CN1201737C - 千金藤素在制备抗sars病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用,是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物,在安全剂量范围内,对SARS病毒的抑制率高;强的预防SARS病毒感染的作用;愈后快,可以减轻感染病人的综合症状;药物毒性小,稳定性好,耐药性强。
Description
技术领域
本发明涉及药物领域,具体地是千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。
背景技术
自正式确定非典型肺炎的病原体为SARS冠状病毒以来,对于非典型肺炎及其病原体的防治和研究取得了极大进展,抗SARS冠状病毒药物和疫苗研制工作也在全力进行。SARS病毒是一种新型的冠状病毒,具有较强的传染性和变异性。目前SARS还缺乏特效的治疗,目前的治疗包括抗病毒治疗如利巴韦林,血清疗法等,用激素降低免疫***对肺的损伤,用抗生素治疗潜在的细菌感染,辨证的中西医结合治疗;呼吸机的应用以及应激和ARDS的对症支持治疗等。抗SARS药物研制目前尚处于初期阶段。国内外多家实验室用各种方式在不同水平正进行着抗SARS病毒药物的筛选工作。国内军事医学科学院研制的ω干扰素作为一种辅助性治疗SARS药物已通过鉴定,中国科学院上海药物研究所以非典病毒E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶作药靶,初步筛选到可能有抗SARS病毒活性的药物19种,但是尚未见到有明确抗SARS病毒药物的体外细胞实验结果报道。千金藤素为米黄色粉末,经图谱(红外、紫外、核磁、质谱)分析结果证明符合分子式C37H38N2O6,分子量为606.686,用非水滴定法测定纯度达95%以上。本品易溶于氯仿、甲醇、乙醇,不溶于水。临床上主要用于防治肿瘤患者因放、化疗及其它原因所致的白细胞减少症,是从防己科千金藤属(Stephanialour)植物中提取分离出来的生物碱。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷,提供千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。
本发明是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物,可采用常规的制备工艺,制备成不同的药物剂型供患者使用,如制成口服液、胶囊、粉剂、针剂等。
药物注射液的用法与用量:通常成人,一次50mg,一日一次,(与250ml 5%葡萄糖液混匀后,也可不加葡萄糖。)缓缓静脉滴注。
以千金藤素为有效成分制备的抗SARS病毒药物作用如下:
1、药物对细胞的保护作用
以不同浓度药物加到长满单层用于体外培养SARS病毒的Vero-E6细胞株Vero-E6细胞的96孔板中,培养2h后弃药液,接种100TCID50的SARS-CoV病毒液,37℃吸附5%CO2培养48h,观察药物处理后的细胞对SARS-CoV感染的影响。同时做单用病毒感染时的病毒对照、正常细胞对照。结果显示:在Vero-E6细胞上的最大无毒浓度为10μg/mL。
表1是用MTS/PMS法测定药物对Vero-E6细胞的毒性剂量试验结果
表1
千金藤素(μg/mL) | OD值 | 存活率 | ||||
M+sd | ||||||
100.00 | 0.285 | 0.287 | 0.287 | 0.280 | 0.285+0.003 | 16% |
50.00 | 0.258 | 0.254 | 0.259 | 0.246 | 0.254+0.006 | 14% |
25.00 | 0.672 | 0.532 | 0.708 | 0.637 | 0.637+0.076 | 35% |
12.50 | 1.215 | 1.157 | 1.129 | 1.359 | 1.215+0.102 | 66% |
6.25 | 1.761 | 1.751 | 1.812 | 1.722 | 1.762+0.038 | 91% |
3.13 | 1.797 | 1.808 | 1.819 | 1.808 | 1.808+0.009 | 100% |
1.56 | 1.759 | 1.754 | 1.757 | 1.745 | 1.753+0.006 | 97% |
细胞对照 | 1.815 | 1.791 | 1.796 | 1.801 | 1.801+0.010 | 100% |
根据CC50综合法求得CC50 21.38ug/mL,即千金藤素对Vero-E6细胞的半致死剂量为21.38ug/ml。
2、药物的抗SARS病毒作用
用细胞病变(CPE)法观察得千金藤素在不同情况下的效果。表2是不同剂量的千金藤素作用48h后,SARS-CoV感染的Vero-E6细胞病变情况
表2
千金藤素(μg/mL) | 预防作用 | 治疗作用 | 直接杀伤作用 | 综合作用 |
0.5 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
1 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
2 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
4 | ++++ | +++ | +++ | ++++ |
6 | +++ | ++ | +++ | +++ |
8 | +++ | + | ++ | ++ |
10 | + | ---- | ---- | ---- |
细胞对照 | ---- | ---- | ---- | ---- |
病毒对照 | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ |
注:“+”为CPE等级,0~25%为+、25%~50%为++、50%~75%为+++、75%~100%为++++
结果显示;
(1)药物对SARS-CoV增殖的影响
接种100TCID50的SARS-CoV于长满单层Vero-E6细胞的96孔板上,37℃吸附2h,换上含相应浓度药物的维持液,继续培养48h,观察药物对SARS-CoV增殖的影响。结果显示;千金藤素对SARS-CoV的半抑制剂量为8ug/ml。
(2)药物对SARS-CoV的直接杀伤作用
含不同浓度药物的维持液与等量病毒液后,置37℃作用2h后,将孵育液加入长满单层Vero-E6细胞的96孔板中,0.1ml/孔,37℃吸附1h,换上含相应浓度药物的维持液,继续培养48h,观察药物对SARS-CoV的直接杀伤作用。结果显示:不同浓度药物与病毒等量混合2h后,在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV皆有全抑制作用。
(3)药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用
药物和病毒等量混合后直接加到长满单层Vero-E6细胞的96孔板上37℃吸附2h,弃混合液加维持液,继续培养4gh,观察药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用。结果显示:千金藤素对SARS-CoV感染细胞的综合作用效果为:8ug/ml有抑制作用,浓度为10ug/ml时,对SARS-CoV病毒有100%的抑制效果。
(4)药物对病毒感染细胞的预防作用
不同浓度药物预先与细胞作用2h后,接种病毒,千金藤素在10μg/mL时可以66%抑制SARS病毒感染的Vero-E6细胞病变。
(5)药物对病毒感染细胞的治疗作用
千金藤素在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV有全部抑制作用。
本发明与现有技术相比具有如下优点:
1、在安全剂量范围内,对SARS病毒的抑制率高。
2、有较强的预防SARS病毒感染的作用。
3、愈后快,可以减轻感染病人的综合症状。
4、药物毒性小,稳定性好,耐药性强。
附图说明
图1是Vero-E6正常细胞图;
图2是Vero-E6细胞被SARS-CoV感染后病变图;
图3是千金藤素药物对被SARS-CoV感染的Vero-E6细胞的保护效果图。
具体实施方式
如图1所示,正常Vero-E6细胞贴壁生长,具有贴壁细胞的一般特性,细胞之间空隙小。如图2所示,Vero-E6细胞被SARS-CoV感染后,细胞从壁上脱落,细胞碎裂。如图3所示,被SARS-CoV感染Vero-E6细胞加入千金藤素处理后,仅有部分细胞从壁上脱落,大部分细胞的形态与正常细胞相同。
实施例1
1、实验材料 受试药物是千金藤素,实验时用生理盐水配成混悬液,供实验用。
2、实验动物 昆明种小鼠,体重(20±2)g;Wistar大鼠,体重(270±20)g;C57BL/6小鼠,体重(20±2)g。
3、经口灌胃给药的急、慢性毒性试验 ①对小鼠急性毒性(LD50)及最大耐受量测定试验:取预先空腹12h的动物30只,随机分为3组,每组10只,各剂量组间间距为0.85。将千金藤素分别配成浓度为(2.0,1.7,1.4%),然后给动物0.4ml·10g-1体重,1次ig,最大剂量为800mg·kg-1,观察1周,所有动物一般情况良好,无任何毒性反应及死亡。在此基础上进行1天内最大耐受量试验;另取动物20只,雌雄各半,禁食(不禁水)12h,然后按上法给动物1天2.0%的浓度ig两次,总量达1600mg·kg-1,,相当于人用量1.0mg·kg-1的1000倍以上,仅有少数动物出现少动,停止饮水和进食,持续2~3h后,即恢复正常,无动物死亡。表明,千金藤素对昆明种小鼠ig途径给药的最大耐受剂量为1600mg·kg-1。②对大鼠的长期毒性实验:取大鼠60只,随机分为3组,每组20只,雌雄各半。(a)对照组:NS,20ml·kg-1,ig;(b)和(c)组为千金藤素组,剂量分别为40,80mg·kg-1,ig(相当于人用量的40,80倍),每日1次,连用60d,ig;给药。在用药期间每日观察动物一般情况(活动、毛发、食量、大便等),每10d称1次体重;在用药30d及60d时测定血象(白细胞总数及分类,血小板、红细胞、血色素),肝肾功能,试验结束,处死各组部分动物,剖取主要脏器(心、肺、肝、脾、肾、肠、胃、睾丸、子宫)进行病理组织学检查。其结果为各组所有动物一般情况良好;大剂量组动物体重增长较慢,而对血象、肝肾功能及各主要脏器的病理组织学均无明显影响,与对照组相比,无差异。
实施例2
对人进行的临床试验,试验组用药,千金藤素注射液的用法与用量:一次50mg,一日一次,缓缓静脉滴注。对照组注射生理盐水,其病情状况如表3所示,治愈时间如表4所示:
表3:病情状况
组别 n 减轻 稳定 加重 Ridit检验
试验组 30 19 8 3(0)
对照组 28 2 16 10(2) P<0.05
该表结果显示:试验组(即使用RD-01治疗组)的病人比对照组的病人在病情上有较大的减轻。
表4:治愈时间
组别 n 缩短 基本不变 延长 Ridit检验
试验组 30 21 7 2
对照组 28 3 10 17(2) P<0.05
注;()号内的数字为死亡人数。
该表结果显示:试验组(即使用RD-01治疗组)的病人在治疗时间比对照组有较大的缩短。
Claims (2)
1、一种千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用,是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物。
2、根据权利要求1所述的千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用,制备的药物剂型是口服液、胶囊、粉剂、或针剂。
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