CN1287151C - 流式细胞仪检测专用溶血方法 - Google Patents

Abstract

流式细胞仪专用溶血素及其制备方法与应用，属于医疗检测用试剂技术领域。溶血素主要由NaCl、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、多聚甲醛、双蒸水组成。各种称量好的原料混合，置水浴中4-5小时，每隔30-40分钟搅匀一次；过滤即得。本发明的溶血素用于流式细胞仪检测血液白细胞各群表面标志。本发明的溶血素保护白细胞膜完整、不受破坏，并保持白细胞膜抗原性不受影响，无环境污染，可保护实验操作人员免受病原生物的感染。

Description

流式细胞仪检测专用溶血方法

(一)技术领域

本发明涉及流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志时所用溶血素及其制备方法与应用。

(二)背景技术

流式细胞仪已应用于科学研究和医学临床检验的各个领域，如免疫功能的检查，肿瘤抗原、转移基因与抑癌基因及其他疾病相关基因检测，细胞凋亡，艾滋病诊断与预后判断等。随着流式细胞仪的普及和应用，其配套试剂的开发和研制也显得越来越重要。目前，流式细胞仪所用溶血素基本依靠进口，主要有美国Becton Dickinson(BD)公司和Beckman Coulter公司的产品，其价格昂贵，并且不能及时供应，给使用者带来很大的不便和浪费。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供流式细胞仪专用溶血素及其制备方法与应用。

本发明流式细胞仪专用溶血素的组成如下：

NaCl                   5～12g

Na₂HPO₄·12H₂O     1～8g

或Na₂HPO₄.2H₂O    0.5～6g

或K₂HPO₄            5～10g

KH₂PO₄               0.1～0.6g

或NaH₂PO4.₂H₂O    0.1～3g

KCl                    0～0.5g

多聚甲醛[(CH₂O)n]    20～50g

加双蒸水至              1L

多聚甲醛分子式：(CH₂O)n，其中n＝8-100。

本发明流式细胞仪专用溶血素的制备方法如下：

1.原料称量：将所需各种原料按以上配方比例分别称量。

2.配制：将各种称量好的原料混合，置45-50℃水浴中4-5小时，其间每隔30-40分钟搅拌混匀一次。

3.过滤：将上述溶液用双层滤纸过滤去除沉淀，即得本发明的溶血素。

然后进行产品分装：将过滤好的产品进行分装，50ml/瓶。将分装好的产品贴好标签，标注使用说明及注意事项等。成品验收合格入库。

本发明流式细胞仪专用溶血素用于流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。具体可用于BD、Beckman Coulter或其它公司生产的各系列的流式细胞仪。

具体使用方法如下：

方法一：

1.按外周血∶溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟。

2.加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。

方法二：

1.使用前将溶血素用双蒸水10倍稀释，混匀。

2.按20∶1体积比将稀释溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。

与现有技术相比本发明的优良效果如下：

1.本发明流式细胞仪专用溶血素组分中包括多聚甲醛，多聚甲醛具有固定白细胞膜作用，可以最大程度地保护白细胞膜完整、不受破坏，并保持白细胞膜抗原性不受影响。多聚甲醛对血液中可能存在的病原微生物如乙肝病毒、SARS-CoV等具有固定作用，降低其毒性和传染性。以保护环境和实验操作人员免受病原生物的感染。

2.溶血素优选的PH值5.0-8.0，如果PH值太低或太高，对白细胞的破坏增加。本发明流式细胞仪专用溶血素组分中包括磷酸缓冲液，PH值为7.2-7.4，较为稳定，这一PH值接近人体血液的PH值，是白细胞生存的最适合PH值，能够保护白细胞免受破坏和抗原改变。

3.本发明流式细胞仪专用溶血素使用浓度中含有大量的水成分，这是使红细胞溶解的主要成分。水依靠低渗作用，使红细胞涨裂，达到红细胞溶解的作用。

4.本发明流式细胞仪专用溶血素各成分价格低廉，供应方便，容易获得，使产品成本和造价降低。

5.本发明流式细胞仪专用溶血素制作工艺简单，配置过程不需要昂贵的仪器设备条件，使生产简单易行。

6.本发明流式细胞仪专用溶血素使用方法简易，多样化，使用者可以根据自己的习惯自行选择，方便易行。

7.本发明流式细胞仪专用溶血素没有毒性，对使用者和环境无危害。

(四)附图说明

图1是使用本发明实施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图，可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。

图2是BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图。可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。另外还有一团较明显的细胞碎片，这是由于红细胞的溶解不彻底造成的。

图3、4分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD14表达直方图。

图5、6分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD14表达直方图。

图7、8分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD14表达直方图。

图9、10分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD45表达直方图。

图11、12分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD45表达直方图。

图13、14分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD45表达直方图。

(五)具体实施方式

实施例1：流式细胞仪专用溶血素的组成如下：

NaCl                8g

Na₂HPO₄.12H₂O   2.89g

KH₂PO₄            0.2g

KCl                 0.2g

多聚甲醛             30g

加双蒸水至           1L

制备方法：

1.原料称量：将所需各种原料按以上配方比例分别称量。

2.配制：将各种称量好的原料混合，放入50℃水浴中4小时，其间每隔30分钟搅拌混匀一次。

3.过滤：双层滤纸过滤去除沉淀。

然后进行产品分装：将过滤好的产品进行分装，50ml/瓶。将分装好的产品贴好标签，标注使用说明及注意事项等。成品验收合格入库。

表1是40例人抗凝外周血在本发明流式细胞仪专用溶血素实施例1和BD公司生产的溶血素分别作用下在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞CD14、CD45表达水平统计结果，二者比较具有高度一直性。这表明使用本发明流式细胞仪专用溶血素检测白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)膜抗原表达水平与使用BD公司生产的溶血素检测白细胞(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)膜抗原表达水平结果具有很好的一直性。

                         表1.使用本发明实施例1的溶血素和BD溶血素

                       淋巴细胞、单核细胞、粒细胞CD14、CD45表达结果

	例数	CD14表达(％)		CD45表达(％)
						本发明溶血素	BD溶血素	本发明溶血素	BD溶血素
		淋巴细胞	40	1.01±0.24	1.00±0.23					98.94±0.71	98.90±0.72
单核细胞	40					92.80±1.98	92.81±1.94	95.15+2.73	95.11+2.76
		粒细胞	40	91.16±3.68	91.22±3.76					99.39±0.48	99.41±0.47

本实施例溶血素具体使用方法为：按外周血∶溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟。加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解。用流式细胞仪检测血液白细胞各群(淋巴细胞、单核细胞、粒细胞)表面标志。

图1是使用本发明实施例1的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图，可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。

图2是BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的白细胞前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)的点密度图。可见白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞三群。另外还有一团较明显的细胞碎片，这是由于红细胞的溶解不彻底造成的。

图3、4分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。

图5、6分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。

图7、8分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD14表达直方图。可见二者CD14表达水平具有很好的一直性。

图9、10分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的淋巴细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。

图11、12分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的单核细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。

图13、14分别为使用本发明实施例1的溶血素和BD公司生产的溶血素作用于人抗凝外周血后在美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪上得到的粒细胞CD45表达直方图。可见二者CD45表达水平具有很好的一直性。

实施例2.

制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下：

NaCl                 7.2g

Na₂HPO₄·12H₂O   3.73g

KH₂PO₄             0.43g

多聚甲醛              40g

加双蒸水至            1L

实施例3.

制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下：

NaCl                 9g

Na₂HPO₄·12H₂O   6g

NaH₂PO₄·2H₂O    0.4g

多聚甲醛              25g

加双蒸水至            1L

实施例4.

制备方法同实施例1，所不同的是溶血素组成如下：

NaCl                 7.2g

K₂HPO₄             7.52g

NaH₂PO₄·2H₂O    1.49g

多聚甲醛              30g

加双蒸水至            1L

Claims (2)

1.一种流式细胞仪检测专用溶血方法，步骤如下：

按外周血∶溶血素为1∶1的体积比将溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温10分钟；加入20倍体积的双蒸水，混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解，保留白细胞，包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞，用于流式细胞仪检测；

所述的溶血素组成如下：

NaCl                            5～12g

Na₂HPO₄·12H₂O              1～8g

或Na₂HPO₄.2H₂O              0.5～6g

或K₂HPO₄                     5～10g

KH₂PO₄                       0.1～0.6g

或NaH₂PO₄.2H₂O              0.1～3g

KCl                             0～0.5g

多聚甲醛[(CH₂O)n]，n＝8-100   20～50g

加双蒸水至                     1L。

2.一种流式细胞仪检测专用溶血方法，步骤如下：

使用前将溶血素用双蒸水10倍稀释，混匀；按20∶1体积比将稀释溶血素加入到抗凝外周血中，低速混匀，室温5-10分钟，使红细胞完全溶解，保留白细胞，包括淋巴细胞、粒细胞和单核细胞，用于流式细胞仪检测；

所述的溶血素组成如下：

NaCl                             5～12g

Na₂HPO₄·12H₂O               1～8g

或Na₂HPO₄.2H₂O               0.5～6g

或K₂HPO₄                      5～10g

KH₂PO₄                        0.1～0.6g

或NaH₂PO₄.2H₂O               0.1～3g

KCl                              0～0.5g

多聚甲醛[(CH₂O)n]，n＝8-100    20～50g

加双蒸水至                      1L。

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