试验培养基加入每个试验井中,同时将没有双边条曲菌素的50μl试验培养基加入到每个对照井中,并在37℃将它们培养2-3天;
(c).在每个井中加入100μl含有125I-碘代-2′-125I-脱氧尿苷(I-UdR)的溶液,并在37℃培养4-6小时;
(d).将培养基移出,并将每个井用PBS洗涤一次;
(e).在每个井中加入200μl甲醇,在室温培养10分钟,并将甲醇移出;
(f).在每个井中加入200μl 1M氢氧化钠溶液,在37℃培养30分钟;以及
(g).将1M氢氧化钠溶液移出并用γ-计数器计数,其中存在的放射性数量是125I-IUdR掺入和细胞增殖的数量,而数目的短缺则指出对细胞增殖的抑制。
19、权利要求6的蛋白质或肽或其片段,它们抑制上皮源人体癌细胞系的生长。
20、权利要求19的蛋白质,其中上皮源的人体癌细胞系包括阴门A431表皮癌或乳腺HTB132腺癌。
21、权利要求6的蛋白质或肽或其片段,它们促进体外培养的人体***成纤维细胞的生长。
22、权利要求21的蛋白质,其中人体***成纤维细胞包括Sakamoto或Goodwin细胞系。
23、含有双功能细胞生长调节剂的权利要求6的蛋白质或肽或其片段,它们抑制上皮源的人体癌细胞系的生长并促进体外培养的人体***成纤维细胞的生长。
24、权利要求23的蛋白质,其中上皮源人体癌细胞系包括阴门A431表皮癌或乳腺HTB132腺癌。
25、权利要求23的蛋白质,其中人体***成纤维细胞包括Sadamoto或Goodwin细胞系。
26、权利要求19、20、21、22、23、24或25的蛋白质任意一种肽或其片段,其中细胞生长的抑制或促进由下面的试验测定:
(a).将在50μl试验培养基中含有3.5×104个细胞的各微量滴定井培养3小时,试验培养基中含有DMEM,还补充有5%加热失活的胎儿牛血清(FBS)、青霉素/链霉素和谷酰胺;
(b).将含有双边条曲菌素的50μl试验培养基加入每个试验井中,同时将没有双边条曲菌素的50μl试验培养基加入到每个对照井中,并在37℃将它们培养2-3天;
(c).在每个井中加入100μl含有125I-碘代-2′-125I-脱氧尿苷(I-UdR)的溶液,并在37℃培养4-6小时;
(d).将培养基移出,并将每个井用PBS洗涤一次;
(e).在每个井中加入200μl甲醇,在室温下培养10分钟,并将甲醇移出;
(f).在每个井中加入200μl 1M氢氧化钠溶液,在37℃培养30分钟;以及
(g).将1M氢氧化钠溶液移出并用γ-计数器计数,其中存在的放射性数量是125I-IUdR掺入和细胞增殖的数量,而数目的短缺则指出对细胞增殖的抑制。
27、双边条曲菌素,一种双功能生长调节因子,由下面方法得到,包括:
(a).在12-O-十四烷酰基-佛波醇-13-乙酸酯(TPA)存在下培养MCF-7细胞;
(b).从MCF-7细胞中收集条件培养基;
(c).从条件培养基中分离双边条曲菌素。
28、编码双边条曲菌素前体的核苷酸序列,包含有基本上如图16所描绘的由大约核苷酸残基数1到大约核苷酸残基数1243的核苷酸编码序列。
29、双边条曲菌素前体,含有基本上如图16所描绘的由大约氨基酸残基数1到大约氨基酸残基数252的氨基酸序列。
30、生产双边条曲菌素的方法,包括:
(a).在调节基因表达的第二核苷酸序列控制下,培养含有编码双边条曲菌素核苷酸序列的大肠杆菌细胞,结果具有双边条曲菌素活性的肽或蛋白质由大肠杆菌细胞生成;
(b).从培养物中回收双边条曲菌素。
31、按照权利要求30的方法,其中编码双边条曲菌素核苷酸序列含有基本上如图16所描绘的核苷酸数目为1-1243的核苷酸序列。
32、按照权利要求30的方法,其中控制基因表达的第二核苷酸序列含有Tac启动子。
33、生产双边条曲菌素的方法,包括:
(a).培养大肠杆菌菌种JM109,随NRRL沉积,同时随质粒pTacAPAR1转化,并确定增加数目_;以及
(b).由培养物中回收双边条曲菌素。
34、生产双边条曲菌素的方法,包括:
(a).培养大肠杆菌菌种JM109,随NRRL沉积,同时随质粒pTacAPHILE转化,并确定增加数目_;以及
(b).由培养物中回收双边条曲菌素。
35、在调节基因表达的第二核苷酸序列控制下,所设计的细胞含有编码双边条曲菌素核苷酸序列,结果,这些细胞生成双边条曲菌素。
36、按照权利要求35的设计的细胞,其中编码双边条曲菌素核苷酸序列含有基本上如图16所描绘的核苷酸数目为528到761的核苷酸序列。
37、按照权利要求35的设计的细胞,它含有大肠杆菌细胞。
38、按照权利要求35的设计的细胞,其中控制基因表达的第二核苷酸序列含有Tac启动子。
39、在大肠杆菌细胞系中所含有的质粒pAR1载有随NRRL沉积并确定增加数目_的质粒。
40、在大肠杆菌细胞系中所含有的质粒p ARH12载有随NRRL沉积并确定增加数目_的质粒。
41、在大肠杆菌细胞系中所含有的质粒pARH6载有随NRRL沉积并确定增加数目_的质粒。
42、在大肠杆菌细胞系中所含有的质粒pTacAPAR1载有随NRRL沉积并确定增加数目_的质粒。
43、在大肠杆菌细胞系中所含有的质粒pTacAPHILE载有随NRRL沉积并确定增加数目_的质粒。
44、可识别双边条曲菌素抗原决定基的抗体。
45、权利要求44的抗体,其中抗原决定基含有氨基酸序列DTYSGKREPFSGDHSADGFE。
46、权利要求44的抗体,其中抗原决定基含有氨基酸序列SSSEPSSGADYDYSEEYDNE。
47、权利要求44的抗体,其中抗原决定基含有氨基酸序列VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG。
48、权利要求44的抗体,其中抗原决定基含有氨基酸序列EAVTCKCQQEYFGERCGEK。
49、权利要求44的抗体,其中抗原决定基含有氨基酸序列VQLRRQYVRKYEGEAEERKK。
50、编码双边条曲菌素基因的基因组核苷酸序列,含有基本上如图17所描绘的核苷酸序列。
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