CN1305387A - 通过共同给予***素抑制剂增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫应答 - Google Patents
通过共同给予***素抑制剂增强抗体－细胞因子融合蛋白介导的免疫应答 Download PDFInfo
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Abstract
公开了在哺乳动物中增强针对预定细胞类型的杀细胞免疫应答的组合物和方法。所述方法和组合物依赖于抗体—细胞因子免疫缀合物和***素抑制剂的组合。一旦给予所述哺乳动物后;由于通过所述***素抑制剂的免疫增强作用,所述免疫缀合物诱导的针对所述预定细胞类型(例如癌细胞)的免疫应答大于仅用所述免疫缀合物诱导的免疫应答。所述方法和组合物在杀伤哺乳动物中的实体瘤或病毒感染细胞方面特别有用。
Description
相关申请的参考
本申请要求1998年4月17日中请的U.S.S.N 60/082,166的优先权及权益，该申请的说明书通过引用结合到本文中。
发明领域
本发明一般而言涉及免疫缀合物，特别是可用于定向免疫治疗和普遍性免疫刺激的抗体-细胞因子融合蛋白。更具体地讲，本发明涉及应用减少免疫抑制性***素的产生、分泌和活性的因子增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的针对预定细胞类型(例如实体瘤中的细胞)的免疫应答。
发明背景
多年来已经用抗体治疗人类疾病，主要是提供针对病毒或细菌感染的被动免疫。然而最近，已经用抗体和抗体缀合物作为抗肿瘤剂。在大多数肿瘤类型中难以证明抗肿瘤活性，除非临床状态是一种最小残余的疾病(Reithmuller等，Lancet 94:1177-1183)，或当所述肿瘤为循环中的抗体可及时，例如在B-淋巴瘤的情况下(Maloney等(1994)B1ood84:2457-2466)。对于抗体介导的治疗干涉而言，实体瘤比最小残余疾病状态中发现的微转移病灶顽固得多。
早期研究表明，可以通过将免疫刺激性细胞因子融合至抗体分子，增强用抗体对肿瘤的体内治疗。然而，抗体-细胞因子融合蛋白在破坏较大的实体瘤方面远不如对弥散性转移病灶有效(Xiang等(1997)Cancer Reseach 57:4948-4955和Lode等(1998)B1ood 91:1706-1715)。
因此，本领域仍需要增强针对预定细胞类型(例如实体瘤中存在的细胞类型)的抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答的组合物和使用这类组合物的方法。
发明概述
本发明部分基于这样的发现：如果将免疫缀合物与***素抑制剂一起给予，当将所述疫缀合物给予哺乳动物时，可能产生更有效的针对预定细胞类型的免疫应答。特别是，已经发现，这类组合物在预定细胞类型(诸如实体瘤中发现的细胞类型)和病毒感染的细胞中介导免疫破坏方面特别有用。
一方面，本发明提供在哺乳动物中诱导针对预定细胞类型的杀细胞免疫应答。该方法包括给予所述哺乳动物(ⅰ)免疫缀合物，包含一个能够结合预定细胞类型的抗体结合位点和一个能够诱导这种针对预定细胞类型的免疫应答的细胞因子，和(ⅱ)***素抑制剂，其量足以相对于仅用免疫缀合物而言增强所述免疫应答。
在一个优选实施方案中，所述预定细胞类型可以是例如在实体瘤中、更优选在较大的实体瘤(即大于约100mm3)中存在的癌细胞。或者，所述预定细胞类型可以是病毒感染的细胞，例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染的细胞。
在另一个优选实施方案中，可以将***素抑制剂与所述免疫缀合物同时给予。或者，所述***素抑制剂可以在给予免疫缀合物之前给予。此外，设想免疫缀合物可以与多种不同的***素抑制剂一起给予。或者，设想所述***素抑制剂可以与多种不同的免疫缀合物一起给予。
另一方面，本发明提供用于在哺乳动物中诱导针对预定细胞类型的杀细胞免疫应答的组合物。所述组合物结合包含：(ⅰ)免疫缀合物，包含一个能够结合预定细胞类型的抗体结合位点和一个能够诱导这种针对所述预定细胞类型的免疫应答的细胞因子，和(ⅱ)***素抑制剂，其量足以相对于仅用免疫缀合物而言增强所述免疫应答。
在另一优选实施方案中，所述免疫缀合物的抗体结合位点最好包含免疫球蛋白重链或其抗原结合片段。所述免疫球蛋白重链最好以氨基末端至羧基末端的方向包含：能够结合预定抗原的一个免疫球蛋白可变区(VH)结构域、一个免疫球蛋白重链恒定区1(CH1)结构域、一个免疫球蛋白重链恒定区2(CH2)结构域，可选地可以还包含一个免疫球蛋白重链恒定区3(CH3)结构域。在一个更优选的实施方案中，所述免疫缀合物是包含通过一个多肽键融合至需细胞因子的免疫球蛋白重链或其抗原结合片段的融合蛋白。因此，有效的抗体-细胞因子融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含：(ⅰ)抗体结合位点，包含一个能够结合预定细胞类型上的细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区、一个免疫球蛋白CH1结构域、一个免疫球蛋白CH2结构域(可选的CH3结构域)，和(ⅱ)所述细胞因子。在Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immuno1.160:6195-6203和美国专利第5,650,150号中，详细描述了制备和使用这类融合蛋白的方法。
免疫球蛋白恒定区结构域(即CH1、CH2和/或CH3结构域)可以是天然产生的抗体中的与可变区正常相连的恒定区结构域。或者，一个或多个所述免疫球蛋白恒定区结构域可以衍生自与用作可变区结构域来源的抗体不同的抗体。换句话说，所述免疫球蛋白可变区结构域和恒定区结构域可以衍生自不同的抗体，例如，衍生自不同物种的抗体。参见例如美国专利第4,816,567号。此外，所述免疫球蛋白可变区可以包含衍生自一个物种(例如人类)的构架区(FR)序列和***所述FR之间、衍生自第二个不同物种(例如小鼠)的互补决定区(CDR)序列。例如在美国专利第5,225,539号和第5,585,089号中公开了用于制备和使用这类嵌合免疫球蛋白可变区的方法。
基于抗体的免疫缀合物最好还包含免疫球蛋白轻链，所述轻链最好通过例如二硫键共价连接至所述免疫球蛋白重链。所连接的免疫球蛋白重链和轻链的可变区一起确定结合预定抗原的单一完整的结合位点。在其它实施方案中，所述免疫球蛋白包含两个嵌合链，每个链包含融合至细胞因子的至少一部分免疫球蛋白重链。所述两个嵌合链最好通过例如一个或多个链间二硫键共价连接。
本发明因此提供其中将抗体的所述抗原结合特异性和活性与细胞因子的有效生物活性结合的融合蛋白。本发明的融合蛋白可以用来将所述细胞因子选择性地体内传递至靶细胞，使得所述细胞因子可以在所述靶细胞附近发挥局部的生物学效应。在一个优选实施方案中，所述融合蛋白的抗体组分特异性地结合癌细胞上的抗原，结果所述融合蛋白发挥局部抗肿瘤活性。在一个替代的优选实施方案中，所述融合蛋白的抗体组分特异性地结合病毒感染的细胞，诸如HIV感染的细胞，结果所述融合蛋白发挥局部抗病毒活性。
可以加入本发明免疫缀合物中的优选的细胞因子包括例如肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。优选的肿瘤坏死因子包括例如组织坏死因子α(THFα)。优选的白介素包括例如白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-7(IL-7)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)和白介素-18(IL-18)。优选的集落刺激因子包括例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。优选的淋巴因子包括例如淋巴毒素(LT)。其它有用的细胞因子包括干扰素，包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ，所有这些均具有免疫效应以及不依赖于抗病毒活性的抗血管生成效应。
能够减少免疫抑制性***素产生的几种药理学药剂或生物药剂是本领域已知的。在一个优选实施方案中，***素抑制剂包括环加氧酶(COX)抑制剂。非选择性环加氧酶抑制剂的实例包括吲哚美辛、舒林酸、布洛芬和阿斯匹林。所述环加氧酶抑制剂更优选为对COX-2形式具有特异性的选择性抑制剂。COX-2选择性抑制剂的实例包括临床研制中的几种化合物，诸如Celecoxib、MK-966和美洛昔康。在本发明中优选后一类化合物，因为没有胃肠副作用应该允许较高剂量给药和更有效地抑制肿瘤细胞合成***素。
在一个替代的优选实施方案中，所述***素抑制剂是维生素A类。已经表明维生素A类抑制表皮生长因子和佛波醇酯对COX-2的诱导。
在再一替代的优选实施方案中，所述***素抑制剂为肿瘤血管生成的抑制剂。可用于实施本发明的优选的血管生成抑制剂包括例如endostatin、制管张素、对αvβ3整联蛋白具有结合亲和性的肽、对αvβ3整联蛋白具有结合亲和性的抗体或其片段、对表皮生长因子(EGF)受体具有结合亲和性的肽、对EGF受体具有结合亲和性的抗体或其片段、COX-2抑制剂、夫马洁林和称为AGM-1470的类似物、沙利度胺、抗血管生成细胞因子(例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ)和包含这种抗血管生成细胞因子的细胞因子融合蛋白。
也提供用于联合所述***素抑制剂给予免疫缀合物的剂量和给药方法。
附图简述
当结合附图一起阅读时，根据以下优选实施方案的描述，可以更全面地理解本发明前述的和其它的目的、特征和优点以及发明本身。
图1是示意图，表示可用于实施本发明的示例性免疫缀合物；
图2A和2B图示通过荧光激活细胞分类术(FACS)分析的人EpCAM在转染的小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞中的表达。等数目的转染细胞或者仅用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第二抗人Fc特异性抗体染色(A组)，或者首先用huKS-huIL2抗体融合蛋白染色，然后用FITC标记的抗人Fc特异性抗体染色(B组)；
图3是一曲线图，描述或者单独给予的或者联合第二抗体-细胞因子融合蛋白给予的抗体-细胞因子融合蛋白对皮下肿瘤的效应，其中所述细胞因子具有***素抑制剂(抗血管生成)活性。在植入LLC细胞后13天开始5天的处理。用以下物质处理小鼠：磷酸缓冲盐水(空心菱形)；单独的15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(实心方形)；10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白(实心三角形)；和7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的组合(打叉)；
图4是一曲线图，描述或者单独给予的或者联合endostatin融合蛋白给予的抗体-细胞因子融合蛋白对皮下肿瘤的效应。在用以下物质处理的小鼠中监测CT26/EpCAM皮下肿瘤的大小：磷酸缓冲盐水(实心菱形)、muFc-muEndo融合蛋白(实心方形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(空心菱形)以及muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的组合(打叉)；且
图5是一曲线图，描述或者单独给予的或者联合吲哚美辛给予的抗体-细胞因子融合蛋白对皮下肿瘤的效应。在用以下物质处理的小鼠中监测LLC-EpCAM皮下肿瘤的大小：磷酸缓冲盐水(实心菱形)、huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(实心方形)、吲哚美辛(实心三角形)以及huKS-huγ4-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的组合(打叉)。
发明详述
研究已经表明，大的实体瘤对于抗体介导的治疗干涉以及对于免疫疗法而言一般比弥散性转移病灶顽固得多(Sulitzeanu等(1993)Adv.Cancer Res.60:247-267)。人们认为，对基于抗体的疗法反应性低部分基于免疫抑制因子的产生。
尽管对肿瘤根除的机制尚未完全了解，但预期细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答可以导致破坏肿瘤细胞并提供免疫记忆。此外，预期在某些情况下，天然杀伤(NK)细胞在缺乏CTL的情况下负责根除肿瘤。所述不同的免疫应答可以得自以下事实：某些肿瘤产生不同类型或不同量的能够负调节T细胞的物质。对于微转移性病灶以外的、已经达到临界质量并能够以足以调节抗所述肿瘤的免疫应答的水平产生并分泌免疫抑制性因子的实体瘤尤其如此。
现在已经发现，可以通过将免疫缀合物与***素抑制剂一起给予，显著增强由所述免疫缀合物引发的针对预定细胞类型的杀细胞免疫应答。联合疗法在介导对患病组织(诸如建立的肿瘤)的免疫破坏方面特别有效。尽管不希望受限于理论，但预期所述***素抑制剂减少肿瘤诱导的免疫抑制剂的产生、分泌或活性，由此使得所述抗体-细胞因子免疫缀合物更有效地激活抗所述肿瘤的细胞免疫应答。同样，预期这种方法可用于治疗某些其中相似的免疫抑制机制阻止有效的细胞免疫的病毒病，例如在HIV感染中。预期所述***素抑制剂与所述抗体-细胞因子免疫缀合物协同作用，以介导对患病组织(诸如建立的肿瘤或病毒感染的细胞)的免疫破坏。本发明也描述了用于制备和使用有用的免疫缀合物的方法以及用于测试当将其与合适的***素抑制剂联合时其在临床前体内动物模型中的药代动力学活性的测定。
本文所用的术语“杀细胞免疫应答”应理解为是指在哺乳动物中由本发明的免疫缀合物刺激的、或者杀伤哺乳动物中预定细胞类型或者降低其生存力的任何免疫应答，在性质上或为体液免疫应答或为细胞免疫应答。所述免疫应答可以包括一种或多种细胞类型，包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞。
本文所用的术语“免疫缀合物”应理解为是指(ⅰ)抗体结合位点和(ⅱ)细胞因子的缀合物，其中所述抗体结合位点对于癌细胞或病毒感染细胞上的表面抗原具有结合特异性并能够结合所述表面抗原，而所述细胞因子能够诱导或刺激针对所述癌细胞或病毒感染细胞的杀细胞免疫应答。因此，所述免疫缀合物能够选择性地将所述细胞因子体内传递至靶细胞，使得所述细胞因子可以介导针对所述靶细胞的局部免疫应答。例如，如果所述免疫缀合物的抗体组分选择性地结合癌细胞上的抗原，例如实体瘤(特别是大于约100mm3的较大的实体瘤)中的癌细胞，则所述免疫缀合物发挥局部抗癌活性。或者，如果所述免疫缀合物的抗体组分选择性地结合病毒感染细胞上的抗原，诸如HIV感染的细胞，则所述免疫缀合物发挥局部抗病毒活性。
本文所用的术语“抗体结合位点”应理解为是指免疫球蛋白重链的至少一部分，例如能够结合预定细胞类型的免疫球蛋白可变区。所述抗体结合位点也最好包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分，包括例如CH1结构域、CH2结构域和可选的CH3结构域。此外，所述免疫球蛋白重链可以或者共价或者非共价结合至免疫球蛋白轻链，例如免疫球蛋白轻链可变区和可选的轻链恒定区。因此，设想所述抗体结合位点可以包含能够结合预定细胞类型的完整的抗体或其片段。
关于所述免疫缀合物，设想所述抗体片段可以通过多种本领域技术人员熟知的方法连接至细胞因子。例如，在融合蛋白构成物中，抗体结合位点最好通过多肽键连接至细胞因子。或者，抗体结合位点可以通过反应基化学偶联至细胞因子，所述反应基例如为所述抗体结合位点和所述细胞因子内存在的氨基酸侧链中的巯基。
本文所用的术语“细胞因子”应理解为是指能够在哺乳动物中刺激或诱导针对预定细胞类型(例如癌细胞或病毒感染细胞)的杀细胞免疫应答的任何蛋白或肽、其类似物或功能片段。因此，设想可以将多种细胞因子掺入本发明的免疫缀合物中。有用的细胞因子包括例如肿瘤坏死因子、白介素、淋巴因子、集落刺激因子、干扰素，包括能够刺激或诱导这类杀细胞免疫应答的其物种变异体、截短的类似物。有用的肿瘤坏死因子包括例如THFα。有用的淋巴因子包括例如LT。有用的集落刺激因子包括例如GM-CSF和M-CSF。有用的白介素包括例如IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。有用的干扰素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ。
编码特定目的细胞因子的基因可以重新克隆、得自可利用的来源，或根据已知的核苷酸序列通过标准的DNA合成来合成。例如，LT的DNA序列是已知的(参见例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361)，IL-2(参见例如Taniguchi等(1983)Nature 302:305-318)、GM-CSF(参见例如Gasson等(1984)Science 266:1339-1342)和TNFα(参见例如Nedwin等(1985)Nucleic Acids Res.13:6361)的序列也是已知的。
在一个优选实施方案中，所述免疫缀合物为通过常规重组DNA方法产生的重组融合蛋白，即通过形成编码所述嵌合免疫缀合物的核酸构成物产生的重组融合蛋白。在现有技术中已经描述了重组抗体-细胞因子融合蛋白的构建。参见例如Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432；Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203；和美国专利第5,650,150号。编码本发明免疫缀合物的基因构成物最好以5’至3’方向包含：编码一个疫球蛋白重链可变区结构域的DNA区段、编码一个疫球蛋白重链恒定区结构域的DNA区段和编码所述细胞因子的DNA。将所融合的基因装配到或***表达载体中，以转染入合适的表达所融合基因的受体细胞中。杂种多肽链最好与一条免疫球蛋白轻链结合，使得所述免疫球蛋白重链可变区(VH)和免疫球蛋白轻链可变区(VL)结合，产生单一完整的结合预定抗原的位点。在一个优选实施方案中，所述免疫球蛋白重链和轻链例如通过链间二硫键共价偶联。此外，或者其中之一或两者融合至细胞因子的两条免疫球蛋白重链可以例如通过一个或多个链间二硫键共价偶联。
图1显示示例性免疫缀合物10的示意图。在该实施方案中，细胞因子分子2和4为连接至抗体重链14和16的CH3区10和12的羧基末端6和8。VL区26和28显示以典型的IgG构型与VH区18和20配对，由此在免疫缀合物10的氨基末端提供抗原结合位点30和32，并在免疫缀合物10的羧基末端提供2个细胞因子受体结合位点40和42。当然，在更广泛的意义上，所述免疫缀合物不必如所述一样配对，或两条免疫球蛋白重链中仅一条需要融合至细胞因子分子。
本发明的免疫缀合物根据其结构的两个方面可以被认为是嵌合的。首先，所述免疫缀合物是嵌合的，因为它包含连接至给定细胞因子的具有抗原结合特异性的一条免疫球蛋白重链。其次，本发明的免疫缀合物在以下意义上是嵌合的：它包含一个免疫球蛋白可变区(V)和一个免疫球蛋白恒定区(C)，它们均得自不同的抗体，使得所产生的蛋白为V/C嵌合体。例如，所述可变区和恒定区可以得自天然产生的可分离自不同物种的抗体分子。参见例如美国专利第4,816,567号。也包括这样的构成物：其中所述免疫球蛋白可变区中任一个或两个包含得自不同物种的构架区(FR)序列和互补决定区(CDR)序列。这类构成物公开于例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美国专利第5,225,539号和第5,585,089号。而且，设想可以通过从文库(例如噬菌体呈现文库)筛选以所需亲和性结合预定抗原的可变区序列，来衍生所述可变区序列。用于制备和筛选噬菌体呈现文库的方法公开于例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
所述免疫缀合物的免疫球蛋白重链恒定区结构域可以选自5类免疫球蛋白，即IgA(Igα)、IgD(Igδ)、IgE(Igε)、IgG(Igγ)和IgM(Igμ)。然而，最好是得自IgG类的免疫球蛋白重链恒定区。此外，设想所述免疫球蛋白重链可以得自本领域内称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的任何一个IgG抗体亚类。正如所知的，每个免疫球蛋白重链恒定区包括4个或5个结构域。所述结构域按顺序名为：CH1-铰链区-CH2-CH3-(-CH4)。CH4存在于IgM中，IgM没有铰链区。在各类免疫球蛋白中所述重链结构域的DNA序列具有交叉同源性，例如IgG的CH2结构域与IgA和IgD的CH2结构域同源，与IgM和IgE的CH3结构域同源。所述免疫球蛋白轻链可以具有或者κ或者λ恒定链。这些免疫球蛋白区的序列和序列对比是本领域众所周知的(参见例如Kabat等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”美国健康和人类服务部，第三版1983，第四版1987,Huck等(1986)Nuc.Acids Res.14:1779-1789)。
在优选实施方案中，所述可变区得自对预定细胞表面抗原(与患病细胞诸如癌细胞或病毒感染细胞有关的抗原)特异性的抗体，而所述恒定区包含来自与所述可变区来源的抗体相同或不同的抗体的CH1和CH2(和可选的CH3)结构域。在本发明实施中，所述免疫缀合物的抗体部分最好在计划的受体中无免疫原性或免疫原性弱。因此，所述抗体部分最好尽可能地得自与计划的受体相同的物种。例如，如果所述免疫缀合物将给予人类，则所述恒定区结构域最好来自人类。参见例如美国专利第4,816,567号。此外，当所述免疫球蛋白可变区序列得自非计划受体的物种时，例如当所述可变区序列来源于鼠而计划受体为人类时，则所述可变区最好包含人FR序列与***所述FR序列之间的鼠CDR序列，以产生对预定抗原具有特异性、但在计划宿主中的免疫反应性最小的嵌合可变区。这类嵌合可变区的设计和合成公开于例如Jones等(1986)Nature 321:522-525,Verhoyen等(1988)Science 239:1534-1535和美国专利第5,225,539号和第5,585,089号。Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中已经描述了人源化抗体-细胞因子融合蛋白KS-1/4抗EpCAM抗体-IL-12融合蛋白的克隆和表达及其根除建立的结肠癌转移癌的能力。
编码所述细胞因子的基因或者直接或者通过接头(例如通过编码(Gly4-Ser)3接头的DNA)符合读框地连接至编码免疫球蛋白恒定区的基因(例如CH2或CH3外显子)的3’端。在某些实施方案中，所述接头可以包含编码蛋白水解切割位点的核苷酸序列。该位点当***免疫球蛋白恒定区和细胞因子之间时，可以用来保证于靶位点蛋白水解释放所述细胞因子。例如，众所周知，血纤溶酶和胰蛋白酶于蛋白酶可及的位点在赖氨酸和精氨酸之后切割。许多其它位点专一性内切蛋白酶和它们切割的氨基酸序列是本领域众所周知的。优选的蛋白水解切割位点和与这类切割位点反应的蛋白水解酶公开于美国专利第5,541,087号和第5,726,044号。
所述核酸构成物可选地可以包括所述可变区编码基因的内源启动子和增强子，以调节所述嵌合免疫球蛋白链的表达。例如，可变区编码基因可以作为DNA片段获得，包含前导肽、轻链的VJ基因(功能性重排的可变(V)区与连接(J)区段)或重链的VDJ基因、以及这些基因的内源启动子和增强子。或者，编码所述可变区的基因可以与内源调节元件分开获得，并用于提供这些元件的表达载体中。
可以通过标准DNA克隆方法，从产生所需抗体的细胞获得可变区基因。使用合适的DNA探针，诸如含有J区DNA序列和下游序列的DNA区段，可以根据特定的功能重排的可变区筛选基因组文库。通过对所克隆基因测序并将该序列与相应的全长的、正确剪接的mRNA序列进行比较，完成正确克隆的鉴定和证实。
靶抗原可以是肿瘤细胞、癌细胞、病毒感染细胞或另一患病细胞的细胞表面抗原。编码合适可变区的基因一般可以得自产生免疫球蛋白的淋巴细胞系。例如，通过本领域众所周知的标准的体细胞杂交技术(参见例如美国专利第4,196,265号)，可以获得产生对肿瘤相关抗原或病毒抗原特异性的免疫球蛋白的淋巴瘤细胞系。这些产生免疫球蛋白的细胞系提供功能性重排形式可变区基因来源。所述可变区基因通常来源于鼠，因为该鼠***使其产生种类繁多的所需特异性的免疫球蛋白。此外，通过根据以所需亲和性结合预定抗原的可变区序列筛选文库(例如噬菌体呈现文库)，可以衍生可变区序列。制备和筛选噬菌体呈现文库的方法公开于例如Huse等(1989)Science 246:1275-1281和Kang等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123。
将编码含功能活性可变区的基因的DNA片段连接至含所需恒定区编码基因的DNA片段(或其部分)。可以通过标准的基因克隆技术，从产生抗体的细胞获得免疫球蛋白恒定区(重链和轻链)。已经克隆了两类人类轻链(κ和λ)和5类人重链(α、δ、ε、γ和μ)的基因，因此，容易由这些克隆获得的人类来源的恒定区。
将编码杂交免疫球蛋白重链的融合基因装配或***到用于引入受体细胞的表达载体中。将基因构成物引入质粒载体可以通过标准基因剪接方法完成。所述嵌合免疫球蛋白重链可以与相应的免疫球蛋白轻链在相同的细胞中共同表达，使得可以同时表达和装配完整的免疫球蛋白。为此，所述重链和轻链构成物可以置于相同或分开的载体中。
受体细胞系一般为淋巴细胞。优选的受体细胞为骨髓瘤(或杂交瘤)。骨髓瘤可以合成、装配和分泌由转染基因编码的且为糖基化蛋白的免疫球蛋白。特别优选的受体或宿主细胞包括Sp2/0骨髓瘤(它通常不产生内源免疫球蛋白)和小鼠骨髓瘤NS/0细胞。当转染时，所述细胞仅产生由所转染基因构成物编码的免疫球蛋白。可以在培养物中培养转染的骨髓瘤，或在小鼠腹膜中培养，在这种情况下可以从腹水中回收分泌的免疫缀合物。其它淋巴细胞诸如B淋巴细胞可以用作受体细胞。
有几种方法用于用含编码所述嵌合免疫球蛋白链的核酸构成物的载体转染淋巴细胞。例如，可以将载体通过球芽融合引入淋巴细胞(参见例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。其它有用的方法包括电穿孔或磷酸钙沉淀(参见例如Sambrook等编辑(1989)“MolecularCloning：A Laboratory Manual,”Cold Spring Harbor Press)。
其它有用的产生免疫缀合物的方法包括制备编码所述构成物的RNA序列并使其在合适的体内或体外表达***中翻译。考虑到，用于合成编码抗体-细胞因子融合蛋白的基因、将基因引入宿主细胞、在宿主中表达所述基因和收获所产生的融合蛋白的重组DNA方法是本领域众所周知并且已有大量文献记载。具体的方案例如描述于Sambrook等编辑(1989)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,”Cold SpringHarbor Press。
应该理解，采用多种本领域技术人员熟知的方法，可以产生化学偶联的免疫缀合物。例如，可以利用所述抗体或抗体片段和所述细胞因子中的化学反应性氨基酸侧链，将所述抗体或其片段化学偶联至所述细胞因子。所述氨基酸侧链可以通过例如二硫键或通过同或异双功能交联试剂共价连接，所述交联试剂例如为N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酸酯、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯和1,4-二[3’-(2’-吡啶硫基)丙酰氨基]丁烷，所有这些均可在商业上得自Pierce,Rockford,IL。
肿瘤细胞分泌多种免疫抑制性因子。这些因子包括***素(PG)，例如PGE2，即一种已知的IL-10(细胞介导的免疫应答的抑制剂)的诱导物和IL-12(细胞介导的免疫应答的刺激物)的强有力的抑制剂。环加氧酶由花生四烯酸产生***素。该酶有两种已知形式，在本领域称为COX-1和COX-2。COX-1在许多细胞类型中表达，而COX-2由包括免疫刺激在内的各种刺激诱导。许多包括阿斯匹林和非类固醇抗炎药(NSAIDS)在内的常用疼痛缓解药抑制这两种形式的酶。已经将COX-2的抑制与抗炎化合物的有益效应相联系，而已经将COX-1的抑制与胃肠道的毒性副作用相联系。最近出现的选择性COX-2抑制剂在其鉴别并抑制***素而无胃肠毒性的能力方面显示出有很大前途。此外，这些COX-2抑制剂已经用于阐述COX-2在肿瘤细胞产生免疫抑制性***素方面的作用。其它研究提示，在上皮来源的癌细胞的增生和/或存活中诱导COX-2。
由于炎性反应而产生***素并且***素同时为免疫抑制性的，这一事实提示用于在所述应答末期负调节免疫***的潜在的反馈机制。在肿瘤细胞的情况下，在无炎性反应的情况下产生所述终产物抑制剂以在宿主中有意诱导免疫抑制。因此设想，由于在细胞因子介导的免疫刺激之前存在大量的抑制剂，因此建立的肿瘤的微环境可能是用抗体-细胞因子融合蛋白引发T细胞反应的困难之处。
本发明部分基于这样一个发现：抗体-细胞因子融合蛋白的抗肿瘤活性可以通过同时给予***素抑制剂而显著增强。设想所述***素抑制剂减低肿瘤诱导的免疫抑制的程度，以使得抗体-细胞因子融合蛋白更有效地激活细胞免疫应答。
应该理解，本文所用的术语“***素抑制剂”是指能够抑制或者在其它情况下减少环加氧酶的产生或活性、或能够用作血管生成抑制剂的任何分子。
***素抑制剂包括例如环加氧酶抑制剂，尤其是对COX-2形式具有特异性的环加氧酶抑制剂。非选择性环加氧酶抑制剂的实例包括吲哚美辛、舒林酸、布洛芬和阿斯匹林。COX-2选择性抑制剂的实例包括临床研制中的几种化合物，诸如Celecoxib(Searle)、MK-966(Merck)和美洛昔康(Boehringer Ingelheim)。在本发明中优选后一类化合物，因为胃肠副作用的发生率降低使得可以较大剂量给药和更有效地抑制肿瘤细胞合成***素。也已经表明维生素A类抑制表皮生长因子和佛波醇酯对COX-2的诱导(参见例如Mestre等，(1997)Cancer Res.57:2890-2895)。
设想多种测定例如基于分离的酶的测定、基于细胞的测定或抗炎测定，可以用来鉴定可用于实施本发明的环加氧酶抑制剂(参见例如美国专利第5,886,178号和第5,543,297号)。例如，可以用按Barnett等(1994)Biochem.Biopfhys.Acta 1209:130-139中所述制备、并如美国专利第5,886,178中所述使用的部分纯化的COX-Ⅰ和COX-Ⅱ酶，分析假定的环加氧酶抑制剂的活性。简而言之，将COX-Ⅰ和COX-Ⅱ酶在含10％甘油的缓冲液中稀释，通过与2mM苯酚一起温育5分钟，然后再与1μM高铁血红素一起温育5分钟进行重建。通过加入14C花生四烯酸起始反应。通过加入2M HCl终止反应，终产物在C18 Sep-Pak色谱柱上分级分离(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)。氧合产物在乙腈/水/乙酸(50∶50∶0.1(v/v))中洗脱，并通过闪烁计数器对放射性计数。
***素抑制剂也包括肿瘤血管生成抑制剂，血管生成是与COX-2表达和***素合成密切相关的过程(参见例如Majima等(1997)Jpn J.Pharmacol.75:105-114。应该理解，本文所用的术语“血管生成抑制剂”是指减少或抑制哺乳动物中新血管形成的任何分子。在癌症治疗方面，所述血管生成抑制剂减少或抑制肿瘤内或肿瘤上的新血管形成，最好是减少或抑制实体瘤中或实体瘤上新血管的形成。设想可以采用多种本领域熟知的测定，鉴定有用的血管生成抑制剂。这类测定包括例如牛毛细血管内皮细胞增生测定、鸡尿囊绒膜(CAM)测定或小鼠角膜测定。然而，最好是CAM测定(参见例如O’Reilly等(1994)Cell79:315-328和O’Reilly等(1997)Cell 88:277-285)。简而言之，从受精3天的白色的卵中取出具有完整卵黄的胚并将其置于培养皿中。于37℃、3％CO2下培育3天后，将含有假定血管生成抑制剂的甲基纤维素圆片置于各个胚的尿囊绒膜上。培育约48小时后，在显微镜下观察尿囊绒膜中抑制带的证据。
许多血管生成抑制剂是本领域熟知的并有大量的记载。可用于实施本发明的血管生成抑制剂的实例包括例如血管生成的蛋白/肽抑制剂，诸如：制管张素，即血纤溶酶原的一种蛋白水解片段(O’Reilly等(1994)Cell 79:315-328和美国专利第5,733,876、5,837,682和5,885,795号)；endostatin，即胶原蛋白ⅩⅧ的一种蛋白水解片段(O’Reilly等(1997)Cell 88:277-285和美国专利第5,854,205号)；含RGD三肽序列并能够结合αvβ3整联蛋白的肽(Brooks等(1994)Cell 79:1157-1164)；和某些抗体及其抗原结合片段以及与肿瘤血管上皮细胞上发现的αvβ3整联蛋白(Brooks等，见上文)或EGF受体(Ciardello等(1996)J.Natl.Cancer Inst.88 1770-1776)相互作用的肽。其它血管生成抑制剂的实例包括：COX-2抑制剂(Masferrer等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)；夫马洁林和类似物，诸如AGM-1470(Inger等(1990)Nature 348:555-557)；和其它小分子，诸如沙利度胺(D’Amato等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4082-4085)。然后，目前最好使用endostatin和制管张素。
也已经报道了几种细胞因子、包括其物种变异体及其截短的类似物具有抗血管生成活性，因此可用于实施本发明。实例包括IL-12，据报道通过依赖于IFN-γ的机制起作用(Voest等(1995)J.Natl.Canc.Inst.87:581-586)；和IFN-γ自身，它诱导一种具有血管抑制活性的趋化因子(IP-10)(Arenberg等(1996)J.Exp.Med.184:981-992)。因此，IL-12、IFN-γ和IP-10代表于同一抑制途径不同点的血管生成抑制剂。已经表明其它干扰素、尤其是IFN-α单独或联合其它抑制剂时是血管抑制性的(Brem等(1993)J.Pediatr.Surg.28:1253-1257)。干扰素IFN-α、IFN-β和IFN-γ均具有免疫学效应以及不依赖于其抗病毒活性的抗血管生成特性。据报道另一细胞因子GM-CSF通过诱导制管张素抑制血管生成(Kumar等(1998)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.39:271)。
应该理解，如本文所用的，如果对于所述抗原或受体的结合亲和性大于105M-1，更优选大于107M-1，则所述免疫缀合物的抗体部分特异性地结合预定抗原，细胞因子特异性地结合所述细胞因子的受体，或***素抑制剂特异性地结合所述抑制剂的受体。本文所用的术语制管张素、endostatin、TNF、IL、GM-CSF、M-CSF、LT和IFN不仅是指完整的蛋白，也是指其生物活性片段和/或类似物。生物活性片段是指具有完整蛋白生物活性的至少30％、更优选至少70％、最优选至少90％的完整蛋白部分。类似物是指所述完整蛋白的物种变异体和等位基因变异体、或具有所述完整蛋白生物活性的至少30％、更优选至少70％、最优选至少90％的氨基酸取代体、***体或缺失体。
***素抑制剂可以与所述免疫缀合物同时给予，或分别通过不同的给药途径给予。本发明的化合物可以通过与特定分子相匹配的任何途径给予。因此，合适时，可以口服或胃肠外给予，包括静脉内和腹膜内给药途径。
可以将本发明的组合物通过任何合适的方法直接(例如局部如通过注射、植入或体表给予组织部位)或***(例如胃肠外或口服)提供给动物。当所述组合物待胃肠外提供时，诸如通过静脉内、皮下、经眼、腹膜内、肌内、经颊、直肠、***、眶内、脑内、颅内、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、鼻内或通过气雾剂给予，所述组合物最好包含部分水性或生理上相容的流体悬浮液或溶液。因此，所述载体或溶媒是生理上可接受的，使得除将所需组合物传递至患者外，它不会另外不利地影响患者的电解质和/体积平衡。所述药物的所述流体介质因此可以包含通常的生理盐水(例如9.85％NaCl水溶液，0.15M,pH7-7.4)。
每次给予的免疫缀合物的优选剂量范围为0.1mg/m2-100mg/m2，更优选为1mg/m2-20mg/m2，最优选为2mg/m2-6mg/m2。***素抑制剂的优选剂量一般将取决于所用的***素抑制剂的类型，然而，可以用常规试验确定最适剂量。免疫缀合物和/或***素抑制剂的给予可以通过定期大剂量注射，或从外部储器(例如从静脉内袋)或内部(例如从可生物消化的植入物)通过连续静脉内或腹膜内给予。此外，设想了本发明的免疫缀合物也可以与多种不同的***素抑制剂一起给予计划的受体。然而，设想了免疫缀合物和***素抑制剂的最佳组合、给药模式、剂量可以通过常规试验确定，这在本领域技术人员的技术水平之内。
可以用多种方法，评估采用抗体-细胞因子融合蛋白和***素抑制剂的联合疗法对免疫应答的效力。例如，技术人员可以实施例1描述的动物模型或其它合适的动物模型来测试哪种***素抑制剂、或***素抑制剂的组合在与免疫缀合物(例如抗体-IL-2融合蛋白)协同作用以增强对建立的肿瘤的免疫破坏方面最有效。所述***素抑制剂或***素抑制剂的组合可以在免疫缀合物治疗之前或同时给予，通过测定体积可以方便地监测对肿瘤的效应。此外，当鉴定出新的***素抑制剂时，技术人员将能够使用本文所述的方法来评估这些新抑制剂增强或在其它情况下改变抗体-细胞因子融合蛋白抗癌活性的潜力。
或者，在治疗后，可以切下肿瘤，将其切片并通过标准组织学方法染色，或通过特异性的免疫组织试剂染色，以评价所述联合疗法对免疫应答的效应。例如，用苏木精和曙红的简单染色可能揭示出为细胞免疫应答的指标的淋巴细胞浸润到实体瘤中的差异。此外，用针对特定免疫细胞类别的抗体将切片免疫染色，可以揭示出所诱导的应答的性质。例如，结合CD45(一种通常的白细胞标记)、CD4和CD8(用于T细胞亚类鉴定)和NK1.1(NK细胞上的一种标记)的抗体可以用来评估由本发明免疫缀合物介导的免疫应答类型。
或者，通过例如在Lode等(1998)Blood 91:1706-1715中描述的常规的细胞亚群排除研究，可以评估由所述免疫缀合物介导的免疫应答类型。排除抗体的实例包括与T细胞标记CD4和CD8反应的抗体，以及结合NK标记NK1.1以及脱唾液酸(asialo)GM的抗体。简而言之，在开始相当高的剂量(例如约0.5mg/小鼠的剂量)进行抗体-细胞因子处理之前，给所述哺乳动物注射这些抗体，以每周1次的间隔给予，此后直至试验完成。该技术可以鉴定引发所观察的哺乳动物的免疫应答所需的细胞类型。
在另一途径中，将从已经用联合疗法处理的动物中分离的脾细胞的细胞毒活性与其它处理组的细胞毒性活性相比。通过用在大多数免疫学实验室手册中找到的标准技术机械切碎回收的、无菌的脾，制备脾细胞培养物。参见例如Coligan等(编辑)(1988)“Current Protocols inImmunology”John Wiley & Sons,Inc。然后在合适的含有血清、抗生素和低浓度IL-2(约10U/ml)的细胞培养基(例如得自GIBCO的DMEM)中培养所产生的细胞。例如，为了比较NK活性，3天的培养物通常是最适的，而为了比较T细胞细胞毒活性，5天的培养物通常是最适的。通过用51Cr放射标记肿瘤靶细胞(例如LLC)30分钟，可以测定细胞毒性活性。在去除过量的放射标记后，将标记细胞与不同浓度的培养脾细胞混合4小时。温育结束时，用γ计数器测量来自所述细胞的51Cr，然后将其用来定量由所述免疫细胞诱导的细胞裂解的程度。以该方式测定常规的细胞毒T淋巴细胞(或CTL)活性。
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1．动物模型
开发出鼠癌症模型来研究组合抗体-细胞因子融合蛋白和***素抑制剂在介导抗肿瘤的有效免疫应答方面的效应。用于以下实施例的抗体-细胞因子融合蛋白结合EpCAM，这是一种在大多数上皮衍生肿瘤上发现的人肿瘤抗原。(参见Perez和Walker(1989)J.Immunol.142:3662-3667)。为了测试在免疫活性鼠模型中的效力，必需在与小鼠宿主同源的小鼠肿瘤细胞表面上表达人抗原。选择一种众所周知的小鼠肺癌细胞系Lewis肺癌(LLC)细胞用于此目的。已知该细胞系产生高水平的***素并且其生长部分受环加氧酶抑制剂(诸如吲哚美辛的抑制(Macci等，J.Biol.Resp.Mod.7:568-580)。结果，在LLC细胞表面上表达了人肿瘤抗原EpCAM。
用含编码人EpCAM抗原(由KS1/4抗体识别，如Vurki等(1984)Cancer Res.44:681中描述)、并由巨细胞病毒(CMV)早期启动子(Immunogen,Carlsbad,CA)驱动的cDNA的表达质粒转染LLC细胞。通过PCR，从由人***癌细胞LnCAP制备的cDNA克隆所述KS抗原(KSA或EpCAM)。正向引物具有核苷酸序列5’TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC(SEQ ID NO:1)，其中ATG为翻译起始密码子，而反向引物具有核苷酸序列5’CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT(SEQ ID NO:2)，其中TTA为翻译终止的反密码子。EpCAM cDNA克隆入反转录病毒载体pLNCS(Clontech,Palo Alto,CA)中，并按照已建立的方案(Ausubel等(编辑)“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley & Sons)进行转染。简而言之，通过磷酸钙共沉淀法，用pLNCX-EpCAM转染包装细胞系PA317(ATCC CRL 9078)，含有所述病毒的条件培养基用来转染LLC细胞。将G418(Sigma Chemical Co.)加入转染细胞至1mg/ml，以选择稳定的克隆。通过免疫染色和荧光激活细胞分类术(FACS)分析，鉴定表达人EpCAM抗原的克隆(LLC-Ep)。
如图1描述，首先用hu-KS-IL2抗体融合蛋白(参见以下实施例2)染色、然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人Fc特异性抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)染色的LLC-Ep克隆，表现出相当均一的人EpCAM表达水平。在这些克隆中的表达水平远高于单独用FITC标记的抗人Fc特异性抗体染色的克隆所观察到的水平。
为了表明人细胞表面蛋白的表达不增加LLC-Ep细胞的免疫原性，给C57B1/6小鼠皮下注射不同数目的细胞。发现所有小鼠在注射5×105细胞后均快速产生进行性肿瘤，其生长动力学与用亲代LLC细胞系观察的大致相同。所有动物均为垂死的，将其处死以避免不必要的受苦。实施例2．抗体-细胞因子融合蛋白或抗体-血管生成抑制剂融合蛋白
的制备
在以下实施例中讨论多种抗体-细胞因子融合蛋白。具体地说，实施例3公开了人源化KS-鼠γ2a-鼠IL2(huKS-muγ2a-muIL2)和人源化KS-鼠γ2a-鼠IL12(huKS-muγ2a-muIL12)融合蛋白的应用。实施例4公开了人源化KS-人γ4-人IL2(huKS-huγ4-huIL2)和鼠Fc-鼠endostatin(muFc-muEndo)融合蛋白的应用。最后，实施例5公开了人源化KS-人huγ1-人IL2(huKS-huγ1-huIL2)融合蛋白与吲哚美辛的应用。下面讨论这些融合蛋白的构建。huKS-huγ1-huIL2
基本上按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203和美国专利第5,650,150号描述的方法，制备并表达编码huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的基因。简而言之，用Jones等(1986)Nature 321:522-525中公开的方法，制备小鼠KS1/4抗体的人源化可变区(Varki等，(1984)Cancer Res.44:681-687)的模型，所述公开的方法涉及将每个KS1/4可变区的CDR***人可变区具有最高程度同源性的共有框架序列中。用运行BioSym软件的Silicon Graphics Indigo工作站的分子模拟证实所述CDR的形状得到保持。然后反向翻译所述蛋白的序列，通过连接重叠的寡核苷酸构建基因。
基本上按照Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，将产生的可变区***含有人κ轻链和人Cγ1重链恒定区的表达载体中，只是用CMV启动子/增强子取代所述金属硫蛋白启动子和免疫球蛋白重链增强子，以表达两条链。按Gillies等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1428-1432中所述，制备IL-2的成熟序列融合至人重链的羧基末端的融合体，只是所述IL-2基因的3’非翻译区得自SV40 poly(A)区。
通过将所产生的质粒转染入NS/0骨髓瘤细胞系，用含0.1μM氨甲蝶呤(MTX)的选择培养基，表达所述IL-2融合蛋白。简而言之，为了获得稳定转染的克隆，通过电穿孔将质粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0细胞。NS/0细胞在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。用PBS洗涤约5×106细胞，再悬浮于0.5ml PBS中。然后在Gene Pulser Cuvette(0.4cm电极间距，BioRad)中将10μg线性化质粒DNA与所述细胞一起在冰上孵育10分钟。用Gene Pulser(BioRad,Hercules,CA)，设定0.25V和500μF进行电穿孔。让细胞在冰上恢复10分钟，此后将其再悬浮于生长培养基中，然后铺到2个96孔板上。通过在100nM氨甲蝶呤存在下，通过生长选择稳定转染的克隆，所述氨甲蝶呤在转染后2天加入。每3天饲喂细胞一次，再饲喂3次，在2-3周内出现MTX抗性克隆。
用合适的抗体，通过Fc或细胞因子ELISA鉴定表达克隆(参见例如Gillies等(1989)Biotechnol.7:798-804)。按生产商的说明，通过结合、然后从A蛋白Sepharose(Pharmacia)洗脱，纯化所产生的融合蛋白。huKS-huγ4-huIL2
基本上按照1999年2月24日申请的U.S.S.N09/256,156(该申请要求1998年2月25日申请的U.S.S.N 60/075,887的优先权)所述，构建并表达编码huKS.huγ4.huIL2融合蛋白的基因。
简而言之，通过从huKS-huγ1-huIL2表达载体中去除免疫球蛋白恒定区Cγ1基因片段，并用来自人Cγ4基因的相应序列取代，制备如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的Igγ4形式。人重链恒定区Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4的序列和序列对比公开于Huck等(1986)Nuc.AcidsRes.14:1779-1789。
通过用HindⅢ和XhoⅠ消化原始的含Cγ1质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化大的7.8kb片段，完成Cγ1和Cγ4片段的交换。含所述Cγ4的第二质粒用HindⅢ和NsiⅠ消化，并纯化1.75kb片段。含有融合至人Cγ1基因羧基末端的人IL-2 cDNA和SV40 poly A位点的第三质粒用XhoⅠ和NsiⅠ消化，并纯化小的470bp片段。以大致等摩尔的量连接所有三种片段，连接产物用来转化感受态大肠杆菌。用连接产物转化感受态大肠杆菌，通过在含氨苄青霉素的平板上生长选择菌落。通过得自分离转化子的质粒DNA制备物的限制分析，并用FspⅠ消化来区别Cγ1(无FspⅠ)和Cγ4(一个位点)基因***片段，鉴定正确装配的重组质粒。
将含有Cγ4-IL2重链取代的最终载体通过电穿孔(0.25V和500μF)引入NS/0小鼠骨髓瘤细胞，并通过在含氨甲蝶呤(0.1μM)的培养基中生长选择转染子。鉴定、扩增表达高水平huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的细胞克隆，并用A蛋白Sepharose色谱从培养上清液中纯化所述融合蛋白。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定Cγ4融合蛋白的纯度和完整性。在T细胞增生测定(Gillis等(1978)J.Immunol.120:2027-2032)中测量IL-2活性，发现与γ1构成物的活性相同。huKS-muγ2a-muIL2
通过用相应的鼠序列取代如上所述的huKS-huγ1-huIL2融合蛋白的人抗体恒定区和人IL-2，构建编码huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白的基因。具体地说，用融合至编码鼠IL-2的DNA的鼠Cγ2a cDNA片段取代人Cγ1-IL2 DNA。简而言之，用重叠寡核苷酸引物，通过进行重叠PCR，将huKS的V区符合读框地融合至鼠γ2a cDNA，所述引物为：(有义)5’CC GTC TCC TCA GCC AAA ACA ACA GCC CCA TCG GTC(SEQ ID NO:3)； (反义)5’GG GGC TGT TGT TTTGGC TGA GGA GAC GGT GACTGA CG(SEQ IDNO:4)；(有义)5’C TTA AGC CAG ATC CAG TTG GTG CAG(SEQ ID NO:5)；和(反义)5’CC CGG GGT CCG GGA GAA GCT CTT AGT C(SEQ ID NO:6)。
设计SEQ ID NO:3和4的寡核苷酸，以杂交至huKS的所述VH结构域和鼠γ2a恒定区cDNA的接点(斜体)。在第一轮PCR中，有两个单独的反应。在一个反应中，huKS VH DNA用作模板，采用SEQ IDNO:4和5的寡核苷酸。SEQ ID NO:5的引物在编码huKS VH的成熟氨基末端的序列上游引入一个AflⅡ(CTTAAG)限制位点(粗体)。在另一反应中，鼠γ2a cDNA用作模板，使用寡核苷酸SEQ ID NO:3和6。SEO ID NO:6的引物杂交至编码γ2a C末端周围区域的cNDA，并引入一个XmaⅠ(CCCGGG)限制位点，以随后连接至muIL2 cDNA。混合得自这两个反应的PCR产物，并采用SEQ ID NO:5和6的寡核苷酸进行第二轮的PCR。克隆所产生的PCR产物，在序列证实后，将编码huKS的VH和鼠γ2a恒定区的AflⅡ-XmaⅠ片段用来在AflⅡ位点连接至编码信号肽的DNA并在XmaⅠ位点连接至编码muIL2 cDNA。
用SEO ID NO:7和8中叙述的寡核苷酸，从鼠外周血单核细胞的mRNA克隆鼠IL2cDNA，所述寡核苷酸为：(有义)5’GGC CCG GGT AAA GCA CCC ACT TCA AGC TCC(SEQ ID NO.7)；和(反义)5’CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG(SEQ ID NO.8)。
SEQ ID NO:7的引物改变于XmaⅠ限制位点(CCCGGG)连接至muγ2a的muIL2(粗体的序列)。SEQ ID NO:8的引物在紧接翻译终止密码子(反义序列中的粗体)之后引入一个XhoⅠ限制位点(CTCGAG)。
同样，通过重叠PCR将huKS的轻链可变区(VL)连接至muκcDNA序列。所用的重叠寡核苷酸包括：(有义)5’G GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT G(SEQ ID NO.9)；
(反义)(有义)
(反义)5’GCAGC ATCAGC CCGTT TTA TTT CCA GCT TGG TCC(SEQ ID NO.10)；5’C TTA AGC GAG ATC GTG CTG ACC CAG (SEQ ID NO.11)；和5’CTC GAG CTA ACA CTC ATT CCT GTT GAA GC(SEQ ID NO.12)。
所述寡核苷酸用来杂交至huKS的VL和鼠κcDNA恒定区的接点(斜体)。在第一轮PCR中，有两个单独的反应。在一个反应中，huKSDNA的VL用作模板，采用SEQ ID NO:10和11中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在编码huKS VL的成熟氨基末端的序列上游引入一个AflⅡ(CTTAAG)限制位点。在另一个反应中，用鼠κcDNA作为模板，采用SEQ ID NO:9和12中提出的寡核苷酸，所述寡核苷酸在翻译终止密码子(反义引物中的粗体)后引入一个XhoⅠ限制位点。
混合得自这两个反应的PCR反应，并采用SEQ ID NO:11和12中提出的寡核苷酸引物进行第二轮PCR。克隆所产生的PCR产物，在证实序列后，将编码huKS的VL和鼠κ恒定区的AflⅡ-XhoⅠ片段在AflⅡ位点连接至编码信号肽的DNA。
用鼠重链序列和轻链序列取代pdHL7中的人序列。将产生的包含dhfr选择标记基因的抗体表达载体进行电穿孔(0.25V和500μF)进鼠NS/0骨髓瘤细胞中，并通过在含0.1μM氨甲蝶呤的培养基中培养而选择克隆。采用标准ELISA方法测试抗氨甲蝶呤的转染克隆中抗体决定簇的分泌。按照生产商的说明，通过A蛋白Sepharose色谱纯化所述融合蛋白。huKS-muγ2a-muIL12
基本上按照1997年12月8日申请的U.S.S.N.08/986,997和Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，构建和表达编码huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的基因。简而言之，通过将鼠p35IL-12亚单位cDNA融合至先前制备的huKS-muγ2a重链编码区，完成这一步骤。然后将所产生的载体转染入NS/0骨髓瘤细胞系中，所述细胞系用p40IL-12亚单位预先转染并能够表达p40 IL-12亚单位。换句话说，单独用p40转染细胞系，选择稳定的高表达细胞，然后用其作为含p35融合蛋白转染的受体(即顺序转染(sequential transfection))。
从用伴刀豆凝集素A(5μg/ml，在培养基中3天)激活的脾细胞制备的mRNA，通过PCR分离鼠p35和p40IL-12亚单位。所述PCR引物用于分离编码p35的核酸序列，同时将p35 cDNA修改为XmaⅠ-XhoⅠ限制片段，所述引物包括：5’CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG(SEQ ID NO:13)；和5’CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC(SEQ ID NO:14)。
用于分离编码p40的核酸序列的PCR引物包括：5’TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC(SEQ ID NO:15)；和5’CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG(SEQ ID NO:16)。
按照所述(Gillies等J.Immunol.Methods 125:191)构建质粒载体(pdHL7-huKS-muγ2a-p35)，它含有dhfr选择标记基因、一个编码人源化KS抗体轻链的转录单位和一个编码融合至鼠IL-12的p35亚单位的鼠重链的转录单位。通过将修改的p35亚单位cDNA的XmaⅠ至XhoⅠ片段连接至先前制备的鼠γ2a基因CH3外显子末端的单一XmaⅠ位点，完成融合。H链和L链转录单位均于5’端包含一个巨细胞病毒(CMV)启动子(取代原始参比序列中金属硫蛋白启动子)，于3’端包含一个聚腺苷酸化位点。
构建相似的载体(pNC-p40)以表达游离的p40亚单位，所述载体包含一个选择标记基因(新霉素抗性基因)、但仍使用CMV启动子用于转录。在这种情况下的编码区包括p40亚单位的天然前导序列，以正确地转运至内质网并与所述融合蛋白一起装配。将质粒pNC-p40电穿孔到细胞中，将细胞铺平板，并在含G418的培养基中选择。在这种情况下，通过ELISA测试来自抗药性克隆的培养上清液的p40亚单位的产生。
按Gillies等(1998)J.Immunol.160:6195-6203中所述，将pdHL7-huKS-muγ2a-p35表达载体电穿孔到已经表达鼠p40的NS/0细胞系中。通过标准ELISA方法，测试抗氨甲蝶呤的转染克隆的抗体决定簇和鼠IL-12的分泌。按照生产商的说明，通过结合至A蛋白Sepharose柱，并从该柱洗脱，纯化所产生的蛋白。muFc-muEndo
基本上按照1998年8月25日申请的U.S.S.N.60/097,883所述，构建和表达编码muFc-muEndo融合蛋白的基因。
简而言之，将鼠endostatin和鼠Fc作为muFc-muEndostatin融合蛋白表达。用PCR改变endostatin基因以在pdCs-muFc(D4K)载体中表达(Lo等(1998)Protein Engineering 11:495-500)，该载体含有一个肠激酶识别位点Asp4-Lys(LaVallie等(1993)J.Biol.Chem.268:23311-23317)。正向引物为5’-C CCC AAG CTT CAT ACT CAT CAG GAC TTT C(SEO ID NO:17)，其中在AAGCTT(HindⅢ位点)之后接编码endostatinN末端的序列(粗体)。反向引物为5’-CCC CTC GAG CTA TTT GGAGAA AGA GGT C(SEQ ID NO:18)，该引物用来将翻译终止密码子(反密码子，CTA)紧接endostatin C末端后放置，此后为一个XhoⅠ位点(CTCGAG)。
将PCR产物克隆并测序，将编码endostatin的HindⅢ-XhoⅠ片段连接到pdCs-muFc(D4K)载体中。用抗muFc ELISA选择稳定的表达muFc(D4K)-muEndo的NS/0克隆并对其分析。表达所产生的融合蛋白，并通过A蛋白Sepharose色谱纯化所述融合蛋白。实施例3．采用KS-IL2和KS-IL12融合蛋白的联合疗法用于治疗
LLC-Ep肿瘤.
已知IL-12通过依赖于IFN-γ的机制抑制血管生成(Voest等，J.NatlCanc.Inst.87:581-586)，所述机制进而负调节COX-2活性、另一PG的产生和IL-10的诱导。为了确定将IL-12给予所述肿瘤微环境是否可以用来克服PG的免疫抑制效应，以及是否可以使定向(targeted)IL-2激活对所述肿瘤的细胞免疫破坏，将用huKS-muγ2a-muIL2和huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的组合处理的效应与仅用各个融合蛋白处理的效应进行比较。
在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射在细胞培养物中培养的LLC-Ep细胞(5×105/小鼠)。约2周后，将具有范围为150-400mm3的可触知肿瘤的动物分为4组，各组之间肿瘤大小的分布相同。对动物如下处理：在组1中，动物仅接受PBS(对照组)；在组2中，动物仅接受huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白；在组3中，动物仅接受huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白；在组4中，动物接受huKS-muγ2a-muIL2和huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白。通过测量体积监测肿瘤生长，直至对照组的动物濒死并将其无痛致死。用测径规测量肿瘤体积，并按以下公式计算：V=4π/3(0.5L×0.5W×0.5H)，其中L为肿瘤长度，W为肿瘤宽度，而H为肿瘤高度。
图3概述了结果。用PBS处理的小鼠用空心菱形表示，用15μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白处理的小鼠用实心方形表示，用10μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白处理的小鼠由实心三角形表示，而用7.5μg/天huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白和5μg/天huKS-muγ2a-muIL12融合蛋白的组合处理的小鼠用打叉表示。
如图3所示，用huKS-muγ2a-muIL2融合蛋白(15μg连续5天)处理不延迟或减少LLC-Ep肿瘤的生长(实心方形)。在单独用10μghuKS-muγ2a-muIL12融合蛋白/剂连续5天处理的小鼠中观察到仅略有抗肿瘤效应(实心三角形)。这提示，IL-12的效应不足以触发足够的免疫应答以显著减慢肿瘤的生长。然而，当以每种融合蛋白各一半原始量(分别为7.5μg huKS-muγ2a-muIL2和5μg huKS-muγ2a-muIL12)将这两种融合蛋白组合时，观察到显著的生长延迟(打叉)，提示在这两种融合蛋白之间有协同作用。尽管这种观察到的协同作用的机制是未知的，但它可能部分归因于克服肿瘤产生的***素对IL-10的诱导。实施例4．抗体-细胞因子融合蛋白和endostatin的联合疗法。
IL-2和IL-12抗体融合蛋白的组合表现出显著的抗大肿瘤的肿瘤活性，而用抗体-IL-2融合蛋白和***素抑制剂可能可以得到相似的结果。
将表达人EpCAM的小鼠CT26癌细胞皮下注射BALB/c小鼠已剃毛的背部(2×106细胞/注射)。当肿瘤的大小达到100-200mm3(约7-14天)时，将小鼠随机分为4组，每组4只。组1每日接受0.2ml PBS的静脉注射。组2每日接受muFc-muEndostatin(320μg/小鼠)的PBS溶液的静脉注射。组3仅接受huKS-huγ4-huIL2融合蛋白(10μg/小鼠)的PBS溶液的静脉注射，注射5天。组4接受PBS中的huKS-huγ4-huIL2(10μg/小鼠)和muFc-Endo(320μg/小鼠)静脉注射5天，此后每天接受PBS中的muFc-Endo(320μg/小鼠)静脉注射。按实施例3所述测量肿瘤体积。
图4总结了结果。用PBS处理的小鼠用实心菱形表示，用muFc-muEndo融合蛋白处理的小鼠用实心方形表示，用huKS-huγ4-huIL2融合蛋白处理的小鼠由实心菱形表示，而用muFc-muEndo融合蛋白和huKS-huγ4-huIL2融合蛋白的组合处理的小鼠用打叉表示。
图4表明，所述抗体-细胞因子融合蛋白和所述***素蛋白muFc-muEndo的组合优于这两种因子本身中任一种。处理19天后，huKS-huγ4-huIL2和muFc-muEndo联合疗法的T/C比(处理组的平均肿瘤大小/对照组的平均肿瘤大小)为0.25，这与huKS-huγ4-huIL2的T/C为0.31以及muFc-muEndo的T/C为0.42相比，有显著提高。实施例5．抗体-细胞因子融合蛋白和吲哚美辛的联合疗法。
在该实验中，用IL-2融合蛋白和一种COX-2抑制剂-吲哚美辛处理小鼠。在C57B1/6雌性小鼠中背部皮下注射LLC-Ep细胞(2×106/注射)。当肿瘤达到600-1200mm3时处死小鼠。用聚烯吡酮碘和乙醇清洁覆盖肿瘤的皮肤，切下肿瘤并弃去坏死组织。通过使活肿瘤组织通过筛网，然后通过一系列连续变小的22-30号低温针，制备肿瘤细胞在磷酸缓冲盐水中的悬浮液。调节细胞的浓度为1×107细胞/ml，并置于冰上。然后在C57B1/6小鼠背部近中线皮下注射0.1ml新鲜在再悬浮的细胞(1×106细胞/小鼠)。
当肿瘤的大小达到100-200mm3(约7-14天)时，将小鼠随机分为4组，每组5只。组1每日接受0.2ml PBS的静脉注射。组2每日接受PBS中的huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)静脉注射共5天。组3在整个处理期间在饮用水中口服接受吲哚美辛(20μg/ml，或每日消费约60-70μg吲哚美辛/小鼠)。组4每日接受huKS-huγ1-huIL2(25μg/小鼠)的静脉注射共5天，在整个处理期间在饮用水中口服吲哚美辛(20ug/ml)。按实施例3所述测量肿瘤体积。
图5展示了结果。用PBS处理的小鼠用实心菱形表示，用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白处理的小鼠用实心方形表示，用吲哚美辛处理的小鼠由实心三角形表示，而用huKS-huγ1-huIL2融合蛋白和吲哚美辛的组合处理的小鼠用打叉表示。
图5表明，抗体-细胞因子融合蛋白和所述抗血管生成化学化合物吲哚美辛的组合由优于这两种因子本身中的任一种。处理22天后，huKS-huγ4-huIL2和吲哚美辛联合疗法的T/C比为0.40，这与huKS-huγ4-huIL2的T/C为0.61以及吲哚美辛的T/C为0.60相比，有显著提高。
等同方案
在不违背本发明的精神和基本特征的情况下，本发明可以具体体现为其中具体形式。因此，上述实施方案在所有方面应被认为是说明性的，而不限制本文所述的发明。因此，本发明的范围由所附的权利要求书指明，而不是由前述说明书指明，在所述权利要求书等同方案意义和范围内的所有变化均包括在本发明内。
通过引用而结合
上文公开的每个专利文献和科学出版物均通过引用结合到本文中。
序列表<110>Gillies,Stephen D<120>通过共同给予***素抑制剂增强抗体-细胞因子融合蛋白介导的免疫应答<130>LEX-004PC<140><141><150>60/082,166<151>1998-04-17<160>18<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<220><221>misc_特征<222>(12)...(14)<223>翻译起始密码子<400>1tctagagcag catggcgccc ccgc 24<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<220><221>misc_特征<222>(7)...(9)<223>翻译终止反密码子<400>2ctcgagttat gcattgagtt ccct 24<210>3<211>35100393.01<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>3ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc 35<210>4<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>4ggggctgttg ttttggctga ggagacggtg actgacg 37<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>5cttaagccag atccagttgg tgcag 25<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>6cccggggtcc gggagaagct cttagtc 27<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>7ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc 30<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>8ccctcgagtt attgagggct tgttg 25<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>9ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg 32<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>10gcagcattag cccgttttat ttccagcttg gtcc 34<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>11cttaagcgag atcgtgctga cccag 25<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>12ctcgagctaa cactcattcc tgttgaagc 29<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>13ccccgggtag ggtcattcca gtctctgg 28<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>14ctcgagtcag gcggagctca gatagc 26<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>15tctagaccat gtgtcctcag aagctaac 28<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>16ctcgagctag gatcggaccc tgcag 25<210>17<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>17ccccaagctt catactcatc aggactttc 29<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>18cccctcgagc tatttggaga aagaggtc 28
Claims (27)
1．在哺乳动物中诱导针对预定细胞类型的杀细胞免疫应答的方法，所述方法包括：
给予所述哺乳动物(ⅰ)免疫缀合物，包含一个能够结合预定细胞类型的抗体结合位点和一个能够诱导针对所述预定细胞类型的所述免疫应答的细胞因子，和(ⅱ)***素抑制剂，其量足以相对于仅用免疫缀合物而言而增强所述免疫应答。
2．权利要求1的方法，其中所述预定细胞类型为癌细胞。
3．权利要求1的方法，其中所述预定细胞类型为病毒感染的细胞。
4．权利要求1的方法，其中所述***素抑制剂与所述免疫缀合物一起共同给予。
5．权利要求1的方法，其中所述***素抑制剂在给予所述免疫缀合物之前给予。
6．权利要求1的方法，其中所述抗体结合位点以氨基末端至羧基末端的方向包含：一个免疫球蛋白可变区、一个CH1结构域和一个CH2结构域。
7．权利要求6的方法，其中所述抗体结合位点还包含连接至所述CH2结构域羧基末端的一个CH3结构域。
8．权利要求l的方法，其中所述免疫缀合物为一种融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含：(ⅰ)抗体结合位点，包含一个能够结合预定细胞类型上的细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区、一个免疫球蛋白CH1结构域、一个免疫球蛋白CH2结构域，和(ⅱ)所述细胞因子。
9．权利要求8的方法，其中所述抗体结合位点还包含***所述CH2结构域和所述细胞因子之间的一个CH3结构域。
10．权利要求l的方法，其中所述免疫缀合物的所述细胞因子选自：肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
11．权利要求1的方法，其中所述***素抑制剂选自：环加氧酶抑制剂、维生素A类化合物、细胞因子和肿瘤血管生成的抑制剂。
12．在哺乳动物中诱导针对癌细胞的杀细胞免疫应答的方法，所述方法包括：
给予所述哺乳动物(ⅰ)免疫缀合物，包含一个能够结合所述癌细胞的抗体结合位点和一个能够诱导针对所述肿瘤细胞的所述免疫应答的细胞因子，和(ⅱ)环加氧酶抑制剂，其量足以相对于仅用免疫缀合物而言而增强所述免疫应答。
13．权利要求12的方法，其中所述环加氧酶抑制剂与所述免疫缀合物一起共同给予。
14．权利要求12的方法，其中所述环加氧酶抑制剂在给予所述免疫缀合物之前给予。
15．权利要求12的方法，其中所述抗体结合位点以氨基末端至羧基末端的方向包含：一个免疫球蛋白可变区、一个CH1结构域和一个CH2结构域。
16．权利要求15的方法，其中所述抗体结合位点还包含连接至所述CH2结构域羧基末端的一个CH3结构域。
17．权利要求12的方法，其中所述免疫缀合物为一种融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方法包含：(ⅰ)抗体结合位点，包含一个能够结合预定细胞类型上的细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区、一个免疫球蛋白CH1结构域、一个免疫球蛋白CH2结构域，和(ⅱ)所述细胞因子。
18．权利要求17的方法，其中所述抗体结合位点还包含***所述CH2结构域和所述细胞因子之间的一个CH3结构域。
19．权利要求12的方法，其中所述免疫缀合物的所述细胞因子选自：肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
20．在哺乳动物中诱导针对预定细胞类型的免疫应答的组合物。所述组合物结合包含：
(ⅰ)免疫缀合物，包含一个能够结合预定细胞类型的抗体结合位点和一个能够在所述哺乳动物中诱导针对所述预定细胞类型的免疫应答的细胞因子，和
(ⅱ)***素抑制剂，其量足以相对于仅用免疫缀合物而言而增强所述免疫应答。
21．权利要求20的组合物，其中所述抗体结合位点以氨基末端至羧基末端的方向包含：一个免疫球蛋白可变区、一个CH1结构域和一个CH2结构域。
22．权利要求21的组合物，其中所述抗体结合位点还包含连接至所述CH2结构域羧基末端的一个CH3结构域。
23．权利要求20的组合物，其中所述免疫缀合物为一种融合蛋白，所述融合蛋白以氨基末端至羧基末端的方向包含：(ⅰ)抗体结合位点，包含一个能够结合预定细胞类型上的细胞表面抗原的免疫球蛋白可变区、一个免疫球蛋白CH1结构域、一个免疫球蛋白CH2结构域，和(ⅱ)所述细胞因子。
24．权利要求23的组合物，其中所述抗体结合位点还包含***所述CH2结构域和所述细胞因子之间的一个CH3结构域。
25．权利要求20的组合物，其中所述免疫缀合物的所述细胞因子选自：肿瘤坏死因子、白介素、集落刺激因子和淋巴因子。
26．权利要求20的组合物，其中所述***素抑制剂选自：环加氧酶抑制剂、维生素A类化合物、细胞因子和肿瘤血管生成的抑制剂。
27．权利要求20的组合物，其中所述预定细胞类型为癌细胞。
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