CN1321679C - 治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物 - Google Patents
治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物,其重量份数组成如下:姜提取物100、陈皮提取物0.1-200,所述姜提取物是姜的根茎的超临界二氧化碳萃取物,所述陈皮提取物是橘及其栽培变种的成熟果皮的水蒸气蒸馏提取物。主要含姜挥发油、姜辣素、以及陈皮挥发油,具有抗自由基氧化、保护心肌细胞、调整血压、改善血液流变学、抗凝血、抗血栓形成、耐缺氧等作用。本发明以姜、陈皮提取物混合物作为活性成分,与适宜的赋形剂相结合,制成各种药物制剂,如软胶囊剂、胶囊剂、滴丸、片剂、颗粒、口服液以及注射剂,用于各种心血管病尤其是心肌缺血、动脉粥样硬化的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物。具体地说是以姜科植物姜(Zingiber offficinale Rosc)的根茎、芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)栽培变种的成熟果皮(陈皮)为原料的提取物的混合物,尤其适用于制备抗心肌缺血、抗血栓形成、降血脂、调节血压、抗动脉粥样硬化相关药物。
背景技术
心血管疾病是威胁人类的重大疾病之一,尽管近30年来心血管病死亡率除东欧各国外的大多数国家都有不同程度的下降,但其仍是多数国家45岁以上男性第一位的死亡原因,在女性则是仅次于肿瘤的第二位死因,严重影响着人类的期望寿命和生存质量。在中国,随着生活水平的提高,患心血管病人群持续攀升,并呈年轻化趋势,农村地区发病率也在明显上升,目前患病者已逾1亿。所以,治疗心血管病的药物不仅具有巨大的市场前景,而且对保障人类健康同样意义重大。
心血管疾病的病理学基础主要是动脉粥样硬化(AS)。虽然AS的病因学至今尚未阐明,但近年的研究结果所提出的氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)致AS的病因学说,已为多数学者所接受。所以,从氧化应激致AS的过程中有关环节应用抗氧化剂的策略来防治动脉粥样硬化是完全有可能的。事实上,至今已发现的许多心血管药物(合成药)除各有其主要药理作用外,同时也具有抗氧化剂的特性,如:钙拮抗剂、β受体阻滞剂、ACE抑制剂等。但到目前为止,尚未有以抗氧化作用为主要药理作用的心血管病治疗药物。
在心血管药物市场,治疗心血管病的药物呈逐渐增长趋势。目前世界治疗心血管疾病药物的市场销售额已达400多亿美元,位居首位。其中钙拮抗剂占治疗心血管疾病药物市场份额的19.2%,ACE抑制剂占了18.2%,降血脂药约占13%,β-阻断剂占了11.8%,其它药占38%左右。在中国,2004年全国医院心脑血管***用药总价值超过70亿元,中药在心血管疾病的治疗中占的比重将进一步加大,除了“地奥心血康”、“步长脑心通”、“复方丹参滴丸”三大品种外,一些新的中药也将进入心血管类药物市场。虽然用于治疗心血管疾病的中药有上百种,但由于药理上不能解决动脉粥样硬化问题,而没有进一步突破。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗自由基氧化作用、清除自由基、保护心肌细胞、调整血压、改善血液流变学、抗凝血、抗血栓形成、耐缺氧的用于治疗心血管病的治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物。
本发明的治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物的重量份数组成如下:
姜提取物 100
陈皮提取物 0.1-200
其最佳比例为:
姜提取物 100
陈皮提取物 50-100
所述姜提取物是姜的根茎的超临界二氧化碳萃取物,通过下述方法制备得到将干燥的原料姜投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在15-30MPa,25-40℃下进行萃取0.5-2小时;萃取液进入分离罐中,在8-15MPa,40-60℃下进行分离0.5-2小时,得到姜超临界CO2提取物。
所述陈皮提取物是橘及其栽培变种的成熟果皮的水蒸气蒸馏提取物,通过下述方法制备得到:将陈皮用水蒸气蒸馏3-8小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。
所述的姜、陈皮提取物的混合物可以直接服用,也可按常规工艺制成符合制剂要求的口服药物剂型如软胶囊剂、胶囊剂、滴丸、片剂、颗粒、口服液或注射剂。
本发明的治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物可以与其他药物配伍制备可治疗心血管病等疾病的药物。
姜提取物中含姜挥发油和姜辣素:姜醇(即姜油酮)、姜烯、没药烯、α-姜黄烯、α-和β-金合欢烯、芳樟醇、桉油素、壬醛、α-龙脑和β-倍半菲兰烯;姜辣素(姜酚)及其分解产物姜烯酚、姜酮。陈皮提取物中的主要成分是陈皮挥发油,含柠檬烯、α-蒎烯,γ-松油烯等。
所述的姜、陈皮提取物混合物用于具有以下功效的治疗各种心血管疾病,尤其是抗心肌缺血、抗血栓形成、降血脂、调节血压和抗动脉粥样硬化相关药物的制造:
(1)对脑垂体后叶素引起的急性心肌缺血有改善和保护作用;
(2)有改普瘀血模型大鼠血液流变学的作用;
(3)对ADP诱导的血小板聚集有明显的抑制作用;
(4)提高血清的活性氧单位数,具有显著的抗自由基氧化作用;
(5)提高小鼠抗应激能力,
(6)急性毒性实验表明,所述的姜提取物的小鼠LD50为4.261mL/kg,在临床用药是安全的。
(7)急性毒性实验表明,所述的陈皮提取物的小鼠LD50为8.5612mL/kg,在临床用药是安全的。
姜是姜科植物姜(Zingiber officinale Rosc.)的新鲜或干燥根茎,分别称为生姜和干姜。生姜性味辛温,能发汗解表,温中止呕,温肺止咳,常用于治疗风寒感冒、恶心呕吐等;干姜性味辛热,能温中回阳,温肺化饮,常用于治疗脾胃虚寒、肺寒咳嗽等。姜的化学成分复杂,不下百种,主要含挥发油、姜辣素,此外,还含有二氢姜酚、六氢姜黄素、γ-氨基丁酸、天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸等。
陈皮为芸香科植物橘(Citrus reticulate Blanco)及其栽培变种的成熟果皮。陈皮味辛苦性温,能理气健脾,燥湿化痰。常用于治疗脾胃气滞、湿痰咳嗽等。陈皮中含有挥发油,主要成分为柠檬烯,还含有黄酮甙类物质(如橙皮甙)等。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
(1)姜和陈皮是常见易得的药食两用中药材,制作工艺简易,成本低廉,姜和陈皮的提取物按特定比例配伍,具有明确抗自由基氧化、保护心肌细胞、调整血压、改善血液流变学、抗凝血、抗血栓形成、抗心肌缺血和抗动脉粥样硬化作用。
(2)本发明姜与陈皮的提取物混合而成,运用现代药理研究结果,从抗氧化的途径来解决动脉粥样硬化问题,开拓了橘皮汤的新用途,而且相比于同类中药制剂,有效部位清楚,作用靶点明确,对于心血管疾病的治疗作用毋庸置疑,市场潜力巨大。
(3)本发明基于中医学和现代医学对心血管疾病病因病机的认识和治疗原则,结合现代药理研究成果,选择行气、通脉、活血、化瘀的中药,按中医理论进行组方,以姜、陈皮为原料,经现代分离技术进行分离提纯,并进行混合,具有抗自由基氧化、保护心肌细胞、调整血压、改善血液流变学、抗凝血、抗血栓形成、耐缺氧等多种作用,可用于制造各种治疗心血管病的药物。
附图说明
图1是姜提取物指纹图谱
图2是6批姜提取物样品的色谱指纹图的三维图
图3三种不同色谱柱子获得的GC色谱图,其中
图3-1是柱PEG-20M获得的色谱图
图3-2是柱OV-1701获得的色谱图
具体实施方式
实施例1-1:姜、陈皮提取物混合物的制备
称取10kg预先干燥、破碎至粒度1mm以下的原料姜,投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在25MPa,35℃下进行萃取1小时;萃取液进入分离罐中,在10MPa,50℃下进行分离1小时,得到姜超临界CO2提取物。称取陈皮药材粗粉10kg,用水蒸气蒸馏5小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。按姜提取物∶陈皮提取物=100∶100重量比进行混合,得到姜、陈皮提取物混合物。
实施例1-2:姜、陈皮提取物混合物的制备
称取10kg预先干燥、破碎至粒度1mm以下的原料姜,投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在15MPa,40℃下进行萃取0.5小时;萃取液进入分离罐中,在15MPa,40℃下进行分离2小时,得到姜超临界CO2提取物。
称取陈皮药材粗粉5kg,用水蒸气蒸馏8小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。按姜提取物∶陈皮提取物=100∶50重量比进行混合,得到姜、陈皮提取物混合物。
实施例1-3:姜、陈皮提取物混合物的制备
称取10kg预先干燥、破碎至粒度1mm以下的原料姜,投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在30MPa,25℃下进行萃取2小时;萃取液进入分离罐中,在8MPa,60℃下进行分离0.5小时,得到姜超临界CO2提取物。
称取陈皮药材粗粉10kg,用水蒸气蒸馏3小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。按姜提取物∶陈皮提取物=100∶0.1重量比进行混合,得到姜、陈皮提取物混合物。
实施例1-4:姜、陈皮提取物混合物的制备
称取10kg预先干燥、破碎至粒度1mm以下的原料姜,投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在25MPa,35℃下进行萃取1小时;萃取液进入分离罐中,在10MPa,50℃下进行分离1小时,得到姜超临界CO2提取物。称取陈皮药材粗粉10kg,用水蒸气蒸馏5小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。按姜提取物∶陈皮提取物=100∶200重量比进行混合,,得到姜、陈皮提取物混合物。
实施例1-5:姜、陈皮提取物混合物的制备
称取10kg预先干燥、破碎至粒度1mm以下的原料姜,投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在25MPa,35℃下进行萃取1小时;萃取液进入分离罐中,在10MPa,50℃下进行分离1小时,得到姜超临界CO2提取物。称取陈皮药材粗粉10kg,用水蒸气蒸馏5小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。按姜提取物∶陈皮提取物=100∶10重量比进行混合,得到姜、陈皮提取物混合物。
以下实施例均采用实施例1-2得到的姜、陈皮提取物及混合物进行试验
实施例2:姜、陈皮提取物及混合物对脑垂体后叶素致心肌缺血大鼠的心功能改善和心肌保护作用
(一)姜、陈皮提取物及混合物对脑垂体后叶素致心电图改变的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物:Wistar大鼠,雌雄均用,140~160g
1.1.2试剂:脑垂体后叶素(上海第一生化药业公司,上海生物化学制药厂,批号010327有效期至030326)、戊巴比妥钠(上海第三制药厂批号861106)
1.1.3试药:复方丹参滴丸(购自天津天士力制药有限公司),姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物(体积比2∶1)
1.1.4仪器:IM-600型电生理仪(日本光电)
1.2方法
1.2.1动物分组:Wistar大鼠,140~160g,雄性,分为7组,10只/组。正常对照组,模型对照组,阳性药(复方丹参滴丸)对照组,姜提取物组,陈皮提取物组,姜、陈皮提取物混合物低剂量组,姜、陈皮提取物混合物高剂量组。预给药4天。
1.2.2给药:空白组、模型组给水,阳性药组复方丹参滴丸给药剂量为8.3mg/100g;姜提取物组给药剂量为24μl/100g,陈皮提取物组给药剂量为12μl/100g,姜、陈皮提取物混合物低剂量组给药剂量为36μl/100g,姜、陈皮提取物混合物低剂量组给药剂量为9μl/100g。
1.2.3第5天给药后45min用戊巴比妥钠麻醉,大鼠背位固定,四肢接二导联,大鼠心电图稳定时,腹腔注射脑垂体后叶素,观察记录0s,5min,15min,30min,45min时心电图变化,同时记录心率的变化。正常对照组用生理盐水代替脑垂体后叶素。
1.2.4以S点到T点的靠S点端1/3处记为J点,计算统计J点的偏移程度。
1.2.5实验记录条件:纸速:50mm/s,电压:0.5mv/mm,
2结果
表1是姜、陈皮提取物及混合物对脑垂体后叶素引起急性心肌缺血的影响。
表1
与正常组比较:*p<0.05,**p<0.01;与模型组比较:#p<0.05,##p<0.01由表可见,姜、陈皮提取物混合物低剂量、高剂量组与阳性药对照组各时点比较:△p<0.05,△△p<0.01;45min处与30min处比较:▲p<0.05,▲▲p<0.01
在30min点时,各给药组中以阳性药(复方丹参滴丸)组,姜、陈皮提取物混合物高剂量组ST段均被抬高至最高点。45min时逐渐恢复,给药组ST段并未恢复到给药前水平(即0min时)。正常组ST段也略有抬高,但并不明显。而模型组则在此期间无恢复迹象。
3结论
实验结果表明,姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物均具有不同程度的改善脑垂体后叶素所致的心肌缺血症状的作用,其中以姜、陈皮提取物混合物的作用最强.
(二)姜、陈皮提取物及混合物对心肌缺血引起的血清超氧化物歧化酶(SOD)活力下降的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物:Wistar大鼠,雌雄兼用,140~160g
1.1.2试剂:脑垂体后叶素、SOD试剂检测盒(购自南京冷泉港科技中心)
1.1.3试药:同“实施例2”(一)中“1.1.3”。
1.1.4测盒:SOD试剂检测盒(购自南京冷泉港科技中心)
1.1.5仪器:HP6010可见光-紫外分光光度计
1.2方法步骤
1.2.1动物分组:同“实施例2”(一)中“1.2.1”。
1.2.2给药方法:同“实施例2”(一)中“1.2.2”。
1.2.3空白组给药以给水,第4天腹腔注射脑垂体后叶素改为生理盐水;模型组则腹腔注射脑垂体后叶素,余同正常对照组;阳性药对照组则以复方丹参滴丸为阳性药。
1.2.4药物配制:药物配制每2天一次。
1.2.5检测方法:第4天给药后30min后,颈动脉取血,离心取血清。按试剂盒说明书检测。
1.2.6配制试剂:按试剂盒说明配制试剂一、二、三、四。试剂一、二为缓冲液,试剂二配好后4℃保存。试剂三为对氨基苯磺酸,试剂四为盐酸萘乙二胺。
1.2.7加样:
1)每试管加样品50μl。
2)各试管依次加入双蒸馏水0.25ml、试剂一、试剂二各0.1ml。同时做空白对照管、标准曲线。
3)混匀,37℃水浴30min。
4)加试剂三、试剂四各0.5ml。
5)将各管混匀,置30℃水浴15min。
6)水浴取出,室温静置15min,待检。
7)对照管用双蒸馏水代替样品,其余处理同待测样品。
8)标准曲线制作:标准品与双蒸馏水的总体积为0.3ml,标准品加样量分别为0.01ml、0.02ml、0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.2ml,其余处理皆与其他组雷同。SOD标准曲线方程:y=-0.737x+0.150;r2=0.997
1.2.8在550nm处用可见光-紫外分光光度计检测OD值
2结果
表2是姜、陈皮提取物及混合物对SOD活力的影响
表2
组别 | n | SOD活力 |
正常对照组模型对照组阳性药对照组姜提取物组陈皮提取物组姜、陈皮混合物低剂组姜、陈皮混合物高剂组 | 10101010101010 | 0.070±0.0070.062±0.0080.074±0.011*0.068±0.008*0.066±0.007*0.070±0.007*0.071±0.006* |
与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01
由表可见,模型组SOD活力下降,各给药组均能提高SOD活力,姜、陈皮提取物混合物的作用比姜提取物和陈皮提取物的作用强.
3结论
姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物都具有提高心肌缺血损伤模型SOD活力的作用,有改善心肌缺血损伤作用,以姜、陈皮提取物混合物的作用最强。
实施例3:姜、陈皮提取物及混合物对瘀血模型大鼠血液流变学的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物:Wistar大鼠,雄性,150g±20g
1.1.2试剂:盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司,批号000703,购自广州中医药大学附属第一医院)
1.1.3试药:同“实施例2”(一)中“1.1.3”
1.1.4仪器:L-100血液粘度计,LIANG-微机显示自动记录血液血浆粘度计
1.2方法
1.2.1动物分组:同“实施例2”(一)中“1.2.1”。
1.2.2给药方法:同“实施例2”(一)中“1.2.2”。
1.2.3造模方法:采用寒冷刺激结合肾上腺素造模方法,属于寒凝型血瘀证模型。用生理盐水将1mg/mL的异丙肾上腺素稀释1倍,每隔4小时按0.1ml/100g皮下注射(SC)1次,共3次。在每两次给药的中间将大鼠放入0~2℃冰水中冷刺激4分钟。造模共进行2天。
1.2.4给药方法:正常组、模型对照组均给水,阳性药对照组给复方丹参滴丸。预给药3天,造模后,再给药2天,第3天检测。造模同时不停药。
1.2.5造模后第3天,心脏取全血,肝素抗凝。
1.2.6检测方法及指标:检测血液流变学指标:血液粘度,红细胞压积,红细胞变形能力,血浆粘度等。
2结果
表3是姜、陈皮提取物及混合物对瘀血模型大鼠血液流变学的影响
表3
组别 | n | 红细胞变形性 | 红细胞聚集性 | 红细胞聚集指数 |
正常对照组模型对照组阳性对照组姜提取物组陈皮提取物组姜、陈皮混合物低剂组姜、陈皮混合物高剂组 | 10101010101010 | 6.895±1.20510.358±1.608△△7.314±1.495**8.825±1.314△△**#9.088±1.384**△△8.606±1.412△△*8.618±1.686△* | 10.0641±1.46619.633±1.797△△10.347±1.506**11.853±1.504△△**#11.328±1.452**△12.028±1.421△△**#12.518±1.653△△**## | 1.410±0.1241.749±0.139△△1.476±0.129**1.598±0.126△**1.689±0.136*△1.574±0.145△*1.546±0.139△** |
由表可见,与正常组比较:△p<0.05,△△p<0.01;与模型组比较:*p<0.05,**p<0.01;姜、陈皮提取物混合物给药组与复方丹参组比较:#p<0.05数据经方差齐性检验,各组间方差齐。
缺血性心脏病常伴有血液流变学的改变。血液的粘、0浓、凝、聚状态,使缺血性心脏病更易发生。从表3可以看到,与模型组比较,姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物对红细胞变形性、聚集性、聚集指数影响均有显著性意义,其中以混合物高剂组作用最强。
3结论
实验结果表明,姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物对瘀血模型大鼠血液流变学均有改善作用,姜、陈皮提取物混合物的作用较姜提取物,陈皮提取物的作用强。
实施例4:姜、陈皮提取物及混合物对ADP诱导的血小板聚集的影响
1材料和方法
1.1材料
1.1.1材料:塑料试管、一次性射器
1.1.2仪器:离心机、血液凝聚仪LBY-NJ2
1.1.3动物:Wistar大鼠,雌雄兼用,200g~250g
1.1.4试药:阿司匹林(购自广州中医药大学附属第一医院),姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物(体积比2∶1)
1.1.5试剂:血小板聚集诱导剂ADP钠盐、盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司,批号000703,购自广州中医药大学附属第一医院)、枸橼酸钠
1.2实验步骤
1.2.1动物分组:Wistar大鼠70只,雌雄兼用。随机分为7组,10只/组,设为正常对照组,模型对照组,阳性药(阿司匹林)对照组,姜提取物组,陈皮提取物组,姜、陈皮提取物混合物低剂量组,姜、陈皮提取物混合物高剂量组。除正常组外,其余均用肾上腺素冰水造模。
1.2.2给药方案:ig给药,正常组、造模组给水溶液,阳性对照组给予阿司匹林,姜提取物组给药剂量为24μl/100g,陈皮提取物组给药剂量为12μl/100g,姜、陈皮提取物混合物低剂量组给药剂量为36μl/100g,姜、陈皮提取物混合物低剂量组给药剂量为9μl/100g。
1.2.3造模方法:将1mg/mL的肾上腺素用生理盐水稀释1倍,每隔4小时按0.1ml/100g皮下注射(SC)1次,共3次。在每两次给药的中间将大鼠放入0~2℃冰水中冷刺激4分钟。造模共进行2天。
1.2.4给药共5天。(造模结束后继续用药3天)。第5天给药1h后心脏取全血,置入抗凝试管中(用1%肝素处理)。以1000rpm离心5min,吸取上层PRP,余下血浆再以4000rpm离心10min,其上清液即乏血小板血浆PPP(platelet poor plasma)。
1.2.5以PPP调PRP,使PRP中血小板数平均约为45万/μl。(血液凝聚仪LBY-NJ2计数)
1.2.6取PRP0.3ml于比浊管内,以PPP调透光度,用血液凝聚仪LBY-NJ2检测描记PRP中血小板在5分钟内的最大聚集程度。
1.2.7计算两者的比值和血小板聚集率。
2结果
表4是姜、陈皮提取物及混合物对抗ADP诱导的血小板聚集的影响
表4
组别 | n | 血小板最大聚集率(%) |
正常对照组模型对照组阳性药对照组姜提取物组陈皮提取物组姜、陈皮混合物低剂组姜、陈皮混合物高剂组 | 10101010101010 | 41.98±6.471#48.64±5.339*##28.50±5.323**##33.07±4.767**##34.39±5.804**##33.45±4.226**##31.88±5.083**## |
*与正常对照组比较:p<0.05;**与正常对照组比较:p<0.01
#与模型对照组比较:p<0.05;##与模型对照组比较:p<0.01
结果表明,模型对照组与正常对照组比较有差异p<0.05,说明造模成功:各给药组和阳性药对照组对ADP诱导的血小板聚集均有不同程度的抑制作用,与模型对照组比较均p<0.01。其中,姜、陈皮提取物混合物高剂组的作用比姜提取物、陈皮提取物的作用强。
3结论
姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物对ADP诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用,以姜、陈皮提取物混合物的作用最强。
实施例5:姜、陈皮提取物及混合物抗自由基氧化试验
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物:雄性SD大鼠,体重260~300克,广东省医学实验动物场提供,合格证号:(广东省科委发)2001A046。饲料由广东省医学实验动物场提供。
1.1.2受试药物及配制:姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物(体积比2∶1),维生素E(阳性对照药)(广州星群药业股份有限公司提供)。姜提取物、陈皮提取物以2%的吐温-80分别配成2.5μL/mL、1.25μL/mL,姜、陈皮提取物混合物也用2%的吐温-80配成前述浓度。维生素E用2%吐温生理盐水溶液配成3.125mg/mL浓度备用。
1.1.3试剂:检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20011210)。
1.2方法
1.2.1动物分组:动物按体重随机分为5组,每组10只。设为正常对照组、阳性药对照组、姜提取物组、陈皮提取物组,姜、陈皮提取物混合物。
1.2.2给药:各组实验大鼠均灌胃给药,灌胃体积为10mL/kg,正常对照组给等体积的2%吐温-80生理盐水溶液,阳性对照组给Vit E溶液,连续给药5天,1次/日。
1.2.3取样和测定:末次给药后30min,大鼠颈动脉取血,4℃静置,析出血清后于1500rpm离心10min取血清,每管均用生理盐水稀释为20倍。然后按试剂盒方法操作(见表5-1),测定OD值。
表5-1是Fenton反应法测定抗氧自由基试验操作方法
表5-1
试剂 | 标准空白管 | 标准管 | 对照管 | 测定管 |
蒸馏水(mL) | 0.2 | 0.1 | 0.1 | |
0.03%H2O2标准品应用液(mL) | 0.1 | |||
底物应用液(mL) | 0.1 | 0.1 | ||
样品(mL) | 0.1 | |||
试剂三(mL) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
显色剂(mL) | 1 | 1 | 1 | 1 |
规定每毫升血清在37℃下反应1分钟,使反应体系中H2O2浓度降低1mmoL/L为一个活性氧单位。计算结果单位为U/mL血清。计算公式如下:
1.3统计学处理:应用SPSS统计软件10.0版,进行One-WayANOVA分析。
2结果
Fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应。在Fenton反应产生的羟自由基中加入电子受体,并用gress试剂显色,结果呈现红色,其颜色与羟自由基的多少成正比关系。用分光光度计在550nm下测量OD值,可测知受试药对羟自由基的抑制作用。
结果表明(见表5-2),姜、陈皮提取物混合物组、陈皮提取物组、阳性药对照组均能显著血清的活性氧单位数,与正常对照组比较p<0.01,姜提取物组与正常组比较也有差异(p<0.05);姜、陈皮提取物混合物组与阳性药对照组比较无差异,姜提取物组、陈皮提取物组与阳性对照组比较有差异(p<0.05,0.01)。
表5-2是姜、陈皮提取物及混合物对活性氧单位数的影响
表5-2
组别 | n | 活性氧单位数(U/mL) |
正常对照组阳性药对照组姜提取物组陈皮提取物组姜、陈皮提取物混合物组 | 1010101010 | 752.06±89.801075.6±08.8**843.43±75.13*△△971.67±108.17**△1039.8±128.4** |
注:*与正常对照组比较p<0.05**与正常对照组比较p<0.01
△与阳性对照组比较p<0.05△△与阳性对照组比较p<0.01
3结论
姜、陈皮提取物混合物有显著的抗自由基氧化作用,效果与Vit E相似;姜提取物、陈皮提取物单用均有抗氧化作用,但抗氧化作用没有配伍应用好。
实施例6:姜、陈皮提取物及混合物对小鼠抗应激能力影响的试验研究
1材料和方法
1.1材料
1.1.1动物:NIH小鼠,体重18~22克,雌雄各半,广东省医学实验动物场提供,合格证号:(广东省科委发)2001A044。饲料由广东省医学实验动物场提供。
1.1.2试药:姜提取物,陈皮提取物,姜、陈皮提取物混合物(体积比2∶1)
1.2方法
1.2.1动物分组:动物按体重随机分为4组,12只/组:设为正常对照组(生理盐水)、姜提取物组,陈皮提取物组,姜、陈皮提取物混合物组。
1.2.2试验方法:选择负重游泳试验方法,分别观察姜提取物单用,陈皮提取物单用和配伍应用对动物抗应激能力的影响。
1.2.3给药剂量:各实验组小鼠均灌胃给药,灌胃体积为20ml/kg。姜提取物组给药剂量为24μl/100g,陈皮提取物组给药剂量为12μl/100g,姜、陈皮提取物混合物组给药剂量为36μl/100g。正常对照组灌胃等体积2%吐温-80生理盐水溶液,连续给药(水)5天,1次/日。末次给药(水)后30分钟,各小鼠尾部负重为体重的10%,进行常温水游泳试验。观察并记录各小鼠游泳时间。
1.3统计学处理
应用SPSS统计软件10.0版,进行One-Way ANOVA分析。
2结果
表6是姜、陈皮提取物及混合物对小鼠负重游泳时间的影响
表6
组别 | n | 小鼠负重游泳时间(s) |
正常对照组姜提取物组陈皮提取物组姜、陈皮提取物混合物组 | 12121212 | 59.2±15.757.5±21.397.6±20.7**98.4±22.6** |
注:与正常对照组比较,*p<0.05**p<0.01
试验结果表明,陈皮提取物组和姜、陈皮提取物混合物组与正常对照组比较,小鼠负重游泳时间有显著性差异(p<0.01),而姜提取物组则无显著性差异。
3结论
陈皮提取物和姜、陈皮提取物混合物具有显著地增强小鼠的抗应激能力和明显地抗疲劳作用,姜提取物单用则无此作用。
实施例7:姜提取物急性毒性试验
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂:苦味酸试剂,蒸馏水,吐温80
1.1.2试药:姜超临界CO2提取物
1.1.3动物:NIH小鼠(普通级),18~22g,雌雄各半
1.1.4实验条件:开放***
1.2方法
实验前均禁食不禁水14小时,ig给药,给药容量为0.3ml/10g。给药1h后给食,对死亡小鼠进行解剖,记录死亡情况。给药后观察7天。
1.2.1预实验:12只小鼠,雄鼠编号1~6,雌鼠编号7~12,随机分为三组。初步确定三组给药剂量分别为每10克0.2ml、0.10ml、0.05ml。(组间剂量1∶0.5)
1.2.1.1预实验结果见表7-1,是姜油小鼠急性毒性预实验结果。
表7-1
组别 | 数量 | 死亡数 | 给药剂量 | 结果 |
组一组二组三 | 444 | 421 | 0.2ml/10g0.1ml/10g0.05ml/10g | 全部死亡死亡2个死亡1个 |
1.2.1.2由预实验结果,可初步确定小鼠姜油最小全部死亡剂量(Dm)为0.2ml/10g,最大全部存活剂量(Dn)为0.03ml/10g。为确保实验的顺利的进行,将Dm扩大1.5倍定为0.3ml/10g。
1.2.2正式实验:NIH小鼠100只,雌雄各半,分为10组。在Dn和Dm的范围内分为10个剂量梯度,确定组间剂量以1∶0.75(1∶K)递减。第1剂量为0.3ml/10g,第2剂量为0.225ml/10g,第10剂量为0.0225ml/10g,延续到第11剂量为0.01689ml/10g。具体剂量情况见表7-2。
1.2.2.1先从第2剂量开始给药,在给药期间此剂量组即全部死亡,故第1剂量不必再做。
实验结果如表7-2。
1.2.2.2实验情况:小鼠的死亡基本大部分发生在第一、二天,两天后,死亡数量大减。第4天后,组10与组9的未死亡小鼠外观行动恢复正常;第5天组7、组8小鼠恢复正常:进食饮水,大便、活动均见正常;第7天,组6未死亡小鼠恢复正常。小鼠在死亡前先后出现活动减少,蜷缩,静卧,呼吸急促、浅,皮毛无松弛现象,未见流涎、流鼻涕现象,未见抽搐现象。死亡后解剖,见:胃肠胀气、充血,第2、3天死亡小鼠解剖可见大便有干结现象,小便少(膀胱空)。肺部、心、肝、脾、肾外观无明显异常。
1.2.3一周来小鼠日死亡情况见表7-2,总体实验情况见表7-3。
表7-2正式实验小鼠日死亡情况
组别 | 死亡数(只) | ||||||
第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | 第6天 | 第7天 | |
组1组2组3组4组5组6组7组8组9组10∑ | 10107564222048 | 003431100012 | 00011100003 | 00000000000 | 00000000000 | 00000000000 | 00000000000 |
表7-3姜油小鼠实验急性毒性实验情况
组别 | 死亡数/动物数 | 给药剂量(ml/kg ) | 对数剂量 | 计算资料 | P[注] | P2 |
组1组2组3组4组5组6组7组8组9组10 | 10/1010/1010/1010/1010/106/103/102/102/100/10 | 22.5016.8812.669.497.125.344.003.002.251.69 | 1.35221.22721.10230.97740.85240.72750.60250.47760.35270.2277 | Dm=22.5Xm=1.3522n=10K=6i=0.1249 | 1.01.01.01.01.00.60.30.20.20 | 1.01.01.01.01.00.360.090.040.040 |
注:P为小鼠死亡率,P2为死亡率的平方值
2结果
根据实验,按改良寇氏法公式计算:
姜油小鼠半数致死量LD50=4.562ml/kg
LD50的95%可信限=lg-1(0.8552±1.96×0.0407)=5.0211~3.6158ml/kgLD50的平均可信限=4.261±(5.0211-3.6158)/2=4.261±0.7026ml/kg
直线回归方程为:Y=5.77x-1.19
3结论
姜油的急性毒性实验表明,其小鼠的LD50为4.261ml/kg,相当于人约25ml/60kg,相当于生药500g,是临床常用量的50~100倍。由此,可初步认为姜油在临床应用上是安全的。
实验过程中解剖发现,姜油对胃肠道有较大刺激,引起胃肠粘膜充血,并且大肠有大便干结现象。心、肺、肝、脾、肾等器官外观无明显变化。小鼠第1天大部分在1~2小时左右死亡,第2天则少,第3天已基本无死亡现象,第7天则已恢复正常。
实施例8:陈皮提取物急性毒性试验
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂:蒸馏水,陈皮提取物,吐温80
1.1.2动物:NIH普通小鼠,18~22g,雌雄各半
1.1.3实验条件:天气,晴;室温,26℃~29℃;相对湿度,50%~74%
1.2方法
按改良寇氏法进行。
1.2.1实验前一天晚上禁食不禁水。ig给药,给药容量基本定为0.3ml/10g,给药1h后给食,观察7天。
1.2.2进行预试验,求得Dm(最小全部死亡剂量)和Dn(最大全部存活剂量)。预实验进行了2次,见表8-1、表8-2。
1.2.3预实验结果:可初步确定Dm为0.15ml/10g,Dn为0.025ml/10g。解剖情况:均为胃肠道刺激,胃幽门部充血,胃肠粘膜充血,其余器官心脏、肺、脾、肝、肾等外观未见明显变化。
表8-1陈皮提取物小鼠急性毒性预实验(一)小鼠死亡情况
组别 | 数量(只) | 死亡数(只) | ig剂量(ml/10g) | 结果 |
组1组2组3组4组5 | 44444 | 34444 | 0.10.20.30.40.5 | 死亡3只全部死亡全部死亡全部死亡全部死亡 |
表8-2.陈皮提取物小鼠急性毒性预实验(二)小鼠死亡情况
组别 | 数量(只) | 死亡数(只) | ig剂量(ml/10g) | 结果 |
组1组2组3组4 | 5555 | 4100 | 0.10.050.0250.012 | 1只存活,4只死亡1只死亡,4只存活全部存活全部存活 |
1.2.4根据Dm和Dn进行正式急性毒性实验。
正式实验:NIH小鼠60只,雌雄各半。在Dn和Dm的范围内随机分为6组,每组10只,雌雄各半。
1.2.4.1用2.5%吐温80水溶液配制药液,给药。
1.2.4.2给药剂量:组1为高剂量,给药剂量为0.15ml/10g组;组6为低剂量组,给药剂量为0.036ml/10g。组间剂量比为1∶0.75。
表8-3正式实验小鼠日死亡数
组别 | 日期 | ||||||
第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | 第6天 | 第7天 | |
组1组2组3组4组5组6∑ | 54322016 | 2111106 | 1200003 | 0000000 | 0000000 | 0000000 | 0000000 |
表8-4陈皮油小鼠急性毒性实验小鼠死亡情况
注:P为小鼠死亡率,P2为死亡率的平方值
2结果
实验情况:小鼠死亡前先后出现活动减少,蜷缩,静卧,呼吸急促、浅,皮毛无松弛现象,未见流涎、流鼻涕现象。
小鼠死亡情况记录见表8-3,在第4天以后即无死亡发生。
死亡小鼠解剖情况:均为胃肠道刺激,胃幽门部充血,胃肠粘膜充血,其余器官未见明显病理变化。只第4组有2只死亡小鼠除有以上情况外,还可见肺部颜色较红。
根据实验结果计算LD50。(见表8-4)
按改良寇氏法公式计算得:
陈皮提取物的小鼠半数致死量LD50=8.5612ml/kg;logLD50的标准误SX50=0.0408;
其LD50的95%可信限:L95=8.1747±1.5715;
LD50的99%可信限:L99=8.1747±2.0604
陈皮提取物小鼠急性毒性的回归直线方程是:Y=4.2532x-1.0338
3结论
陈皮提取物小鼠急性毒性实验的LD50为8.5612ml/kg。
对死亡小鼠解剖发现,其毒性表现与姜油一样,主要集中于对胃肠道的刺激。肺、心脏、肝、脾、肾、生殖***等,外观未见明显变化。
小鼠恢复情况:小鼠死亡一般均发生于给药后1~2h,第2天死亡的小鼠已大减。组6小鼠第2天即已恢复,活动正常,进食饮水正常;到第5天,组4、组5小鼠恢复正常;到第6天,全部存活小鼠均完全恢复。
实验过程中,第4组有2只死亡小鼠肺部颜色异常,而其他小鼠未见此现象,疑为灌胃操作不熟练,有少许药液呛入肺部所致。
实施例9:姜提取物气相色谱指纹图谱分析
1材料和方法
1.1样品:姜提取物(超临界CO2萃取物)。
1.2仪器:Autosystem XL气相色谱仪,美国PERKIN-ELMER公司。
1.3实验方法
1.3.1色谱条件
色谱柱:PEG-20M,15m×0.32mmID×0.4μm膜厚的石英毛细管柱;炉温:80℃,每分钟升高5℃到250℃保持26min;进样口温度:100℃,每分钟升高30℃到280℃保持54min;载气:高纯氮;柱压:3.5PSI;FID:300℃;分流比:20∶1;氢气流速:45ml/min;空气
流速:450ml/min。
1.3.2测定方法
精密吸取样品0.2μl,进样,测定并记录图谱。
2结果
2.1方法学研究
为了考察分析方法的可靠性,对其稳定性、仪器精密度、实验方法的重现性作了相应的考察,结果证明稳定性及重现性良好。
2.1.1稳定性试验
取同一样品,分别在一周内每天进行检测,在每组峰中选一个峰,如图1,考察其保留时间的一致性,各色谱峰保留时间的RSD≤0.58%。见表9-1。
表9-1 所选色谱峰的保留时间
色谱图 | 峰保留时间(min) | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
ZING061ZING068ZING074ZING079ZING085ZING091 | 2.0872.0612.0842.0892.0942.092 | 9.9309.8879.9339.9679.9949.960 | 22.61522.62522.64522.65022.64322.642 | 29.28829.10129.10929.12229.09729.090 | 43.55543.57943.29243.61443.58643.529 |
RSD(%) | 0.58 | 0.37 | 0.060 | 0.26 | 0.27 |
表9-2所选色谱峰的保留时间
色谱图 | 峰保留时间(min) | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
ZING092ZING093ZING094ZING095ZING096ZING097 | 2.1022.1012.0992.0932.0972.087 | 9.9609.9519.9789.9789.9719.960 | 22.64322.63622.65022.63422.65122.639 | 29.09529.09629.09429.08929.09829.089 | 43.56243.54643.55643.52643.54643.523 |
RSD(%) | 0.27 | 0.11 | 0.032 | 0.013 | 0.036 |
2.1.2仪器精密度试验
取同一份样品,连续进样6次,考察色谱峰的保留时间的一致性,各主要色谱峰保留时间的RSD≤0.27%。见表9-2。
2.1.3重现性试验
取同一批号的供试品6份,同法检测,考察色谱峰的保留时间的一致性,各主要色谱峰保留时间的RSD≤0.27%。见表9-3及图2。
表9-3所选色谱峰的保留时间
色谱图 | 峰保留时间(min) | ||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
ZING086ZING087ZING088ZING089ZING090ZING091 | 2.0982.0842.0942.0982.0872.092 | 9.9719.9569.9679.9789.9679.960 | 22.65022.63322.64822.64922.64122.642 | 29.10229.08729.08529.09429.09229.090 | 43.56243.55943.54543.57143.55343.529 |
RSD(%) | 0.27 | 0.078 | 0.029 | 0.023 | 0.034 |
2.2姜提取物GC指纹图的建立
作为中药色谱指纹图,其建立的测定方法不仅要简单、准确,同时要在其色谱图中尽可能多地反映出药物的内在信息,以便能从整体上把握其特征,从而保证鉴定的可靠性。由于不同的色谱柱所获得的色谱图可能有所不同,反映出来的特征也不完全一样,因此本实验选用三种不同极性的柱子:OV-1,OV-1701和PEG-20M柱,获得了3张色谱图,如图3。从图中可看到,OV-1及OV-1701柱能提供109及105个色谱峰,而PEG-20M柱却能提供多达125个峰,且色谱图有一个很明显的特征,它由数个峰群组成,我们可以人为地把它分成5组,保留时间从1min~5min(炉温80~105℃)为第一组,5min~15min(炉温105~155℃)为第二组,15min~25min(炉温155~205℃)为第三组,25min~40min(炉温205~250℃)为第四组,40min~55min(炉温250℃)为第五组。从量的方面看,第二组峰的含量其面积达60%,占了绝大部分;而从整体上,各个峰群清晰可辩,分离度较好,这些都构成了姜提取物指纹图谱的特征。
色谱指纹图谱用于中药鉴别,较用任何单一化学对照品作为鉴别的依据所提供的信息都要丰富得多。在生姜挥发油的研究中,往往只是对某一成分或某类成分进行测定[3-5],这显然缺乏专属性。当然,在近几年的研究中,也有很多应用GC/MS对其进行定性定量的分析,但由于GC/MS价格较为贵,而不利于推广应用。本研究通过反复试验比较,筛选出文中记述的方法,规范了实验条件,使获得的指纹图谱在分离度、分辨率、重现性与稳定性方面均较为理想。可作为姜药材及其制剂的质量控制方法。
3结论
本研究表明应用GC色谱指纹图谱以及文中所述方法、条件,是一种对姜提取物进行鉴别和质量监测的简单、易行、准确、可控的方法。
Claims (3)
1、一种治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物,其特征在于其重量份数组成如下:
姜提取物 100
陈皮提取物 0.1-200
所述姜提取物是姜的根茎的超临界二氧化碳萃取物,所述陈皮提取物是橘及其栽培变种的成熟果皮的水蒸气蒸馏提取物。
2、根据权利要求1所述的治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物,其特征在于其重量份数组成如下:
姜提取物 100
陈皮提取物 50-100。
3、根据权利要求1或2所述的治疗心血管病的姜、陈皮提取物的混合物,其特征在于所述姜提取物通过下述方法制备得到:将干燥的原料姜投入萃取釜中,通入超临界CO2流体,在15-30MPa,25-40℃下进行萃取0.5-2小时;萃取液进入分离罐中,在8-15MPa,40-60℃下进行分离0.5-2小时,得到姜超临界CO2提取物;所述陈皮提取物是橘及其栽培变种的成熟果皮的水蒸气蒸馏提取物,通过下述方法制备得到:将陈皮用水蒸气蒸馏3-8小时,收集蒸馏液,油水分离后得陈皮挥发油提取物。
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姜对心脑血管***的药理作用 卢传坚,中药新药与临床药理,第14卷第5期 2003 * |
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浅述陈皮的药理及炮制研究 张群智,中国药业,第11卷第5期 2002 * |
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