CN1177925C - 发酵培养生产虫草素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用气升式生物反应器大规模培养北冬虫夏草，从培养液中分离提取虫草素的方法。该方法是在MS培养基上培养发酵的种子，再将种子转移到20L生物反应器中进行大规模培养。然后对反应器中的培养液进行分离、纯化获取虫草素含量达46.25%，纯度99%，解决了虫草素生产的原料问题。易操作，生产成本低，不污染环境，达到了产业化水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过发酵培养生产虫草素的方法。具体讲是以植物细胞培养技术为手段，通过在细胞生物反应器内进行的北冬虫夏草大规模培养生产虫草素的方法。本发明属于生物制药领域。
背景技术
北冬虫夏草(Corduceps militaris L；Sp，PL)为子囊菌亚门(Ascomycotina)麦角菌目(Clavicipitales)麦角菌科(Cordycepps)真菌子座单生或有数个从昆虫头部发出，有时从节上发出，橙黄色，大多不分枝，高2～5厘米，头部棒形，长1～2厘米，粗0.3～0.5厘米。疗食与冬虫夏草相同。无性生殖为蛹草拟青霉(Paecilmyces militarae)，经现代科学论证北冬虫夏草不仅具有特殊的营养价值，而且有明显的药用价值。自古以来，冬虫夏草一直被作为我国中药宝库中的一宝，得到重视与应用，并与人参、鹿茸一起被称为中国三大补品。中国传统医学认为冬虫夏草性味甘、平、入肺肾经，功能益肺、肾、止咳嗽、补虚损、益精气。深受消费者喜爱。运用生物技术方法深层发酵培养虫草菌丝体，发现发酵液中含有丰富的蛋白质、Va、Ve等多种维生素及硒、锌、锰、铬等多种必需微量元素。其中尤以虫草酸、虫草素[Cordgxepin(即3’-脱氧腺苷)]、虫草多糖和SOD等多种生物活性物质的药用价值最为显著。特别是虫草素的天然含量明显高于天然冬虫夏草。发酵培养获得的虫草多糖含量远远高于天然虫草中的含量。迄今国内外市场销售的有关冬虫夏草药品及营养品其原料来源一是取自天然的冬虫夏草，二是取自人工栽植的虫草，虫草菌丝体经过传统的醇洗或水洗制成胶囊及液体口服等剂型，药用成分复杂，有效成分含量低。由于生长地理的特殊要求以及严格的寄生性，造成冬虫夏草资源极其稀少，加之采收的不易更使得野生冬虫夏草资源十分缺乏，因而导致冬虫夏草价格昂贵，价值高于参、茸。近些年来，随着对冬虫夏草认识领域的不断扩大，对虫草的需求，不仅国内市场日趋扩大，而且东南亚、日本、美国等国际市场的需求量也在增加、依靠自然采收，很受资源的限制，常常出现供不应求的现象。鉴于天然冬虫夏草已属国家禁止采摘的一类保护药用植物种，原料来源已成为该品种能否进一步扩大市场的关键。所以大力开展虫草的研究和人工培养就具有极大的价值。而人工培育的冬虫夏草或北冬虫夏草其有效成分含量极不稳定，菌种变异较大，不易控制。所以大力开展虫草的研究特别是生产、分离、提取有效成分的研究就具有极大的价值。从保护生态环境和提高冬虫夏草的临床疗效与营养价值分析，以生物技术手段开发冬虫夏草既解决了原料来源问题，又大幅度提高了有效成分虫草素和虫草多糖等的含量，成本低，市场潜力巨大。国内外已发表的文献和专利中，未见运用气升式细胞反应器深层发酵培养北虫草技术开发虫草多糖和虫草素的报道。
发明内容
本发明根据北冬虫夏草菌丝体发酵培养产生虫草多糖和虫草素的特殊机理，首创了采用种子半连续传代培养，菌种悬浮培养相结合的气升式深层发酵培养技术。很好地控制了菌球的生长过程，进而缩短了培养周期，降低了成本，能有效提高其产量。
冬虫夏草的培养工艺步骤如下：
1、先制备种子：液体种子培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO41克、蛋白胨5克、酵母膏2克。
种子的培养条件：
将装有液体种子的三角烧瓶放到旋转式摇床上，200转/分，26℃±1培养3-8天，温度23-28℃，散射光，种子培养3-8天为一周期。
在产业化生产时采用2L气升式细胞反应器(中国科学院生化中心有售)作种子罐，进行种子的培养。
2、发酵培养：
种子培养3-8天后，选取培养色泽清澈，菌球均匀一致，约3mm直径大小的种子液，按10％接种量接种至20L发酵罐中，在无菌条件下培养，温度23-28℃，培养3-8天，通气量200ml/min，发酵培养3-8天为一周期。
本发明所说的种子已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，株名为北冬虫夏草菌种，拉丁文学名为Cordycepsmilitaris，保藏号为CGMCC 0611，保藏日期是2001年8月7日。
发酵培养的培养基组成与上述种子液培养基组成相同。以20L气升式细胞反应器作为生产罐进行培养。培养条件为：温度23-28℃，培养3-8天，通气量200ml/min。接种量10％，散射光。
3、经过上述发酵培养之后，进行分离纯化，本发明的分离和纯化过程如下：
细胞培养液下罐后，通过HPLC过柱，获得虫草素晶体。即，将培养品在60℃以下干燥，取干燥物0.7g溶于6ml H2O中，将所得的溶液用0.45um滤膜过滤，取续滤液，重复进样3次，进样量为10ul，所得的峰面积为2340604，通过代入标准曲线计算得虫草素浓度为7.1mg/l，这样虫草素占原干燥品的比例为46.25％。结果见检测图谱(附图1)。
高效液相(HPLC)色谱条件的选择：
利用甲醇∶水(15∶85)作为流动相使干燥物中的虫草素(CCS)与其它组分达到基线分离，虫草素的保留时间少于20分钟，大约在12分钟左右出峰(药典规定HPLC测定组分应在20分钟以内出峰)，进行收集。
实验证明，采用本发明气升式深层发酵培养技术培养获得的培养液，其虫草素含量比其他培养方法获得虫草素含量更高。
下表是采用2种培养方式获得的培养液当中虫草素不同产量的结果。
2种不同培养方式对虫草素产量的影响
培养方式 菌球成活率(％) 虫草素产量(mg/l)
摇瓶培养 80.7 0.65
气升式培养 100 7.10
从表中可以看到，气升式细胞反应器的菌球成活率和虫草素产量都明显高于摇瓶培养，在培养时，0.08m3/h的通气量能够使菌球较好地生长并产生虫草素。由于摇瓶培养存在通气不畅造成菌球生长不利。气升式细胞反应器则无上述情况。
由于虫草素和虫草多糖主要以胞外分泌为主，经过分离、纯化得到的虫草素和虫草多糖等的含量均比天然的冬虫夏草和人工栽培的北虫草有极显著的提高。经检测，虫草素含量为7.1mg/L，比天然的冬虫夏草和人工栽培的北虫草高近百倍。
天然冬虫夏草、北冬虫夏草、本发明气升式细胞反应器深层发酵培养获得的培养物，其主要药用成分含量初步检测结果见下表所示：
天然冬虫夏草、北冬虫夏草、气升式细胞反
应器深层发酵培养物主要药用成分含量表
| 成分 | 北虫草子实体 | 天然冬虫夏草 | 本发明发酵培养物 | |
| 虫草酸％ | 4.81 | 3.08 | 30.56 | |
| 虫草素％ | 0.603 | 0.0029 | 7.1 | |
| 虫草多糖％ | 12.8 | 7.0 | 75 | |
| SOD酶活力比活力 | 184.4u/ml42.4u/mg | 149.4u/ml10.3u/mg | --- | |
| 氨基酸％ | 天门冬氨酸 | 2.55 | 2.02 | 1.63 |
| 苏氨酸 | 1.50 | 1.03 | 0.93 | |
| 丝氨酸 | 1.57 | 1.16 | 0.91 | |
| 谷氨酸 | 3.97 | 3.81 | 1.74 | |
| 脯氨酸 | 0.90 | 1.26 | 0.76 | |
| 甘氨酸 | 1.64 | 1.17 | 1.40 | |
| 丙氨酸 | 2.39 | 1.47 | 1.66 | |
| 胱氨酸 | 0.49 | 0.21 | 0.33 | |
| 缬氨酸 | 1.65 | 1.10 | 1.00 | |
| 蛋氨酸 | 0.28 | 0.12 | 1.33 | |
| 异亮氨酸 | 1.98 | 0.89 | 0.79 | |
| 亮氨酸 | 2.49 | 2.09 | 1.19 | |
| 酪氨酸 | 0.92 | 0.66 | 0.61 | |
| 苯丙氨酸 | 1.89 | 0.71 | 0.68 | |
| 赖氨酸 | 1.09 | 1.23 | 0.89 | |
| 色氨酸 | 0.30 | 0.32 | 0.94 | |
| 组氨酸 | 0.46 | 0.66 | 0.70 | |
| 精氨酸 | 1.26 | 1.76 | 0.69 | |
| 微量元素(ppm) | K | 1.7％ | 3.5％ | 4.5％ |
| Ca | 249 | 634 | 476 | |
| Zn | 85 | 267 | 330 | |
| Fe | 210 | 543 | 588 | |
| Cr | 3.12 | 8.55 | 2.79 | |
| Cu | 8.05 | 21.1 | 13.5 | |
| Mn | 47.1 | 29.6 | 53.0 | |
| Ni | 2.18 | 7.24 | 1.42 | |
| Pb | 1.04 | --- | --- | |
| As | 0.30 | --- | --- | |
国内外已上市的冬虫夏草类保健品及药品均为天然提取的冬虫夏草菌丝体制剂。由于其具有很高的药用价值，深受患者喜爱。然而由于其成分复杂，有效成分含量低，大大影响了该药的临床疗效以及市场的进一步扩大。特别是天然冬虫夏草已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此各个国家都投入大量的人力物力研究冬虫夏草的替代产品。目前国际上公认的替代产品为人工培养冬虫夏草或北冬虫夏草菌丝体，筛选有效成分含量高的菌种进行人工培育，得到的菌丝体进行一些常规处理制成浸膏、胶囊或口服液。这仍属于中药传统的产业加工方式。直接成本虽低但虫草素和虫草多糖等的含量则非常低，生产周期长约为75天左右。
本发明采用气升式细胞反应器深层发酵培养技术，生产虫草素和虫草多糖，不变性，纯度高，成本低，周期短(约为7天左右)。极具市场竞争力。特别是虫草素含量为，比天然的冬虫夏草和人工栽培的北虫草高近百倍。
附图说明
图1是从本发明培养的虫草所获得的虫草素色谱检测图谱。
实施例
采用2L气升式细胞反应器(购自中国科学院生化中心)作种子罐，将液体种子在26℃±1下培养96小时，温度24℃，散射光。液体种子培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO41克、蛋白胨5克、酵母膏2克。
液体种子培养5天后，选取培养色泽清澈，菌球均匀一致，约3mm直径大小的种子液，按10％接种量接种至20L气升式发酵罐中，在无菌条件下培养，发酵培养的培养基组成与上述种子液培养基组成相同，培养温度24℃，培养5天，通气量200ml/min。
经过上述发酵培养之后，通过HPLC过柱，将培养品在60℃以下干燥，取干燥物0.7g溶于6ml H2O中，将所得的溶液用0.45um滤膜过滤，取续滤液，上色谱柱，重复进样3次，进样量为10ul，收集分离得到的虫草素。
Claims (7)
1、一种通过微生物发酵生产虫草素的方法，其特征在于该方法为在培养基上进行种子培养和大规模发酵培养，细胞培养液下罐后，通过HPLC过柱，分离获得虫草素晶体，所说种子株名为北冬虫夏草(拉丁文学名为Cordycepsmilitaris)，保藏号是CGMCC 0611。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于种子培养3-8天为一周期，发酵培养3-8天为一周期。
3、根据权利要求1的方法，其特征在于种子培养条件为将装有液体种子的三角烧瓶放到旋转式摇床上，200转/分，23-28℃培养3-8天，散射光。
4、根据权利要求1的方法，其特征在于其所说的培养基组成为：马铃薯200克、葡萄糖10克、KH2PO42克、MgSO41克、蛋白胨5克、酵母膏2克。
5、根据权利要求1的方法，其特征在于发酵培养的方法是，在液体种子培养5天后，选取培养色泽清澈，菌球均匀一致，约3mm直径大小的种子液，按10％接种量接种至20L发酵罐中，在无菌条件下培养，温度24℃，培养5天，通气量200ml/min。
6、根据权利要求1的方法，其特征在于所说的大规模细胞培养采用气升式细胞反应器进行深层发酵培养。
7、根据权利要求1的方法，其特征在于高效液相色谱条件为：利用甲醇∶水＝15∶85作为流动相使培养品中的虫草素与其它组分达到基线分离，虫草素的保留时间少于20分钟，大约在12分钟左右出峰，进行分离收集。
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