CN1287127A - 叶酸－多聚糖复合物,其制备方法和以该复合物为活性成分的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及叶酸与多聚糖的复合物及其制备方法,特别是涉及叶酸与右旋糖酐的复合物及其制备、以该复合物为活性成分的药物组合物,以及该复合物在肿瘤治疗中的应用。本发明涉及的叶酸—多聚糖复合物的通式为:X－Y其中:X可以是叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质;Y可以是各种类型的多聚糖。

Description

叶酸-多聚糖复合物，其制备方法 和以该复合物为活性成分的药物组合物

本发明涉及叶酸与多聚糖的复合物及其制备方法，特别是涉及叶酸与右旋糖酐的复合物及其制备、以该复合物为活性成分的药物组合物，以及该复合物在肿瘤治疗中的应用。

自从提出特异性叶酸结合蛋白(FBP)概念[Johns et al：J Clin Invest1961；40：1684]以后，Rothenberg等人首先在人体细胞内发现FBP[ProcSoc Expl Biol Med 1970；133：428.J Clin Invest 1971；50：717]，Lesli等人也从细胞膜中分离出FBP[Biochem 1972；11：1696]。而Antony等人通过对胎盘细胞的***研究，明确提出了这种FBP在细胞膜上具备叶酸受体(FR)功能[J Biol Chem 1981；256(18)：9684]，并陆续***地阐明了FR的生物化学特性[Blood 1992；79(11)：2807.Annu Rev Nutr1996；16：501]。FR是一种被锚在细胞膜中甘油磷脂酰肌醇(GPI)上的FBP，其可被GPI特异性磷脂酶C或D从细胞膜上切除[Lee et al：Biochem 1992；31：3236.Verma et al：J Biol Chem 1992；267(6)：4119]。FR较均匀散布于细胞膜表面，结合叶酸后，在促发剂作用下移入被膜小凹(coated pits)或凹穴(coveolae)内集束[Mayor et al：Science 1994；264：1948]，随之发生细胞内吞，将叶酸传输至胞内[Anderson et al：Science 1992；255：410]。

人的FR主要有三种异构形式，即FR-α、FR-β和FR-γ，其中FR-γ是一种表达在造血细胞上的分泌蛋白[Shen et al：Biochem1995；34：5660]。动物细胞表面也存在FR-1和FR-2异构体，FR-1主要表达在肿瘤细胞和肾细胞上，FR-2表达在肝细胞上。叶酸对细胞的亲和性和密度具有一定调节作用，限制叶酸食用量，FR-1对叶酸亲和性降低，但其在肿瘤细胞中密度增加，而在肾细胞中减少，FR-2则影响不大[Gates et al：Clin Cancer Res 1996；2：1135]。

随着多数肿瘤细胞表面FR表达数目或活性显著高于正常细胞的事实逐渐被揭示[Campbell et al：Cancer Res 1991；51：5329.Coney etal：Cancer Res 199l；51：6125.Weitman et al：Cancer Res1992；52：33961。以叶酸介导靶向肿瘤细胞的研究得到了迅速发展。

叶酸作为FR配体与放射性核素直接或间接连接而成的复合物，在肿瘤影像诊断方面的动物实验结果表明，肿瘤部位靶向效果显著[Low et al：WO96/36367 Nov.21，1996；USA 5688488 Nov.18，1997]。叶酸间接与脂质体表面结合生成的叶酸-PEG-脂质体细胞培养结果表明，其靶向肿瘤细胞效果明显好于PEG-脂质体或普通脂质体[Lee et al：J Biol Chem 1994；269(5)：3198.Wang et al：Proc Natl AcadSci USA 1995；92：3318.Lee et al：Biochim Biophys Acta 1995；1233：134.Vogel et al：J Am Chem Soc 1996；118(7)：1581.Thompson et al：WO97/31624 Sep.4，1997.陆伟跃等：上海医科大学学报200O；27(1)：4]。

叶酸与高分子复合物也可通过FR将高分子完整地传释至细胞内的非溶酶体浆质中。与叶酸复合的牛血清白蛋白、牛免疫球胆白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶、豆丝氨酸酶抑制剂和抗DNA寡核苷酸均能明显导入KB细胞(人鼻咽癌细胞)、HeLa细胞(人***细胞)和XC细胞(Rous肉瘤病毒转染的成纤维细胞)发挥其相应效果[Leamon et al：Proc Natl Acad Sci USA 1991；88：5572.Low et al：WO90／2096 Oct.18，1990]。结合叶酸的抗T细胞受体单克隆抗体或抗Fc受体单克隆抗体能将肿瘤细胞与T细胞或天然杀伤细胞、单核细胞、巨噬细胞紧密地撮合在一起，达到有效溶解肿瘤细胞目的[David et al：WO96/34630 Nov.7，1996]。而具有抑制蛋白合成功能的毒素[木鳖子皂甙(Momordin)-一种只有透过核糖体到达细胞浆才表现出细胞毒性的蛋白毒素；假单胞菌外毒素片段(LysPE38和CysPE35)]与叶酸复合后，其抑制肿瘤细胞生长能力极大增强[Leamon et al：J Biol Chem1992；267(35)：249666.1993；268(33)：24847]。

右旋糖酐(又名葡聚糖)是一种由蔗糖通过肠膜状明串珠菌发酵而制成的D-葡萄糖聚合物[Gronwall et al：Acta Physiol Scand1944；7：97.1945；9：1.USA 2437518.USA 2644815]。所用菌种不同，产生的右旋糖酐中葡萄糖基连接方式有所差异，但主要以α-1，6键连接为主，其余为α-1，4或α-1，3键[Van Cleve et al：J Am Chem Soc1956；78：4435.许丹枫等：药学学报1986；21(3)，204]。动物实验和临床试验追踪结果均表明，输注右旋糖酐后，动物实质性器官未见异常和组织损伤[Boyd et al：Lancet 1953；1：59.Gronwall et al：Acta PhysiolScand 1945；9：1]，人体肝、脾、肾、肺等器官未见右旋糖酐蓄积[Wilkinson et al：J Interal chir 1951；11：186]。临床上，右旋糖酐主要作为血容量扩胀剂[Gelin et al：Acta Chir Scand 1961；122：309]和血液流动性改善剂[Gelin：Sock Pathogenesis and Therapy 1962；P332]，用于：失血性休克、烧伤和肝肾综合征，急性血栓、血栓性闭塞脉管炎，心肌梗塞，全身性硬化症等。

鉴于右旋糖酐生物特性及其分子结构的多羟基特点，其曾被作为各种药物的载体，以达到增强药物的化学稳定性，或提高药物生物有效性，或用于淋巴***疾患诊断的目的。这些右旋糖酐-药物复合物包括：右旋糖酐锑[Mikhail et al：Exptl Parasitol 1975；37：348]，右旋糖酐铁[Beresford et al：Brit J Pharmacol 1957；12：107]，右旋糖酐-胰岛素[Armstrong et al：Biochim Biophys Res Comm 1972；47：354]，右旋糖酐-柔毛霉素[Bernsten et al：J Nalt Cancer Inst 1978；60(2)：379]，右旋糖酐-丝裂霉素C[Kojima et al：J Pharmacol 1980；32：30]，右旋糖酐-维生素B₁₂，[Scrollini et al：Eur J Med Chem 1974；9：621]，右旋糖酐-甲氨喋呤[Hubert et al：EP 0383170A2]，右旋糖酐-α(或β)-淀粉糖化酶(或胰蛋白酶)[Marshall et al：Arch Biochem Biophys 1975；167：777]，右旋糖酐硫酸酯[Kozo Yamada et al：Jap Circul J 1961；25：570，575，579]，放射性锝(^99mTc)-右旋糖酐[Henze et al：J Nucl Med 1982；23：923.Ercan etal：Eur J Nucl Med 1985；11：80.陆伟跃等：上海医科大学学报1991；18(4)：246.刘永昌等：中华核医学杂志1993；13(3)：143]。其中发明人研制开发的主要用于淋巴***疾患定位和肿瘤淋巴转移辅助诊断的^99mTc-右旋糖酐105注射液及其注射用亚锡右旋糖酐105已正式生产和临床使用。

综上所述，肿瘤细胞膜表面FR是一条可通过叶酸将包括放射性核素、脂质体和高分子等药物导入肿瘤细胞内的有效途径；右旋糖酐的研究历史悠久，主要用作血容量扩胀剂和作为抗肿瘤药物、放射性核素等药物的载体研究，未见其本身具有抗肿瘤作用。迄今为止，叶酸与多聚糖的复合物，尤其是与右旋糖酐的复合物及其作为抗肿瘤药物研究尚未见任何文献或专利报道。

本发明目的是提供一类叶酸-多聚糖复合物，其可循细胞膜上叶酸受体途径入胞，杀死体内肿瘤细胞、抑制肿瘤组织生长，同时又不损伤正常组织；本发明也提供叶酸-多聚糖复合物的制备方法；本发明还提供一种以该复合物为活性成分的药物组合物；本发明进一步提供该复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

为实现本发明和达到上述发明目的，采用了如下技术方案。

1.叶酸-多聚糖合成：将叶酸或叶酸衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质与不同种类、分子量从4，000到2000，000的多聚糖在吡啶类催化剂和碳化二亚胺类脱水剂作用下，缩合成叶酸-多聚糖复合物。本发明用下述通式表示：

X-Y其中：X代表叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y代表不同种类多聚糖。

本发明所涉及的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，其对动物或人体细胞无明显毒副作用，它们包括：叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸，四氢蝶呤、蝶酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。其中，某位“去氮”是指叶酸中该位氮原子被碳原子取代的意思。

本发明所涉及的不同种类多聚糖，其对动物或人体肿瘤细胞或肿瘤组织生长无明显直接抑制活性，本身也不具备受体的配体性质，这些多聚糖包括：①葡聚糖类，如：右旋糖酐，黑曲霉多糖，茁霉多糖，小核菌葡聚糖，香菇多糖，云芝多糖，茯苓多糖，茯苓异多糖，痂囊腔多糖，虫草多糖，猪苓多糖，蘑菇多糖，裂褶多糖，亮菌多糖，喉头菇多糖，银耳多糖，粗糙脉孢多糖，鬼伞多糖，地衣多糖，异地衣多糖，昆布多糖，许长卿多糖，当归多糖，汉防己多糖，黄芪多糖，海带胶多糖，直链淀粉，糊精等；②聚蔗糖类，如：聚蔗糖；③果聚糖类，如：黄精多糖、石蒜多糖、大麦多糖和海浜海葱多糖等的菊糖，梯牧草多糖和匍匐冰草多糖等的左旋唐酐；④杂聚多糖类，如：枝孢多糖，变异青霉多糖，犁头霉多糖，粗糙脉孢外多糖，灵芝多糖，紫菜多糖，刺五加多糖，魔芋多糖，人参多糖，箬竹多糖，蔗渣多糖，枸杞多糖，女贞子多糖，竹黄多糖，茶叶多糖等；⑤单或杂聚多糖硫酸酯类，如：琼脂多糖，角叉多糖，银杏藻多糖，绿藻多糖，岩藻多糖，肝素，硫酸软骨素等；⑥单或杂聚糖醛酸多糖类，如：人参果胶多糖及其它果胶多糖，***胶，西黄蓍胶，印度胶，黄芪胶，海藻酸盐等；⑦其它亲水性醇类高聚物，如：聚乙二醇，甲氧基聚乙二醇等。

2.叶酸-多聚糖循叶酸受体途径导入肿瘤细胞的论证：叶酸-右旋糖酐标记上荧光素作为模型药物，进行体外肿瘤细胞培养。通过测定肿瘤细胞对不同培养浓度下的叶酸-右旋糖酐摄取量变化及其与单纯右旋糖酐摄取量的区别、相同培养浓度和不同培养时间下的叶酸-右旋糖酐摄取量变化，了解肿瘤细胞对叶酸-右旋糖酐的摄取是否有明显的饱和趋势及其摄取量明显高于右旋糖酐程度；通过测定肿瘤细胞对相同培养浓度和相同培养时间下的培养液中含不同游离叶酸的叶酸-右旋糖酐摄取量变化，了解游离叶酸是否能明显竞争性抑制叶酸-右旋糖酐的摄取；通过用不同浓度磷脂酶D对肿瘤细胞预处理后，测定肿瘤细胞对叶酸-右旋糖酐摄取量变化，了解细胞膜上叶酸受体数量减少会否影响肿瘤细胞对叶酸-右旋糖酐的摄取。最后，综合评估叶酸-多聚糖是否能够通过细胞膜上叶酸受体途径导入肿瘤细胞。

3.体内肿瘤细胞对叶酸-多聚糖选择性摄取的观察：通过在荷瘤裸小鼠瘤旁注射标记上荧光素的叶酸-右旋糖酐或右旋糖酐后24小时处死，观察瘤组织中肿瘤细胞内荧光强度和分布范围，了解叶酸-多聚糖被在体肿瘤细胞选择性摄取的优劣。

4.叶酸-多聚糖在体内的抑瘤效果：荷瘤裸小鼠设定空白对照组、右旋糖酐组和叶酸-右旋糖酐组后，分别在瘤旁不注射、注射叶酸-右旋糖酐或右旋糖酐。观察小剂量和大剂量给药后的在体瘤体大小变化、结束后的瘤体重量、瘤组织内的形态和结构变化及其肿瘤细胞内DNA倍体改变程度，了解叶酸-聚多糖对荷瘤裸小鼠的抑瘤效果强弱。

5.叶酸-多聚糖的安全性评价：肿瘤化疗药物最大的缺点就是毒副作用大，叶酸-聚多糖是否同样存在这样的问题，为此需要进行叶酸-聚多糖急性毒性试验加以论证。通过小鼠静脉注射最大浓度叶酸-右旋糖酐溶液后，观察小鼠活动程度、体重变化、死亡情况和处死后的主要脏器损伤情况，初步了解叶酸-多聚糖作为抗肿瘤药物的安全程度。

在上述叶酸-多聚糖的实验基础上，本发明可采用药剂学上允许的赋形剂、粘合性、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等辅料与叶酸-多聚糖配伍，制备成相应药物组合物制剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，或用特定的生产方法制备。

本发明采用前述葡聚糖类、聚蔗糖类、单或杂聚多糖硫酸酯类、单或杂聚糖醛酸多糖类等的分子量为4，000～2000，000的多聚糖与叶酸共价复合成叶酸-多聚糖复合物。选择分子量为105，000右旋糖酐的叶酸-右旋糖酐复合物作为模型药物进行如下***研究。

1.体外肿瘤细胞培养  叶酸-右旋糖酐的体外HeLa229细胞培养结果表明：①叶酸-右旋糖酐摄取量随培养浓度增大而增加，但递增幅度逐渐减缓(见图1)，叶酸-右旋糖酐浓度为4.5m／ml时的摄取量为右旋糖酐的2.7倍；②叶酸-右旋糖酐摄取量随培养时间延长而增加，但递增幅度也逐渐减缓(见图2)；③叶酸-右旋糖酐摄取量随培养液中叶酸浓度增大而显著降低(见图3)；④叶酸-右旋糖酐摄取量随HeLa229细胞预先所用磷脂酶D处理的浓度升高而明显降低(见图4)。由此可见，叶酸-右旋糖酐可循细胞膜上叶酸受体途径导入HeLa229细胞内，且导入量显著高于右旋糖酐。

2.荷瘤裸小鼠体内肿瘤细胞靶向和抑瘤试验  叶酸-右旋糖酐在接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠瘤旁向瘤内肿瘤细胞靶向试验结果表明，叶酸-右旋糖酐扩散至瘤组织后导入肿瘤细胞内的量显著高于右旋糖酐(见图5)，对体内肿瘤细胞靶向明显。叶酸-右旋糖酐对接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠抑瘤试验结果表明：①小剂量时，显著减缓肿瘤生长；大剂量时，显著抑制肿瘤生长(见图6)；②给药33天后处死，与空白对照组和右旋糖酐组比较，叶酸-右旋糖酐组的肿瘤瘤体明显小(见图7和8)，抑瘤率可达75％左右；③与空白对照组和右旋糖酐组比较，叶酸-右旋糖酐对瘤组织具有十分明显的破坏作用(见图9a、9b和9c)；④叶酸-右旋糖酐对瘤组织中肿瘤细胞内的DNA指数(即肿瘤细胞内DNA质量与正常细胞内DNA质量的比值，用DI表示)具有明显的降低作用，其中空白对照组DI值为3.5，右旋糖酐组DI值为3.1，叶酸-右旋糖酐组DI值为2.3。

3．急性毒性试验叶酸-右旋糖酐在小鼠体内急性毒性试验结果表明，雌雄小鼠静脉各注射1.5g/kg叶酸-右旋糖酐(因溶解度较低，只能配制该最大浓度进行最大耐受剂量试验)后，观察7天，小鼠活动正常、体重增加、无一死亡，且主要脏器未见明显异常。

上述实验结果证实，本发明具有如下优点：①右旋糖酐本身不具备抗肿瘤效果；②叶酸-右旋糖酐可循叶酸受体途径导入细胞，具有显著抑制肿瘤组织生长作用，而本身毒副作用小、安全程度高；③叶酸-右旋糖酐抗肿瘤作用与传统化疗药物不同，故本发明为肿瘤的药物治疗提供一种新的方略。

组合物制剂包括：肿瘤内、肿瘤旁或静脉注射用的叶酸-多聚糖冻干品，含碳酸氢钠或氢氧化铝和三硅酸镁的口服用叶酸-多聚糖干糖浆，口服用叶酸-多聚糖肠溶胶囊。也可制备成口服用叶酸-多聚糖肠溶片、动脉栓塞用叶酸-多聚糖微球、口服用结肠释药的叶酸-多聚糖小丸、以及鼻腔、子宫腔和其它腔器喷射给药用的或腹腔注射用的叶酸-多聚糖生物粘附微球等。

附图说明

图1显示：HeLa229细胞对不同培养浓度的F-Dx105和Dx105(37℃培养4h)摄取。

图2显示：HeLa229细胞对不同培养时间的F-Dx105(37℃，培养浓度4.5mg/ml)摄取。

图3显示：HeLa229细胞对培养液中不同F浓度时的F-Dx105(37℃培养4h，培养浓度4.5mg/ml)摄取。

图4显示：HeLa229细胞经不同浓度磷脂酶D预处理后，对F-Dx105(37℃培养4h，培养浓度4.5mg/ml)摄取。

图5显示：接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠瘤旁注射F-Dx105-FITC(左)或Dx105-FITC(右)24h后，肿瘤组织切片的荧光照片(圆形亮点为肿瘤细胞内荧光)。

图6显示：接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠(每组6只)瘤旁分别注射F-Dx105和Dx105(第1～6天：56mg/kg，第19天：526mg/kg)后的肿瘤体积(V=πab²/6)动态变化。

图7显示：三组接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠瘤旁给药33天后处死的在体瘤体大小比较(上图：空白组；左下图：Dx105；右下图：F-Dx105)。

图8显示：三组接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠瘤旁给药33天后处死的离体瘤体大小比较。

图9a显示：接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠空白对照组饲养33天后瘤体组织切片。

图9b显示：接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠Dx105组给药33天后瘤体组织切片。

图9c显示：接种HeLa229细胞的荷瘤裸小鼠F-Dx105组给药33天后瘤体组织切片。

以下借助非限制性实施例进一步描述本发明。实施例1  叶酸-多聚糖(F-PS)制备1.F-PS制备①叶酸-右旋糖酐(F-Dx)*Dx分子量影响●0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶剂，加入0.25g F和1.16g二环己基碳化二亚胺，然后加入溶于上述混合溶剂的Dx(分子量10，000)溶液(0.1g/ml)6ml，25℃避光反应20h，反应终止后抽滤，滤液注入丙酮中，产生淡黄色沉淀，抽滤收集沉淀物，真空干燥，得F-Dx粗品。用Sephadex G-15柱纯化，重蒸水洗脱，收集第一色谱段洗脱液，冷冻干燥，得F-Dx纯品。●Dx(分子量70，000)与F如上反应和处理。●Dx(分子量105，000)与F如上反应和处理。●Dx(分子量500，000)与F如上反应和处理。●Dx(分子量200，000)与F如上反应和处理。*F与Dx质量比影响●Dx(分子量105，000)与F反应质量比为2.4∶1(g／g)。如上反应和处理。●Dx(分子量105，000)与F反应质量比为1.71∶1(g／g)。如上反应和处理.●Dx(分子量105，000)与F反应质量比为1.33∶1(g／g)。如上反应和处理。●Dx(分子量105，000)与F反应质量比为1.20∶1(g／g)。如上反应和处理。②叶酸-聚蔗糖(F-Ficoll)

以0.6g Ficoll(分子量400，000)替代0.6g Dx(分子量10，000)，Ficoll与F的反应质量比为2.4∶1(g／g)，进行与F-Dx制备完全相同的反应和处理。③叶酸-糊精(F-Dextrin)

0.74g二甲氨基吡啶溶于8ml二甲基亚砜，加入0.25g F和1.16g二环己基碳化二亚胺，然后加入溶于二甲基亚砜的Dextrin (分子量4，500)溶液(0.15g/ml)4ml，后续制备及纯化方法与F-Dx制备及纯化方法相同。④叶酸-肝素(F-Heparin)

0.37g二甲氨基吡啶、0.125g F和0.58g二环己基碳化二亚胺，混合溶解于6ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶剂中，然后加入溶于上述混合溶剂的肝素钠(分子量2，000-6，000)溶液(0.03g/ml)10ml，后续反应与F-Dx制备相同，纯化方法除用洗脱液为5mM碳酸氢钠与0.1M氯化钠混合液外，其余均相同。⑤叶酸-***胶(F-Acacia)

以0.6g Acacia(分子量240，000-580，000)替代0.6g Dx(分子量10，000)，Acacia与F的反应质量比为2.4∶1(g/g)，除滤液注入乙醇中沉淀外，进行与F-Dx制备的反应和纯化方法相同。⑥二氢叶酸-右旋糖酐(F₂-Dx)

0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺／N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶剂，加入0.25g F₂和1.16g二环己基碳化二亚胺，然后加入溶于上述混合溶剂的Dx(分子量105，000)溶液(0.1g/ml)6ml，后续反应和纯化方法与F-Dx制备相同。⑦四氢叶酸-右旋糖酐(F₄-Dx)

0.74g二甲氨基吡啶溶于12ml甲酰胺/N，N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷(10∶9∶1)混合溶剂，加入0.25g F₄和1.16g二环己基碳化二亚胺，然后加入溶于上述混合溶剂的Dx(分子量105，000)溶液(0.1g/ml)6ml，后续反应和纯化方法与F-Dx制备相同。2.F-PS检测

用高效硅胶板作载体，氯仿∶甲醇∶乙酸(5/3/2)为展开***，上行展开后晾干，碘蒸气显色，未见样品中游离F点存在。分别将F-PS和F的0.4％氢氧化钠溶液样品在同上波长范围内扫描，F-PS样品在258、285和365nm处均与F有完全相同的特征吸收峰，且A258/A365比值均在2.9～3.1之间。以F为标准品，在365nm处测得F-PS样品中F结合率，结果如下：

不同分子量Dx的F结合率[Dx/F投料比：2.4/1(W/W)]Dx分子量      10，000(Dx10)  70，000(Dx70)  105，000(Dx105)  500，000(Dx500)  2000，000(Dx2000)F结合率(W／W)            8.51％       63.8％          8.98％           8.54％           8.41％分子比(F/Dx)      2∶1         11∶1           23∶1            105∶1           416∶1

Dx/F投料比对F结合率影响(Dx105)

Dx/F(W/W)         2.4∶1      1.71∶1      1.33∶1    120∶1

F结合率(W／W)     10±1％     16±1％      23±1％    25±1％

分子比(F/Dx)      26∶1       45∶1        71∶1      80∶1

Ficoll-400(分子量400，000)/F投料比2.4∶1(W/W)：

F结合率为12.04％(F/Ficoll分子比109∶1)

Dextrin-4.5(分子量4，500)/F投料比2.4∶1(W/W)：

F结合率为18.38％(F/Dextrin分子比1.87∶1)

Heparin(分子量2，000-6，000)/F投料比2.4∶1(W/W)：

F结合率为7.86％(F/Heparin分子比0.39-1.16∶1)

Acacia(分子量240，000-580，000)/F投料比2.4∶1(W/W)：

F结合率为4.53％(F/Acacia分子比25-62∶1)实施例2  叶酸-右旋糖酐-异硫氰荧光素(F-Dx105-FITC)制备1.右旋糖酐-异硫氰荧光素(F-Dx105-FITC)制备①乙酰丙酮铁(FAA)制备：1.84g乙酸钠和2g三氯化铁溶于6ml蒸馏水，加入12ml乙酰丙酮后，抽滤，真空干燥，得FAA粗品。将该粗品溶于蒸馏水，***萃取三次，合并后减压蒸去***，用60％甲醇溶液重结晶，得棕红色FAA结晶。m.p.183～184℃。②Dxl05-FITC制备：0.2g Dxl05、20mgFITC和20mg FAA溶于2m1二甲亚砜，95℃避光反应2h，抽滤，80～90℃真空干燥2h，得Dx105-FITC粗品。用Sephadex G-15柱层析纯化，冻干，得Dx105-FITC纯品。③ Dx105-FITC检测：用高效硅胶板作载体，氯仿∶甲醇∶氨水(6/3.5/0.5)为展开***，上行展开后晾干，在254nm波长灯光下观察，未见样品中游离FITC点存在。分别将Dx105-FITC和FITC的0.4％氢氧化钠溶液样品在230～550nm波长范围内扫描，Dx105-FITC样品与FITC在492nm处均有完全相同的特征吸收峰。以FITC为标准品，在492nm处测得Dx105-FITC样品中FITC结合率为3.6‰(W/W)。2.叶酸-右旋糖酐-异硫氰荧光素(F-Dx105-FITC)制备①F-Dx-FITC制备：Dx105-FITC与F投料质量比为2.4∶1，制备方法与实例1中F-Dx制备方法相同。粗品用Sephadex G-15柱层析纯化，冻干，得F-Dx105-FITC纯品。②F-Dx105-FITC检测：F-Dx105-FITC中游离F的定性检测和结合F的定量测定方法与实例1中F-PS检测方法相同。F-Dx105-FITC样品中F结合率为7.43％(W/W)。实施例3体外HeLa229细胞通过F受体对F-Dx105选择性摄取

用10％小牛血清(NCS)/RPMI-1640培养液对HeLa229细胞(一种人子***细胞，中国科学院上海细胞研究所提供)在六孔培养板上贴壁预先培养(37℃的CO₂培养箱)24h。每孔(φ33mm)含2×10⁵HeLa细胞。临用前弃去原培养液。1.样品浓度对摄取影响

分别加1ml RPMI-1640培养液配制的各浓度F-Dx105-FITC溶液(0.612、1.125、2.25、4.50mg/ml)和Dx105-FITC溶液(0.585、1.17、2.34、4.68mg/ml)于含预先培养HeLa229细胞的孔内，37℃的CO₂培养箱各培养4h。每孔用2ml磷酸盐缓冲液洗涤4次，1.5ml 1％TritonX-100磷酸缓冲液(pH7.4)破细胞。用荧光分光光度计在492nm/512nm处测定细胞溶解液荧光值(OD)。结果表明，随着F-Dx105-FITC浓度增大，HeLa229细胞摄取量明显增加，而递增幅度逐渐减缓，但均显著高于Dx105-FITC(见图1)。2.培养时间对摄取影响

加1ml RPMI-1640培养液配制的4.50mg／ml F-Dx105-FITC溶液于预先培养HeLa229细胞的孔内，37℃的CO₂培养箱分别培养0.5、1、2和4h。同上处理后测定荧光值(OD)。结果表明，随着培养时间延长，HeLa229细胞摄取F-Dx105-FITC量明显增加，但递增幅度逐渐减缓(见图2)。3.游离叶酸对摄取影响

分别加1ml RPMI-1640培养液配制的内含游离F 2.3×10^-6、33×10^-5、1.2×10^-5、1.0×10^-4、1.0×10^-3、1.0×10^-2mol／l的4.50mg／mlF-Dx105-FITC溶液于预先培养HeLa229细胞的孔内，37℃的CO₂培养箱分别培养4h。同上处理后测定荧光值(OD)。结果表明，随着培养液中F加入量增加，HeLa229细胞摄取F-Dx105-FITC量显著降低(见图3)。4.酶处理对摄取影响

分别先用内含磷脂酶D(PLD，卷心菜内提得)0、0.075、0.15、0.30和0.60mg/ml的RPMI-1640培养液处理15min，弃去后用1mlRPMI-1640培养液洗涤二次。分别加1ml RPMI-1640培养液配制的4.50mg／ml F-Dx105-FITC溶液于处理后的HeLa229细胞的孔内，37℃的CO₂培养箱分别培养4h。同上处理后测定荧光值(OD)。结果表明，随着处理液中PLD浓度提高，HeLa229细胞摄取F-Dx105-FITC量显著降低(见图4)。实施例4体内HeLa229细胞对F-Dx105选择性摄取1.HeLa229荷瘤裸小鼠模型建立

BALB／C裸小鼠(18±1g；雌性；上海市肿瘤研究所提供)右前肢近腋下皮下接种0.1ml(1×10⁷)HeLa细胞(中国科学院上海细胞研究所提供)后，饲养于SPF屏障***内，使HeLa细胞在体内连续传代生成较大瘤块后处死，在无菌条件下，取瘤块切成直径约2mm大小，用20号套管针移植于同规格裸小鼠的相同部位，饲养10天，待用。2.体内HeLa229细胞摄取F-Dx105

HeLa229荷瘤裸小鼠二组(每组3只)，分别于瘤旁皮下注射0.1mlF-Dx105-FITC(5.7mg)和Dx105-FITC(5.7mg)，饲养24h后处死，取瘤块，组织切片，在相同视野内用荧光和相差显微镜对比观察并与摄片记录。结果表明，F-Dx105-FITC扩散至肿瘤组织后能明显进入HeLa229细胞内(见图5)。实施例5 F-Dx105抑瘤作用

HeLa229荷瘤裸小鼠三组(每组6只)，其中二组分别于瘤旁皮下每天每只注射0.1ml F-Dx105(1.12mg)和Dx105(1.12mg)，连续给药6天，第20天再分别每只一次性各补注射0.3ml F-Dx105(10.52mg)和Dx105(10.52mg)；空白对照组不注射任何药液。三组动物均共饲养33天。1.瘤体动态变化

三组HeLa229荷瘤裸小鼠于给药后每隔一定天数测定瘤体大小，即用卡尺测量瘤体长径(a)和垂直于长径的最大横径(b)，按V=πab²/6经验公式计算瘤体大小。结果表明，F-Dx105组瘤体生长速率明显慢于Dx105组和空白对照组；补加高浓度药液后，F-Dx105组瘤体生长显著受到抑制，且在饲养期内未见瘤体反跳(见图6)。2.抑瘤率

三组HeLa229荷瘤裸小鼠于给药33天后处死(见图7)，取瘤体(见图8)称重，按(1-实验组瘤重/空白对照组瘤重)×100％式计算。结果表明，F-Dx105抑瘤率可达70％以上，而Dx105未表现出明显抑瘤率(见下表)。

组别      动物数(始/末)    瘤重(mg)    抑瘤率(％)

空白对照      6/6        393.6±201.6    -

Dx105         6/6        416.1±286.7    -1.03

F-Dx105       6/6        98.4±38.3      74.363.瘤组织形态观察

三组瘤体组织固定后分别取材，常规切片和染色后封固在载玻片上，用相差显微镜观察并摄片记录(见图9a、9b和9c)。结果表明，与空白对照组相比，F-Dx105组的瘤组织中肿瘤细胞大量死亡或崩解，并出现许多空心囊泡，而Dx105组的瘤组织仅见部分纤维化和少量肿瘤细胞死亡。4.瘤组织中癌细胞DNA指数测定

三组瘤体组织固定后分别取材，梯度酒精脱水、石蜡包埋、切成5μm厚白片置于载玻片上，用改良的Feulgen-天兰A法染色后封固。用图象细胞光度计(Image Cytometer，CAS-200)测定每张组织切片中50个肿瘤细胞和淋巴细胞(作为正常对照细胞)DNA含量，并按下式计算瘤组织中肿瘤细胞DNA指数(DI；DI值越接近于1，癌细胞恶性程度越低或疗效越好)：

结果表明，F-Dx105组和Dx105组的DI值分别为为空白对照组DI值的66％和89％(见下表)。

组别       切片(份)    DNA主峰质量(mg)       DI

空白对照     6          25.59±2.95      3.51±0.33

Dx105对照    6          22.35±0.58      3．11±0.08

F-Dx105      6          16.74±0.83      2．33±0.12实施例6 F-Dx105对小鼠毒性试验

昆明种小鼠(20～22g)20只，按雌雄分组，每组10只。给药前禁食3小时，称重。小鼠尾静脉注射F-Dx105(浓度50mg／ml)，给药剂量为1500mg/kg，注射容量为0.3ml/10g。给药后，每天观察小鼠外观、活动、行为和中毒鼠数，7天后处死，检查主要脏器。结果表明，小鼠静脉注射1500mg/kg的F-Dx105后，未见小鼠异常反应，一周内活动正常，体重增加，无一小鼠死亡，主要脏器未见异常。实施例7 F-Dx105组合物制剂1.冻干剂

在搅拌条件下，将1.25g F-Dx105溶解于注射用水中，稀释至25ml，配制成浓度为50mg/ml溶液。每10ml管子瓶分装2ml溶液，在冷冻干燥机内干燥48小时，制成有良好形状的疏松絮状冻干品，加塞后压铝盖。2.干糖浆剂①33.0g叶酸-右旋糖酐、7.4g氢氧化铝、3.2g三硅酸镁，充分混匀后，灌装于10瓶各150ml容积的瓶内。临用时，每瓶加100ml温水，振摇至混悬。②33.0g叶酸-右旋糖酐、5.0g碳酸氢钠，充分混匀后，灌装于10瓶各150ml容积的瓶内。临用时，每瓶加100ml水，振摇至溶解。3.肠溶胶囊剂

10.0g叶酸-右旋糖酐、0.2g硬脂酸镁，充分混匀后，灌装于1号肠溶胶囊内。每粒含叶酸-右旋糖酐100mg。

Claims (12)

1．一种叶酸-多聚糖复合物，其特征在于具有以下通式组成：

                             X-Y

其中：X为叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质；Y为不同种类多聚糖。

2．按权利要求1所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的叶酸及其衍生物或其它可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质是叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢蝶呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸、8-去氮叶酸等。

3．按权利要求1所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的多聚糖是葡聚糖类、聚蔗糖类、果聚糖类、杂聚多糖类、单或杂聚多糖硫酸酯类、单或杂聚糖醛酸多糖类和其它亲水性醇类高聚物。

4．按权利要求3所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的多聚糖分子范围为4，000～2000，000。

5．按权利要求3所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的葡聚糖类多聚糖是右旋糖酐。

6．按权利要求5所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量范围为10，000～2000，000。

7．按权利要求6所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量范围为10，000～150，000。

8．按权利要求7所述的叶酸-多聚糖复合物，其特征在于所述的右旋糖酐分子量为105，000。

9．一种叶酸-多聚糖复合物制备方法，其特征在于按下述方法制备：取叶酸和多聚糖，在吡啶类催化剂和碳化二亚胺类脱水剂作用下，缩合成叶酸-多聚糖复合物。

10．一种用于抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的叶酸-多聚糖复合物和药用辅料混合制成的叶酸-多聚糖复合物冻干粉针剂、干糖浆剂和肠溶胶囊剂等药物制剂。

11．按权利要求10所述叶酸-多聚糖复合物的组合物，其特征在于所述药物辅料可以是药剂学上允许的赋形剂、粘合剂、助悬剂、崩解剂、稀释剂、润滑剂、肠溶包衣材料、生物粘附材料、非水溶性骨架材料等辅料。

12．一种叶酸-多聚糖复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

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