CN1464050A - 用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法 - Google Patents
用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法，其特征在于：抗凝剂为柠檬酸三钠的水溶液，洗涤液为氯化钠的水溶液，缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的水溶液，氯仿作溶剂、乙醇起洗涤作用、丙酮起沉淀作用，用鸡、鸭血作原料，或用牛、羊、猪血作原料，工艺过程为：血液抗凝处理、分离血球、血球洗涤、收集红血球、热变过程、静化反应、成品收集；采用离心机和搅拌机进行。SOD可用于化妆品和食用保健品。
Description
技术领域：本发明涉及用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法。
背景技术：超氧化物岐化酶，简称SOD，英文为Super oxide dismutase，是一种广泛存在于动、植物、微生物中的金属酶，它有多种类型，如：Cu.Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Co.Zn-SOD。自1973年Weisiger等在鸡肝中发现以来，现已可以从各种动物的肝脏、血液中提取SOD，SOD在临床上主要用于延缓人体衰老、防止色素沉积、消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等，无副作用，很有临床价值，近年来又被广泛应用于日用化工行业，例如用于生产化妆品、口服液；现有技术的SOD生产方法，工艺复杂。
发明内容：本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法。
A：有机溶剂的配制：
1、抗凝剂的配制方法，水与柠檬酸三钠的重量比为100∶(3.4～4.2)，
按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.4～4.2克，经充分搅拌至完全溶解即可，
2、洗涤液的配制方法，水与氯化钠的重量比为100∶(0.8～1)，
按100毫升水中加入氯化钠0.8～1克，经充分搅拌至完全溶解即可，
3、缓冲液的配制方法，水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量＝100∶(1.35～1.65)∶(0.18～0.22)
按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.35～1.65克和磷酸二氢钠0.18～0.22克，经充分搅拌至完全溶解即可，
A：有机溶剂的配制最佳方案：
1、抗凝剂的配制方法，水与柠檬酸三钠的重量比为100∶3.8
按100毫升水中加入柠檬酸三钠克，经充分搅拌至完全溶解即可，
2、洗涤液的配制方法，水与氯化钠的重量比为100∶0.9
按100毫升水中加入氯化钠0.9克，经充分搅拌至完全溶解即可，
3、缓冲液的配制方法，水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量＝100∶1.5∶0.2
按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.5克和磷酸二氢钠0.2克，经充分搅拌至完全溶解即可，
B、操作步骤：
1、血液抗凝处理，按每50毫升血液加入6.40～7.84毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用，
2、分离血球方法：将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟3000～5000转速离心4.5～5.5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可
3、血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机按每分钟3000～5000转速离心2.7～3.3分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌4.5～5.5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13～17％的氯仿与23～27％的乙醇，继续搅拌4.5～5.5分钟后，再将其溶液分别装入离心管放入离心机，按每分钟3000～5000转速进行离心2.7～3.3分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷的丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置4.5～5.5分钟，便将其分别装入锥形管放入离心机，按每分钟3000～5000转速进行离心2.7～3.3分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为红血球，
5、热变办法：加入沉淀物量45～55倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到55--65℃，鸡、鸭血；或55--60℃，牛、羊、猪血；然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管放入离心机，按每分钟3000～5000转速进行离心2.7～3.3分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀，
6、静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置10--20分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液，
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品。
8、在低温状态下保存SOD，以便确保活性，不挥发，因SOD对热较敏感；
上述搅拌在搅拌机内进行，离心在离心机内进行。
优点：生产工艺简单、易操作，成本低。
实施例；
一、原料及试剂简介：
动物的新鲜血液，血液一定要保证新鲜、干净、无污染。
柠檬酸三钠，又称枸橡酸纳，分子式：Na2C6H5O7.2H2O，无色晶体或粒状粉末，相对密度1.857，150℃时失去结晶水，温度再高则分解，溶于水，难溶于乙醇，在本方法中用作抗凝血剂，防止血液凝固，
乙醇，又称酒精，无色透明易挥发，易燃的液体，有酒味和刺激辛辣，相对密度0.789，沸点78.4℃，溶于水、甲醇、***、氯仿等，在本方法中起洗涤作用，
氯化钠，NaCL，白色立方晶体或细小结晶粉末，相对密度2.165，熔点801℃，味咸，中性，易溶解，溶于水和甘油，难溶于乙醇。
丙酮，无色易挥发，易燃液体，有微香气味，相对密度0.7893，沸点56.5℃，与水、甲醇、***、氯仿等混溶，能溶解油、脂肪、树脂和橡胶等，化学性质活泼，在本方法中起沉淀作用，
氯仿，又称三氯甲烷，无色透明易挥发液体，稍有甜味，相对密度1.49，沸点61.2℃，不易燃烧，微溶于水，溶于乙醇、***、苯、石油醚等，在光的作用下，能被空气氧化成氯化氢和剧毒的光气，在本方法中用作溶剂，选用化学纯试剂，
磷酸氢二钠，Na2HPO4.白色晶体，易溶于水，在本方法中用作缓冲液，
磷酸二氢钠NaH2PO4白色晶体，易溶于水，在本方法中配合磷酸氢二钠作缓冲液。
实施例1：用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法，其特征在于：
A：有机溶剂的配制：
(1)、抗凝剂的配制方法：按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.4克，经充分搅拌至完全溶解即可，
(2)、洗涤液的配制方法：按100毫升水中加入氯化钠0.8克，经充分搅拌至完全溶解即可，
(3)、缓冲液的配制方法：按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.35克和磷酸二氢钠0.18，经充分搅拌至完全溶解即可，
B、操作步骤：
1、血液抗凝处理，按每50毫升血液加入6.40毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用，
2、分离血球方法：将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟3000转速离心4.5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可，
3、血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机按每分钟3000转速离心2.5分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌4.5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13％的氯仿与23％的乙醇，继续搅拌4.5分钟后，再将其溶液分别装入离心管按每分钟3000转速进行离心2.7分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷的丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置4.5分钟，便将其分别装入锥形管按每分钟3000转速进行离心2.7分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为血球，
5、热变办法：加入沉淀物量45倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到60℃，牛、羊、猪血，然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管按每分钟3000转速离心2.7分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀，
6、静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置10分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液，
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品。
8、在低温状态下保存SOD，以便确保活性，不挥发，因SOD对热较敏感。
实施例2：A：有机溶剂的配制：
(1)、抗凝剂的配制方法：按100毫升水中加入柠檬酸三钠4.2克，(2)、洗涤液的配制方法；按100毫升水中加入氯化钠1克，(3)、缓冲液的配制方法：按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.65克和磷酸二氢钠0.22克，
B、操作步骤：
(1)血液抗凝处理，按每50毫升血液加入7.84毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀；
(2)分离血球方法：将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟5000转速离心5.5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可；
(3)血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机按每分钟5000转速离心3.3分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌5.5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量17％的氯仿与27％的乙醇，继续搅拌5.3分钟后，再将其溶液分别装入离心管进行按每分钟5000转速离心3.3分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要；
(4)收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置5.5分钟，便将其分别装入锥形管放入离心机按每分钟5000转速进行离心3.3分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为血球；
(5)热变办法；加入沉淀物量55倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到60℃，牛、羊、猪血，然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管放入离心机，按每分钟5000转速离心3.3分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀；
(6)静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置20分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液；
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品；
(8)在低温状态下保存SOD。
上述离心过程在离心机内进行。
实施例3：
A、有机溶剂的配制：
(1)、抗凝剂的配制方法：按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.8克，(2)、洗涤液的配制方法：按100毫升水中加入氯化钠0.9克，(3)、缓冲液的配制方法：按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.5克和磷酸二氢钠0.2克，PH＝7.6
B、操作步骤：
1、血液抗凝处理，按每50毫升血液加入7.12毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用，
2、分离血球方法：将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟4000转速离心5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可，
3、血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机按每分钟4000转速离心3分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量15％的氯仿与25％的乙醇，继续搅拌5分钟后，再将其溶液分别装入离心管放入离心机内，按每分钟4000转速进行离心3分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置5分钟，便将其分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟4000转速进行离心3分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为血球，
5、热变办法：加入沉淀物量50倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到55--65℃，鸡、鸭血；然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟4000转速离心3分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀，
6、静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置10--20分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液，
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品，
8、在低温状态下保存SOD，以便确保活性，不挥发，因SOD对热较敏感。
C、生产设备
| 离心机 | 1台 | 红头温度计(0-100℃) | 1支 | 烧杯(100ml) | 2只 |
| 搅拌机 | 1台 | 分液漏斗 | 2-3个 | 天平(250型) | 1台 |
| 搪瓷桶(20升) | 4只 | 玻璃柱(40厘米) | 1根 | 量筒(250ml) | 1个 |
| 塑料桶(20升) | 4只 | 烧杯(1000ml) | 2只 | 定性(中速)滤纸 | 1包 |
| PH试纸(1-14) | 2本 | 烧杯(500ml) | 2只 | 锥形试管 | 12--24只 |
Claims (2)
1、用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法，其特征在于：
A：有机溶剂的配制：
抗凝剂的配制方法，水与柠檬酸三钠的重量比为100∶(3.4～4.2)，经充分搅拌至完全溶解即可，
洗涤液的配制方法，水与氯化钠的重量比为100∶(0.8～1)，经充分搅拌至完全溶解即可，
缓冲液的配制方法，水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量＝100∶(1.35～1.65)∶(0.18～0.22)，经充分搅拌至完全溶解即可；
B、操作步骤：
(1)血液抗凝处理，按每50毫升血液加入6.40～7.84毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀；
(2)分离血球方法：将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟3000～5000转速离心4.5～5.5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可；
(3)血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机内，按每分钟3000～5000转速离心2.7～3.3分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌4.5～5.5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13～17％的氯仿与23～27％的乙醇，继续搅拌4.5～5.5分钟后，再将其溶液分别装入离心管放入离心机内，按每分钟3000～5000转速进行离心2.7～3.3分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要；
(4)收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置4.5～5.5分钟，便将其分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟3000～5000转速进行离心2.7～3.3分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为血球；
(5)热变办法：加入沉淀物量45～55倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到55--65℃，鸡、鸭血；或55--60℃，牛、羊、猪血，然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟3000～5000转速离心2.7～3.3分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀；
(6)静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置10--20分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液；
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品；
(8)在低温状态下保存SOD；
上述搅拌在搅拌机内进行，离心在离心机内进行。
2、根据权利要求1所述的用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法，其特征在于：
A、有机溶剂的配制：
抗凝剂的配制方法：水与柠檬酸三钠的重量比为100∶3.8；
洗涤液的配制方法：水与氯化钠的重量比为100∶0.9；
缓冲液的配制方法：水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量＝100∶1.5∶0.2
B、操作步骤：
(1)、血液抗凝处理，按每50毫升血液加入7.12毫升抗凝剂，经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用，
(2)、分离血球方法；将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀，然后放入离心机内，按每分钟4000转速离心5分钟后，切断离心机电源，将离心管取出，倒掉上层黄色液体后，再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可，
(3)血球的洗涤方法：在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液，搅拌均匀后，分别装入离心管放入离心机内，按每分钟4000转速离心3分钟，切断电源，取出离心管，倒掉上层液体，将洗涤后的血球收集到一个烧杯内，再加入血球量等量的去离子水，或纯净水或蒸馏水，剧烈搅拌5分钟后，一边搅拌一边加入烧杯内溶液量15％的氯仿与25％的乙醇，继续搅拌5分钟后，再将其溶液分别装入离心管放入离心机内，按每分钟4000转速进行离心3分钟后，将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内，离心管内下层沉淀物不要。
(4)收集洗涤后红血球的方法：在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀物产生，静置5分钟，便将其分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟4000转速进行离心3分钟，倒掉上层清液，下层沉淀即为血球，
(5)热变办法：加入沉淀物量50倍的缓冲液，经搅拌充分后，用水浴法加热到55--65℃，鸡、鸭血；或55--60℃，牛、羊、猪血，然后迅速冷却至室温，再将溶液分别装入锥形管放入离心机内，按每分钟4000转速离心3分钟后，将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤，去掉锥形管内下层沉淀，
(6)静化反应的办法：在上层清液中加入等量体积的丙酮，充分搅拌均匀，静置10--20分钟，便形成白色结晶物，即为SOD成品水溶液，
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤，滤纸上的白色晶体物便为SOD产品，冷却脱水，即得成品，
(8)在低温状态下保存SOD。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |