CN1249224C - 超氧化物歧化酶组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种超氧化物歧化酶(SOD)组合物及其制备方法，以及一种从动物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并进行聚乙二醇修饰的方法。本发明的组合物，可有效地清除人体内过多的氧自由基、增强人体的免疫功能、预防疾病、延缓衰老。本发明组合物还可以有效地清除血管壁胆固醇的沉积、降低血液粘度、防止和延缓动脉硬化、狭窄和堵塞，使该组合物中的维生素C和维生素E更易于被人体吸收和储存，从而最大限度地满足人体的需要。

Description

超氧化物歧化酶组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种超氧化物歧化酶(SOD)组合物及其制备方法，以及一种从动物血液，尤其是牛血中提取超氧化物歧化酶并对其进行聚乙二醇修饰的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动植物及微生物中，具有催化超氧阴离子歧化反应的金属酶，分别含有Cu、Zn、Mn、Fe、Co等金属元素，具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、增强人体免疫力的功能，被誉为人体内的垃圾清道夫。临床上主要用于延缓人体衰老、防治色素沉积、消除局部炎症。特别用于治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后出现的炎症。超氧化物歧化酶因其无抗原性，毒副作用较小，所以被认为是很有临床价值的治疗酶。不仅如此，近年来，超氧化物歧化酶还成为日用化工产品和保健食品行业的重要添加剂。
超氧化物歧化酶的制备方法随原料而异。目前国内外制备超氧化物歧化酶的原料有动物血液、微生物和动植物组织。由于超氧化物歧化酶的生物半衰期短，且具有异体蛋白免疫原性和患者不易吸收利用等缺点，因此其临床应用受到了限制。通过使用聚乙二醇对天然超氧化物歧化酶进行共价交联修饰，降低、甚至消除了天然超氧化物歧化酶免疫原性，生物半衰期由此得以延长。
迄今为止，动物血液是提取制备超氧化物歧化酶的主要原料。从动物血液中制备超氧化物歧化酶的方法已有报导，其基本工艺流程为：对于动物血液进行预处理，洗涤红细胞和溶血；用有机溶剂去除大部分杂蛋白得超氧化物歧化酶粗制品；再经柱层析分离得到成品。但是这些方法普遍存在处理量小、纯化效率低、周期长等缺陷。本发明所述制备超氧化物歧化酶的方法，克服了上述缺陷，而且适用于大规模工业化生产。
含有超氧化物歧化酶作为活性成分的组合物也有少量报导，但研制新的、用途更为广泛和更为有效的超氧化物歧化酶组合物一直是本领域技术人员努力的目标。
发明内容
本发明人在进行多次筛选和大量实验后惊奇地发现，当将过氧化物歧化酶、维生素C(VC)、维生素E(VE)、蜂胶按照以下特定比例制成本发明组合物时，其各有效成分能在人体内靶向定位，清除过剩自由基，免除细胞损伤，从而阻断疾病的发生与发展，保护生命大分子(基因)，延缓衰老，而且没有副作用，且可改善患者因长期依赖药物的累积性毒副作用并降低用药量与标准，大幅度提高生命质量。
此外，本发明所述组合物中各有效成分具有协同作用，其对于人体内过剩自由基的清除作用明显优于各组分单独使用时作用之和。同时可以有效地清除血管壁胆固醇的沉积，恢复和提高高血脂患者的血清高密度脂蛋白，有效降低血液粘度，防止和延缓动脉硬化、狭窄和堵塞，使蜂胶和螺旋藻中的营养成分更易于被人体吸收和储存。
本发明的超氧化物歧化酶组合物含有超氧化物歧化酶、维生素C(VC)、维生素E(VE)、蜂胶。此外，本发明组合物还可以含有螺旋藻。
其中，每百克本发明组合物中含有600,000-1,200,000U的超氧化物歧化酶，组合物中维生素C、维生素E和蜂胶的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0。优选的本发明组合物含有750,000-960,000U的超氧化物歧化酶，维生素C、维生素E和蜂胶的优选重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。
当本发明组合物中含有螺旋藻时，维生素C、维生素E、蜂胶与螺旋藻的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0∶3.5-5.1，优选5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。
本发明的超氧化物歧化酶组合物可以按照以下方法制备：
1.过筛与灭菌：取蜂胶过筛并灭菌；
2.称量：按比例称取超氧化物歧化酶、维生素C、维生素E、灭菌后的蜂胶和螺旋藻(在使用螺旋藻时)；
3.原料混合与包装：将称量好的上述原料按照维生素E、超氧化物歧化酶、蜂胶、维生素C、螺旋藻(在使用螺旋藻时)的添加顺序在三维混料机中进行充分混合，然后按需要进行包装。
本发明的超氧化物歧化酶组合物的服用量为每公斤体重0.02g，每日2次。
另外，本发明提供了一种从动物血液，尤其是牛的血液中提取超氧化物歧化酶的方法，其具体步骤为：
1.制备抗凝血：向新鲜的动物血液，优选牛的血液中加入抗凝剂柠檬酸三钠溶液；
2.分离洗涤红细胞：将抗凝血在常温下离心4-6分钟，优选5分钟，去除上层黄色液体，收集下层的红细胞，生理盐水洗涤两次；
3.溶血，破碎：将步骤2所得红细胞中加入适量去离子水，剧烈搅拌使所述红细胞溶血破碎；
4.去除血红蛋白：加入相当于步骤3所得溶血溶液0.2-0.3倍，优选0.25倍量的乙醇和0.05-0.15倍，优选0.1倍量的氯仿，搅拌使得血红蛋白反应沉淀，离心除去血红蛋白沉淀；
5.超氧化物歧化酶粗产物的制备：将步骤4制得的乙醇-氯仿上清液中加入1-3倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集沉淀物；
6.热变：将步骤5中所得的沉淀物准确称量，按超氧化物歧化酶：磷酸钾缓冲液1∶10-14，优选1∶12的重量比加入磷酸钾缓冲液(所述磷酸钾缓冲液按1000ml去离子水加入5.9g磷酸氢二钾和2.2g磷酸二氢钾配制而成)，加热该溶液使其温度快速升至55-62℃，优选60℃，然后再快速使其温度降至15℃以下，高速离心收集上清液后加入1.5-2.5倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集沉淀物；
7.去除杂蛋白：准确称量步骤6制得的沉淀并向其中加入4-6倍，优选5倍量的所述磷酸钾缓冲液，搅拌至其彻底溶解。高速离心收集上清液，加入1.5-2.5倍，优选2倍量的丙酮，高速离心收集下层沉淀；
8.除盐、浓缩：向步骤7所得沉淀物中加入去离子水，搅拌至彻底溶解，离心收集上清液，加入该上清液1.5-2.5倍量的丙酮，离心收集下层沉淀，所述沉淀与去离子水的比例优选1∶1；
9.将步骤8所得沉淀加入去离子水，混合后真空冷冻干燥。
根据本发明的上述方法所制得的超氧化物歧化酶的比活为3600-9000u/mg
本发明还提供了一种使用聚乙二醇(PEG)对超氧化物歧化酶进行修饰的方法，该方法包括以下步骤：
1.聚乙二醇的活化：
(1)向二氧六环中依次和混和加入聚乙二醇、丁二酸钾；所得溶液水浴中充分加热搅拌，然后冰浴冷却搅拌该溶液；
(2)向所得溶液中加入***，离心后去除***；
(3)向去除***后的残余物中二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离出上清液；
(4)向所得上清液中加入无水***，离心分离收集沉淀；
(5)将所得沉淀冻干后，加入二甲基甲酰胺和羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜；
(6)加入无水***，离心分离出沉淀，将该沉淀冻干。
2.将步骤1所得冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶按比例于双蒸水中充分混合，低温过夜后，真空冷冻干燥。
其中，优选在下述条件下进行过氧化物歧化酶的聚乙二醇修饰：
1.聚乙二醇的活化：
(1)将聚乙二醇、丁二酸钾加至二氧六环中，所述各物质的比例为二氧六环∶聚乙二醇∶丁二酸钾1000∶400-800∶10-50(ml∶g∶g)。所得溶液放入90℃水浴锅中搅拌1小时，然后冰浴冷却搅拌；
(2)按前述二氧六环4-6倍量加入***，离心10分钟后去除***；
(3)向去除***后的残余物中按前述二氧六环1-2倍量加入二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离15分钟，分离出上清液；
(4)按前述二氧六环4-6倍量向所得上清液中加入无水***，离心分离15分钟，离心分离收集沉淀；
(5)将所得沉淀冻干后，按前述二氧六环1-3倍量加入二甲基甲酰胺，同时按每100ml二甲基甲酰胺加入0.050-0.075g羟基琥珀酰亚胺的比例加入羟基琥珀酰亚胺搅拌过夜；
(6)按二氧六环4-6倍量的比例加入无水***，离心15分钟分离出沉淀，将该沉淀冻干。
2.将步骤1所得冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶按1∶1.5-2.5，优选1∶2重量比充分混合于二氧六环4-6倍量的双蒸水中，低温过夜后，真空冷冻干燥，所得产品即为聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶。
通过上述方法得到的聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶，其免疫原性被降低，甚至被消除，其生物半衰期因此得以延长。
本发明所制得的经聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶，其比活为3600u/mg-9,000u/mg，且在体内可以存活7个小时以上。
除非另有说明，本发明所使用的比例均为体积比。
具体实施方式
参考下列实施例将更易于理解本发明，但给出下述实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1
超氧化物歧化酶的制备
将4％的柠檬酸三钠1000ml加至7000ml的新鲜牛血中，制备成抗凝血。
将上述抗凝血在常温下离心5分钟，去除上层黄色液体，收集下层的红细胞。用生理盐水洗涤两次，收集洗涤后的红细胞。向红细胞中加入等量去离子水，剧烈搅拌使红细胞溶血破碎。之后，加入相当于溶血溶液0.25倍量的乙醇和0.1倍的氯仿，搅拌使血红蛋白反应沉淀，离心除去沉淀。
向上述制得的乙醇-氯仿上清液中加入2倍量的丙酮，高速离心收集超氧化物歧化酶粗产物沉淀。将所得超氧化物歧化酶准确称量，按1∶12的比例加入磷酸钾缓冲液。所得溶液放入95℃-100℃的水浴锅中加热，使该溶液温度快速升至60℃，然后再放入冰水浴中使其温度快速降至15℃以下。通过高速离心收集上清液后加入2倍量的丙酮，再高速离心收集沉淀物。
准确称量沉淀并加入5倍量的磷酸钾缓冲液，搅拌至其彻底溶解。高速离心收集上清液，加入相当于上清液量2倍量的丙酮，高速离心收集下层沉淀。
将制得的SOD加入去离子水中，搅拌至彻底溶解，高速离心收集上清液。
向所得上清液中加入2倍量的丙酮，离心收集沉淀。然后按1∶1的比例向该沉淀加入去离子水，混合后进行真空冷冻干燥。从而得到高纯度的超氧化物歧化酶。
实施例2：
超氧化物歧化酶的聚乙二醇(PEG)修饰
将120g聚乙二醇加至200ml二氧六环中，然后向其中加入6g丁二酸钾。所得溶液放入90℃水浴锅中搅拌1小时，然后冰浴冷却搅拌。
向其中加入1,000ml***，离心10分钟后去除***。
向去除***后的残余物中加入300ml二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离15分钟，取上清液加入1,000ml无水***，离心分离15分钟，将所得沉淀放入冻干机里冻干后，加入400ml二甲基甲酰胺和0.25g羟基琥珀酰亚胺搅拌过夜。
向上述搅拌过夜物质中加入1,000ml的无水***，离心15分钟分离出沉淀，将该沉淀放入冻干机里冻干。
将所得冻干后物质和实施例1中所得超氧化物歧化酶75g在1,000ml的双蒸水中充分混合，低温过夜后，将其真空冷冻干燥，得到经聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶。
经检测，制得的经聚乙二醇修饰的超氧化物歧化酶的比活为7500u/mg。
实施例3超氧化物歧化酶组合物及其制备
取蜂胶过80目筛，然后对蜂胶进行灭菌。取实施例2所制得的超氧化物歧化酶360mg，并按0.023∶6.0∶4.4∶4.5∶4.0的比例称取总重300g的超氧化物歧化酶、维生素C、维生素E、灭菌后的蜂胶和螺旋藻。
然后，按照维生素E、超氧化物歧化酶、蜂胶、维生素C、螺旋藻的加料顺序依次将各原料加至三维混料机中进行充分混合，然后包装为肠溶性缓释胶囊1,000粒。其中，每粒胶囊中含2,700U超氧化物歧化酶，以及维生素C120mg、维生素E90mg、蜂胶90mg。每百克产品含900,000U超氧化物歧化酶。
果蝇寿命实验
使用上海铁道大学医学院提供的美国野生型黑腹果蝇(OrigenK)，设一个空白对照组和4个剂量组，各剂量组饲料含实施例3组合物浓度分别为0％、0.013％、0.040％、0.120％、0.360％。
配制果蝇基础饲料，其组分为：玉米粉8.5％、红糖6.5％、琼脂0.75％、丙酸0.5％、干酵母粉0.75％、水83％，pH7。
将所述果蝇的卵、幼虫、蛹及成虫培养在25±1(℃)，相对湿度40-70(％)生化培养箱中。将果蝇基础饲料煮成粥后，分装于无菌培养试管中。每支培养管用无菌海绵塞封口。成虫基础饲料每4天更换一次。将培养管平放在培养箱内，收集6hr内孵出的成虫进行分组。在此时间范围内孵化的果蝇均未交配。
用***麻醉后称重分组。选择个体大小相近的果蝇，每管20只，雌雄分养。每组雌雄果蝇各200只。在成虫期给本发明实施例3组合物，所述组合物掺入到预先溶化的50℃基础饲料中，并保持各组pH值一致。每天定时统计果蝇存活数和死亡数。直至全部死亡。每组最后死亡的20只果蝇存活天数的平均数为该组的最高寿命。
实验结束，计算实验果蝇平均寿命和最高寿命及半数死亡时间。实施例3组合物对果蝇半数死亡时间的影响、对果蝇寿命的影响等结果如表1、2。
                      表1
  饲料中实施例3组合物浓度(％)   性别   样本数   半数死亡时间(天)
00.0130.0400.1200.360   ♀♂♀♂♀♂♀♂♀♂   200200200200200200200200200200   61586463646160626061
                                  表2 ( x±SD)
  饲料中实施例3组合物浓度(％) 性别 样本数 平均寿命(d) P值 最高寿命 P值
00.0130.0400.1200.360   ♀♂♀♂♀♂♀♂♀♂   200200200200200200200200200200   58.7±13.354.9±12.459.6±13.658.7±12.1**60.8±14.056.4±13.956.9±13.858.2±12.7**57.7±14.156.1±12.3   --0.51830.00160.13160.25430.18330.00820.45050.3030   76.5±2.773.9±3.978.6±3.5*76.2±2.6*80.1±2.7***77.7±3.1**77.6±3.177.7±1.9***76.1±3.174.4±3.5   --0.04190.03600.00010.00150.21620.00040.66820.6744
*：与空白对照组比较有显著差异(p＜0.05)
**：与空白对照组比较有非常显著差异(p＜0.01)
***：与空白对照组比较有极显著差异(p＜0.001)
表1、2结果表明，与空白对照组(含本发明实施例3组合物0％的果蝇饲料喂养)相比较：
含本发明实施例3组合物浓度为0.013％的果蝇饲料喂养的雌性果蝇平均寿命无显著差异(p＞0.05)，最高寿命延长3％(p＜0.05)，半数死亡时间延长3天；雄性果蝇平均寿命延长7％(p＜0.01)；最高寿命延长3％(p＜0.05)，半数死亡时间延长5天。
含本发明实施例3组合物浓度为0.040％的果蝇饲料所喂养的雌性果蝇平均寿命无显著差异(p＞0.05)，最高寿命延长5％(p＜0.001)，半数死亡时间延长3天；雄性果蝇平均寿命无显著差异(p＞0.05)，最高寿命延长5％(p＜0.01)，半数死亡时间延长3天。
含本发明实施例3组合物浓度为0.120％的果蝇饲料所喂养的雌性果蝇平均寿命、最高寿命均无显著差异(p＞0.05)，半数死亡时间缩短1天；雄性果蝇平均寿命延长6％(p＞0.01)，最高寿命延长5％(p＜0.001)，半数死亡时间延长4天。
含本发明实施例3组合物浓度为0.360％的果蝇饲料所喂养的雌性果蝇平均寿命、最高寿命均无显著差异(p＞0.05)，半数死亡时间缩短1天；雄性果蝇平均寿命、最高寿命均无显著差异(p＞0.05)，半数死亡时间延长3天。
试验结果表明：与空白对照组相比，本发明组合物在果蝇饲料中含量在0.013％-0.040％之间时，可以显著延长受试果蝇寿命。
抗疲劳动物实验例
实验动物为二级昆明种雄性小鼠220只，体重18-22g，购自中国药品生物制品检定所实验动物中心。
给予小鼠本发明实施例3组合物的剂量分别为：低剂量0.04g/kgbw(体重)、中剂量0.2g/kg bw、高剂量0.6g/kg bw，高、中、低剂量分别相当于人的推荐每公斤体重日摄入量30倍、10倍和2倍。
称取本发明实施例3组合物适量，用蒸馏水配制高剂量组的样品溶液，中、低剂量组的样品溶液则由高剂量组的溶液按比例用蒸馏水稀释制得。
给各实验组小鼠连续经口灌胃本品各剂量组的样品溶液，正常对照组小鼠给予蒸馏水。
实验中使用的仪器：
Fisher M-300 DR电子天平(德国)、
TP-1000动物天平(湘宜天平仪器厂)、计时器、
120L游泳桶、
铅皮、
实验方法
小鼠进入实验室适应2天后，负重4％体重的铅皮进行游泳筛选实验，10分钟后取出存活者。
将游泳筛选后的60只小鼠晾干，称重并随机分成4组，即正常对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，进行负重游泳实验。
给各剂量实验组小鼠连续经口灌胃相应的样品溶液28天，每日灌胃一次，小鼠灌胃量0.2ml/10g bw，每周称体重，以调整所述组合物浓度。末次灌胃0.5小时后，在小鼠的尾根部负重5％体重的铅皮，置水深30cm，温度25℃的游泳桶中游泳。记录小鼠入水至力竭身亡时的游泳时间，作为小鼠的游泳时间。
表3为所述组合物对小鼠游泳耐力的影响。与正常对照组比较，各剂量组小鼠的分组时及游泳前体重无显著性差异，p＞0.05。
                                        表3
  组别   剂量(g/kg.bw)  分组时体重(g)1，2  游泳前体重(g)1，3
  正常对照组低剂量组中剂量组高剂量组   -0.040.200.60   19.2±0.9(15)19.6±1.0(15)19.3±0.6(15)19.2±0.7(15)   40.5±1.6(15)38.3±2.1(15)39.6±2.9(15)38.6±2.8(15)
1 x±SD，括号内为动物数
2方差分析：F＝0.98，P＝0.41
3方差分析：F＝2.64，P＝0.058
                              表4
  组别   剂量(g/kg.bw)   动物数(只)   游泳时间(min)1，2
  正常对照组低剂量组中剂量组高剂量组   -0.040.200.60   15151515   19.1±19.232.2±34.3)38.5±36.657.1±41.2*
表4为所述组合物对小鼠游泳耐力的影响。与正常对照组比较。高剂量组小鼠的分组的游泳时间显著延长，p＜0.05。
1 x±SD
2方差分析：F＝3.26，P＝0.028
*与正常对照组比较，p＜0.050
实验结果表明：以各剂量的本发明组合物溶液灌食于受试小鼠，对于受试小鼠的体重没有影响。小鼠的抗疲劳效果与灌食的本发明组合物剂量成正比，在大剂量灌食的条件下，小鼠的抗疲劳效果明显提高。

Claims (15)

1.一种超氧化物歧化酶组合物，该组合物含有超氧化物歧化酶、维生素C、维生素E和蜂胶，其中每百克组合物中含有600,000-1,200,000U的超氧化物歧化酶，其中，维生素C、维生素E和蜂胶的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0。
2.根据权利要求1的组合物，其特征在于每百克组合物中含有750,000-960,000U的超氧化物歧化酶，其中，维生素C、维生素E和蜂胶的重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。
3.根据权利要求1的组合物，其特征在于该组合物中还含有螺旋藻，其中维生素C、维生素E、蜂胶和螺旋藻的重量比为5.2-7.3∶4.1-5.2∶4.1-5.0∶3.5-5.1。
4.根据权利要求3的组合物，其特征在于维生素C、维生素E、蜂胶和螺旋藻的重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。
5.根据权利要求1-4之一的组合物，其特征在于该组合物为肠溶缓释胶囊制剂。
6.根据权利要求1-4之一的组合物，其特征在于所使用的超氧化物歧化酶经过聚乙二醇修饰，比活为3600u/mg-9000u/mg。
7.根据权利要求1-4之一的组合物，其特征在于，其中的超氧化物歧化酶按照下述方法提取，该方法包括以下步骤：
a.制备抗凝血：向新鲜的动物血液中加入抗凝剂柠檬酸钠溶液；
b.分离洗涤红细胞：将抗凝血在常温下离心4-6分钟，去除上层黄色液体，收集下层的红细胞，生理盐水洗涤两次；
c.溶血破碎：将步骤b所得红细胞中加入适量去离子水，剧烈搅拌使所述红细胞溶血破碎得溶血溶液；
d.去除血红蛋白：加入相当于步骤c所得溶血溶液0.2-0.3倍量的乙醇和0.05-0.15倍量的氯仿，搅拌使得血红蛋白反应沉淀，离心除去血红蛋白沉淀，保留乙醇-氯仿上清液；
e.超氧化物歧化酶粗产物的制备：将步骤d中制得的乙醇-氯仿上清液中加入其1-3倍量的丙酮，离心收集超氧化物歧化酶粗产物沉淀；
f.热变：将所得的超氧化物歧化酶准确称量，按超氧化物歧化酶：磷酸钾缓冲液1∶10-14的重量比加入磷酸钾缓冲液，加热该溶液使其温度快速升至55-62℃，然后再快速使其温度降至15℃以下，离心收集上清液后加入该上清液1.5-2.5倍量的丙酮，离心收集沉淀物；
g.去除杂蛋白：准确称量步骤f中制得的沉淀，向其中加入该沉淀4-6倍量的磷酸钾缓冲液，搅拌至其彻底溶解，离心收集上清液，加入该上清液1.5-2.5倍量的丙酮，离心收集下层沉淀；
h.除盐、浓缩：向步骤g所得沉淀中加入去离子水，搅拌至其彻底溶解，离心收集上清液，加入该上清液1.5-2.5倍量的丙酮，离心收集下层沉淀；
i.将步骤h中收集的沉淀加入去离子水，混合后真空冷冻干燥。
8.根据权利要求7的组合物，其特征在于，所述超氧化物歧化酶提取方法步骤a中所使用的新鲜动物血液为牛血；所述步骤b中的离心时间为5分钟；所述步骤d中乙醇和氯仿的用量分别为所述溶血溶液的0.25倍和0.1倍；所述步骤e中丙酮的用量为所述乙醇-氯仿上清液的2倍；所述步骤f中超氧化物歧化酶与磷酸钾缓冲液的重量比为1∶12，丙酮的用量为所述上清液的2倍，加热升温至60℃；所述步骤g中磷酸钾缓冲液的用量为所述沉淀的5倍，丙酮的用量为所述上清液的2倍；所述步骤i中所述沉淀与去离子水的用量比为1∶1。
9.根据权利要求6的组合物，其特征在于，所述超氧化物歧化酶按照以下步骤进行聚乙二醇修饰：
a.聚乙二醇的活化：
向二氧六环中依次加入聚乙二醇、丁二酸钾后混合；
所得溶液水浴中充分加热搅拌，然后冰浴冷却搅拌该溶液；
向所得溶液中加入***，离心后去除***；
向去除***后的残余物中二氯甲烷，搅拌溶解后离心分离出上清液；
向所得上清液中加入无水***，离心分离收集沉淀；
将所得沉淀冻干后，加入二甲基甲酰胺和羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜，
加入无水***，离心分离出沉淀，将该沉淀冻干；
b.将步骤a所得冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶充分混合于双蒸水中，低温过夜后，真空冷冻干燥。
10.根据权利要求9的组合物，其特征在于，所述步骤a中，二氧六环∶聚乙二醇∶丁二酸钾的比例为1000ml∶400-800g∶10-50g；水浴温度90℃，搅拌时间为1小时；
***加入量为所述二氧六环用量的4-6倍，离心时间为10分钟；
去除***后的残余物中二氯甲烷的加入量为所述二氧六环用量的1-2倍，离心分离时间为15分钟；
所得上清液中无水***的加入量为所述二氧六环用量的4-6倍，离心分离时间为15分钟；
将所得沉淀冻干后，二甲基甲酰胺的加入量为所述二氧六环用量的1-3倍，同时按每百毫升二甲基甲酰胺加入0.050-0.075g羟基琥珀酰亚胺的比例加入羟基琥珀酰亚胺，搅拌过夜后无水***的加入量为所述二氧六环用量的4-6倍，离心时间为15分钟；
所述步骤b中冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶的重量比为1∶1.5-2.5，双蒸水的用量为所述二氧六环用量的4-6倍。
11.根据权利要求10的组合物，其特征在于，所述步骤b中冻干后的沉淀和超氧化物歧化酶的重量比为1∶2。
12.权利要求1所述超氧化物歧化酶组合物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a.过筛与灭菌：取蜂胶原料过筛并对其进行灭菌；
b.称量：按权利要求1所述比例称取维生素E、超氧化物歧化酶、灭菌后蜂胶、维生素C；
c.混合与包装：将称量好的上述原料进行充分混合，然后进行包装。
13.根据权利要求12的制备方法，其特征在于，各组分的比例为每百克组合物中含有750,000-960,000U的超氧化物歧化酶，维生素C、维生素E和蜂胶的重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7。
14.根据权利要求12的制备方法，其特征在于步骤b为按权利要求3所述比例称取维生素E、超氧化物歧化酶、灭菌后蜂胶、维生素C和螺旋藻。
15.根据权利要求14的制备方法，其特征在于，所述维生素C、维生素E、蜂胶和螺旋藻的重量比为5.9-6.4∶4.3-4.5∶4.4-4.7∶3.8-4.4。
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