CN1464050A - 用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法 - Google Patents
用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法,其特征在于:抗凝剂为柠檬酸三钠的水溶液,洗涤液为氯化钠的水溶液,缓冲液为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的水溶液,氯仿作溶剂、乙醇起洗涤作用、丙酮起沉淀作用,用鸡、鸭血作原料,或用牛、羊、猪血作原料,工艺过程为:血液抗凝处理、分离血球、血球洗涤、收集红血球、热变过程、静化反应、成品收集;采用离心机和搅拌机进行。SOD可用于化妆品和食用保健品。
Description
技术领域:本发明涉及用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法。
背景技术:超氧化物岐化酶,简称SOD,英文为Super oxide dismutase,是一种广泛存在于动、植物、微生物中的金属酶,它有多种类型,如:Cu.Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD、Co.Zn-SOD。自1973年Weisiger等在鸡肝中发现以来,现已可以从各种动物的肝脏、血液中提取SOD,SOD在临床上主要用于延缓人体衰老、防止色素沉积、消除局部炎症,特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症等,无副作用,很有临床价值,近年来又被广泛应用于日用化工行业,例如用于生产化妆品、口服液;现有技术的SOD生产方法,工艺复杂。
发明内容:本发明的目的在于克服上述缺点,提供一种用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法。
A:有机溶剂的配制:
1、抗凝剂的配制方法,水与柠檬酸三钠的重量比为100∶(3.4~4.2),
按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.4~4.2克,经充分搅拌至完全溶解即可,
2、洗涤液的配制方法,水与氯化钠的重量比为100∶(0.8~1),
按100毫升水中加入氯化钠0.8~1克,经充分搅拌至完全溶解即可,
3、缓冲液的配制方法,水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量=100∶(1.35~1.65)∶(0.18~0.22)
按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.35~1.65克和磷酸二氢钠0.18~0.22克,经充分搅拌至完全溶解即可,
A:有机溶剂的配制最佳方案:
1、抗凝剂的配制方法,水与柠檬酸三钠的重量比为100∶3.8
按100毫升水中加入柠檬酸三钠克,经充分搅拌至完全溶解即可,
2、洗涤液的配制方法,水与氯化钠的重量比为100∶0.9
按100毫升水中加入氯化钠0.9克,经充分搅拌至完全溶解即可,
3、缓冲液的配制方法,水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量=100∶1.5∶0.2
按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.5克和磷酸二氢钠0.2克,经充分搅拌至完全溶解即可,
B、操作步骤:
1、血液抗凝处理,按每50毫升血液加入6.40~7.84毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用,
2、分离血球方法:将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟3000~5000转速离心4.5~5.5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可
3、血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机按每分钟3000~5000转速离心2.7~3.3分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌4.5~5.5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13~17%的氯仿与23~27%的乙醇,继续搅拌4.5~5.5分钟后,再将其溶液分别装入离心管放入离心机,按每分钟3000~5000转速进行离心2.7~3.3分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷的丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置4.5~5.5分钟,便将其分别装入锥形管放入离心机,按每分钟3000~5000转速进行离心2.7~3.3分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为红血球,
5、热变办法:加入沉淀物量45~55倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到55--65℃,鸡、鸭血;或55--60℃,牛、羊、猪血;然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管放入离心机,按每分钟3000~5000转速进行离心2.7~3.3分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀,
6、静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置10--20分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液,
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品。
8、在低温状态下保存SOD,以便确保活性,不挥发,因SOD对热较敏感;
上述搅拌在搅拌机内进行,离心在离心机内进行。
优点:生产工艺简单、易操作,成本低。
实施例;
一、原料及试剂简介:
动物的新鲜血液,血液一定要保证新鲜、干净、无污染。
柠檬酸三钠,又称枸橡酸纳,分子式:Na2C6H5O7.2H2O,无色晶体或粒状粉末,相对密度1.857,150℃时失去结晶水,温度再高则分解,溶于水,难溶于乙醇,在本方法中用作抗凝血剂,防止血液凝固,
乙醇,又称酒精,无色透明易挥发,易燃的液体,有酒味和刺激辛辣,相对密度0.789,沸点78.4℃,溶于水、甲醇、***、氯仿等,在本方法中起洗涤作用,
氯化钠,NaCL,白色立方晶体或细小结晶粉末,相对密度2.165,熔点801℃,味咸,中性,易溶解,溶于水和甘油,难溶于乙醇。
丙酮,无色易挥发,易燃液体,有微香气味,相对密度0.7893,沸点56.5℃,与水、甲醇、***、氯仿等混溶,能溶解油、脂肪、树脂和橡胶等,化学性质活泼,在本方法中起沉淀作用,
氯仿,又称三氯甲烷,无色透明易挥发液体,稍有甜味,相对密度1.49,沸点61.2℃,不易燃烧,微溶于水,溶于乙醇、***、苯、石油醚等,在光的作用下,能被空气氧化成氯化氢和剧毒的光气,在本方法中用作溶剂,选用化学纯试剂,
磷酸氢二钠,Na2HPO4.白色晶体,易溶于水,在本方法中用作缓冲液,
磷酸二氢钠NaH2PO4白色晶体,易溶于水,在本方法中配合磷酸氢二钠作缓冲液。
实施例1:用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法,其特征在于:
A:有机溶剂的配制:
(1)、抗凝剂的配制方法:按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.4克,经充分搅拌至完全溶解即可,
(2)、洗涤液的配制方法:按100毫升水中加入氯化钠0.8克,经充分搅拌至完全溶解即可,
(3)、缓冲液的配制方法:按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.35克和磷酸二氢钠0.18,经充分搅拌至完全溶解即可,
B、操作步骤:
1、血液抗凝处理,按每50毫升血液加入6.40毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用,
2、分离血球方法:将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟3000转速离心4.5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可,
3、血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机按每分钟3000转速离心2.5分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌4.5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13%的氯仿与23%的乙醇,继续搅拌4.5分钟后,再将其溶液分别装入离心管按每分钟3000转速进行离心2.7分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷的丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置4.5分钟,便将其分别装入锥形管按每分钟3000转速进行离心2.7分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为血球,
5、热变办法:加入沉淀物量45倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到60℃,牛、羊、猪血,然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管按每分钟3000转速离心2.7分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀,
6、静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置10分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液,
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品。
8、在低温状态下保存SOD,以便确保活性,不挥发,因SOD对热较敏感。
实施例2:A:有机溶剂的配制:
(1)、抗凝剂的配制方法:按100毫升水中加入柠檬酸三钠4.2克,(2)、洗涤液的配制方法;按100毫升水中加入氯化钠1克,(3)、缓冲液的配制方法:按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.65克和磷酸二氢钠0.22克,
B、操作步骤:
(1)血液抗凝处理,按每50毫升血液加入7.84毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀;
(2)分离血球方法:将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟5000转速离心5.5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可;
(3)血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机按每分钟5000转速离心3.3分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌5.5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量17%的氯仿与27%的乙醇,继续搅拌5.3分钟后,再将其溶液分别装入离心管进行按每分钟5000转速离心3.3分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要;
(4)收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置5.5分钟,便将其分别装入锥形管放入离心机按每分钟5000转速进行离心3.3分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为血球;
(5)热变办法;加入沉淀物量55倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到60℃,牛、羊、猪血,然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管放入离心机,按每分钟5000转速离心3.3分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀;
(6)静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置20分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液;
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品;
(8)在低温状态下保存SOD。
上述离心过程在离心机内进行。
实施例3:
A、有机溶剂的配制:
(1)、抗凝剂的配制方法:按100毫升水中加入柠檬酸三钠3.8克,(2)、洗涤液的配制方法:按100毫升水中加入氯化钠0.9克,(3)、缓冲液的配制方法:按100毫升水中加入磷酸氢二钠1.5克和磷酸二氢钠0.2克,PH=7.6
B、操作步骤:
1、血液抗凝处理,按每50毫升血液加入7.12毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用,
2、分离血球方法:将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟4000转速离心5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可,
3、血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机按每分钟4000转速离心3分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量15%的氯仿与25%的乙醇,继续搅拌5分钟后,再将其溶液分别装入离心管放入离心机内,按每分钟4000转速进行离心3分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要。
4、收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置5分钟,便将其分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟4000转速进行离心3分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为血球,
5、热变办法:加入沉淀物量50倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到55--65℃,鸡、鸭血;然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟4000转速离心3分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀,
6、静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置10--20分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液,
7、将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品,
8、在低温状态下保存SOD,以便确保活性,不挥发,因SOD对热较敏感。
C、生产设备
离心机 | 1台 | 红头温度计(0-100℃) | 1支 | 烧杯(100ml) | 2只 |
搅拌机 | 1台 | 分液漏斗 | 2-3个 | 天平(250型) | 1台 |
搪瓷桶(20升) | 4只 | 玻璃柱(40厘米) | 1根 | 量筒(250ml) | 1个 |
塑料桶(20升) | 4只 | 烧杯(1000ml) | 2只 | 定性(中速)滤纸 | 1包 |
PH试纸(1-14) | 2本 | 烧杯(500ml) | 2只 | 锥形试管 | 12--24只 |
Claims (2)
1、用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法,其特征在于:
A:有机溶剂的配制:
抗凝剂的配制方法,水与柠檬酸三钠的重量比为100∶(3.4~4.2),经充分搅拌至完全溶解即可,
洗涤液的配制方法,水与氯化钠的重量比为100∶(0.8~1),经充分搅拌至完全溶解即可,
缓冲液的配制方法,水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量=100∶(1.35~1.65)∶(0.18~0.22),经充分搅拌至完全溶解即可;
B、操作步骤:
(1)血液抗凝处理,按每50毫升血液加入6.40~7.84毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀;
(2)分离血球方法:将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟3000~5000转速离心4.5~5.5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可;
(3)血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机内,按每分钟3000~5000转速离心2.7~3.3分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌4.5~5.5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量13~17%的氯仿与23~27%的乙醇,继续搅拌4.5~5.5分钟后,再将其溶液分别装入离心管放入离心机内,按每分钟3000~5000转速进行离心2.7~3.3分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要;
(4)收集洗涤后红血球的方法
在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置4.5~5.5分钟,便将其分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟3000~5000转速进行离心2.7~3.3分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为血球;
(5)热变办法:加入沉淀物量45~55倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到55--65℃,鸡、鸭血;或55--60℃,牛、羊、猪血,然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟3000~5000转速离心2.7~3.3分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀;
(6)静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置10--20分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液;
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品;
(8)在低温状态下保存SOD;
上述搅拌在搅拌机内进行,离心在离心机内进行。
2、根据权利要求1所述的用新鲜动物血提取超氧化物岐化酶的方法,其特征在于:
A、有机溶剂的配制:
抗凝剂的配制方法:水与柠檬酸三钠的重量比为100∶3.8;
洗涤液的配制方法:水与氯化钠的重量比为100∶0.9;
缓冲液的配制方法:水重量∶磷酸氢二钠重量∶磷酸二氢钠重量=100∶1.5∶0.2
B、操作步骤:
(1)、血液抗凝处理,按每50毫升血液加入7.12毫升抗凝剂,经充分搅拌均匀即可达到抗凝作用,
(2)、分离血球方法;将经抗凝处理后的血液分别按离心管容量装均匀,然后放入离心机内,按每分钟4000转速离心5分钟后,切断离心机电源,将离心管取出,倒掉上层黄色液体后,再将离心管内下层的红色血球收集到一个烧杯内即可,
(3)血球的洗涤方法:在装有红血球的烧杯内加入红血球两倍量的洗涤液,搅拌均匀后,分别装入离心管放入离心机内,按每分钟4000转速离心3分钟,切断电源,取出离心管,倒掉上层液体,将洗涤后的血球收集到一个烧杯内,再加入血球量等量的去离子水,或纯净水或蒸馏水,剧烈搅拌5分钟后,一边搅拌一边加入烧杯内溶液量15%的氯仿与25%的乙醇,继续搅拌5分钟后,再将其溶液分别装入离心管放入离心机内,按每分钟4000转速进行离心3分钟后,将上层液体倒入漏斗内进行过滤到一个烧杯内,离心管内下层沉淀物不要。
(4)收集洗涤后红血球的方法:在装有清液的烧杯内加入清液等量的冷丙酮,搅拌均匀,即有大量白色沉淀物产生,静置5分钟,便将其分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟4000转速进行离心3分钟,倒掉上层清液,下层沉淀即为血球,
(5)热变办法:加入沉淀物量50倍的缓冲液,经搅拌充分后,用水浴法加热到55--65℃,鸡、鸭血;或55--60℃,牛、羊、猪血,然后迅速冷却至室温,再将溶液分别装入锥形管放入离心机内,按每分钟4000转速离心3分钟后,将锥形管内的上层清液倒入漏斗过滤,去掉锥形管内下层沉淀,
(6)静化反应的办法:在上层清液中加入等量体积的丙酮,充分搅拌均匀,静置10--20分钟,便形成白色结晶物,即为SOD成品水溶液,
(7)将含有SOD成品的水溶液倒入漏斗过滤,滤纸上的白色晶体物便为SOD产品,冷却脱水,即得成品,
(8)在低温状态下保存SOD。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |