CZ20003817A3 - Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi - Google Patents

Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi Download PDF

Info

Publication number
CZ20003817A3
CZ20003817A3 CZ20003817A CZ20003817A CZ20003817A3 CZ 20003817 A3 CZ20003817 A3 CZ 20003817A3 CZ 20003817 A CZ20003817 A CZ 20003817A CZ 20003817 A CZ20003817 A CZ 20003817A CZ 20003817 A3 CZ20003817 A3 CZ 20003817A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
schop
domain
antibody
cytokine
immunoconjugate
Prior art date
Application number
CZ20003817A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen D. Gillies
Original Assignee
Lexigen Pharmaceuticals Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lexigen Pharmaceuticals Corporation filed Critical Lexigen Pharmaceuticals Corporation
Publication of CZ20003817A3 publication Critical patent/CZ20003817A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi
Oblast techniky
Vynález obecně popisuje imunokunjugáty, přesněji pak fúzní proteiny protilátka-cytokin, které jsou použitelné pro cílenou imunoterapii a celkovou stimulaci imunitního systému. Ještě přesněji lze říci, že vynález popisuje použití látek potlačujících produkci, sekreci nebo aktivitu imunosupresivních prostaglandinů,. Tyto látky tak posilují imunitní ddpověď vůči zvolenému typu buněk, například buněk v.pevných nádorech, zprostředkovanou fúzním proteinem protilátka-cytokin .
Dosavadní stav techniky
Protilátky jsou po mnoho let používány k léčbě onemocnění lidí, přičemž jejich hlavní funkcí při této léčbě je navodit pasivní imunitu vůči virové nebo bakteriální infekci. V nedávné době začaly být protilátky a konjugáty protilátek rovněž využívány jako protinádorová agens. U většiny typů nádorů bylo obtížné prokázat protinádorovou aktivitu v případech, kdy se nejedná o model minimálního reziduálního onemocnění (Reithmuller a další, Lancet, 94:1177 až 1183) nebo v případech, kdy je nádor přístupný protilátkám v krevním oběhu, například v případech lymfomu B (Maloney a další, Blood, 84:2457 až 2466, 1994). Pevné nádory odolávají terapeutické intervenci pomocí protilátek daleko lépe než mikrometastatická ložiska na modelech minimálních reziduálních onemocnění.
Dřívější studie prokázaly, že účinnost léčby nádorů pomocí protilátek in vivo může být mnohonásobně zvýšena připojením cytokinů stimulujících imunitní systém k molekule použité protilátky. Fúzní proteiny protilátka-cytokin jsou nicméně daleko méně účinné při ničení větších pevných nádorů, než- Lpři eradikaci roztroušených metastatických ložisek (Xiang a další, Cancer Research, 57:4948 až 4955, 1997; a Lodě a další, Blood, 91:1706až 1715, 1998).
V současnosti tedy stále existuje potřeba vyvinout přípravky a postupy využitelné k posílení imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk, například buňkám v pevných nádorech, zprostředkované fúzním proteinem protilátka-cytokin.
Popis obrázků na výkresech
Cíle, charakteristické rysy a výhody předkládaného vynálezu uvedené v předcházejícím i následujícím textu, jakož i vynález sám, mohou být dokonale pochopeny z následujících výhodných provedení vynálezu a přiložených obrázků.
Obrázek 1 je schématických znázorněním ukázkového imunokonjugátu využitelného v praktické aplikaci vynálezu.
Na obrázcích 2A a 2B je graficky znázorněna exprese lidského EpCAM v transfekovaných buňkách myšího Lewisova karcinomu plic (LLC) analyzovaná metodou FACS (fluorescenceactivated cell sorting). Stejné počty transfekovaných buněk byly značeny buď samotnou sekundární protilátkou proti lidské doméně Fc, konjugovanou s fluorescein isothiokyanátem (FITC, panel A), nebo nejprve fúzním proteinem huKS-huIL2 a následným barvením sekundární protilátkou proti lidské doméně Fc konjugovanou s FITC (panel B) .
Obrázek 3 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s dalším fúzním proteinem pro2 • ·· ·· ·· · · • · · · · * · · · · • · ····· · * tilátka-cytokin, v němž byl použit cytokin inhibující aktivitu prostaglandinu (inhibitor angiogeneze). 5-ti denní léčba byla zahájena třináct dnů po implantaci buněk LLC. Myším byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem (prázdné kosočtverce); samotný fúzní protein huKSmuY2a-muIL2 v množství 15 pg/den (plné čtverečky); fúzní protein huKS-muY2a-muIL12 v množství 10 pg/den (plné trojúhelníky) ; a směs fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL2 v množství 7,5 pg/den a fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL12 v množství 5 pg/den (křížky).
Obrázek 4 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s fúzním proteinem s endostatinem. Velikost podkožních nádorů CT26/EpCAM byla monitorována u myší, kterým byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým, pufrem (plné kosočtverce); fúzní protein muFcmuEndo (plné čtverečky); fúzní protein huKS-huY4-huIL2 (plné kosočtverce); a kombinace fúzního proteinu muFc-muEndo a fúzního proteinu huKS-huY4-huIL2 (křížky).
Obrázek 5 je grafických znázorněním vlivu aplikace fúzního proteinu protilátka-cytokin na velikost podkožních nádorů. Fúzní protein protilátka-cytokin byl aplikován buď samostatně nebo v kombinaci s- indomethacinem. Velikost podkožních nádorů LLC-EpCAM byla monitorována u myší, kterým byl podáván fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem (plné kosočtverce); fúzní protein huKS-huYl-huIL2 (plné čtverečky); indomethacin (plné trojúhelníky); a kombinace fúzního proteinu huKS-huYl-huIL2 a indomethacinu (křížky).
3.
• ·· 9 9 · 9 ·· 9
9 9 9 · · · · · · · • 9 9 9 9 9 · · · 9
9 99 99 999 * ·
9999 999 • 99 9999 99 99 99 999
Podstata vynálezu
Tento vynález je zčásti založen na objevu, že podáním nějakého imunokonjugátu do organizmu savce je možné vyvolat silnější imunitní odpověď vůči zvolenému typu buněk v případě, je-li tento imunokonjugát aplikován spolu s inhibitorem syntézy prostaglandinů. 'Zvláště pak bylo zjištěno, že tyto kombinace jsou především výhodné pro zprostředkování zničení zvoleného typu buněk'; jako například buněk v pevných nádorech nebo buněk infikovaných viry, imunitním systémem.
Jedna stránka vynálezu popisuje způsob indukce cytotoxické imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organizmu savců. Tento způsob zahrnuje podání: (i) imunokonjugátu zahrnujícího vazebné místo (odvozené z protilátky) schopné vázat se na zvolený typ buněk a nějaký cytokin schopný indukovat imunitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk; a (ii) inhibitoru syntézy prostaglandinů v množství dostačujícím k posílení indukované imunitní odpovědi, a to ve srovnání s imunitní odpovědí stimulovanou pouze samotným imunokunjugátem.
Ve výhodném provedení vynálezu mohou být zvoleným typem buněk buňky rakovinné, například buňky v pevných nádorech a výhodněji pak buňky ve větších pevných nádorech (tj. nádorech větších než přibližně 100 mm3) . Alternativně mohou být zvoleným typem buněk buňky infikované nějakým virem, například buňky infikované virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV).
V jiném výhodném provedení vynálezu může být inhibitor syntézy prostaglandinů aplikován současně s použitým imunokonjugátem. Alternativně může být inhibitor syntézy prostaglandinů aplikován před podáním tohoto imunokonjugátu. Imunokonjugát může být rovněž podáván spolu s několika rozdílnými inhibitory syntézy prostaglandinů. Alternativně může být inhibitor syntézy prostaglandinů aplikován ,
·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · · · být inhibitor syntézy prostaglandinů aplikován současně s několika rozdílnými imunokonjugáty.
Jiná stránka vynálezu popisuje přípravky použitelné pro indukci cytotoxické imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organizmu savců. Takový přípravek zahrnuje směs:
(i) imunokonjugátu Zahrnujícího vazebné místo (odvozené z protilátky) schopné vázat se na zvolený typ buněk a nějaký cytokin schopný indukovat imúnitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk v organizmu savců; a (ii) inhibitoru syntézy prostaglandinů v množství dostačujícím k posílení indukované imunitní odpovědi, a to ve srovnání s imunitní odpovědí stimulovanou pouze samotným imunokunjugátem.
Ve výhodném provedení vynálezu zahrnuje vazebné místo (odvozené z protilátky) imunokonjugátu těžký řetězec imunoglobulinu nebo antigen-vazebný fragment tohoto řetězce. Těžký řetězec imunoglobulinu ve výhodném provedení zahrnuje, ve směru od N-konce k C-konci, variabilní doménu (VH) schopnou vázat zvolený antigen, konstantní doménu 1 (CH1) těžkého řetězce, konstantní doménu 2 (CH2) těžkého řetězce a volitelně dále konstantní doménu 3 (CH3) těžkého řetězce. Ve výhodnějším provedení vynálezu je imunokonjugátem fúzní protein zahrnující imunoglobulinový těžký řetězec nebo jeho antigen-vazebný fragment připojený k použitému cytokinu polypeptidovou spojkou. Výhodně-používané fúzní proteiny protilátka-cytokin tudíž, ve směru od N-konce k C-konci, zahrnují: (i) vazebné místo (odvozené z protilátky) zahrnující variabilní doménu (VH) schopnou vázat povrchový antigen na zvoleném typu buněk, konstantní doménu 1 (CH1) těžkého řetězce, konstantní doménu 2 (CH2) těžkého řetězce (volitelně dále konstantní doménu 3 (CH3) těžkého řetězce); a (ii) cytokin. Způsoby přípravy a použití takových fúzních proteinů jsou detailně popsány v publikacích Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992; Gillies a dal• · · · · ······· ·· ·· ší, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998; a přihláška US 5650150.
Domény konstantní oblasti imunoglobulinu (t j . domény CH1, CH2 a/nebo CH3) mohou být konstantními doménami obvykle asociovanými s doménou variabilní oblasti v přirozeně se vyskytujících protilátkách. Alternativně může být jedna nebo více domén konstantní oblasti imunoglobulinu odvozeno z protilátek, které jsou odlišhé od protilátky sloužící jako zdroj domény variabilní oblasti. Jinak řečeno, domény variabilní a konstantních oblastí mohou pocházet z různých protilátek, například protilátek odvozených z odlišných živočišných druhů (viz. například přihláška US 4816567). Variabilní oblasti imunoglobulinů mohou dále zahrnovat sekvence FR (framework region, konstantní část ve variabilní doméně) odvozené z jednoho živočišného druhu, například lidské FR, a sekvence hypervariabilní oblasti (CDR, complementarity determining region) vmezeřené mezi sekvence FR, odvozené z jiného, odlišného živočišného druhu, například myši. Způsoby přípravy takových chimérických variabilních oblastí imunoglobulinů jsou popsány například v přihláškách US 5225539 a 5585089.
Imunokonjugáty ve výhodném provedení dále zahrnují lehký řetězec imunoglobulinu, kde tento řetězec je výhodně kovalentně připojen k těžkému řetězci imunoglobulinu, a to například disulfidickou vazbou. Variabilní oblasti spojených řetězců (lehkého a těžkého) spoluvytvářejí jedinečné a kompletní vazebné místo pro vazbu zvoíeného antigenu. V jiných provedeních vynálezu zahrnují zmíněné imunokonjugáty dva chimérické řetězce, kde každý z těchto řetězců zahrnuje alespoň část těžkého řetězce imunoglobulinu spojenou s nějakým cytokinem. Zmíněné dva chimérické řetězce jsou ve výhodném provedení kovalentně spojeny například jednou nebo více intermolekulárními disulfidickými vazbami.
•· · · 9·· ·999
9 9 · 9 · · 9 · .9 • 9 9999 9 9 9
999 9999 99 99 99 999
Do rozsahu vynálezu tudíž spadají fúzní proteiny, v nichž jsou kombinovány antigen-vazebná specifičnost a aktivita protilátky a účinná biologická aktivita cytokinu. Fúzní protein podle vynálezu může být využit k selektivnímu směrování cytokinu k cílové buňce in vivo tak, aby biologická aktivita tohoto cytokinu mohla být uplatněna v blízkosti cílové buňky. Ve výhodném provedení vynálezu se složka fúzního proteinu odvozená z protilátky specificky váže na nějaký antigen na povrchu rakovinné buňky a výsledkem je, že protinádorová aktivita použitého fúzního proteinu je lokalizována do blízkosti této buňky. V jiném výhodném provedení vynálezu se složka fúzního proteinu odvozená z protilátky specificky váže na buňku infikovanou virem, například infikovanou virem HIV, a výsledkem je, že antivirální aktivita použitého fúzního proteinu je lokalizována do blízkosti této buňky.
Mezi výhodně používané cytokiny, které mohou být začleněny do imunokonjugátů podle vynálezu, patří například tumor nekrotizující faktory, interleukiny, faktory stimulující růst kolonií a lymfokiny. Mezi výhodně používané tumor nekrotizující faktory patří tumor nekrotizující faktor a (TNFa). Mezi výhodně používané interleukiny patří například interleukin-2 (IL-2), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-7 (IL-7),- interleukin-12 (IL-12), interleukin-15 (IL-15) a interleukin-18 (IL-18). Mezi výhodně používané faktory stimulující růst kolonií patří například faktor stimulující růst granulocytu-makrofágů (GM-CSF; granulocyte-macrophage colony stimulating factor) a faktor stimulující růst makrofágů (M-CSF). Mezi výhodně používané lymfokiny patří například lymfotoxin (LT). Dalšími využitelnými cytokiny jsou interferony včetně IFN-a, IFN-β a IFN-γ. Všechny tyto interferony vykazují imunologické účin7 • · · 0 0 0« 00 000· 000 000 ky jakož i účinky anti-angiogenní, a tyto účinky jsou nezávislé na jejich účincích antivirálních.
V současnosti je známo několik farmakologických a biofarmaceutických látek schopných potlačovat produkci imunosupresivních prostaglandinů. Ve výhodném provedení vynálezu jsou jako inhibitory syntézy prostaglandinů používány inhibitory cyklooxygenázy (COX). Příkladem neselektivních inhibitorů cyklooxygenázy jsou ihdomethacin, sulindac, ibuprofen a aspirin. Ve výhodnějším provedení vynálezu je inhibitor cyklooxygenázy inhibitorem selektivním vůči formě COX2. Příkladem látek selektivně inhibujících COX-2 je několik klinicky testovaných sloučenin jako například Celecoxib, MK-966 a meloxicam. Tato druhá třída inhibitorů je ve vynálezu výhodně používána, jelikož nemá nežádoucí vedlejší účinky na gastrointestinální trakt a je tudíž umožněno podávání vyšších dávek a tím účinnější potlačení syntézy prostaglandinů v nádorových buňkách.
V jiném výhodném provedení vynálezu je jako inhibitor syntézy prostaglandinů využíván nějaký retinoid. Bylo prokázáno, že retinoidy inhibují indukci exprese COX-2 epidermálním růstovým faktorem a estery forbolu.
V dalším výhodném provedení vynálezu je jako inhibitor syntézy prostaglandinů využíván nějaký inhibitor angiogeneze v nádorech. Inhibitory angiogeneze výhodně používané při praktickém využití tohoto vynálezu zahrnují například endostatin, angiostatin, peptidy s vazebnou aktivitou vůči integrinu ανβ3, protilátky nebo jejich fragmenty s vazebnou aktivitou vůči integrinu ανβ3, peptidy s vazebnou aktivitou vůči receptoru pro epideřmální růstový faktor(EGF), protilátky nebo jejich fragmenty s vazebnou aktivitou vůči receptoru pro EGF, inhibitory COX-2, fumagilin a jeho analog označovaný jako AGM-1470, thalidomid, anti-angiogenní cytokiny jako například IFN-oí, IFN-β a IFN-γ a fúzní proteiny cytokinů zahrnující některý z výše uvedených antiangiogenních cytokinů.
Vynález rovněž popisuje výhodně používaná dávkování a dávkovači režimy pro současnou aplikaci imunokonjugátů podle vynálezu a inhibitorů syntézy prostaglandinů.
Prováděné studie prokázaly, že objemné, pevné nádory odolávají terapeutické intervenci prostřednictvím protilátek, a imunoterapiím obecně, daleko lépe než roztroušená mikrometastatická ložiska (Sulitzeanu a další, Adv. Cancer Res., 60:247 až 267, 1993). Předpokládá se, že nízká citlivost vůči terapeutické intervenci prostřednictvím protilátek částečně závisí na produkci imunosupresivních faktorů.
Ačkoliv mechanizmus eradikace nádorů není dokonale prostudován, předpokládá se, že destrukce rakovinných buněk a imunologická paměť jsou důsledkem cytotoxické odpovědi T lymfocytů (CTL) . Dále se předpokládá, že za určitých okolností (při absenci cytotoxických T lymfocytů) jsou nádory ničeny přirozenými zabíječskými buňkami (NK-buňky). Tyto odlišné typy imunitních odpovědí mohou být důsledkem skutečnosti, že jednotlivé nádory produkují rozdílné typy nebo množství látek schopných potlačovat aktivitu T-buněk. To je zvláště patrné u pevných nádorů, na rozdíl od mikrometastatických ložisek, které dosáhly kritické velikosti a jsou schopny produkovat a sekretovat imunosupresivní faktory v množstvích dostačujících k modulaci imunitní odpovědi vůči nádorům.
Bylo zjištěno, že cytotoxické imunitní odpovědi indukované prostřednictvím imunokonjugátu namířeného proti zvolenému typu buněk mohou být mnohonásobně zesíleny současnou aplikací takového imunokonjugátu a inhibitoru syntézy prostaglandinů. Tato kombinovaná terapie.je zvláště účinná při zprostředkování destrukce abnormálních tkání, jako napří9 • ·· 44 44
4 · 4 4 4 4 • 4 · 4 444 • · · · 4
444 4444 44 ·· klad nádorů, imunitním systémem. Předpokládá se, že inhibitory syntézy prostaglandinů potlačují produkci, sekreci nebo aktivitu imunosupresorů z nádorových buněk a umožňují tudíž účinnější aktivaci buněčné imunitní odpovědi vůči danému nádoru, indukovanou imunokonjugáty protilátka-cytokin. Předpokládá se rovněž, že výše zmíněné postupy mohou být využitelné při léčbě určitých virových onemocnění, při kterých podobné imunosupresivní mechanizmy blokují buněčnou imunitní odpověď. Takovým onemocněním je například infekce virem HIV. Předpokládá se, že inhibitory syntézy prostaglandinů budou při destrukci abnormální tkáně (jako například nádorů nebo buněk infikovaných viry) vykazovat synergické účinky s imunokonjugáty protilátka-cytokin. Vynález popisuje způsoby přípravy a použití imunokonjugátů a rovněž stanovení využitelná k testování jejich farmakokinetických parametrů in vivo na preklinických živočišných modelech v případech, kdy jsou tyto imunokonjugáty kombinovány s vhodnými inhibitory syntézy prostaglandinů.
Termíny cytotoxická imunitní odpověď nebo cytotoxická imunitní reakce označují imunitní odpověď v organizmu savců, a to buď odpověď humorální nebo buněčnou, kde tato imunitní odpověď je stimulována imunokonjugáty podle vynálezu, a při níž je zvolený typ buněk buď zabíjen nebo je jiným způsobem snížena jeho životaschopnost. Této imunitní odpovědi se může účastnit jeden nebo více typů buněk, včetně Tbuněk, přirozených zabíječů (NK-buněk) a makrofágů.
Termín imunokonjugát označuje nějaký konjugát zahrnující (i) vazebné místo (odvozené z protilátky) s vazebnou specifitou pro a se schopností vázat se na nějaký povrchový antigen rakovinných buněk nebo buněk infikovaných virem a (ii) cytokin schopný indukovat nebo stimulovat cytotoxickou imunitní odpověď vůči rakovinným buňkám nebo buňkám infikovaným virem. Daný imunokonjugát je tudíž schopný in vivo
10,
99
9 9 9
9
99 99 ♦ · 9 9 9 9
9 999 9 9
9999 999 • 99 9999 99 99 99 999 selektivně směrovat cytokin k cílové buňce tak, aby indukovaná imunitní odpověď byla lokalizována do blízkosti této cílové buňky. Jestliže například složka imunokonjugátu odvozená z protilátky selektivně váže antigen na povrchu rakovinné buňky, například rakovinné buňky v pevném nádoru a zvláště pak velkém pevném nádoru větším než přibližně 100 mm3, pak je protinádorová aktivita tohoto imunokonjugátu lokalizována do blízkosti této buňky. Jestliže například složka imunokonjugátu odvozená z protilátky selektivně váže antigen na povrchu buňky infikované virem, například buňky infikované virem lidské imunitní nedostatečnosti (HIV), pak je antivirální aktivita tohoto imunokonjugátu lokalizována do blízkosti této buňky.
Slovní spojení vazebné místo odvozené z protilátky, vazebné místo (odvozené z protilátky), složka imunokonjugátu odvozená z protilátky označují alespoň část těžkého řetězce·imunoglobulinu, například variabilní oblast imunoglobulinu schopnou vazby na zvolený typ buněk. Vazebné místo odvozené z protilátky ve výhodném provedení zahrnuje alespoň část konstantní oblasti imunoglobulinu včetně například domény CH1, domény CH2 a volitelně domény CH3. Těžký řetězec imunoglobulinu může být dále asociován, buď kovalentně nebo nekovalentně, s lehkým řetězcem imunoglobulinu zahrnujícím například variabilní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce a volitelně konstantní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce. Předpokládá se tedy, že vazebné místo odvozené z protilátky může zahrnovat intaktní protilátku nebo fragment této protilátky schopné vazby na zvolený typ buněk.
Složka imunokonjugátu odvozená z protilátky může být k cytokinu připojena množstvím způsobů odborníkům v současnosti známých. Ve výhodném provedení je ve fúzním proteinu vazebné místo odvozené z protilátky spojeno s cytokinem na11 • 44 ·4 44 4·
4444 444 4 * 4
4 44444 4 4
4444 444
444 4444 44 44 4» 444 příklad peptidovou vazbou. Jinou možností je připojení vazebného místa odvozeného z protilátky k cytokinu chemickou cestou využívající reaktivních skupin, jako například merkapto skupin přítomných v postranních řetězcích aminokyselin ve vazebném místě odvozeném z protilátky a cytokinu.
Termín cytokin zahrnuje jakýkoliv protein nebo peptid nebo jeho analog nebo funkční fragment, které jsou v organizmu savců schopny stimulovát nebo indukovat cytotoxickou imunitní odpověď vůči zvolenému typu buněk, například rakovinným buňkám nebo buňkám infikovaným virem. Do imunokonjugátů podle vynálezu může být tedy začleněno velké množství nejrůznějších cytokinu. Mezi výhodně používané cytokiny patří například tumor nekrotizující faktory, interleukiny, lymfokiny, faktory stimulující růst kolonií a interferony, včetně druhově odlišných variant a zkrácených analogů, schopné stimulovat nebo indukovat zmíněné cytotoxické imunitní reakce. Mezi výhodně používané tumor nekrotizující faktory patří TNFoí. Mezi výhodně používané lymfokiny patří například LT. Mezi výhodně používané faktory stimulující růst kolonií patří například GM-CSF a M-CSF. Mezi výhodně používané interleukiny patří například IL-2, IL-4, IL-5, IL-7, IL-12, IL-15 a IL-18. Mezi výhodně používané interferony patří například IFN-a, IFN-β a IFN-y.
Gen kódující požadovaný cytokin může být nakloňován de novo, získán z dostupného zdroje nebo syntetizován standardními postupy na základě známé sekvence nukleotidů. Jsou například známé sekvence DNA kódující LT (viz. například Nedwin a další, Nucleic Acid Res., 13:6361, 1985), jakož i sekvence kódující IL-2 (viz. například Taniguchi a další, Nátuře, 302:305 až 318, 1983), GM-CSF (viz. například Gasson a další, Science, 266:1339 až 1342, 1984) a TNFa (viz. například Nedwin a další, Nucleic Acid Res., 13:6361,
1985).
• «9 ·· 99 ··
9·· 9 9 9 9 · 9
9 9 9··· 9 9
9999 999 • 99 9999 99 99 99 999
Ve výhodném provedení vynálezu jsou zmíněnými imunokonjugáty rekombinantní fúzní proteiny produkované standardními rekombinantními technikami, tj. vytvořením konstruktu nukleové kyseliny kódujícího chimérický imunokonjugát. Konstrukce rekombinantních fúzních proteinů protilátka-cytokin byla popsána již dříve (viz. například Gillies a další,
Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992; Gillies a další, J. Immunol., 160:6Γ95 až 6203, 1998; a přihláška US 5650150). Ve výhodném provedení zahrnuje konstrukt kódující imunokonjugát podle vynálezu, v orientaci od 5' k 3', segment DNA kódující oblast variabilní domény těžkého imunoglobulinového řetězce, segment DNA kódující konstantní část těžkého imunoglobulinového řetězce a sekvenci kódující cytokin. Tento fúzní gen je sestaven v nebo vložen do expresívního vektoru použitelného k transfekci vhodných hostitelských buněk a v těchto buňkách exprimován. Takto připravený hybridní polypeptidový. řetězec je ve výhodném provedení kombinován s lehkých řetězcem imunoglobulinu například takovým způsobem, že variabilní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce (VH) a variabilní oblast lehkého imunoglobulinového řetězce (VL) vytvářejí jedinečné a kompletní místo pro vazbu zvoleného antigenů. Ve výhodném provedení jsou lehký a těžký imunoglobulinový řetězec spojeny kovalentně, například prostřednictvím intermolekulární disulfidické vazby. Dále mohou být kovalentně spojeny, například jednou nebo více intermolekulárními disulfidickými vazbami, dva imunoglobulinové těžké řetězce, kde buď jeden nebo oba jsou ve formě fúzního proteinu s cytokinem.
Obrázek 1 je schématických znázorněním imunokonjugátu (10). V tomto provedení vynálezu jsou molekuly cytokinu (2 a 4) připojeny peptidovou vazbou k C-koncům (6 a 8) oblastí CH3 (10 a 12) těžkých imunoglobulinových řetězců (14 a 16) . Oblasti VL (26 a 28) jsou znázorněny ve formě páru s oblast13· • ·« ·· ·· ·· ♦ A · · 9 9 9 9 9 9
9 9 9 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 99 99 9 mi VH (18 a 20) v typické konfiguraci imunoglobulinu IgG a na N-konci imunokonjugátu (10) tudíž vytvářejí dvě vazebná místa pro antigen (30 a 32). Na C-konci imunokonjugátu (10) se pak nalézají dvě místa vazby na receptor pro cytokin (40 a 42) . Je zřejmé, že obecně není nezbytné vytvářet páry imunokonjugátů jak “jsou'znázorněny na obrázku 1, ale postačující je připojit molekulu cytokinu pouze k jednomu ze dvou těžkých imunoglobulinových řetězců.
Imunokonjugáty podle vynálezu mohou být za chimérické považovány na základě dvou aspektů jejich struktury. Za prvé, imunokonjugát je označován jako chimérický, jestliže zahrnuje těžký imunoglobulinový řetězec specificky vážící antigen, připojený k danému cytokinu. Za druhé může být imunokonjugát podle vynálezu označen jako chimérický, jestliže zahrnuje variabilní imunoglobulinovou oblast (V) a konstantní imunoglobulinovou oblast (C), kde každá z těchto oblastí je odvozena z rozdílné protilátky a vzniklý protein je tudíž chimérickým proteinem V/C. Variabilní a konstantní oblasti mohou být například odvozeny z přirozeně se vyskytujících molekul protilátek izolovatelných z rozdílných živočišných druhů (viz. například přihláška US 4816567). Jako chimérické jsou rovněž označovány konstrukty, kde jedna nebo obě variabilní imunoglobulinové oblasti zahrnují sekvence FR a hypervariabilní oblasti (CDR) odvozené z rozdílných živočišných druhů. Takové konstrukty jsou například popsány v publikacích Jones a další, Nátuře, 321:522 až 525, 1986; Verhoyen a další, Science, 239:1534 až 1535, 1988; přihlášky US 5225539 a 5585089. Sekvence variabilních oblastí mohou být rovněž získány screeningem knihoven, například knihoven vystavených na povrchu fágů. Tímto způsobem mohou být získány sekvence variabilních oblastí, které se na zvolený antigen vážou s požadovanou afinitou. Způsoby přípravy a screeningu knihoven vystavených na povrchu fágů jsou po14 • ·« 4« 44 44
4 4 4 444 444 • 4 44444 *4
4444 444
444 4444 44 44 44 444 psány například v publikacích Huse a další, Science,
246:1275 až 1281, 1989; a Kang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:11120 až 11123, 1991.
Oblasti konstantních domén těžkých imunoglobulinových řetězců v imunokonjugátech mohou být odvozeny z jakékoliv z pěti imunoglobulinových tříd označovaných jako IgA (Iga),
IgD (IgS), IgE (Ige), IgG (Igy) a IgM (Igp). Ve výhodném provedení jsou nicméně využívány konstantní oblasti těžkých řetězců imunoglobulinů typu IgG. Vynález dále předpokládá, že těžké řetězce imunoglobulinů mohou být odvozeny z jakékoliv podtřídy IgG označovaných jako IgGl, IgG2, IgG3 nebo IgG4. Je známo, že každá konstantní oblast těžkého imunoglobulinového řetězce se skládá ze čtyř nebo pěti domén.
Tyto domény jsou označovány následovně: CHl-pantová oblastCH2-CH3-(-CH4). Doména CH4 se vyskytuje u IgM a imunoglobuliny typu IgM nemají pantovou oblast. Sekvence DNA jednotlivých domén.těžkých řetězců vykazují zkříženou homologii mezi jednotlivými třídami imunoglobulinů. Doména CH2 imunoglobulinu IgG je například homologní s doménou CH2 imunoglobulinů IgA a IgD a s doménou CH3 imunoglobulinů IgM a IgE. Konstantní domény lehkých imunoglobulinových řetězců mohou být typu kappa (k) nebo lambda (λ). Sekvence a sekvenční homologie těchto oblastí imunoglobulinů jsou v současnosti známé (viz. například Kabat a další, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, třetí vydání 1983, čtvrté vydání 1987; Huck a další, Nucleic Acid Res., 14:1779 až 1789,
1986).
Ve výhodných provedeních vynálezu jsou variabilní oblasti odvozeny z protilátek specificky interagujících se zvoleným antigenem na povrchu buněk (nějakým antigenem asociovaným s abnormální buňkou jako například rakovinnou buňkou nebo buňkou infikovanou virem) a konstantní oblasti zahrnu15 • · · · «·· 4 4 · 4
4 4 4 444 4 4 4
444 44 444 4 4
4444 444
444 44*4 44 4* 44 444 jí domény CH1, CH2 (a volitelně CH3) odvozené z protilátek, které jsou totožné nebo odlišné od protilátky, jenž je zdrojem použité variabilní oblasti. Ve výhodném provedení vynálezu jsou části imunokonjugátu odvozené z protilátek v organizmu příjemce neimunogenní nebo pouze mírně imunogenní. Část imunokonjugátu odvozená z protilátky je tudíž, jeli to možné, získána ze stejného živočišného druhu k jakému náleží příjemce. Budou-li například imunokonjugáty podávány lidem, pak oblast konstantních domén je ve výhodném provedení lidského původu (viz. například přihláška US 4816567). Je-li variabilní oblast imunoglobulinu odvozena z jiného druhu než ke kterému náleží recipient, například jsou-li sekvence variabilní oblasti myšího původu a recipientem je člověk, pak ve výhodném provedení zahrnují tyto variabilní sekvence lidské FR sekvence a mezi nimi vložené myší CDR sekvence; tímto způsobem je připravena chimérická variabilní oblast, která specificky váže zvolený antigen a současně je minimalizována imunoreaktivita v organizmu příjemce. Návrh a syntéza takových chimérických variabilních oblastí jsou popsány v publikacích Jones a další, Nátuře, 321:522 až 525, 1986; Verhoyen a další, Science, 239:1534 až 1535, 1988; přihlášky US 5225539 a 5585089. Klonování a exprese fúzního proteinu humanizovaná protilátka-cytokin (fúzní protein KS-1/4 anti-EpCAM prdtilátka-IL-12) a schopnost tohoto fúzního proteinu ničit metastázy karcinomu tlustého střeva jsou popsány v publikaci Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998).
Gen kódující příslušný cytokin je ve stejném čtecím rámci připojen, buď přímo nebo prostřednictvím linkeru, například prostřednictvím DNA kódující linker (Gly4-Ser)3, ke 3' konci genu kódujícího konstantní oblast imunoglobulinu (například exon CH2 nebo CH3). V určitých provedeních vynálezu může zmíněný linker zahrnovat nukleotidovou sekvenci kódu16• » * ··· jící proteolyticky štěpitelné místo. Toto místo, je-li umístěno mezi konstantní oblast imunoglobulinu a cytokin, může být navrženo tak, bylo umožněno proteolytické uvolnění daného cytokinů v cílovém místě. Je například dobře známo, že v místech, která jsou přístupná pro proteázy, je polypeptidový řetězec štěpen za argininem nebo lysinem prostřednictvím plasminu a trypsinu. V současnosti je známo množství jiných místně specifických proteáz a aminokyselinových sekvencí těmito proteázami štěpených. Výhodně používaná místa proteolytického štěpení a výhodně používané enzymy štěpící polypeptidové řetězce v těchto místech jsou popsány v přihláškách US 5541087 a 5726044.
Konstrukt nukleové kyseliny může volitelně zahrnovat endogenní promotor a enhancer pro gen kódující variabilní oblast, kde tyto dvě složky regulují expresi chimérického polypeptidového řetězce. Geny kódující variabilní oblast mohou být například získány ve formě fragmentů DNA zahrnujících signální peptid, gen VJ (funkčně přeskupené variabilní oblasti (V) a spojující segment (J)) pro lehký řetězec nebo gen VDJ pro těžký řetězec a endogenní promotor a enhancer pro tyto geny. Gen kódující variabilní oblast může být alternativně získán bez endogenních regulačních prvků a použit v expresívním vektoru, který tyto regulační prvky obsahuje.
Geny kódující variabilní oblasti mohou být z buněk produkujících požadované protilátky získány standardními postupy klonování DNA.
S využitím vhodných DNA sond, jako například segmentů DNA obsahujících sekvence oblasti J a sekvence dále po směru transkripce, může být proveden screening genomové knihovny za účelem nalezení specifických, funkčně přeskupených variabilních oblastí. Identifikace a potvrzení správnosti nalezených klonů může být provedeno sekvenací klono17 *9 9
99 99 99 9
999 9999
999 999 9 9 9
999 99 999 9 9
9999 999
999 9999 99 99 9· 99» váných genů a srovnáním získané sekvence s odpovídající sekvencí nezkrácené, řádně sestřižené mRNA.
Cíleným antigenem může být antigen na povrchu nádorových nebo rakovinných buněk, buněk infikovaných virem nebo jiných abnormálních buněk. Geny kódující vhodné variabilní oblasti mohou být obecně získány z lymfoidních buněčných linií produkujících imunoglobuliny. Standardními postupy hybridizace somatických buněk v současnosti známými (viz. například přihláška US 4196265) mohou být například vytvořeny buněčné linie hybridomů produkující imunoglobuliny specificky namířené proti antigenům asociovaným s nádory nebo proti virovým antigenům. Tyto buněčné linie produkující imunoglobuliny jsou zdrojem genů pro variabilní oblasti. Zmíněné geny se zde nacházejí ve funkčně přeskupené formě. Geny kódující variabilní oblasti budou obvykle myšího původu, protože myší systém umožňuje produkci velkého množství nej různějších imunoglobulinů s požadovanou specifitou. Sekvence variabilních oblastí mohou být rovněž získány screeningem knihoven, například knihoven vystavených na povrchu fágů. Tímto způsobem mohou být získány variabilní oblasti, které zvolený antigen vážou s požadovanou afinitou. Způsoby přípravy a screeningu knihoven vystavených na povrchu fágů jsou popsány například v publikacích Huse a další, Science, 246:1275 až 1281, 1989; a Kan’g a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:11120 až 11123, 1991.
Fragment DNA kódující funkčně aktivní variabilní oblast je připojen k fragmentu DNA obsahující gen kódující požadovanou konstantní oblast (nebo její část). Konstantní oblasti’ imunoglobulinů (lehký a těžký řetězec) mohou být z buněk produkujících protilátky získány standardními klonovacími postupy. Byly klonovány geny pro dvě třídy lidských lehkých řetězců (k a λ) a pro pět tříd lidských těžkých řetězců (a,
18·.
• ·· ·· ··
• « • • · •
• · • • ··♦ • •
• · • • Φ • •
• Φ ···· ·· ·· • Φ 4
δ, ε, γ a μ) . Konstantní oblasti lidského původu jsou tedy z těchto klonů snadno dostupné.
Fúzovaný gen kódující hybridní těžký řetězec imunoglobulinu je sestaven v nebo vložen do expresívního vektoru vhodného pro transfekci hostitelských buněk. Zavedení zmíněného' genového konstruktu do vektoru může být provedeno standardními postupy. Chimérický těžký imunoglobulinový řetězec může být v dané buňce bxprimován společně s příslušným lehkým imunoglobulinovým řetězcem a tak může být současně exprimována a sestavena celá molekula imunoglobulinu. Za tímto účelem mohou být konstrukty lehkého a těžkého řetězce umístěny na stejném vektoru nebo na dvou samostatných vektorech.
Hostitelskými buněčnými liniemi jsou obvykle lymfoidní buňky. Ve výhodném provedení je hostitelskou buňkou myelom (nebo hybridom). Myelomy umožňují syntézu, sestavení (assembling) a sekreci imunoglobulinů kódovaných transfekovanými geny a rovněž umožňují glykosylaci těchto proteinů. Zvláště výhodně používanými hostitelskými buňkami jsou myelomy Sp2/0, které neprodukují endogenní imunoglobuliny, a buňky myšího myelomu NS/0. Po transfekci produkují tyto buňky pouze imunoglobuliny kódované transfekovanými geny. Transfekované myelomy mohou být kultivovány in vitro nebo v peritoneu myší. Z peritonea mohu být sekretované imunokonjugáty získány z ascitické tekutiny. Jako hostitelské buňky mohou být použity i jiné lymfoidní buňky jako například Blymfocyty.
Existuje několik způsobů transfekce lymfoidních buněk vektory obsahujícími konstrukty nukleových kyselin kódujícími chimérické imunoglobulinové řetězce. Takové vektory mohou být do lymfoidních buněk zavedeny například fúzí sféroblastů (viz. například Gillies a další, Biotechnol.,
7:798 až 804, 1989). Dalšími použitelnými způsoby jsou
elektroporace nebo koprecipitace s fosforečnanem vápenatým (viz. například Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
Další způsoby použitelné pro produkci imunokonjugátů podle vynálezu zahrnují přípravu sekvencí RNA kódujících příslušný konstrukt a jejich translaci ve vhodném expresívním systému in vitro nebo invivo. Předpokládá se, že rekombinantní techniky pro syntézu genů kódujících fúzní proteiny protilátka-cytokin, pro zavádění takových genů do hostitelských buněk a jejich expresi v těchto buňkách a pro izolaci takto připravených fúzních proteinů jsou v současnosti dobře známé. Podrobné protokoly jsou uvedeny například v publikaci Sambrook a další, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Je zřejmé, že s využitím velkého množství postupů odborníkům známých mohou být připraveny imunokonjugáty, v nichž jsou jednotlivé části spojeny chemickou cestou. Protilátka nebo fragment protilátky mohou být například chemickou cestou připojeny k danému cytokinu. Při tomto způsobu mohou být využity chemicky reaktivní postranní řetězce aminokyselin v protilátce, fragmentu protilátky a cytokinu. Tyto postranní řetězce aminokyselin mohou být kovalentně spojeny například disulfidickou vazbou nebo prostřednictvím homonebo hetero-bifunkčních zesíťovadel, včetně například Nsukcinimidyl 3(-2-pyridinyldithio)propionátu, esteru mmaleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinátu a 1,4-di-[3'(2'pyřidylthio)propionamido]butanu. Všechna tato činidla jsou komerčně dostupná například od společnosti Pierce, Rockford, IL.
Nádorové buňky sekretují velké množství různých imunosupresivních faktorů. Mezi tyto faktory patří prostaglandiny
20'
(PG), například PGE2, který je známým induktorem IL-10 (supresor buněčně zprostředkované imunitní reakce) a silným inhibitorem IL-12 (stimulátor buněčně zprostředkované imunitní reakce). Prostaglandiny jsou produkovány z kyseliny arachidonové činností cyklooxygenázy. Jsou známy dvě formy tohoto enzymu označované jako COX-1 a COX-2.' COX-1 je exprimována mnoha typy buněk, zatímco exprese COX-2 je indukována nej různějšími podnětý', včetně například při stimulaci imunitního systému. Mnoho přípravků tišících bolest, včetně aspirinu a nesteroidních protizánětlivých léčiv (NSAIDS), inhibují obě formy zmíněného enzymu. Inhibice COX-2 je spojována s příznivými účinky protizánětlivých sloučenin, zatímco inhibice COX-1 bývá spojována s vedlejšími nežádoucími účinky na gastrointestinální trakt. V nedávné době začaly být používány inhibitory selektivní vůči COX-2 a tyto jsou příslibem možné inhibice syntézy prostaglandinů bez současné gastrointestinální toxicity. Tyto inhibitory specifické vůči COX-2 jsou dále užitečné při vymezení role COX-2 při produkci imunosupresivních prostaglandinů nádorovými buňkami. Jiné studie naznačují, že exprese COX-2 je indukována při proliferaci a/nebo přežívání rakovinných buněk endotheliálního původu.
Skutečnost, že produkce prostaglandinů je důsledkem zánětlivé reakce a současně, že prostaglandiny působí jako imunosupresiva, ukazuje na možný zpětnovazebný mechanizmus při potlačení aktivity imunitního systému v konečné fázi imunitní odpovědi. V případě nádorových buněk je tento koncový produkt-inhibitor produkován v nepřítomnosti zánětlivé reakce a tím je záměrně potlačován imunitní systém hostitele. Předpokládá se tedy, že v těsném sousedství nádorů může být obtížné prostřednictvím fúzního proteinu protilátkacytokin indukovat odpověď T-buněk, a to vzhledem k velkému
množství inhibitorů přítomných před stimulací imunitního systému cytokiny.
Tento vynález je zčásti založen na objevu, že protinádorová fúzních proteinů protilátka-cytokin může být značně posílena současným podáním inhibitoru syntézy prostaglandinů. Předpokládá se, ze inhibitory syntézy prostaglandinů snižují rozsah suprese imunitního systému indukované nádorem a tím umožňují účinnější aktivaci buněčné imunitní odpovědi prostřednictvím fúzních proteinů protilátka-cytokin.
Termín inhibitor syntézy prostaglandinů označuje jakoukoliv molekulu, které potlačuje nebo inhibuje produkci nebo aktivitu cyklooxygenázy nebo je schopna účinkovat jako inhibitor angiogeneze.
Mezi inhibitory syntézy prostaglandinů patří například inhibitory cyklooxygenázy, zvláště pak inhibitory specificky interagující s formou COX-2. Příkladem neselektivních inhibitorů cyklooxygenázy jsou indomethacin, sulindac, ibuprofen a aspirin. Příkladem látek selektivně inhibujících COX-2 je několik klinicky testovaných sloučenin jako například Celecoxib (Searle), MK-966 (Merck) a meloxicam (Boehringer Ingelheim). Tato druhá třída inhibitorů je ve vynálezu výhodně používána, jelikož nevykazuje nežádoucí vedlejší účinky na gastrointestinální trakt a je tudíž umožněno podávání vyšších dávek a tím účinnějšího dosažení potlačení syntézy prostaglandinů nádorovými buňkami. Bylo rovněž prokázáno, že indukce exprese COX-2 epidermálním růstovým faktorem a estery forbolu je inhibována retinoidy (viz. například Mestre a další, Cancer Res., 57:2890 až 2895, 1997) .
Předpokládá se, že k identifikaci inhibitorů cyklooxygenázy využitelných při provádění tohoto vynálezu mohou být použita nej různějších stanovení, například stanovení využívající izolované enzymy, stanovení v buněčných kulturách
nebo stanovení sledující intenzitu protizánětlivé reakce (viz. například přihlášky US 5886178 a 5543297). Aktivita domnělých inhibitorů cyklooxygenázy může být například testována s využitím částečně purifikovaných COX-I a COX-II, připravených postupem uvedeným v publikaci Barnett a další, Bióčhim. Bióphys. Acta,; 1209:130 až 139, 1994 a použitých ve stanovení popsaném v přihlášce US 5886178. Stručně řečeno, COX-I a COX-II jsou zředěny v pufru obsahujícím 10% glycerol, rekonstituovány inkubací s 2mM fenolem po dobu 5 minut a následnou inkubací s 1 μΜ hematinem po dobu dalších 5 minut. Reakce je zahájena přídavkem kyseliny arachidonové značené 14C. Reakce je ukončena přídavkem 2M HC1 a produkty jsou rozděleny na koloně Ci8 Sep-Pak (J.T.Baker, Phillipsburg, NJ). Produkty oxygenační reakce jsou eluovány směsí acetonitril/voda/kyselina octová (50:50:0,1 (v/v)) a radioaktivita měřena čítačem pulzů.
Mezi inhibitory syntézy prostaglandinů rovněž patří inhibitory angiogeneze v nádorech. Tento proces je těsně spjat s expresí COX-2 a syntézou prostaglandinů (viz. například Majima a další,' Jpn. J. Pharmacol., 75:105 až 114, 1997) . Termín inhibitor angiogeneze označuje jakoukoliv molekulu, které potlačuje nebo inhibuje tvorbu nových krevních kapilár v organizmu savců. Při léčbě rakoviny inhibitory angiogeneze potlačují nebo inhibují tvorbu nových krevních kapilár v nebo na nádorech, výhodně pak v nebo na pevných nádorech. Výhodně využitelné inhibitory angiogeneze mohou být identifikovány pomocí nej různějších stanovení v současnosti známých a používaných. Mezi taková stanovení patří například sledování proliferace bovinních endotheliálních buněk tvořících kapiláry, stanovení na kuřecích chorioalantoických membránách (CAM) nebo stanovení na myší rohovce. V současnosti je nicméně s výhodou používáno stanovení CAM (viz. například 0'Reilly a další, Cell, 79:315 až
23’
328, 1994; a O'Reilly a další, Cell, 88:277 až 285, 1997). Stručně řečeno, z oplodněných bílých vajec (3 dny po oplození) jsou vyjmuta embrya spolu s nepoškozených žloutkem a tato jsou umístěna na Petriho misky. Po třídenní inkubaci při 37°C v atmosféře 3% C02 je na chorioalantoicku membránu každého z embryí umístěn disk z methylcelulóžy obsahující předpokládaný inhibitor angiogeneze. Po přibližně 48 hodinové inkubaci jsou chorioalantoické membrány pozorovány pod mikroskopem a jsou zde sledovány známky inhibice angiogeneze.
V současnosti je známo a dokonale popsáno velké množství inhibitorů angiogeneze. Příkladem inhibitorů angiogeneze použitelných při praktickém využití vynálezu jsou proteinové/peptidové inhibitory angiogeneze jako například: angiostatin, který je proteolytickým fragmentem plasminogenu (O'Reilly a další, Cell, 79:315 až 328, 1994; a přihlášky US 5733876, 5837682 a 5885795); endostatin, který je proteolytickým fragmentem kolagenu XVIII (O'Reilly a další,
Cell, 88:277 až 285, 1997; a přihláška US 5854205); peptidy obsahující tripeptidovou sekvenci RGD, které jsou schopné se vázat na integrin ανβ3 (Brooks a další, Cell, 79:1157 až 1164, 1994); a určité protilátky, jejich antigen-vazebné fragmenty a peptidy, které interagují s integrinem ανβ3 exprimovaným na epitheliálních buňkách tvořících vaskulaturu nádorů (Brooks a další, viz. výše), nebo které interagují s receptorem pro EGF (Ciardello a další, J. Nati. Cancer Inst., 88:1770 až 1776, 1996). Příkladem jiných inhibitorů angiogeneze jsou: inhibitory COX-2 (Masferrer a další,
Proč. Amer. Assoc. Cancer Res., 39:271, 1998); fumagilin a jeho analogy jako například AGM-1470 (Ingber a další, Nátuře, 348:555 až 557, 1990); a jiné malé molekuly jako například thalidomid (D'Amanto a další, Proč. Nati. Acad. Sci.
24• ·» · 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 99 99 ·
USA, 91:4082 až 4085, 1994). Ve výhodných provedeních jsou však používány endostatin a angiostatin.
Antiangiogenní aktivita byla rovněž popsána u několika cytokinů včetně jejich druhových variant a zkrácených analogů. Tyto sloučeniny jsou tedy rovněž použitelné při praktickém provedení vynálezu. Příkladem jsou IL-12, který účinkuje mechanizmem závislým na IFN-γ (Voest a další, J.
Nati. Canc. Inst., 87:581 až''586, 1995); a IFN-γ, který indukuje tvorbu chemokinu (IP-10) s angiostatickou aktivitou (Arenberg a další, J. Exp. Med., 184:981 až 992, 1996). IL12, IFN-γ a IP-10 tedy reprezentují inhibitory angiogeneze na různých místech stejné inhibiční dráhy. Bylo prokázáno, že i další interferony, zvláště pak IFN-α, vykazují antiangiogenní aktivitu a to buď samostatně nebo v kombinaci s jinými inhibitory (Brém a další, J. Pediatr. Surg., 28:1253 až 1257, 1993). Interferony IFN-ft, IFN-β a IFN-γ vykazují imunomodulační účinky a rovněž účinky antiangiogenní, kde tyto účinky jsou nezávislé na jejich antivirálním působení. GM-CSF je dalším inhibitorem angiogeneze a inhibiční vliv tohoto faktoru je zprostředkován indukcí produkce angiostatinu (Kumar a další, Proč. Amer. Assoc. Cancer Res.,
39:271, 1998).
Část imunokonjugátu odvozená z protilátky se specificky váže na zvolený antigen, cytokin se specificky váže na receptor pro cytokin nebo inhibitor syntézy prostaglandinů se specificky váže na receptor pro tento inhibitor, jestliže vazebná afinita pro takový antigen nebo receptor je vyšší než 105 M”1 nebo ve výhodném provedení vyšší než 107 M1. Termíny angiostatin, endostatin, TNF, IL, GM-CSF, M-CSF, LT a IFN neoznačují pouze intaktní proteiny, ale rovněž jejich biologicky aktivní fragmenty a/nebo analogy. Jako biologicky aktivní fragmenty jsou označovány části intaktního proteinu, které vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení • ·
alespoň 70% a nejvýhodněji pak přinejmenším 90% biologické aktivity příslušných intaktních proteinů. Jako analogy jsou v přihlášce označovány druhové nebo alelické varianty intaktních proteinů nebo proteiny s aminokyselinovými záměnami, inzercemi nebo delecemi, které vykazují alespoň 30%, ve výhodném provedení alespoň 70% '?a 'hejvýhódněji' pak přinejmenším 90% biologické aktivity příslušných intaktních proteinů.
Inhibitory syntézy prostaglandinů mohou být podávány spolu s imunokonjugátem nebo jsou aplikovány samostatně jinými způsoby. Přípravky podle vynálezu mohou být aplikovány jakýmkoliv způsobem slučitelných s příslušnou molekulou. Je-li to tedy vhodné, podání může být orální nebo parenterální, včetně intravenózního a intraperitoneálního způsobu aplikace.
Přípravky podle vynálezu mohou být živočichům aplikovány jakýmkoliv vhodným způsobem, přímo (tj . lokálně jako například injekcí, implantátem nebo lokální aplikací na postiženou tkáň) nebo systemicky (například parenterálně nebo orálně). Je-li přípravek aplikován parenterálně, například intravenózně, subkutánně, do oka, intraperitoneálně, intramuskulárně, na tkáň tváře, rektálně, vaginálně, intraorbitálně, intracerebrálně, intrakraniálně, intraspinálně, intravetrikulárně, intrathekálně, intracisternálně, intrakapsulárně, intranazálně nebo prostřednictvím aerosolu, pak ve výhodném provedení část tohoto přípravku zahrnuje vodnou suspenzi nebo roztok nebo suspenzi nebo roztok v jiné fyziologicky přijatelné kapalině. Použitý nosič nebo vehikulum jsou tudíž fyziologicky přijatelné, takže s výjimkou umožnění aplikace daného přípravku do organizmu pacienta, tyto složky žádným nežádoucím způsobem neovlivňují rovnováhu elektrolytů a/nebo objem v organizmu pacienta. Kapalné médium pro použitou sloučeninu může tudíž například zahrnovat • *» ·· ·♦ • φ · · · * · • · φ · · · · • · · · · · ···«··· · · ·· fyziologický roztok (například 9,85% vodný roztok NaCl,
0,15 M, pH 7,0 až 7,4).
Ve výhodném provedení je na jednu aplikaci použito množství imunokon jugátu v intervalu 0,1 mg/m2 až 100 mg/m2, výhodněji pak 1 mg/m2 až 20 mg/m2 a nej výhodněji 2 mg/m2 až 6 mg/m2. Výhodně používané dávky inhibitorů syntézy prostaglandinů budou obecně záviset na typu použitého inhibitoru syntézy prostaglandinu. Optimální dávkování může být nicméně stanoveno standardními experimenty. Podávání imunokonjugátu a/nebo inhibitoru syntézy prostaglandinů může být uskutečňováno injekcemi v pravidelných intervalech nebo kontinuální intravenózní nebo intraperitoneální aplikací z externího (například z intravenózního vaku) nebo interního (například z biologicky degradovatelného implantátu) zdroje. Imunokonjugát podle vynálezu může být rovněž aplikován spolu s větším množství rozdílných inhibitorů syntézy prostaglandinů. Optimální kombinace imunokonjugátů a inhibitorů syntézy prostaglandinů, způsoby aplikace a dávkování mohou být stanoveny na základě výsledků standardních experimentů v současnosti známých.
Účinnost kombinované terapie využívající fúzní proteiny protilátka-cytokin a inhibitory syntézy prostaglandinů na imunitní odpověď může být stanovena množstvím nej různějších způsobů. Ke zjištění, které inhibitory syntézy prostaglandinů, nebo které kombinace inhibitorů syntézy prostaglandinů jsou nejúčinnější v kombinaci s daným imunokonjugátem, například fúzním proteinem protilátka-cytokin (například fúzním proteinem protilátka-IL2), při indukci destrukce nádorů imunitním systémem, mohou odborníci využít například živočišný model popsaný v příkladu 1 nebo jiné živočišné modely. Inhibitor syntézy prostaglandinů nebo směs inhibitorů syntézy prostaglandinů mohou být podávány před nebo spolu s aplikací imunokonjugátu a vliv této terapie na ná27
dor může být snadno vyhodnocován sledováním objemu takového nádoru. Jakmile budou identifikovány nové inhibitory syntézy prostaglandinů, pak s využitím postupů popsaných v této přihlášce budou odborníci schopni odhadnout potenciál těchto nově identifikovaných inhibitorů zesílit protinádorovou aktivitu použitých fúzních proteinů protilátka-cytokin.
Alternativně mohou být nádory po ukončení terapie vyjmuty, rozřezány a obarveny standardními histologickými postupy nebo specifickými imunohistologickými sloučeninami. Tak může být stanoven vliv kombinované terapie na imunitní odpověď. Například jednoduché barvení hematoxylinem a eosinem může odhalit rozdíly v infiltraci lymfocytů do pevných nádorů. Intenzita této infiltrace je pak indikátorem buněčné imunitní odpovědi. Imunologické barvení řezů s využitím protilátek specificky interagujících s jednotlivými typy buněk imunitního systému může navíc odhalit charakter takto indukované imunitní reakce. Ke stanovení typu imunitní odpovědi zprostředkované imunokonjugáty podle vynálezu mohou být například využity protilátky, které se váží na CD45 (obecný markér leukocytů) , CD4 a CD8 (identifikace podtříd T-buněk) a NKl.1 (markér na NK-buňkách).
Typ imunitní odpovědi zprostředkované imunokonjugáty může být alternativně stanoven postupy využívajícími odstranění určitých typů buněk. Tyto metody jsou popsány například v publikaci Lodge a další, Blood, 91:1706 až 1715,
1998. Příkladem protilátek využívaných k odstranění jednotlivých typů buněk jsou protilátky reagující s CD4 a CD8 (markéry T-buněk), jakož i protilátky, které specificky vážou NK1.1 a asialoGM (markéry NK-buněk). Stručně řečeno, tyto protilátky jsou, před započetím léčby využívající fúzní protein protilátka-cytokin, ve vysoké dávce (například v dávce přibližně 0,5 mg/myš) injikovány do organizmu pokusných živočichů a tato aplikace pokračuje v týdenních inter28 ·• ·· 4 4 4 · · · • ••4 4 · 4 4·· valech až do skončení experimentu. Tímto způsobem mohou být identifikovány typy buněk nezbytné k indukci pozorované imunitní odpovědi v organizmu savců.
Jiným přístupem je srovnání cytotoxické aktivity splenocytů izolovaných z živočichů podstoupivších kombinovanou terapii s cytotoxickou aktivitou splenocytů izolovánýchz jiných skupin živočichů. Kultury splenocytů mohou být připraveny mechanickou dezintegrací sterilně odebraných slezin standardními způsoby. Tyto postupy jsou popsány ve většině imunologických laboratorních manuálů (viz. například Coligan a další, Current Protocols ίή Immunology, Jonh Wiley and Sons, lne., 1998). Takto připravené buňky jsou následně kultivovány ve vhodném kultivačním médiu (například médium DMEM, Gibco) obsahujícím sérum, antibiotika a nízké koncentrace IL-2 (přibližně 10 U/ml). Pro srovnání aktivit NKbuněk je například optimální kultivovat tyto buňky po dobu 3 dní, zatímco pro T-buňky je obvyklá optimální doba kultivace 5 dnů. Cytotoxická aktivita může být měřena s využitím cílových nádorových buněk (například buněk LLC) radioaktivně značených izotopem 51Cr po dobu 30 minut. Po odstranění nadbytku radioaktivní značky jsou značené buňky smíchány s různými koncentracemi kultivovaných splenocytů a inkubace probíhá 4 hodiny. Po ukončení inkubace je na detektoru záření gama stanoveno množství izotopu 51Cr uvolněného z buněk a tato hodnota je použita pro kvantifikaci lýze buněk indukované použitými buňkami imunitního systému. Cytotoxická aktivita T-lymfocytů (CTL) je obvykle stanovována tímto způsobem.
Příklady provedení vynálezu
Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které ovšem nelimitují rozsah vynálezu.
29, • · · • · · 9
9
9
999 9999
Příklad 1
Živočišný model
Za účelem sledování vlivu kombinované terapie fúzními proteiny protilátka-cytokin spolu s inhibitory syntézy prostaglandinů pa indukci účinné protinádorové imunitní odpovědi byl připraven myší model rakoviny. Fúzní proteiny protilátka-cytokin, používané v'-následuj ících příkladech, se vážou na EpCAM, což je antigen lidských nádorů exprimovaný na většině nádorů odvozených z epitheliálních buněk (viz. Perez a Walker, J. Immunol., 142:3'662 až 3667, 1989). Aby bylo možné testovat účinnost terapie na imunokompetentním myším modelu, bylo nezbytné exprimovat tento lidský antigen na povrchu myší nádorové buňky, která je syngenní s myším hostitelem. Pro tento účel byly zvoleny buňky Lewisova karcinomu plic (LLC), což je dobře prozkoumaná buněčná linie myších nádorových buněk. Je známo, že tato buněčnálinie produkuje velká množství prostaglandinů a její růst je částečně inhibován inhibitory cyklooxygenázy jako například endomethacinem (Macci a další, J. Biol. Resp. Mod., 7:568 až 580). Výsledkem bylo, že na povrchu buněk LLC byl exprimován antigen lidských nádorů EpCAM.
Buňky LLC byly transfekovány expresívním plazmidem obsahujícím cDNA kódující lidský antigen EpCAM (rozpoznávaný protilátkou KS-1/4, popsáno v publikaci Vurki a další, Cancer. Res., 44:681, 1984), která je pod kontrolou časného promotoru cytomegaloviru (CMV; Immunogen, Carlsbad, CA) . Antigen KS (KSA neboli EpCAM) byl nakloňován PCR přístupem z cDNA připravené z buněk lidského karcinomu prostaty (LNCaP) .
Použitý přímý primer měl oligonukleotidovou sekvenci 5'TCTAGAGCAGCATGGCGCCCCCGC (SEK. ID. Č.: 1), kde ATG je kodon pro iniciaci translace, a jako reverzní primer byl pou30 • A A A A ·· · · • A A A A ♦ ♦ * · A
A · A A A A A A A • A A* ·· A · A A • A · · A A · A
A A A A· A A A A A A A A A žit oligonukleotid o sekvenci 5'CTCGAGTTATGCATTGAGTTCCCT (SEK. ID. Č.: 2) , kde TTA je antikodon terminátoru translace. cDNA kódující EpCAM byla zaklonována do retrovirového vektoru pLNCS (Clontech, Palo Alto, CA) a transfekce byla provedena standardním postupem (Ausubel a další, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons). Stručně řečeno, pakovací buněčná linie PA317 (ATCC CRL 9078) byla transfekována plazmidempLNCX-EpCAM metodou využívající koprecipitace s fosforečnanem vápenatým a kondiciované médium obsahující virové částice bylo použito k transfekci buněk LLC.
Za účelem selekce stabilních klonů bylo k transfekovaným buňkám přidáno G418 (Sigma Chemical Co.) v koncentraci 1 mg/ml. Klony exprimující lidský antigen EpCAM (LLC-Ep) byly identifikovány imunoznačením a analýzou FACS (fluorescence activated cell sorting) .
Jak je patrno z obrázku 1, klony buněk LLC-Ep značené nejprve fúzním proteinem hu-KS-IL2 (viz. příklad 2) a následně pak protilátkou specificky interagující s lidskými Fc značenou fluorescein isothiokyanátem (FITC) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) vykazovaly stejnoměrnou hladinu exprese lidského EpCAM. Hladina exprese EpCAM u těchto klonů byla výrazně vyšší než u klonů značených pouze protilátkou (značenou FITC) specificky interagující s lidskými Fc.
Aby bylo možné určit, zda exprese lidského povrchového proteinu nezvýšila imunogenicitu búběk LLC-EP, byly myši C57B1/6 subkutánně injikovány různým počtem těchto buněk.
Po injekci 5 x 105 buněk· byl u všech myší pozorován vznik rychle rostoucích nádorů s přibližně stejnými kinetikami růstu pozorovanými při použití rodičovské buněčné linie LLC. Všechna umírající pokusná zvířata byla usmrcena, aby bylo zamezeno jejich zbytečnému trápení.
• 44 44 44 ·· 4
4 4 4 4 44 ♦ » ··
4 4 4 444 4.4 · • 4 ·»····· 4 4
4444 444
444 4444 44 44 ·· 444
Příklad 2
Příprava fúzních proteinů protilátka-cytokin nebo protilátka-inhibitor angiogeneze
V následujících příkladech je popsáno množství fúzních proteinů protilátka-cytokin. Přesněji řečeno, v příkladu 3 je popsáno použití fúzních proteinů humanizovaný KS-myší y2a-myší IL2 (ΗυΚ5-ΐΐΐυγ23-πηιΙ1ι2) a humanizovaný KS-myší y2amyší IL12 (huKS-muy2a-muIL12) . Příklad 4 popisuje použití fúzního proteinu humanizovaný KS-lidský y4-lidský IL2 (huKS-huy4-huIL2) spolu s fúzním proteinem myší Fc-myší endostatin (muFc-muEndo). Příklad 5 popisuje použití fúzních proteinů humanizovaný KS-lidský yl-lidský IL2 (huKS-huylhuIL2) spolu s indomethacinem. Konstrukce těchto fúzním proteinů je popsána v následujícím textu.
huKS-huyl-huIL2
Gen kódující fúzní protein huKS-huyl-huIL2 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v publikacích Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998; a přihláška US 5650150. Stručně řečeno, humanizované variabilní oblasti myší protilátky KS 1/4 (Varki a další, Cancer Res., 44:681 až 687, 1984) byly vytvořeny postupy popsanými v publikaci1· Jones a další, Nátuře,
321:522 až 525, 1986. Tyto postupy zahrnovaly vložení hypervariabilních smyček (CDR) z variabilních oblastí KS 1/4 do konzervovaných FR sekvencí lidských variabilních oblastí s co možná nejvyšším stupněm homologie. Molekulové modelování na pracovní stanici Silicon Graphic Indigo s programovým vybavením BioSym potvrdilo, že tvary CDR zůstaly zachovány. Takto získané sekvence proteinů byly zpětně přepsány do sekvencí oligonukleotidových a příslušné geny byly vytvořeny ligací překrývajících se oligonukleotidů.
32.
<►·
9 9 ·
9999 • · · 9 9
9 9 9 9 • · · · • 9 · 9
Takto získané sekvence kódující variabilní oblasti byly, způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v publikaci Gillies a další, Proč. Nati, Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992, vloženy do expresívního vektoru obsahujícího konstantní oblast lidského lehkého řetězce κ a konstantní oblast lidského, těžkého řetězce Cyl. Jediným rozdílem -byla ' skutečnost, že metalothioneinové promotory a posilovače transkripce (enhancery) pro imunoglobulinový těžký řetězec byly pro oba řetězce nahrazeny promotorem/enhancerem z CMV. Připojení sekvencí maturovaného IL-2 k COOH-konci lidských těžkých řetězců bylo provedeno postupem podle Gillies a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:1428 až 1432, 1992, pouze s tím rozdílem, že 3' nepřekládané oblasti genu pro IL-2 byly odvozeny z polyA oblasti SV40.
Tento fúzní protein s IL-2 byl exprimován po transfekcí plazmidu připraveného výše uvedeným postupem do myelomové buněčné linie NS/0 kultivované v selekčním médiu obsahujícím 0,1 pM methotrexát. Stručně řečeno, stabilně transfekované klony byly připraveny elektroporací plazmidové DNA do buněk myšího myelomu NS/0. Buňky NS/0 byly kultivovány v Eaglově médiu modifikovaném podle Dulbecca doplněném 10% fetálním telecím sérem. Přibližně 5 x 105 buněk bylo jednou promyto PBS a rozsuspendováno v 0,5 ml PBS. S takto připravenými buňkami bylo následně v elektroporační kyvetě Gene Pulser (vzdálenost elektrod 0,4 cm, BioRad) po dobu 10 minut při 0°C inkubováno deset mikrogramů linearizované plazmidové DNA. Elektroporace byla projedena elektroporátorem Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) s nastaveními 0,25V a 500 pF. Buňky byly ponechány 10 minut na ledu a poté rozsuspendovány v kultiva.čním médiu a vysety na 96-ti jamkové destičky. Stabilně transfekované klony byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím 100 nM methotrexát (MTX), který byl do médiu přidán dva dny po transfekcí. Selekční
33,
• 99 • « · • * 9 9 99 • 9 9 9 • 9 9» • 9 9 9
9 9 9 9
9 9 • 9 9 9 • •
• 9 · ♦ · · • 9 • 9 ♦ · 99
médium bylo měněno každé tři dny a klony rezistentní vůči methotrexátu se začaly objevovat za 2 až 3 týdny.
Klony exprimující požadovaný konstrukt byly identifikovány metodou ELISA s využitím vhodných protilátek proti Fc nebo cytokinu (viz. například Gillies a další, Biotechnol., 7:798,raž 804, 1989). Exprimovaný fúzní protein byl postúpem doporučeným výrobcem purifikován chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A (Pharmacia).
huKS-huy4-huIL2
Gen kódující fúzní protein huKS-huy4-huIL2 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v přihlášce USSN 09/256156, podané 24. února 1999. Tato přihláška je prioritní vzhledem k přihlášce USSN 60/075887, podané 25. února 1999.
Stručně řečeno, Igy4 verze fúzního proteinu huKS-huylhuIL2 popsaného výše byla připravena odstraněním fragmentu genu kódujícího imunoglobulinovou konstantní oblast Cyl z expresívního vektoru huKS-huyl-huIL2 a nahrazením této sekvence odpovídající sekvencí lidského genu Cy4. Sekvence konstantních oblastí lidských těžkých řetězců Cyl, Cy2, Cy3 a Cy4 a jejich srovnání jsou uvedeny v publikaci Huck a další, Nucleic Acid Res., 14:1779 až 1789, 1986.
Záměna fragmentů Cyl a Cy4 byla provedena rozštěpením původní plazmidové DNA obsahující Cyl restrikčními enzymy HindlII a Xhol a purifikací velkého 7,8 kb fragmentu elektroforézou na agarózovém gelu. Druhá plazmidová DNA obsahující Cy4 byla rozštěpena restrikčními enzymy HindlII a Nsil a purifikován byl fragment o velikosti 1,75 kb. Třetí plazmid, obsahující cDNA lidského IL2 a polyA sekvenci z SV40, připojené k COOH konci genu pro lidský Cyl, byl rozštěpen restrikčními enzymy Xhol a Nsil a purifikován byl malý fragment o velikosti 470 bp. Všechny tři takto získané ·
9 99 9 9 99 99
99 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 9 . 9
9
9 9 9 9 9 9 9 •
999 9999 9 9 9 9 9 9 9
fragmenty byly zaligovány v přibližně ekvimolárních množstvích. Produktem této ligační reakce byly transformovány kompetentní buňky E.coli. Selekce transformantů byla provedena na miskách s agarem obsahujícím ampicilin. Identifikace správně sestavených rekombinantních plazmidů izolovaných z transformantů byla provedena restrikční analýzou. K odlišení inzertů Cyl (žádné FspI místo) a Cy4 (jedno FspI místo) bylo využito štěpení resfcrikčním enzymem FspI.
Výsledným vektorem obsahujícím část Cy4-IL2 byly transfekovány (elektroporace, 0,25V a 500 pF) buňky myšího myelomu NS/0 a transfektanty byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím methotrexát (0,1 μΜ). Klony exprimující velké množství fúzního proteinu huKS-huy4-huIL2 byly namnoženy a tento fúzní protein byl ze supernatantů purifikován chromatografii na Sepharóze s navázaným proteinem A. Čistota a integrita purifikovaného fúzního proteinu Cy4 byla analyzována elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu. Aktivita IL-2 byla stanovena měřením proliferace T-buněk (Gillis a další, J. Immunol., 120:2027 až 2032, 1978) a bylo zjištěno, že je totožná s aktivitou pozorovanou u konstruktu yl.
huKS-muy2 a-muIL2
Gen kódující fúzní protein huKS-muy2a-muIL2 byl připraven nahrazením konstantních oblastí lidské protilátky a lidského IL-2 ve fúzním proteinu huKS-huyl-huTL2 (popsán v předchozím textu) odpovídajícími mýšími sekvencemi. Přesněji řečeno, DNA kódující lidský Cyl-IL2 byla nahrazena fragmentem cDNA kódujícím myší Cy2a připojeným k DNA kódující myši IL-2. Stručně řečeno, oblast VH z huKS byla připojena (ve správném čtecím rámci) k cDNA kódující myší y2a. K tomuto účelu byl použit PCR přístup využívající překrývající se oligonukleotidové primery:
• ·· ·♦ »« ·· • « · · · · * · · · • 9 9 · ··· · ·
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 99 99 999 přímý: 5' CCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTC (SEK. ID. Č. :
3) reverzní: 5'GGGGCTGTTGTTTTGGCTGAGGAGACGGTGACTGACG (SEK. ID.
Č. : 4) přímý: 5'CTTAAGCCAGATCCAGTTGGTGCAG (SEK. ID. Č. : 5) » :
reverzní: 5'CCCGGGGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTC (SEK. ID. Č.: 6)
Oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 3 a 4 byly navrženy tak, aby hybridizovaly s místem spojení domény VH z huKS a cDNA kódující konstantní oblast myší y2a (kurzívou). V prvním kole PCR byly provedeny dvě amplifikační reakce. V první reakci byla jako templát použita DNA kódující VH z huKS a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 4 a 5. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 5 zavádí proti směru transkripce od sekvence kódující NH2-konec maturované huKS VH (tučně) restrikční místo AflII (CTTAAG). Ve druhé reakci byla jako templát použita cDNA kódující myší y2a a oligonukleotidy popsané SEK.
ID. Č.: 3 a 6. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 6 hybridizuje s cDNA kódující oblast kolem COOH konce y2a a zavádí restrikční místo Xmal (CCCGGG) použité při následné ligaci k cDNA pro muIL2. Produkty získané těmito dvěma amplifikačními reakcemi byly smíchány a použity při druhém kole PCR s oligonukleotidy popsanými SEK. ID. Č.: 5 a 6. Po ověření sekvence byl získaný produkt (fragment AflII-Xmal kódující VH z huKS a konstantní oblast myší y2a) použit k ligaci s DNA kódující signální peptid (ohrariičený místem AflII) a cDNA kódující muIL2 (ohraničená místem Xmal).
cDNA kódující myší IL2 byla klonována z mRNA myších mononukleárních buněk z periferní krve z využitím oligonukleotidů popsaných SEK. ID. Č.: 7 a 8:
přímý: 5'GGCCCGGGTAAAGCACCCACTTCAAGCTCC (SEK. ID. Č.: 7)
36, • «9 ·· 99 99 • · 9 9 9 9 9 99 • 9 9« »·♦ · 9 • 9 9999 9«
9999999 9« 99 99 reverzní: 5'CCCTCGAGTTATTGAGGGCTTGTTG (SEK. ID. Č.: 8).
Primer popsaný SEK. ID. Č.: 7 modifikoval muIL2 (sekvence uvedená tučně) tak, aby mohla být připojena k muy2a v restrikčním místě Xmal (CCCGGG). Primer popsaný SEK. ID.
Č.: 8 zavádí-okamžitě za kodon pro terminaci translace (tučně, antikódující vlákno) restrikční místo Xhol (CTCGAG).
Obdobným způsobem byla k cDNA sekvenci muK připojena doména variabilní oblasti lehkého řetězce (VL) huKS. Použitými překrývajícími se oligonukleotidy byly:
přímý: 5'GGRAAÍAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG (SEK. ID. Č. : 9) reverzní: 5'GCAGCArCAGCCCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCC (SEK. ID.
Č.: 10) přímý: 5'CTTAAGCGAGATCGTGCTGACCCAG (SEK. ID. Č.: 11) reverzní: 5'CTCGAGCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC (SEK. ID. Č. : 12)
Tyto oligonukleotidy byly navrženy tak, aby hybridizovaly s místem spojení domény VL z huKS a cDNA kódující konstantní oblast myšího řetězce κ (kurzívou). V prvním kole PCR byly provedeny dvě amplifikační reakce. V první reakci byla jako templát použita DNA kódující VL z huKS a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 10 a 11. Primer popsaný SEK.
ID. Č.: 11 zavádí proti směru transkripce od sekvence kódující NH2-konec maturované huKS VL (tučně) restrikční místo AflII (CTTAAG). Ve druhé reakci byla jako templát použita cDNA kódující myší řetězec κ a oligonukleotidy popsané SEK. ID. Č.: 9a 12. Primer popsaný SEK. ID. Č.: 12 zavádí za kodon pro terminaci translace (tučně, antikódující vlákno) restrikční místo Xhol.
Produkty získané těmito dvěma amplifikačními reakcemi byly smíchány a použity při druhém kole PCR s oligonukleo37• ·♦ ·· ·« ·· ···· · · · 9 · · • · · · 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 99 99 · tidy popsanými SEK. ID. Č.: 11 a 12. Po ověření sekvence byl výsledný produkt (fragment AflII-XhoI kódující VL z huKS a konstantní oblast myšího řetězce k) použit k ligaci s DNA kódující signální peptid ohraničený místem AflII.
K záměně lidských sekvencí byly v konstruktu pdHL7 použity sekvence kódující jak těžký, tak lehký myší - řetězec. Výsledným vektorem exprimujícím danou protilátku a jako selekční markér obsahujícím gen pro dhfr byly transfekovány (elektroporace, 0,25V a 500 pF) buňky myšího myelomu NS/0 a transfektanty byly selektovány kultivací v médiu obsahujícím methotrexát (0,1 μΜ). U transfekovaných klonů rezistentních vůči methotrexátu byla standardními ELISA technikami testována sekrece protilátkových determinant. Fúzní proteiny byly postupem doporučeným výrobcem purifikovány chromatografií na Sepharóze s navázaným proteinem A.
huKS-muy2a-muIL12
Gen kódující fúzní protein huKS-muY2a-muIL12 byl připraven a exprimován způsobem v podstatě identickým s postupem popsaným v přihlášce USSN 08/986997, podané 8, prosince 1997, a publikaci Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, 1998. Stručně řečeno, cDNA kódující podjednotku p35 myšího IL12 byla připojena k oblasti kódující těžký řetězec huKS-muy2a (připravený dříve). Tímto vektorem byla následně transfekována buněčná linie myelomu NS/0, která již byla transfekována dříve a byla schopna exprimovat podjednotku p40 IL-12. Jinak řečeno, tato buněčná linie byla nejprve transfekována pouze samotnou podjednotkou p40 a vyselektované stabilní transfektanty s vysokou hladinou exprese byly následně použity jako recipientní buňky pro transfekci kon38 • ·· ·· ·· ··
9·· 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9·· 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9
999 9999 99 99 9 9 999 struktem kódujícím fúzní protein zahrnující p35 (tj . následné transfekce).
Podjednotky p35 a p40 myšího IL-12 byly izolovány PCR přístupem z mRNA připravené ze slezinných buněk aktivovaných konkavalinem A (5 pg/ml v kultivačním médiu po dobu tří dnů). Primery použitými při PCR izolaci nukleotidové sekvence kódující podjednotku p35 byly:
5'CCCCGGGTAGGGTCATTCCAGTCTCTGG (SEK. ID. Č, : 13)
5'CTCGAGTCAGGCGGAGCTCAGATAGC (SEK. ID. Č. : 14)
Tyto primery rovněž modifikovaly cDNA kódující p35 tak, aby mohla být zaligována jako fragment ohraničený restrikčními místy Xmal a Xhol.
Primery použitými při PCR izolaci nukleotidové sekvence kódující podjednotku p40 byly:
5'TCTAGACCATGTGTCCTCAGAAGCTAAC (SEK. ID. Č. : 15)
5'CTCGAGCTAGGATCGGACCCTGCAG (SEK. ID. Č. : 16)
Plazmid pdHL7-huKS-muy2a-p35 byl vytvořen popsaným postupem (Gillies a další, J. Immunol. Methods, 125:191) a obsahuje gen pro selekční markér dhfr, transkripční jednotku kódující humanizovaný lehký řetězec protilátky KS a transkripční jednotku kódující myší těžký řetězec zfázovaný s podjednotkou p35 myšího IL-12. Tato fúze byla uskutečněna ligací fragmentu cDNA kódujícího podjednotku p35 ohraničeného restrikčními místy Xmal a Xhol do jedinečného místa Xmál nacházejícího se na konci exonu CH3 v genu pro myší y2a, připraveného postupem uvedeným výše. Obě transkripční jednotky, jak pro H tak pro L řetězec, obsahují na 5' konci namísto metalothioneinového promotoru (v původní práci)
39.
• φφ ·· φφ φφ φ φφφφ φφφ φφφφ φ φφφ φφφ φ . φ · φφ φ φ φ φ φ · φ φφφ φφφφ φφ φφ φφ φφφ promotor odvozený z cytomegaloviru (CMV) a na 3' konci polyadenylační signál.
Za účelem exprese samostatné podjednotky p40 byl zkonstruován obdobný vektor (pNC-p40). Tento vektor zahrnuje gen pro selekční markér (gen pro rezistenci vůči neomycinu) a rovněž využívá CMV promotor pro zahájení transkripce. V tomto vektoru zahrnuje kódující oblast přirozenou signální sekvenci podjednotky p40 protranslokaci této podjednotky do endoplazmatického retikula a správné sestavení s výše zmíněným fúzním proteinem. Buňky byly transfekovány (elektroporací) plazmidem pNC-p40, vysety na misky a kultivovány v selekčním médiu obsahujícím G418. V supernatantech z jamek obsahujících klony rezistentní vůči G418 byla metodou ELISA stanovována přítomnost podjednotky p40.
Buněčná linie NS/0 exprimujicí myší p40 byla transfekována (elektroporací) expresívním vektorem pdHL7-huKS-muY2ap35 (postupem popsaným v publikaci Gillies a další, J. Immunol., 160:6195 až 6203, .1998). U transfekovaných klonů rezistentních vůči methotrexátu byla standardními metodami ELISA testována schopnost sekrece determinant protilátek a sekrece myšího IL-12. Výsledný protein byl postupem doporučeným výrobcem purifikován afinitní chromatografií na sloupci Sepharózy s navázaným proteinem A.
muFc-muEndo
Gen kódující fúzní protein muFc-muEndo byl zkonstruován a exprese byla provedena postupem v podstatě shodným s postupem uvedeným v přihlášce USSN 60/097883, podané 25. října, 1998.
Stručně řečeno, myší endostatin a myší Fc byly exprimovány ve formě fúzního proteinu muFc-muEndo. Gen pro endostatin byl amplifikován metodou PCR tak, aby mohl být vpraven do expresívního vektoru pdCs-muFc(D4K) (Lo a další, Pro40··
99 0* 90 0« • 000 0*0 0 * ·
0 0·0»0 00
0 0000 0 0 00* 0000 00 00 00 0 tein Engineering, 11:495 až 500, 1998). Tento vektor obsahuje sekvenci Asp4-Lys rozpoznávanou enterokinázou (LaVallie a další, J. Biol. Chem., 268:23311 až 23317, 1993). Použitým přímým primerem byl primer 5'CCCCAAGCTTCATACTCATCAGGACTTTC (SEK. ID. Č. : 17), kde sekvenci kódující N-konec endostatinu (tučně) předcházela sekvence AAGCTT (restrikční místo HindlII). Použitým reverzním primerem byl primer 5'-CCCCTCGAGCTATTTGGAGAAAGAGGTC (SEK.
ID. Č. : 18), který byl navržen tak, aby okamžitě za C-konec endostatinu zavedl kodon pro ukončení translace (antikodon CTA) následovaný restrikčním místem Xhol (CTCGAG).
Produkt amplifikovaný PCR byl osekvenován a fragment kódující endostatin a ohraničený restrikčními místy HindlII/XhoI byl zaligován do vektoru pdCs-muFc(D4K) . Byly vyselektovány stabilní klony NS/0 exprimující muFc(D4K)muEndo. Exprese muFc (D4K)-muEndo byla testována metodou ELISA využívající protilátky proti muFc. Fúzní protein muFc (D4K)-muEndo byl exprimován a následně purifikován chroi matografií na sloupci Sepharózy s navázaným proteinem A.
Příklad 3
Kombinovaná terapie pro léčbu nádorů LLC-Ep využívající fúzní proteiny KS-IL2 a KS-IL12
Je známo, že IL-12 inhibuje angiogenezi mechanizmem zprostředkovaným IFN-γ (Voest a další, J. Nati. Can. Inst., 87:581 až 586). IFN-γ může následně potlačovat aktivitu COX-2, tvorbu dalších PG a indukci IL-10. Za účelem zjištění, zda-li může. aplikace IL-12 do těsného okolí nádoru za překonat imunosupresivní účinky PG a umožnit IL-2 směrovanému tamtéž aktivovat destrukci daného nádoru buňkami imunitního systému, byly srovnány účinky kombinované terapie fúzními proteiny huKS-muY2a-muIL2 a huKS-muY2a-muIL12 s
41’·
• ·· «· ··
• · · • • • •
• * • • •
• · • • • · • •
···· ·· ·· ··
účinky terapie těmito fúzními proteiny aplikovanými samostatně.
Samicím myší C57B1/6 byly do střední části hřbetu subkutánně injikovány buňky LLC-Ep (5 x 106 na jednu myš) kultivované in vitro. Po dvou týdnech byla zvířata s hmatatelnými nádory o objemu 150 až 400 mm3 rozdělena do čtyř skupin tak, aby v každé skupině bylo rovnoměrné zastoupení nádorů různých velikostí. Pokusný zvířatům byly aplikovány následující látky: v první skupině bylo myším aplikováno samotné PBS (kontrolní skupina); ve druhé skupině byl myším aplikován samotný fúzní protein huKS-muy2a-muIL2; ve třetí skupině byl myším aplikován samotný fúzní protein huKS-muy2amuILl2; a ve čtvrté skupině byla myším aplikována směs fúzních proteinů huKS-muy2a-muIL2 a huKS-muY2a-muIL12. Růst nádorů byl monitorován měřením jejich objemů až do doby, kdy zvířata v kontrolní skupině počala umírat a musela být usmrcena. Po změření kaliperem byl objem nádorů vypočítán podle vzorce V = 4n/3 (0,5L x 0,5W x 0,5H), kde L označuje délku, W šířku a H výšku nádoru.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 3. Myším byl podáván PBS (prázdné kosočtverce); samotný fúzní protein huKS-muyŽa-muILŽ v množství 15 pg/den (plné čtverečky); fúzní protein huKS-muY2a-muIL12 v množství 10 pg/den (plné trojúhelníky); a směs fúzního* proteinu huKS-muY2a-muIL2 v množství 7,5 pg/den a fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL12 v množství 5 pg/den (křížky).
Jak je znázorněno na obrázku 3, aplikace fúzního proteinu huKS-muY2a-muIL2 (15 pg v pěti po sobě následujících dnech) neoddělila ani nesnížila rychlost růstu nádorů LLCEp (plné čtverečky). U skupiny myší, kterým byl v pěti po sobě následujících dnech aplikován samotný fúzní protein huKS-muY2a-muIL12 v množství 10 pg/dávka (plné trojúhelníky) , byla pozorována pouze slabá protinádorová aktivita; to
42' naznačuje, že působení IL-12 nedostačovalo k indukci takové imunitní odpovědi, která by byla schopna výrazně zpomalit růst nádorů. Nicméně u skupiny, které byly současně aplikovány oba výše zmíněné fúzní proteiny v polovičních množ- . stvích vzhledem k původním dávkám (huKS-muY2a-muIL2 v množství 7,5 pg a huKS-muy2a-muIL12 v množství 5 pg), bylo pozorováno překvapivé zpomalení růstu nádorů (křížky). Tato skutečnost naznačuje, že tyto dva fúzní proteiny působí synergicky. Ačkoliv mechanizmus pozorovaného synergického působení není znám, je pravděpodobné, že je alespoň z části důsledkem překonání indukce IL-10 působením prostaglandinů produkovaných nádorem.
Příklad 4
Kombinovaná terapie využívající fúzní protein protilátka-cytokin a endostatin
I když při použití kombinace fúzních proteinů protilátky a IL-2 a IL-12 byla pozorována výrazná protinádorová aktivita vůči objemným nádorům, podobné výsledky je možné získat při použití fúzních proteinů protilátka-IL-2 a inhibitorů syntézy prostaglandinů.
Myším BALB/c byly do vyholených hřbetů subkutánně injikovány buňky myšího karcinomu CT26 exprimujíci lidský EpCAM (2 x 105 buněk/injekce). Jakmile dosáhly nádory velikosti 100 až 200 mm3 (po přibližně 7 až 14 dnech) , byly myši rozděleny do čtyř čtyřčlenných skupin. První skupině bylo denně intravenózně aplikováno 0,2 ml PBS. Druhé skupině byl denně intravenózně aplikován muFc-muEndostatin (320 pg/myš) v PBS. Třetí skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován fúzní protein huKS-huy4-huIL2 (10 pg/myš) v PBS. Čtvrté skupině byla denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikována směs fúzního proteinu huKS-huy4-huIL2 (10 pg/myš) a muFc-muEndo (320 pg/myš) v PBS a poté následovaly denní in43jekce samotným muFc-muEndo (320 pg/myš) v PBS. Objemy nádorů byly stanoveny postupem popsaným v příkladu 3.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 4. Skupina, které byl aplikován fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem je reprezentována plnými kosočtverci, skupina injikovaná fúzním proteinem muFc-muEndo je reprezentována plnými čtverečky; skupina injikovaná fúzním proteinem huKSmuy4-huIL2 je reprezentovánaplnými kosočtverci a skupina injikovaná kombinací fúzního proteinu muFc-muEndo a fúzního proteinu huKS-muy4~huIL2 je reprezentována křížky.
Z obrázku 4 je patrné, že při použití kombinace fúzního proteinu protilátka-cytokin a antiangiogenního proteinu muFc-muEndo bylo dosaženo výrazně lepších výsledků než při použití těchto látek samostatně. Po 19 dnech léčby byl poměr T/C (průměrná velikost nádorů v léčené skupině/ průměrná velikost nádorů v kontrolní skupině) pro kombinovanou terapii huKS-huy4-huIL2 a muFc-muEndo 0,25, což je výrazně lepší než poměr T/C u skupiny léčené huKS-huy4-huIL2 (0,31) nebo skupiny léčené muFc-muEndo (0,42).
Příklad 6
Kombinovaná terapie využívající fúzní protein protilátka-cytokin a indomethacin
V tomto experimentu byl myším aplikován fúzní protein s IL-2 a indomethacin, což je inhibitor COX-2.
Samicím myší C57B1/6 byly do střední části hřbetu subkutánně injikovány buňky LLC-Ep (2 x 106 na myš). Myši byly usmrceny, jakmile nádory dosáhly objemu 600 až 1200 mm3. Kůže na nádorech byla dezinfikována betadinem a ethanolem, nádory byly vyjmuty a nekrotická tkáň odstraněna. Suspenze nádorových buněk ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem byla připravena protlačením nádorové tkáně přes sítko a následným protažením injekčními jehlami o • · zmenšujících se průměrech (22 až 30 G). Koncentrace buněk byla upravena na hodnotu 1 χ 107 buněk/ml a buňky byly umístěny na led. Následně byla myším C57BL/6 do střední části hřbetu subkutánně injikována 0,1 ml čerstvě rozsuspendovaných buněk (1 x IQ6 buněk/myš).
Jakmile dosáhly nádory velikosti 100 až 200 mm3 (po přibližně 7 až 14 dnech), byly myši rozděleny do čtyř pětičlenných skupin. První skupině bylo denně intravenózně aplikováno 0,2 ml PBS. Druhé skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován huKS-huYl-huIL2 (25 pg/myš) v PBS. Třetí skupině byl po celou dobu experimentu orálně (v pitné vodě) podáván indomethacin (20 pg/ml, nebo přibližně 60 až 70 pg indomethacinu na myš denně). Čtvrté skupině byl denně po dobu 5 dnů intravenózně aplikován huKS-huyl-huIL2 (25 pg/myš) a po celou dobu experimentu orálně (v pitné vodě) indomethacin (20 pg/ml). Objemy nádorů byly stanoveny postupem popsaným v příkladu 3.
Získané výsledky jsou shrnuty na obrázku 5. Skupina, které byl aplikován fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrem je reprezentována plnými kosočtverci, skupina injikovaná fúzním proteinem huKS-huyl-huIL2 je reprezentována plnými čtverečky, skupina orálně přijímající indomethacin je reprezentována plnými trojúhelníky a skupina léčená kombinací fúzního proteinu- huKS-huyl-huIL2 a indomethacinu je reprezentována křížky.
Z obrázku 5 je patrné, že při použití kombinace fúzního proteinu protilátka-cytokin a antiangiogenní sloučeniny indomethacinu bylo dosaženo výrazně lepších výsledků než při použití těchto látek samostatně. Po 22 dnech léčby byl poměr T/C pro kombinovanou terapii huKS-huy4-huIL2 a indomethacinem 0,40, což je výrazně lepší než poměr T/C u skupiny léčené huKS-huy4-huIL2 (0,61) nebo skupiny léčené indomethacinem (0,60).
• · . ’ , i i.....
, * · · ·· .· · · ·· ···· ·· .·· ···· ·· ·· ··
Předkládaný vynález může být, bez odchýlení se od své podstaty nebo základních charakteristik, aplikován i jinými než popsanými způsoby. Příklady provedení vynálezu uvedené v předchozích textu by tudíž měly být považovány za toliko ilustrativní a ne jakýmkoliv způsobem limitující rozsah vynálezu. Rozsah vynálezu je tudíž definován především připojenými patentovými nároky a ne uvedeným popisem a veškeré změny, které jsou ekvivalentní údajům popsaným patentovými nároky spadají rovněž do rozsahu vynálezu.
Všechny patentové přihlášky a vědecké publikace jsou zde uvedeny záměnou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
SEZNAM SEKVENCÍ <110> Gillies, Stephen D <120> Posíleni imunitní reakce zprostředkované fúzním proteinem protilátka-cytokin souběžným podáváním inhibitoru syntézy prostaglandinů <130> LEX-005PC <140>
<141>
<150> 60/082166 <151> 1998-04-17 <160> 18 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <220>
<221> misc_feature <222> (12).. (14) <223> Kodon pro zahájení translace <400> 1 tctagagcag catggcgccc ccgc <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <220>
<221> misc_feature <222> (7) . . (9) <223> Antikodon pro ukončení translace <400> 2 etcgagttat gcatrgagtt eect <210> 3 <211> 35 <212> DNA • · ·
<213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 3 ccgtctcctc agccaaaaca acagccccat cggtc <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 4 ggggctgttg rtttggcrga ggagacggtg actgacg 37 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 5 cttaagccag atccagttgg tgcag 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 6 cccggggtcc gggagaagct cttagtc <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR
48' • ·
J í · · ··· ♦ · • · · « ·· · · · · ·· 9 9 · · · * ·«····· ·· ·· ·· <400> 7 ggcccgggta aagcacccac ttcaagctcc <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 8 ccctcgagtt attgagggct tgttg <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 9 ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tg <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 10 gcagcatcag cccgttttat ttccagettg gtcc <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 11 cttaagcgag atcgtgctga cccag
49.
• 9 · · • · <210> 12 <211> 29 ΐ <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence
X <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 12 * cccgagctaa cactcattcc tgttgaagc <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 13 cqccgggfcag ggteattcca gtctctgg 28 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 14 ctcgagtcag gcggagcrca gatagc 26 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 15 tcfcagaccafc gtgtcctcag aagctaac <210> 16 <211> 25 <212> DNA
50.
» · · · 9 · ·
9· · · <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 16 ctcgagctag gatcggaccc tgcag <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 17 ccccaagctt catacfccatc aggactttc <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>
<223> Popis uměle připravené sekvence: primer pro PCR <400> 18 ’-5Í5-S.
cccctcgagc tatttggaga aagaggtc

Claims (25)

  1. PATENTO V É
    NÁROKY
    1. Použití kombinace zahrnující (i) imunokonjugát zahrnující vazebné místo odvozené z protilátky schopné vázat se na zvolený typ buněk, a cytokin schopný indukovat cytocidní imunitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk; a (ii) inhibitor cyklooxygenasy v množství postačujícím pro zvýšení cytocidní imunitní odpovědi vzhledem k použití samotného imunokon j ugátu, ? · pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi proti předem zvolené buňce v organismu savce.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde zvoleným typem buňky je nádorová buňka.
  3. 3. Použití podle nároku 1, kde zvoleným typem buňky je buňka infikovaná virem.
  4. 4. Použití podle nároku 1, kde léčivem ke kit skládající se ze dvou kompozic, z nichž jedna obsahuje imunokonjugát a druhá inhibitor cyklooxygenasy.
  5. 5. Použití podle nároku 1, kde vazebné místo odvozené z protilátky ve směru od N-konce k C-konci zahrnuje: variabilní oblast imunoglobulinů, doménu CH1 a doménu CH2.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kde vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 připojenou k COOH52 • · « 9 • · ·*»· ·· ·· • · · ♦ » · « * · * • · 9 * · · · « * · • · * · · 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9 9 9
    9999 99 99 ··· »· «·«· konci domény CH2.
  7. 7. Použití podle nároku 1, kde zmíněným imunokonjugátem je fúzní protein zahrnující ve směru od N-konce k Ckonci: (i) vazebné místo odvozené z protilátky zahrnující variabilní doménu imunoglobulinu schopnou vázat povrchový antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
  8. 8. Použití podle nároku 7, kde vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi ? doménou CH2 a cytokinem.
  9. 9. Použití podle nároku 1, kde cytokin v imunokonjugátu je vybrán ze skupiny zahrnující tumor nekrotizující faktor, interleukin, faktor stimulující růst kolonií a lymfokin.
  10. 10. Použití podle nároku 1, kde inhibitor cyklooxygenasy je vybrán ze skupiny sestávající z retinoidu, cytokinu a inhibitoru angiogeneze v místě nádoru.
  11. 11. Použití kombinace zahrnující (i) imunokonjugát zahrnující vazebné místo odvozené z protilátky schopné vázat se na rakovinné buňky, a cytokin schopný indukovat cytocidní imunitní odpověď vůči rakovinné buňce; a (ii) inhibitor cyklooxygenasy v množství postačujícím pro zvýšení cytocidní imunitní odpovědi vzhledem k použití samotného imuno53 •9 ···· ·· ·♦·· ·· 99
    99 9 9 99 » » · ·
    9 · 9 9 ♦ «9 · · ·
    9 · « 9 · · · 9 9 9 konjugátu, pro výrobu léčiva pro indukci cytocidní imunitní odpovědi proti rakovinné buňce v organismu savce.
  12. 12. Použití podle nároku 11, kde léčivem je kit skládající se ze dvou kompozic, z nichž jedna obsahuje imunokonjugát a druhá inhibitor cyklooxygenasy.
  13. 13. Použití podle nároku 11, kde vazebné místo odvozené z protilátky ve směru od N-konce k C-konci zahrnuje: variabilní oblast imunoglobulinu, doménu GH1 a doménu CH2.
  14. 14. Použití podle nároku 13, kde vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 připojenou k COOH-konci domény CH2.
  15. 15. Použití podle nároku 11, kde zmíněným imunokonjugátem je fúzní protein zahrnující ve směru od N-konce k C-konci: (i) vazebné místo odvozené z protilátky zahrnující variabilní doménu imunoglobulinu schopnou vázat povrchový antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
  16. 16. Použití podle nároku 15, kde vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi doménou CH2 a cytokinem.
  17. 17. Použití podle nároku 11, kde cytokin v imunokonjugátů je vybrán ze skupiny zahrnující tumor ·♦<· «· 9 ·« · · · ·· • · · · » · 9 · · » • · ♦ * ♦ ·· ♦ * · 9 · ♦ · * · · 9 9 «
    9999 99 ·· 999 ·« ···· nekrotizující faktor, interleukin, faktor stimulující růst kolonií a lymfokin.
  18. 18. Přípravek pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buněk v organizmu savce vyznačující se tím, že tento přípravek zahrnuje kombinaci: (i) imunokonjugátu zahrnujícího vazebné místo odvozené z protilátky schopné vázat se na zvolený typ buněk, a cytokin schopný indukovat imunitní odpověď vůči tomuto zvolenému typu buněk v organismu savce; a (ii) inhibitoru cyklooxygenasy v množství dostačuj ícím k 5 posílení této imunitní odpovědi indukované imunokonjugátem obsaženým v kombinaci, a to ve srovnání s imunitní odpovědí stimulovanou pouze samotným imunokunjugátem.
  19. 19. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že vazebné místo odvozené z protilátky ve směru od N-konce k Ckonci zahrnuje: variabilní oblast imunoglobulinu, doménu CH1 a doménu CH2.
  20. 20. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 připojenou k COOH-konci domény CH2.
  21. 21. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že zmíněným imunokonjugátem je fúzní protein zahrnující ve směru od N-konce k C-konci: (i) vazebné místo odvozené z protilátky zahrnující variabilní doménu imunoglobulinu • ΦΦ φ φφ φφφφ Φ· ·· * φ · «φφ · · ♦ φ • φ φ φ φ φφ φφ φ φ φφφφ φφφφ φ • ΦΦΦ «φ φφ φφφ φφ φφφφ schopnou vázat povrchový antigen na zvoleném typu buněk, imunoglobulinovou doménu CH1, imunoglobulinovou doménu CH2; a (ii) cytokin.
  22. 22. Přípravek podle nároku 21 vyznačující se tím, že vazebné místo odvozené z protilátky dále zahrnuje doménu CH3 umístěnou mezi doménou CH2 a cytokinem.
  23. 23. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že cytokin v imunokonjugátu je vybrán ze skupiny zahrnující tumor? nekrotizující faktor, interleukin, faktor stimulující růst kolonií a lymfokin.
  24. 24. Přípravek podle nároku 18 vyznačující se tím, že inhibitor cyklooxygenasy je vybrán ze skupiny sestávající z retinoidu, cytokinu a inhibitoru angiogeneze v místě nádoru.
  25. 25. ~ Přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že zvoleným typem buněk jsou rakovinné buňky.
CZ20003817A 1998-04-17 1999-04-16 Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi CZ20003817A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8216698P 1998-04-17 1998-04-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20003817A3 true CZ20003817A3 (cs) 2002-08-14

Family

ID=22169464

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20003817A CZ20003817A3 (cs) 1998-04-17 1999-04-16 Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20040033210A1 (cs)
EP (1) EP1071469A2 (cs)
JP (1) JP2002512204A (cs)
CN (1) CN1305387A (cs)
AU (1) AU758851B2 (cs)
BR (1) BR9909677A (cs)
CA (1) CA2328081A1 (cs)
CZ (1) CZ20003817A3 (cs)
HK (1) HK1038881A1 (cs)
HU (1) HUP0101343A3 (cs)
MX (1) MXPA00010151A (cs)
NO (1) NO20005186L (cs)
PL (1) PL343486A1 (cs)
RU (1) RU2217168C2 (cs)
WO (1) WO1999053958A2 (cs)
ZA (1) ZA200005477B (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2590912T3 (es) 1997-12-08 2016-11-24 Merck Patent Gmbh Proteínas de fusión heterodiméricas útiles para inmunoterapia dirigida y estimulación general del sistema inmunitario
US20030105294A1 (en) * 1998-02-25 2003-06-05 Stephen Gillies Enhancing the circulating half life of antibody-based fusion proteins
CN1318092C (zh) * 1998-04-15 2007-05-30 利思进药品公司 含有抗体－细胞因子融合蛋白和血管生成抑制剂的免疫治疗用组合物
DE69942207D1 (de) * 1998-08-25 2010-05-12 Merck Patent Gmbh Expression und export von angiostatin und endostatin als immunofusins
SK782002A3 (en) 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
AU6227400A (en) * 1999-07-26 2001-02-13 Childrens Hospital Los Angeles Research Institute Fenretinide increases antibody cellular toxicity
RU2263118C2 (ru) * 1999-08-09 2005-10-27 Лексиген Фармасьютикэлс Корп. Комплексы антител с несколькими цитокинами
US20050202538A1 (en) * 1999-11-12 2005-09-15 Merck Patent Gmbh Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics
DK1252192T3 (da) * 2000-02-11 2006-11-20 Merck Patent Gmbh Forbedring af antistofbaserede fusionsproteiners serumhalveringstid
SK982003A3 (en) * 2000-06-29 2004-05-04 Merck Patent Gmbh Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
US7148321B2 (en) * 2001-03-07 2006-12-12 Emd Lexigen Research Center Corp. Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
WO2002079415A2 (en) * 2001-03-30 2002-10-10 Lexigen Pharmaceuticals Corp. Reducing the immunogenicity of fusion proteins
ES2361664T3 (es) * 2001-05-03 2011-06-21 Merck Patent Gmbh Anticuerpo recombinante para tumor específico y su utilización.
AU2002357784B2 (en) * 2001-12-04 2008-07-31 Merck Patent Gmbh Immunocytokines with modulated selectivity
JP4723811B2 (ja) * 2002-03-15 2011-07-13 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 始原肝幹細胞および近位肝幹細胞
BRPI0317376B8 (pt) * 2002-12-17 2021-05-25 Merck Patent Gmbh proteína de fusão de anticorpo-il2 designada como hu14.18-il2, usos da mesma, vetor e composição farmacêutica
US20050069521A1 (en) * 2003-08-28 2005-03-31 Emd Lexigen Research Center Corp. Enhancing the circulating half-life of interleukin-2 proteins
AU2004309050B2 (en) 2003-12-30 2010-10-14 Merck Patent Gmbh IL-7 fusion proteins
CN1902222A (zh) * 2003-12-31 2007-01-24 默克专利有限公司 具有改善药物代谢动力学的Fc－***融合蛋白质
WO2005066348A2 (en) 2004-01-05 2005-07-21 Emd Lexigen Research Center Corp. Interleukin-12 targeted to oncofoetal fibronectin
DE602005016773D1 (de) * 2004-01-22 2009-11-05 Merck Patent Gmbh Antikrebs-antikörper mit reduzierter komplementfixierung
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
AU2005313492B2 (en) * 2004-12-09 2011-12-15 Merck Patent Gmbh IL-7 variants with reduced immunogenicity
US20070104689A1 (en) * 2005-09-27 2007-05-10 Merck Patent Gmbh Compositions and methods for treating tumors presenting survivin antigens
CN101351475B (zh) * 2005-12-30 2013-05-15 默克专利有限公司 具有提高的稳定性的白细胞介素12p40变体
PT1966245E (pt) 2005-12-30 2011-08-31 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-cd19 com imunogenicidade reduzida
AU2010238858A1 (en) 2009-04-22 2011-12-08 Merck Patent Gmbh Antibody fusion proteins with modified FcRn binding sites
EP3626739A1 (en) 2011-06-24 2020-03-25 Stephen D. Gillies Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
EP2561888A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-27 Deutsches Krebsforschungszentrum Protein comprising NC-1 for treating angiogenesis-related diseases
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5508031A (en) * 1986-11-21 1996-04-16 Cetus Oncology Corporation Method for treating biological damage using a free-radial scavenger and interleukin-2
DE3812605A1 (de) * 1988-04-15 1990-06-07 Leskovar Peter Dipl Ing Dr Hab Immunregulative stoffe und stoffgemische zur aktiven beeinflussung des krankheitsverlaufes
DE69133036T2 (de) * 1990-11-09 2003-02-06 Stephen D. Gillies Cytokine immunokonjugate
ES2167391T3 (es) * 1994-09-16 2002-05-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados ii.
AU3588097A (en) * 1996-07-02 1998-01-21 Bar-Ilan University Retinoyloxy(substituted)alkylene butyrates useful for the treatment of cancer and other proliferative diseases

Also Published As

Publication number Publication date
EP1071469A2 (en) 2001-01-31
JP2002512204A (ja) 2002-04-23
HUP0101343A2 (hu) 2001-08-28
ZA200005477B (en) 2001-11-20
MXPA00010151A (es) 2002-08-06
US20040033210A1 (en) 2004-02-19
PL343486A1 (en) 2001-08-27
RU2217168C2 (ru) 2003-11-27
CA2328081A1 (en) 1999-10-28
WO1999053958A2 (en) 1999-10-28
AU758851B2 (en) 2003-04-03
CN1305387A (zh) 2001-07-25
NO20005186L (no) 2000-12-14
HUP0101343A3 (en) 2003-10-28
HK1038881A1 (zh) 2002-04-04
AU3566499A (en) 1999-11-08
WO1999053958A3 (en) 1999-12-02
NO20005186D0 (no) 2000-10-16
BR9909677A (pt) 2000-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20003817A3 (cs) Léčivo pro indukci cytocidní imunitní odpovědi
CZ20003767A3 (cs) Kompozice pro indukci imunitní odpovědi vůči zvolenému typu buňek v organismu savce a její pouľití pro výrobu léčiva
AU2001271729B2 (en) Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
AU2001271729A1 (en) Enhancement of antibody-cytokine fusion protein mediated immune responses by combined treatment with immunocytokine uptake enhancing agents
AU688817B2 (en) Immunoconjugates
RU2758139C2 (ru) Иммуноконъюгаты il2 и мутантного tnf
WO2022100585A1 (zh) 抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用