CN1318438C - 鞣料云实素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从植物中提取制备鞣料云实素(corilagin)的新方法。植物原料的乙醇提取物经柱层析分离，富集鞣料云实素部位，浓缩，再经柱层析纯化，得到鞣料云实素粗品，用水重结晶，得到鞣料云实素，纯度大于98%。该方法所得鞣料云实素得率高，纯度高，制备过程简单易行，生产周期短，易于批量制备和工业化生产。
Description
技术领域：本发明涉及化学领域化合物的分离提取方法，具体的涉及植物天然生理活性物质鞣料云实素的制备方法。
背景技术：鞣料云实素(corilagin)又称诃子次鞣素、柯里拉京等，化学名称为1-o-没食子酰-3，6-o-六羟基二苯甲酰-β-D-葡萄糖，为天然存在的具有复杂结构的多羟基水解单宁。该化合物具有抗肿瘤、抗病毒、镇痛、抗菌、溶栓、降低血压、降低血糖、抗肝损伤、以及对胃肠道、子宫、膀胱和支气管平滑肌的解痉作用。对乙肝病毒感染具有治疗作用(CN 1197641A)。
鞣料云实素为水解单宁，极性大，提取分离较为困难。已有从植物原料中分离纯化制备鞣料云实素的专利(CN 1197641A)。该方法是以叶下珠属植物、牻牛儿苗属植物、老鹳草属植物为原料，用水提取，水提取物用H 103型大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析以及Sephadex LH-20柱层析进行分离。再用甲醇-水重结晶，得到鞣料云实素。该方法的不足之处是：用水提取的提取率低；鞣料云实素为水解单宁，易被硅胶吸附，用硅胶柱层析分离纯化，影响得率；所用的化学试剂种类多，除甲醇外，还有丙酮、氯仿等，成本高，操作复杂，容易造成溶剂残留和环境污染；操作繁复，不适宜于批量生产制备。
发明内容：本发明的目的旨在提供一种成本低、得率高、纯度高、制备过程简单易行、生产周期短，易于批量制备和工业化生产的鞣料云实素制备方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
取任何一种含鞣料云实素的植物，烘干、粉碎，用含水乙醇加热回流提取2-3次，每次2-3小时，经过滤、浓缩、干燥得乙醇提取物，然后经大孔吸附树脂柱层析分离，在薄层层析的检测指导下，用不同浓度的含水甲醇梯度洗脱，收集含有鞣料云实素的洗脱液，浓缩，再经葡聚糖凝胶柱层析和大孔吸附树脂柱层析纯化，用低级醇与水的混合液进行洗脱，得鞣料云实素粗品，进一步用水重结晶，得鞣料云实素。
上述技术方案中用于提取鞣料云实素的植物原料为：叶下珠属(Phyllanthus)植物，如，叶下珠(P.urinaria Linn.)、珠子草(P.niruriLinn.)、蜜柑草(P.matsumurae Hayata)、苦味叶下珠(P.amarusniruri)等的全草；铁苋属(Acalypha)植物，如，铁苋菜(A.australis Ljnn.)的全草；牻牛儿苗属(Erodium)植物，如，牻牛儿苗(E.stephanianum wild)的全草；大戟属(Euphorbia)植物，如，狼毒大戟(E.fischeriana)的全草；槭属(Acer)植物，如，宁波三角槭(A.buergerianum Miq.)的树叶；榄仁树属(Terminalia)植物，如，诃子(T.chebula Retz.)和千果榄仁(T.myriocarpa Huerck et.Muell.-Arg)的果实等。
上述技术方案中用于柱层析分离的大孔吸附树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂。可以是：如：MCI gel CHP-20P(75-150um，Mitsubishi chemical Co.)，DiaionHP20SS(Mitsubishi chemical Co.)，D-101(天津树脂厂、天津骨胶厂、上海试剂厂、天津市试剂厂，天津南开大学化工厂等)，KB-8(天津树脂厂)等。提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15。
上述技术方案中用于柱层析分离的葡聚糖凝胶为不同厂家生产的各种葡聚糖凝胶的产品型号与规格。例如：Sephadex LH-20(25-100um，Phar-macia Finechemical Co.Ltd)，Toyopearl HW-40F(Phar-macia Fine chemical Co.Ltd)等。
上述技术方案中用于检测和指导柱层析分离的薄层层析法是以苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。
上述技术方案中的重结晶步骤是将鞣料云实素粗品用少量低级醇(可以是甲醇或乙醇)充分溶解，加入适量微微加热，室温下放置过夜，结晶。将析出的结晶用水反复洗涤，过滤，干燥，得到白色粉末，即为鞣料云实素的纯品。
上述技术方案中鞣料云实素干燥方法可用机热干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥。
经过上述制备工艺提取分离得到的鞣料云实素，收率比一般方法高3-5倍，产品的纯度大于98％，无有机溶剂的残留，可直接用作为制药的天然原料或作为标准对照品使用。
本发明制备鞣料云实素的具体步骤如下：
(1)植物原料去杂、洗净、烘干、粉碎成粗粉(过20-40目筛)。
(2)将该植物粗粉用60-95％含水乙醇加热回流提取3次，每次提取时间为2小时，过滤、合并滤液，浓缩、回收溶剂，干燥，得乙醇提取物。
(3)用少量水将乙醇提取物溶解，过滤，缓缓倾入大孔吸附树脂(如：DiaionHP20SS，D-101，KB-8层析柱的上端。层析柱的柱径高比为1∶10-15，乙醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15。以不同浓度的乙醇梯度洗脱，同时用薄层层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，合并，浓缩，回收溶剂，得乙醇洗脱物。
(4)将乙醇洗脱物用少量水溶解，倾入葡聚糖凝胶层析柱的上端。柱径高比为1∶10-15，乙醇洗脱物与葡聚糖凝胶的重量比为1∶5。以不同浓度的乙醇梯度洗脱，用薄层层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，合并，浓缩，回收溶剂，得到淡黄色粉末。
(5)将该淡黄色粉末用少量水溶解，缓缓倾入大孔吸附树脂(如：MCI gelCHP-20P Mitsubishi chemical Co.)层析柱上端。层析柱的柱径高比为1∶10-15，乙醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8。以不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时用薄层层析法检测指导洗脱。薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，合并，浓缩，回收溶剂，得鞣料云实素粗品。
(6)将鞣料云实素粗品用少量乙醇充分溶解，过滤，滤液减压浓缩至干，加适量水微微加热，放置过夜，析出结晶。将结晶用水反复洗涤，过滤，干燥，得到白色粉末，即为鞣料云实素纯品。
(7)鞣料云实素纯品的干燥，可用电热恒温真空干燥法，也可采用冷冻干燥、喷雾干燥和微波干燥法等。
(8)鞣料云实素的高压液相色谱(HPLC)定量分析按以下的方法进行：
仪器与试剂：HPLC仪器为Alliance高效液相色谱仪，自动进样器，PDA二级管阵列可变波长检测器。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余溶剂均为分析纯。
色谱条件及检测波长的选择：用十八烷基硅胶为填充剂(如：Agilent ZORBAXC18酸性柱，4.6×150mm)；乙腈∶水(50M磷酸)(4∶96→30∶70，线形梯度)为流动相。柱温：30℃，流速：1ml/min。
实验材料：精密称取鞣料云实素1mg，加1ml甲醇充分振荡溶解后，即得对照品溶液。
色谱条件与***适用性试验：
1.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(50mM磷酸)溶液(4-30％，60min)为流动相；检测波长为280nm。柱温：30℃。理论板数按鞣料云实素峰计算应不低于10000。
2.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水(50mM磷酸)溶液(0-90％，30min)为流动相；检测波长为280nm。柱温：30℃。理论板数按鞣料云实素峰计算应不低于10000。
3.用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为乙腈-水(50mM磷酸)溶液(13-30％，30min)，线性梯度洗脱；检测波长为280nm。柱温：30℃。理论板数按鞣料云实素峰计算应不低于10000。
重现性考察：以鞣料云实素含量为指标，RSD为0.95％，重现性良好(表1)。稳定性考察：以鞣料云实素含量为指标，考察24小时，RSD为0.59％，鞣料云实素稳定性良好(表2)。
含量测定：由上述工艺制备的鞣料云实素的含量＞98％。
经过上述制备工艺提取分离得到的鞣料云实素，收率比一般方法高3-5倍，产品的纯度大于98％，无有机溶剂的残留，可直接用作为制药的天然原料或作为标准对照品使用。
与现有技术相比，本发明的方法具有下述的优点：
1、本发明从叶下珠属植物、铁苋属植物、大戟属植物、牻牛儿苗属植物、老颧草属植物、安石榴属植物、槭属植物和榄仁树属植物中的任何一种含鞣料云实素的植物中提取鞣料云实素。
表1重现性实验数据
| Area | Conc. |
| 97393449671935949578496021829780063 | 99.420998.451898.427298.444099.2591 |
表2稳定性实验数据
| Area | Conc. |
| 76455467660958762094975185097607013 | 99.098999.103499.098799.077699.0844 |
2、本发明采用薄层层析法作为检测手段，指导柱层析的分离纯化，所得产品的得率高，纯度高。
3、本发明采用乙醇为溶剂从植物原料中提取鞣料云实素，得率高。
4、本发明使用的柱层析填充剂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂和萄聚糖凝胶，不用硅胶，避免了硅胶对鞣料云实素的吸附作用，产品得率高，而且填充剂材料可以重复使用。
5、本发明仅使用低级醇类和水提取分离鞣料云实素，大大降低了成本。
6、本发明采用水重结晶的方法纯化鞣料云实素，不仅产品形状好、纯度高、无溶剂残留，而且简单易行、成本低。
具体实施方式：
下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：从叶下珠全草中提取鞣料云实素
(1)叶下珠全草原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)叶下珠粗粉2.5kg用80％乙醇加热回流提取3次，每次提取时间2小时，过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂、干燥，得叶下珠乙醇提取物300g。回收溶剂可用于反复提取。
(3)用少量水将乙醇提取物溶解，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的上端，乙醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10，以不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到乙醇洗脱物180g。
(4)将乙醇洗脱物用少量水溶解，缓缓倾入葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱的上端，乙醇洗脱物与葡聚糖凝胶的重量比为1∶5，柱径高比为1∶10，以不同浓度的甲乙醇梯度洗脱，同时用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到淡黄色粉末68g。
(5)将淡黄色粉末用少量水溶解，缓缓倾入MCI gel CHP-20P型大孔吸附树脂层析柱的上端，淡黄色粉末与大孔吸附树脂的重量比为1∶8，柱径高比为1∶10。以不同浓度的乙醇梯度洗脱，同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到鞣料云实素粗品2.945g。
(6)将鞣料云实素粗品用少量乙醇充分溶解，过滤，减压浓缩至干，加适量水溶解，放置过夜，析出结晶。反复用水洗涤结晶，过滤，干燥，得到鞣料云实素2.136g。
(7)应用HPLC定量分析方法，对分离制备得到的鞣料云实素进行纯度检测。
实施例2：从珠子草全草中提取鞣料云实素
(1)珠子草全草原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)珠子草粗粉1Kg用80％乙醇加热回流提取3次，每次提取时间为2小时，过滤、合并滤液、减压浓缩、干燥，得珠子草乙醇提取物165g。回收溶剂可用于反复提取。
(3)用少量水将乙醇提取物溶解，缓缓倾入D101大孔吸附树脂层析柱的上端，乙醇提取物与大孔吸附树脂的重量比为1∶10，柱径高比为1∶10，以不同浓度的乙醇梯度洗脱。同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到乙醇洗脱物78g。
(4)将乙醇洗脱物用少量水溶解，缓缓倾入葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析柱的上端，乙醇洗脱物与葡聚糖凝胶的重量比为1∶5，柱径高比为1∶10，以不同浓度的甲乙醇梯度洗脱，同时用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为；苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到淡黄色粉末40g。
(5)将淡黄色粉末用少量水溶解，缓缓倾入MCI gel CHP-20P型大孔吸附树脂层析柱的上端，淡黄色粉末与大孔吸附树脂的重量比为1∶8，柱径高比为1∶10。以不同浓度的乙醇梯度洗脱，同时，用薄层层析法检测指导洗脱，薄层层析的条件为：苯-甲酸乙酯-甲酸(1∶7∶1)为展开剂，2％的三氯化铁乙醇液为显色剂。收集含有鞣料云实素的洗脱液，减压浓缩，得到鞣料云实素粗品1.886g。
(6)将鞣料云实素粗品用少量乙醇充分溶解，过滤，减压浓缩至干，加适量水溶解，放置过夜，析出结晶。反复用水洗涤结晶，过滤，干燥，得到鞣料云实素1.098g。
(7)应用HPLC定量分析方法，对分离制备得到的鞣料云实素进行纯度检测。
由上述工艺制备的鞣料云实素的物理常数和光谱数据：
分子式：C27H23O18
分子量：634
结构式：
性状：淡白色粉末；易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水。
旋光：〔 〕D 22-160.90(c 0.37，MeOH)
红外光谱vmax(KBr)：3424，1720，1618，1521，1447，1351，1241，1200，1030，969，951，752cm-1
紫外光谱λmax(EtOH)：220，270nm
质谱(FAB+-MS)：633[M-H]+
1H NMR谱(氘代丙酮和重水中，125MHz)：4.03(1H，br s，H-2)，4.01(1H，br s，H-4)，4.37(1H，br s，H-5)，4.45(1H，br d，J＝10.9Hz，H-6a)，4.69(1H，br d，J＝10.9Hz，H-6b)，4.74(1H，br s，H-3)，6.26(1H，d，J＝2.3Hz，H-1)，6.61，6.74(each 1h，HHDP-H)，7.03(2H，s，galloyl-H)。13C NMR谱(氘代丙酮和重水中，125MHz)：62.0(C-4)，64.2(C-6)，68.7(C-2)，70.8(C-3)，75.3(C-5)，94.2(C-1)，107.7，109.9(HHDP C-3″，3)，110.5(galloyl C-2′，C-6′)，115.7，116.6(C-1″，1)，120.3(C-1′)，125.2(C-2″，2)，136.4(C-5)，137.0m(C-5″)，139.4(C-4′)，144.6，144.7，145.2(C-4″，6″，4，6)，145.7(C-3′，C-5′)，165.6，167.4，168.8(C-7′，7″，7)。
Claims (4)
1、鞣料云实素的制备方法，其特征在于取叶下珠属植物、大戟属植物、铁苋属植物、牻牛儿苗属植物、老颧草属植物、安石榴属植物、槭属植物或榄仁树属植物，烘干、粉碎，用含水乙醇加热回流提取2～3次，每次2-3小时，经过滤、浓缩、干燥得乙醇提取物，乙醇提取物经聚苯乙烯型的大孔吸附树脂MCI gelCHP-20P，DiaionHP20SS，XAD-2，XAD-4，D-101或KB-8柱层析分离，提取物与大孔吸附近树脂的重量比为1∶8-15，柱径高比为1∶10-15，然后在薄层层析的检测指导下，用不同浓度的乙醇梯度洗脱，收集含有鞣料云实素的洗脱液，浓缩，再经葡聚糖凝胶柱层析和大孔吸附树脂柱层析纯化，用乙醇或甲醇与水的混合液进行洗脱，得鞣料云实素粗品，进一步用水重结晶，即将鞣料云实素粗品用少量乙醇或甲醇充分深解，加入适量水微微加热，室温下放置过夜，结晶，将析出的结晶用水反复洗涤，过滤，干燥，得鞣料云实素。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于葡聚糖凝胶填充剂是SephadexLH-20或Toyopearl HW-40F。
3、根据权利要求1所述的方法，薄层层析是以1∶7∶1的苯∶甲酸乙酯∶甲酸为展开剂，2％三氯化铁乙醇液为显色剂。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于鞣料云实素的干燥方法可采用加热干燥、冷冻干燥或微波干燥。
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| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Yunnan Weihe Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences Contract record no.: 2010530000050 Denomination of invention: Method for preparing tanning material bonducin Granted publication date: 20070530 License type: Exclusive License Open date: 20051221 Record date: 20100929 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070530 Termination date: 20170623 |