CN1303104C

CN1303104C - 一种蛋白酶a抑制剂的提取方法及应用

Info

Publication number: CN1303104C
Application number: CN 200310106596
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 顾国贤; 章克昌; 李屹松; 周楠迪
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2007-03-07
Anticipated expiration: 2023-12-08
Also published as: CN1546525A

Abstract

一种蛋白酶A抑制剂的提取方法及应用，涉及从灵芝深层发酵液或灵芝发酵全粉中提取一种蛋白酶A(PrA)抑制剂及应用。从灵芝发酵液或发酵全粉的抽提液中通过乙醇分级或膜过滤分级得粗PrA抑制剂，再经分子筛层析收集30KD～40KD部分冻干得精制PrA抑制剂。该抑制剂可应用于纯生啤酒的生产中。本发明优点是原料灵芝发酵液或发酵全粉可工业化生产，提取工艺简便、设备投入少、抑制剂成本低；其应用属于一种后修饰手段，适量添加可提高纯生啤酒泡沫稳定性，抑制效果高，添加量较为灵活，对啤酒的色度、风味、澄清度等品质没有影响；抑制剂成分主要是蛋白质、多糖及糖蛋白，其中的高分子多糖不仅对啤酒的泡沫有利，还具一定的保健作用。

Description

一种蛋白酶A抑制剂的提取方法及应用

技术领域

一种蛋白酶A抑制剂的提取方法及应用，涉及从灵芝深层发酵液或灵芝发酵全粉中提取一种蛋白酶A(PrA)抑制剂及应用。

技术背景

纯生啤酒的新鲜和爽口日益为人们喜爱和追求，但真正的纯生啤酒常常会因未经巴士灭菌而残留一些酶类，其中的蛋白酶A(PrA)会破坏啤酒泡沫蛋白质Z，从而使纯生啤酒的泡持性降低。

一般说来，啤酒酿造过程中蛋白酶主要有三个来源。一是来源于麦芽，在大麦发芽时会产生自然蛋白酶，它可以降解蛋白质产生足够的有泡沫稳定性的多肽。但此酶在经过麦汁煮沸后它也就被除去，不会有所残留。第二个来源便是人为添加的蛋白酶，如木瓜蛋白酶就是啤酒中应用最广的蛋白水解酶，这主要是用于控制啤酒中的高分子量蛋白质，提高啤酒的非生物稳定性。在添加时应做到不对形成泡沫核心的蛋白质有不利影响为好。第三个来源是来自于酵母，酵母含有多种蛋白酶，主要的有三类，即PrA、蛋白酶B和羧肽酶Y。许多人的免疫学研究工作表明，主要是其中的PrA降解了泡沫蛋白质，影响了纯生啤酒的泡持性。因而，现在人们更多的是对这类蛋白酶进行了大量的研究。

一般说来，PrA量的多少与原料、酵母的自溶、发酵工艺、酵母菌株有很大关系。过分高的酵母接种量会导致酵母的过分生长和发酵液中的高蛋白酶活。麦汁中溶解氧的含量也必须维持在一定的水平，以阻止PrA的释放，与发酵条件相比，酵母活力更为强烈的影响着PrA的含量。

PrA和其它蛋白酶在发酵和成熟阶段都会从酵母细胞中释放出来。为了控制影响纯生啤酒的PrA的含量，可从以下几个方面着手，第一选择合适菌株；第二就是选择合适的发酵和贮酒工艺，防止酵母过早衰老，死亡和自溶；第三寻找PrA的抑制剂。国外国内对前期菌种和工艺方面都有一定的研究，但人们发现尚不能完全解决此问题，所以寻找特异的PrA抑制剂，作为一种后修饰的思路，已开始引起人们的关注。

国内有研究曾试图从大豆、花生、蚕豆、黄豆、大麦等天然原料中提取PrA抑制剂，结果从大豆中得到一种分子量为5KD的抑制剂，但因其添加量大而使其实际应用受到限制。

灵芝含有多种生物活性成分，是一种具有广泛药理活性的药用真菌；适合于大规模工业化生产的灵芝液体深层发酵之发酵液和菌丝体中同样具有多种蛋白质、多肽、多糖等生物活性物质，国内选择它作为材料已开发出多种保健品，如灵芝口服液，灵芝全粉，灵芝精粉，灵芝胶囊等，其中含有的高分子多糖和灵芝酸等成分的一些保健和药理功效已有大量的实验依据，而对其中其他活性成分的分离和功效的研究也在不断的开展和进行。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白酶A抑制剂的提取方法及应用，并根据后修饰的思路将它能加入纯生啤酒中，在不影响啤酒其它品质的前提下，通过抑制其中的PrA，从而提高纯生啤酒泡沫稳定性，赋予啤酒一定保健功能。

本发明的技术方案：为实现上述目的，本发明从灵芝液体深层发酵所得的新鲜发酵液或喷雾干燥后的灵芝发酵全粉的抽提液中，通过乙醇分级沉淀或膜过滤分级分离提取出粗PrA抑制剂，再经过分子筛凝胶层析后，收集分子量为30KD-40KD部分冻干，即获得精制PrA抑制剂。具体步骤为：

A、从灵芝液体深层发酵所得的新鲜发酵液中分离提取

第一步：将发酵液离心除去菌丝体后，上清液浓缩2～3倍；

第二步：乙醇分级沉淀：灵芝发酵液中先加入乙醇达30％～50％终浓度，离心后的清液中继续加乙醇达60％～80％终浓度，离心得沉淀，真空冷冻干燥得冻干粉即为粗PrA抑制剂。

B、从喷雾干燥后的灵芝发酵全粉中分离提取

第一步：按灵芝全粉∶水为1∶10～30(质量/体积比)的比例溶解灵芝发酵全粉，40℃～55℃水浴抽提1～2小时，离心过滤取上清液；

第二步：将第一步中所得抽提液进行乙醇分级沉淀：抽提液中先加入乙醇达30％～50％终浓度，离心后的清液中继续加乙醇达60％～80％终浓度，离心得沉淀，真空冷冻干燥得冻干粉即为粗PrA抑制剂。

A和B的乙醇分级沉淀可改用膜过滤分级：利用截留5万和3万分子量超滤膜进行膜过滤得分子量在3～5万之间的部分为粗PrA抑制剂。

本发明所述的分子筛凝胶层析条件为，采用0.01～0.05mol/L磷酸缓冲液做洗脱剂，洗脱流速为0.5～0.8ml/min，柱尺寸H/D在30～50之间。

本发明所述的灵芝液体深层发酵的发酵液和喷雾干燥后的发酵全粉均采用当前灵芝产品生产领域常用的方法获得。

本发明在上述条件下所获得的PrA抑制剂主要成分是蛋白质、多糖及糖蛋白。

本发明所获得的PrA抑制剂在纯生啤酒生产中的应用工艺为：

①加入时机：在纯生啤酒第一次0.65um膜过滤之前或第二次0.45um膜过滤之前加入；

②加入量：粗抑制剂按酶抑比20～25∶1(u/mg)的量加入；精制抑制剂按酶抑比40～50∶1(u/mg)的量加入。

本发明所述的酶抑比是指啤酒中PrA酶活(u)与抑制剂中蛋白质量(mg)之比。

本发明如无特殊说明均为体积百分比。

本发明的有益效果在于：①本发明中提取PrA抑制剂的原材料灵芝深层发酵液可工业化规模生产；②本发明所涉及的提取工艺简便、设备投入少、可降低抑制剂成本；③本发明所涉及的抑制剂的应用属于一种后修饰手段，可按实际需要决定是否添加和添加多少，使用较为灵活；④本发明所涉及的抑制剂抑制效果高，添加量少，因此对啤酒的色度、风味、澄清度等品质都不会有影响；⑤本发明所涉及的抑制剂成分主要是蛋白质、多糖及糖蛋白，其中的高分子多糖不仅对啤酒的泡沫有利，还具一定的保健作用。

具体实施方式

下面就本发明进行实施例的描述，在实施例的描述中泡持性下降速率减缓的定义为：泡持性下降速率减缓＝(A-B)/A；其中A＝(起始泡持值-放置一段时间后的空白泡持值)/放置天数；B＝起始泡持值-加入抑制剂后放置同样一段时间后的泡持值)/放置天数。泡持性下降速率减缓所表示的是加入抑制剂后对纯生啤酒泡持性的稳定效果。

蛋白质含量的测定采用微量凯氏定氮法

实施例1：灵芝全粉按1∶30加水，55℃保温抽提1小时，5000r/min离心10分钟，得滤液，凯氏定氮法测定灵芝全粉蛋白质含量为10％，此抽提条件下蛋白质的提取率为85％，滤液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，得粗PrA抑制剂(冻干粉为全粉重量的32％，其中蛋白质占12％，糖占81％)，按酶抑比为23∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓55％。

实施例2：灵芝全粉按1∶20加水，55℃保温抽提1小时，5000r/min离心10分钟，得滤液，凯氏定氮法测定蛋白质含量，发现此抽提条件下蛋白质的提取率为78％，滤液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～65％，得粗PrA抑制剂(冻干粉为全粉重量的30％，其中蛋白质占12％，糖占80％)，按酶抑比为25∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓53.5％。

实施例3：灵芝全粉按1∶30加水，55℃保温抽提2小时，5000r/min离心10分钟，滤液，凯氏定氮法测定蛋白质含量，发现此抽提条件下蛋白质的提取率为81％，滤液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，得粗PrA抑制剂(冻干粉为全粉重量的33％，其中蛋白质占10％，糖占85％)，按酶抑比为24∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓55.8％。

实施例4：灵芝全粉按1∶10加水，55℃保温抽提2小时，5000r/min离心10分钟，得滤液，凯氏定氮法测定蛋白质含量，此抽提条件下蛋白质的提取率为75％，滤液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，所得粗PrA抑制剂溶解后用分子筛柱层析进行分离，收集分子量30～40KD部分作成冻干粉(冻干粉中蛋白质含量是原粗抑制剂的41％，多糖为原粗抑制剂的75％)，按酶抑比为48∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓72.8％。

实施例5：灵芝全粉按1∶20加水，55℃保温抽提2小时，5000r/min离心10分钟，得滤液，凯氏定氮法测定蛋白质含量，此抽提条件下蛋白质的提取率为81％，滤液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～60％，所得粗PrA抑制剂用分子筛柱层析进行分离，收集分子量30～40KD部分作成冻干粉(冻干粉中蛋白质含量是原粗抑制剂的45％，多糖为原粗抑制剂的71％)，按酶抑比为50∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓74.5％。

实施例6：取灵芝大罐新鲜发酵液，4000r/min离心除去菌丝体，真空浓缩3倍左右，浓缩液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，所得粗PrA抑制剂按酶抑比23∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓49.8％。

实施例7：取灵芝大罐新鲜发酵液，4000r/min离心除去菌丝体，真空浓缩3倍左右，浓缩液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，所得粗抑制剂按酶抑比20∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓52.5％。

实施例8：取灵芝大罐新鲜发酵液，4000r/min离心除去菌丝体，真空浓缩3倍左右，浓缩液进行乙醇分级沉淀，分级浓度区段为30％～80％，所得粗抑制剂用分子筛柱层析进行分离，收集分子量30～40KD部分作成冻干粉(冻干粉中蛋白质含量是原粗抑制剂的38％，多糖为原粗抑制剂的70％)，按酶抑比为48∶1的比例加入未灭菌的啤酒中，同时以不加的同批啤酒做对照，室温下放置(20℃)，结果可使15天啤酒的泡持性下降速率平均减缓66.7％。

Claims

1、一种蛋白酶A抑制剂的分离提取方法，其特征是从灵芝液体深层发酵的发酵液中，通过乙醇分级沉淀或膜过滤分级获得粗蛋白酶A抑制剂；再经过分子筛凝胶层析后，收集分子量30KD～40KD部分冻干，即获得精制蛋白酶A抑制剂；

A)灵芝发酵液的处理：灵芝液体深层发酵的发酵液离心除去菌丝体，上清液浓缩2～3倍；

B)乙醇分级沉淀或膜过滤分级；对灵芝液体深层发酵液进行乙醇分级沉淀的处理工艺为：发酵液中先加入乙醇达30％～50％终浓度，离心后的清液中继续加乙醇达60％～80％终浓度，离心得沉淀，真空冷冻干燥得冻干粉即为粗蛋白酶A抑制剂；

或膜过滤分级：利用截留5万～3万分子量超滤膜进行膜过滤得分子量在3～5万之间的部分为粗蛋白酶A抑制剂；

C)分子筛凝胶层析：采用0.01～0.05mol/L磷酸缓冲液做洗脱剂，洗脱流速为0.5～0.8ml/min，柱尺寸H/D在30～50之间，得精制的蛋白酶A抑制剂。