CN101357933B

CN101357933B - 二次高速逆流色谱分离射干中异黄酮类单体化合物的方法

Info

Publication number: CN101357933B
Application number: CN2008100426812A
Authority: CN
Inventors: 范国荣; 周婷婷; 冯超; 谢瑛; 闻俊; 崔莉俊; 陈丹霞; 李霁; 解蕊; 魏华; 张鹤
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2008-09-09
Filing date: 2008-09-09
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2028-09-09
Also published as: CN101357933A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法。国内外多采用柱色谱法和重结晶等分离纯化射干中的有效单体，这些方法存在成本高且操作繁琐、样品损失严重等问题。本发明采用二次高速逆流色谱来分离射干中单体化合物，特别是采用两套不同溶剂体系高速逆流色谱技术将目标化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素与其他极性相近的干扰成分分离，从而获得高纯度的目标化合物。本发明操作简便、分离效率高、产品纯度好，可连续进样，适于工业化生产。

Description

二次高速逆流色谱分离射干中异黄酮类单体化合物的方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从鸢尾科植物射干中分离纯化高纯度的单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素素的方法。

背景技术

射干为鸢尾科(Iridaceae)植物射干Belamcanda Chinesis(L)DC.的干燥根茎，具有解毒利咽，清肺祛痰之功效，主产于湖北、河南、江苏、安徽，湖南、浙江、贵州、云南等地亦产，在广东、广西少数地区用射干系干燥全草。射干始载于《神农本草经》，药理及临床实验表明：射干中异黄酮类化合物具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗过敏等生物活性与药理作用。其中鸢尾苷(Tectoridin)、野鸢尾苷(Iridin)、鸢尾苷元(Tectorigenin)、野鸢尾黄素(Irigenin)和次野鸢尾黄素素(Irisflorentin)是射干中的主要活性成分(Xu YL，et al.J.Acta Bot Yunnan，1999，21(1)：125-130；Li YQ，et al.J.Acta Pham Sin，1986，21(11)：836-841；Li R，et al.J.Ch Pham Univer，2003，34(2)：122-124。)它们的结构式如下：

鸢尾苷(Tectoridin) 野鸢尾苷(Iridin)

鸢尾苷元(Tectorigenin) 野鸢尾黄素(Irigenin)

次野鸢尾黄素(Irisflorentin)

目前，国内外多采用柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化中药射干中的有效单体，这类方法或需使用大量有毒的有机溶剂，会造成环境污染；或成本高且操作繁琐，如聚酰胺填料，耗时费力(HJ Park，et al.Phytochemistry.1999，51：147；Salwa F Farag，et al.Phytochemistry.1999，50：1407)，而且固定相对样品有不可逆性吸附作用，造成样品损失严重。另外，由于射干中各主要成分与干扰组分极性极为相近，通常无法在较短时间内使目标化合物得到有效的分离导致所得产品纯度不高，需借助多次重复制备进行纯化而造成目标化合物损失较多。

高速逆流色谱(High-speed counter-current chromatography HSCCC)是一种较新的液液分配色谱技术，它不用任何固体支撑体或载体而克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用，滞留在柱中的样品可以通过多种洗脱方式予以完全回收，理论回收率为100％，同时还具有应用范围广、适应性好、操作简单、分离效果好和重现性好等优点。目前高速逆流色谱技术也用于中药中有效单体的分离纯化，如彭金咏等以乙酸乙酯：正丁醇：水(2：1：3)为溶剂体系从白花败酱草从分离制备异牡荆苷和异荭草苷成分。(J.Y.Peng，et al.J Chromatogr A.2005，1074：111-115)

国内外尚未见有将高速逆流色谱技术应用于中药射干中单体化合物的分离纯化。

发明内容

本发明的目的是克服柱色谱法和重结晶等传统方法分离纯化射干中有效单体的缺点，提供一种制备工艺简单快速、回收率高、纯度高且适于工业化生产的从射干中分离纯化异黄酮类单体化合物的方法。

射干中主要活性成分为中等极性异黄酮类成分，其中大多结构十分相近，传统的制备液相色谱技术无法在短时间内使各极性相近的异黄酮类化合物获得较好的分离。

本发明采用二次高速逆流色谱来分离射干中单体化合物，特别是采用两套不同溶剂体系高速逆流色谱技术将目标化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素与其他极性相近的干扰成分分离，从而获得高纯度的目标化合物。

本发明提供了一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素素的方法，该方法包括如下步骤：

A.第一次高速逆流色谱分离纯化：

构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷:正丁醇:甲醇:水＝1:4:1.5～2:6或乙酸乙酯:正丁醇:水＝2:1:3，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，取射干粗提物溶于少量上相和下相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”；对高速逆流固定相液进行回收，挥干有机溶剂，得第一次高速逆流固定相挥干物；

B.第二次高速逆流色谱分离纯化：

构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为氯仿:甲醇:水为4:2.7～3:2，对第一次高速逆流固定相挥干物进行第二次分离，分离方法同步骤A；根据检测器谱图接收流分“III”、“IV”和“V”；

流分“I”为野鸢尾苷，流分“II”为鸢尾苷，流分“III”为次野鸢尾黄素，流分“IV”为野鸢尾黄素，流分“V”为鸢尾苷元。

上述第一次高速逆流色谱分离纯化(步骤A)中的射干粗提物，是用以下方法制得的：将干燥射干粗粉以70％～100％乙醇水溶液超声提取、微波提取或加热回流提取1～2次，过滤并合并滤液，将滤液减压浓缩至固形物。较佳的是以70％乙醇水溶液超声提取。

上述第一次高速逆流色谱分离纯化(步骤A)中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系较佳的为正己烷:正丁醇:甲醇:水＝1:4:1.5:6、或正己烷:正丁醇:甲醇:水＝1:4:2:6。

上述第二次高速逆流色谱分离纯化(步骤B)中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为氯仿:甲醇:水为4:2.7:2、或氯仿:甲醇:水为4:3:2。

在进样量为200mg的射干粗提物的高速逆流色谱的色谱图中，野鸢尾苷的保留时间范围为200-220分钟，鸢尾苷的保留时间范围为235-260分钟，次野鸢尾黄素的保留时间范围为29-34分钟，野鸢尾黄素的保留时间范围为38-44分钟，鸢尾苷元的保留时间范围为54-60分钟。

本发明的具体方法为：

1.制备射干粗提物：

按常规将干燥射干粗分采用70％～100％乙醇水溶液超声提取、加热回流提取或者微波辅助提取1～2次，过滤并合并滤液，滤液水浴条件下减压挥干有机溶剂，再真空干燥得射干粗提物，得率为14％～16％。

2.高速逆流制备过程：

(1)首次高速逆流制备过程

将鸢尾苷和野鸢尾苷从射干粗提物中分离制备出来，构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷：正丁醇：甲醇：水＝1：4：1.5～2：6或乙酸乙酯：正丁醇：水＝2：1：3。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，同时将流动相泵入，取步骤1中所得的提取物溶于少量上相和下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”；采用高效液相色谱法对所得流分进行纯度检测(峰面积归一化法)，测得流份“I”为单一色谱峰，纯度98％以上，得率为0.3％-0.5％，流份“II”亦为单一色谱峰，纯度98％以上，得率为0.2％～0.4％；实验结束，对高速逆流固定液进行回收，挥干有机相，得苷元类化合物，得率为1.7％～2.0％，主要含有鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素等异黄酮成分。

(2)二次高速逆流制备过程

应用二次高速逆流色谱分离纯化一次高速逆流固定相挥干物，用溶剂体系为氯仿：甲醇：水＝4：2.7～3：2。操作步骤同第一步，按照图谱收集流分“III”、“IV”、“V”，通过液相色谱检测流分纯度(峰面积归一化法)，得到三种异黄酮类成分分别为次野鸢尾黄素，得率为0.2％～0.4；野鸢尾黄素，得率为0.3％～0.5％和鸢尾苷元，得率为0.07％～0.10％，纯度均大于98％。对流份“I”、“II”、“III”、“IV”、“V”进行MS、¹HNMR和¹³CNMR分析，根据所得数据进行结构确认，流分“I”为野鸢尾苷，流分“II”为鸢尾苷，流分“III”为次野鸢尾黄素，流分“IV”为野鸢尾黄素，流分“V”为鸢尾苷元。

本发明采用一定浓度乙醇超声方法对药材进行快速、有效提取，在对目标组分分离纯化过程中，针对射干中异黄酮类成分结构、极性均十分相近的情况，利用两套溶剂体系不同的高速逆流色谱技术将目标化合物与干扰组分分离，从而从射干中制备得到高纯度的鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素，方法简单快速且回收率高，克服了传统制备方法操作繁琐、分离周期长，样品死吸附损失等缺点，并具有分离效率高、产品纯度好、简便、适于工业化生产等优点。

附图说明

图1为射干经超声提取后粗提物的高效液相色谱图

图2为粗提物初次高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图3为初次高速逆流色谱固定相挥干复溶物的高效液相色谱图

图4为高速逆流色谱固定相挥干成分二次高速逆流色谱(HSCCC)的色谱图

图5为首次HSCCC分离流份“I”(野鸢尾苷)高效液相色谱图

图6为首次HSCCC分离流分“II”(鸢尾苷)高效液相色谱图

图7为二次HSCCC分离流分“III”(次野鸢尾黄素)高效液相色谱图

图8为二次HSCCC分离流分“IV”(野鸢尾黄素)高效液相色谱图

图9为二次HSCCC分离流分“V”(鸢尾苷元)高效液相色谱图

图10为粗提物初次高速逆流色谱(HSCCC)连续进样的色谱图

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：

1.制备射干粗提物：

取干燥射干药材粗粉20g，用10倍量70％乙醇水溶液超声提取2次，每次30分钟，过滤并合并滤液，60℃水浴下减压挥干有机相，真空干燥得射干粗提物3.05g，得率15.3％。

2.高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)将鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素素分离纯化。

A.初次高速逆流色谱两相溶剂体系为正己烷：正丁醇：甲醇：水＝1：4：1.5：6。在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相。先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，同时泵入流动相，逆流色谱柱体积为300ml，固定相保留率43％，流速1.5ml/min，转速850rpm，检测波长265nm，取步骤(1)所得提取物粉末200mg溶解于10ml同体积上、下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”，见图2。对两部分进行HPLC分析表明“I”与“II”均为单一色谱峰，纯度分别为98.5％，98.2％。对高速逆流色谱仪中固定相(主要含有苷元类成分，见图3)进行回收，挥干有机相，得到固体25.4mg，得率1.94％。

B.用溶剂体系为氯仿：甲醇：水＝4：2.7：2高速逆流色谱进行二次分离制备，方法操作同步骤A，固定相保留率70％，流速2.0ml/min，转速860rpm，检测波长265nm，取步骤A回收固体溶于10ml同体积上、下相中，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“III”、“IV”、“V”，见图4。对三部分流分进行HPLC纯度分析表明三者都是单一成分，纯度均大于98％。

HPLC分析条件为色谱柱YMC ODS-C₁₈(250mm×4.6mmi.d.5μm)；流动相为乙腈:水溶液，梯度洗脱程序如下：0～30min，乙腈的体积百分比由20％增至30％；30～60min，乙腈的体积百分比由30％增至60％；60～80min，乙腈的体积百分保持在60％；流速：0.4mL/min；柱温：室温；检测波长：265nm，在此条件下所得各高效液相色谱图见图5-9，其中峰I为野鸢尾苷，峰II为鸢尾苷，峰III为次野鸢尾黄素，峰VI为野鸢尾黄素，峰V为鸢尾苷元。将分离得到的“I”-“V”流分有机相挥干，流分“I”得淡黄色粉末5.9mg，得率0.45％；流分“II”得淡黄色粉末4.4mg，得率0.33％；流分“III”得淡黄色粉末3.9mg，得率0.30％；流分“IV”得淡黄色粉末5.6mg，得率0.43％；流分“V”得淡黄色粉末1.3mg，得率0.10％。对流分“I”-“V”进行¹HNMR、¹³CNMR和MS分析，经结构解析并与文献数据比对，确定流分I为野鸢尾苷，流分II为鸢尾苷，流分III为次野鸢尾黄素，流分IV为野鸢尾黄素，流分V为鸢尾苷元。具体数据为：

流分“I”UV λmax(nm MeOH)：262.69。ESI-MS：521[M-H]⁺，359[M-H-Glc]⁺。¹HNMR(600M，DMSO)δ：12.90(1H，s)，9.27(1H，s)，8.50(1H，s)，6.89(1H，s)，6.72(1H，d，J＝2.0)，6.68(1H，d，J＝2.0)，5.10(1H，d，J＝6.9)，3.78(3H，s)，3.76(3H，s).3.69(3H，s)¹³CNMR(DMSO，δ)：180.5(C-4)，154.9(C-5)，147.0(C-4′)，156.7(C-7)，152.9(C-9)，155.6(C-2)，136.4(C-6)，110.4(C-2′)，125.9(C-1′)，122.0(C-3)，150.3(C-3′)，104.6(C-10)，94.0(C-8)，55.8(6-OCH₃)，60.3(4′-OCH3)，59.9(5′-OCH3)，100.2(Glu-1)，73.1(Glu-2)，76.7(Glu-3)，69.6(Glu-4)，77.3(Glc-5)，60.6(Glc-6)。

流分“II”UV λmax(nm MeOH)：201.10，263.40。ESI-MS：461[M-H]⁺，299[M-H-Glc]⁺。¹HNMR(600M，DMSO)δ：12.94(1H，s)，8.43(1H，s)，7.40(2H，d，J＝8.4)，6.85(2H，d，J＝8.4)，6.88(1H，s)，5.09(1H，d，J＝7.5)¹³CNMR(DMSO，δ)：180.8(C-4)，152.9(C-5)，157.5(C-4′)，154.7(C-7)，152.4(C-9)，152.9(C-2)，132.5(C-6)，130.1(C-2′，C-6′)，121.0(C-1′)，122.1(C-3)，115.1(C-3′，C-5′)，106.5(C-10)，94.0(C-8)，60.3(6-OCH₃)，100.2(Glu-1)，73.1(Glu-2)，76.7(Glu-3)，69.6(Glu-4)，77.3(Glc-5)，60.6(Glc-6)。

流分“III”UV λmax(nm MeOH)：203.32，263.95。ESI-MS：385[M-H]⁺。¹HNMR(600M，DMSO)δ：8.29(1H，s)7.00(2H，s)，6.83(1H，s)，6.17(2H，s)，4.09(3H，s)，3.89(6H，s)，3.87(3H，s)¹³CNMR(DMSO，δ)：173.7(C-4)，153.9(C-5)，152.7(C-9)，152.5(C-1)，150.6(C-3′，C-5′)，106.8(C-2′，C-6′)，140.5(C-7)，137.3(C-4′)，135.9(C-6)，127.5(C-1′)，150.1(C-3′)，113.2(C-10)，102.7(O-CH₂-O)，93.6(C-8)，60.2(5-OCH₃)，60.8(4′-0CH₃)，55.9(3′，5′-OCH₃)。

流分“IV”UV λmax(nm MeOH)：202.85，264.64。ESI-MS：359[M-H]⁺，344[M-H-CH₃]⁺。¹HNMR(600M，DMSO)δ：13.0(1H，s)，8.33(1H，s)，7.35(2H，d，J＝1.6)，6.96(2H，d，J＝1.6)，6.70(1H，s)，3.78(IH，s)，3.74(1H，s)，3.69(1H，s)¹³CNMR(DMSO，δ)：181.2(C-4)，158.0(C-5)，154.7(C-7)，154.0(C-2)，152.9(C-9)，152.7(C-5′)，150.2(C-3′)，136.4(C-4′)，131.6(C-6)，126.1(C-1′)，121.7(C-3)，126.1(C-1′)，110.4(C-10)，104.5(C-6′)，94.0(C-8)，60.0(6-OCH₃)，55.8(4′-OH₃)，55.6(5′-0CH₃)。

流分“V”UV λmax(nm MeOH)：263.46。ESI-MS：299[M-H]⁺，284[M-H-CH3]⁺。¹HNMR(600M，DMSO)δ：13.30(1H，s)，8.29(1H，s)，7.36(2H，d，J＝9.0)，7.02(2H，d，J＝9.1)，6.47(1H，s)3.78(1H，s)¹³CNMR(DMSO，δ)：180.2(C-4)，159.4(C-5)，159.2(C-4′)，154.7(C-7)，154.1(C-9)，153.7(C-2)，136.3(C-6)，131.6(C-2′，C-6′)，121.6(C-1′)，123.3(C-3)，115.0(C-3′，C-5′)，104.5(C-10)，94.0(C-8)，59.9(6-OCH₃)。

实施例2：

1.制备射干粗提物：

射干粗提物制备同实施例1。

2.高速逆流色谱分离制备：

A.鸢尾苷、野鸢尾苷的高速逆流分离制备

采用连续进样四次，每次进样量为200mg，每次节省进样前的平衡时间及进样后出峰前的时间近4个小时，高速逆流条件固定相、流动相的溶剂体系为正己烷：正丁醇：甲醇：水＝1：4：1.5：6。鸢尾苷、野鸢尾苷的高速逆流分离制备方法、步骤同实施例1。在时间0min、180min、360min、540min进样，得野鸢尾苷23.6mg，得率0.45％；鸢尾苷17.6mg，得率0.34％。实验结束后，对高速逆流色谱仪中固定相进行回收，挥干有机相，得到固体101.3mg，得率为1.93％。

B.鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的高速逆流分离制备用溶剂体系为氯仿：甲醇：水＝4：2.7：2高速逆流色谱进行二次分离制备，鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定的方法、步骤同实施例1。次野鸢尾黄素得率为0.30％，野鸢尾黄素得率为0.43％，鸢尾苷元得率为0.10％。

实施例3：

1.制备射干粗提物：

取干燥射干药材粗粉20g，用8倍量无水乙醇水溶液微波辅助提取1次，微波功率800w，温度70℃，提取时间10分钟，过滤，滤液60℃水浴下减压挥干有机相，真空干燥得射干粗提物2.89g，得率14.5％。

2.高速逆流色谱分离制备：

A.鸢尾苷、野鸢尾苷的高速逆流分离制备

初次高速逆流色谱两相溶剂体系为乙酸乙酯：正丁醇：水＝2：1：3。鸢尾苷、野鸢尾苷的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定方法、步骤同实施例1。野鸢尾苷的纯度为98.3％，得率为0.42％；鸢尾苷的纯度为98.0％，得率为0.31％。对高速逆流色谱仪中固定相进行回收，挥干有机相，得到固体24.7mg，得率1.78％。

B.鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的高速逆流分离制备用溶剂体系为氯仿：甲醇：水＝4：3：2高速逆流色谱进行二次分离制备，鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的分离纯化、纯度检测以及结构鉴定方法、步骤同实施例1。次野鸢尾黄素得率为0.27％；野鸢尾黄素得率为0.40％；鸢尾苷元得率为0.09％。

实施例4：

1.制备射干粗提物：

取干燥射干药材粗粉500g，用8倍量70％乙醇水溶液加热回流2次，每次60分钟，过滤并合并滤液，滤液60℃水浴下减压挥干有机溶剂，真空干燥得射干粗提物71g，得率14.2％。

2.高速逆流色谱分离制备：

应用高速逆流色谱(深圳同田生化有限公司)将鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素素分离纯化。二次高速逆流色谱条件、操作步骤、纯度检测以及结构鉴定的方法均同实施例1。野鸢尾苷纯度为98.5％，得率为0.39％；鸢尾苷纯度为98.2％，得率0.28％。对初次高速逆流分离固定相进行回收，挥干有机相，得到固体24.6mg，得率1.75％。经第二次高速逆流色谱分离后，鸢尾苷元得率为0.07％，野鸢尾黄素得率为0.38％，次野鸢尾黄素得率为0.24％。

Claims

1.一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

A、第一次高速逆流色谱分离纯化：

构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶4∶1.5～2∶6或乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，在分液漏斗中充分振摇后静止分层，上相为固定相，下相为流动相；先使逆流色谱仪柱子中充满固定相，然后使主机转动，再泵入流动相，取射干粗提物溶于少量上相和下相，由进样阀进样，根据检测器谱图接收流分“I”、“II”，见图2；对高速逆流固定相液进行回收，挥干有机溶剂，得第一次高速逆流固定相挥干物；

B、第二次高速逆流色谱分离纯化：

构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为氯仿∶甲醇∶水为4∶2.7～3∶2，对第一次高速逆流固定相挥干物进行第二次分离，分离方法同步骤A；根据检测器谱图接收流分“III”、“IV”和“V”，见图4；

2.根据权利要求1所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于第一次高速逆流色谱分离纯化中的射干粗提物，是用以下方法制得的：将干燥射干粗粉以70％～100％乙醇水溶液超声提取、微波提取或加热回流提取1～2次，过滤并合并滤液，将滤液减压浓缩至固形物。

3.根据权利要求2所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于其中的干燥射干粗粉以70％乙醇水溶液超声提取。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于第一次高速逆流色谱分离纯化中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶4∶1.5∶6。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于第一次高速逆流色谱分离纯化中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶4∶2∶6。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于第二次高速逆流色谱分离纯化中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为氯仿∶甲醇∶水为4∶2.7∶2。

7.根据权利要求1或2或3所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于第二次高速逆流色谱分离纯化中构成高速逆流色谱固定相、流动相的溶剂体系为氯仿∶甲醇∶水为4∶3∶2。

8.根据权利要求1或2或3所述的一种从射干中分离纯化单体化合物鸢尾苷、野鸢尾苷、鸢尾苷元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的方法，其特征在于：在进样量为200mg的射干粗提物的高速逆流色谱的色谱图中，野鸢尾苷的保留时间范围为200-220分钟，鸢尾苷的保留时间范围为235-260分钟，次野鸢尾黄素的保留时间范围为29-34分钟，野鸢尾黄素的保留时间范围为38-44分钟，鸢尾苷元的保留时间范围为54-60分钟。