CN104116755A - 一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，所述各组分的质量份配比为灵芝多糖10~250、枸杞多糖1~50、黄精多糖2~10。该灵芝、枸杞及黄精复合多糖的纯度及活性高，具有调节肿瘤微环境的功效。还公开了上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，该制备方法工艺简单、稳定高效，适合工业化生产，成本低，本发明还公开了上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖在制备具有调节肿瘤微环境功效的保健食品中的应用。

Description

一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多糖技术领域，具体涉及一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖及其制备方法和应用。 
背景技术
肿瘤复发和转移是困扰临床肿瘤治疗的具有普遍意义的难题，究其原因，在于现有治疗的目标仍然集中在肿瘤细胞本身，而忽略了其微环境的重要性。肿瘤微环境与肿瘤细胞之间是土壤与种子的关系，肿瘤恶变过程，就是肿瘤细胞与其微环境共进化的过程，其结果就是休眠肿瘤细胞的苏醒，进入快速增殖，并发生转移。因此，改善肿瘤微环境，维持肿瘤细胞的休眠状态，是目前研究的热点和重点。近年来的研究发现，多糖就具有显著地抗肿瘤活性并且对人体的毒副作用相对较小，对多糖的生物活性研究在医学领域已经成为国内外专家学者研究的热点。近年发现一些多糖及其复合物对多种疾病，如免疫紊乱、癌症、糖尿病、高血压、肝炎、血栓、肺炎、病毒等都具有显著疗效，并且参与细胞各种生命现象的调节并具有调节肿瘤微环境的作用。 
灵芝原产于亚洲东部，中国分布最广的在江西，灵芝作为拥有数千年药用历史的中国传统珍贵药材，具备很高的药用价值，经过科研机构数十年的现代药理学研究证实，灵芝对于增强人体免疫力，调节血糖，控制血压，辅助肿瘤放化疗，保肝护肝，促进睡眠等方面均具有显著疗效。枸杞是名贵的药材和滋补品，中医很早就有“枸杞养生”的说法。《本草纲目》记载：“枸杞，补肾生精，养肝……明目安神，令人长寿。”， 黄精是一种常用中药，黄精以根茎入药。具有补气养阴，健脾，润肺，益肾功能，用于治疗脾胃虚弱，体倦乏力，口干食少，肺虚燥咳，精血不足，内热消渴等症。 
 目前尚未有人以灵芝、枸杞和黄精为原料提取多糖并配制复合多糖，并用于辅助抑制肿瘤保健食品方面的应用。 
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题在于提供一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，该复合多糖具有调节肿瘤微环境的功效。 
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供上述具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，该方法工艺简单、稳定高效，适合工业化生产，成本低。 
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供上述具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖在制备具有调节肿瘤微环境功效的保健食品中的应用。 
本发明所要解决的第一个技术问题是通过如下技术方案来实现的：一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，所述各组分的质量份配配比为灵芝多糖10~250、枸杞多糖1~50、黄精多糖 2~10。 
本发明各原料的质量份配比进一步优选为：灵芝多糖50~150、枸杞多糖20~40、黄精多糖4 ~8。 
本发明各原料的质量份配配比最佳为：所述各组分的质量份配比为灵芝多糖125、枸杞多糖10、黄精多糖4。 
作为本发明的优选的一种实施方式，本发明所述的灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖通过以下方法制备获得：选取灵芝、枸杞或黄精原料，采用沸水提取多次，合并提取液并浓缩得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋进行透析得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，取上清液进行中和、透析处理得透析液b2，将透析液b2浓缩得浓缩液a3，在浓缩液a3中加入乙醇水溶液进行醇沉处理，所得沉淀物经干燥处理即为灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖。 
本发明灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖的制备过程中： 
采用沸水提取时，共提取1~5次，每次提取时沸水的用量为灵芝、枸杞或黄精原料总质量的10~20倍，每次提取时间为4~5h。
所述的三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为15~35%，其用量与浓缩液a2的体积相同，进行蛋白沉淀时间为3~4h。 
所述的乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70~95%，乙醇水溶液的用量为浓缩液a3总体积的2~4倍。 
优选将透析液b1浓缩至原体积的1/10左右得浓缩液a2，将透析液b2浓缩至原体积的1/10左右得浓缩液a3。 
透析袋的截留分子量约为3500 Da。 
本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，包括以下步骤： 
（1）选取灵芝、枸杞或黄精原料，采用沸水提取多次，合并提取液并浓缩得浓缩液a1；
（2）将浓缩液a1采用透析袋透析得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2；
（3）在浓缩液a2中加入三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，取上清液进行中和、透析处理得透析液b2，将透析液b2浓缩得浓缩液a3；
（4）在浓缩液a3中加入乙醇水溶液进行醇沉处理，所得沉淀物经干燥处理即为灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖；
（5）将灵芝多糖、枸杞及黄精多糖按照上述计量配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
在该灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法中： 
步骤（1）中采用沸水提取时共提取1~5次，每次提取时沸水的用量优选为灵芝、枸杞或黄精原料总质量的10~20倍，每次提取时间优选为4~5h；步骤（3）中所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量优选为15~35%，其用量优选与浓缩液a2的体积相同，进行蛋白沉淀时间优选为3~4h；步骤（4）中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量优选为70~95%，乙醇水溶液的用量优选为浓缩液a3总体积的2~4倍。
步骤（3）中优选将透析液b1浓缩至原体积的1/10左右得浓缩液a2，步骤（3）中优选将透析液b2浓缩至原体积的1/10左右得浓缩液a3。 
步骤（2）和步骤（3）中透析袋的截留分子量约为3500 Da。 
本发明所要解决的第三个技术问题是通过以下技术方案来实现的：上述具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖在制备具有调节肿瘤微环境功效的保健食品中的应用 
本发明所述保健食品的剂型可以为胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等。
与现有技术相比，本发明具有如下优点： 
（1）本发明中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制及免疫负调控等多途径调节肿瘤微环境，其具有良好的抗肿瘤活性，其可以直接口服，也可以制成药剂学上所说的多种剂型，如胶囊型、片剂、粉剂、颗粒剂或口服液等，食用后具有调节肿瘤微环境以及辅助抑制肿瘤的功效；
（2）本发明中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖以富含活性多糖的中草药为主料，利用各种多糖成分合理组合、配合共用，通过多种途径调节肿瘤微环境以及辅助抑制肿瘤，对亚健康保健具有良好的效果；
（3）本发明中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，其工艺简单、稳定高效，适合工业化生产，成本低。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。 
以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。 
第一部分灵芝、枸杞及黄精复合多糖及其制备方法
实施例1
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分质量份配比为灵芝多糖10、枸杞多糖50及黄精多糖2。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水30L，加热煮沸提取，共提取3次，每次提取5小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋（截留分子量为3500 Da，同下）和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩至原体积的1/10得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为30%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析（截留分子量为3500 Da，同下）大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为85%，用量约为浓缩液a3的3倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照灵芝多糖10、枸杞多糖50及黄精多糖2的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例2
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分质量份配比为灵芝多糖250、枸杞多糖1及黄精多糖5。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水60L，加热煮沸提取，共提取3次，每次提取4小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋）和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为15%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70%，用量约为浓缩液a3的3倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照灵芝多糖250、枸杞多糖1及黄精多糖5的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例3
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分的质量份配比为灵芝多糖100、枸杞多糖20、枸杞多糖4。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水30L，加热煮沸提取，共提取3次，每次提取5小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为35%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为80%，用量约为浓缩液a3的3倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及枸杞多糖按照灵芝多糖100、枸杞多糖20及黄精多糖6的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例4
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分质量份配比为灵芝多糖150、枸杞多糖40及黄精多糖6。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水60L，加热煮沸提取，共提取5次，每次提取4小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为20%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析（截留大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为80%，用量约为浓缩液a3的4倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照灵芝多糖150、枸杞多糖40及黄精多糖6的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例5
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分质量份配比为灵芝多糖100、枸杞多糖30、黄精多糖8。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水40L，加热煮沸提取，共提取5次，每次提取5小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为35%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为95%，用量约为浓缩液a3的3倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照灵芝多糖100、枸杞多糖30及黄精多糖8的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例6
本实施例中的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，其中各组分质量份配比为灵芝多糖200、枸杞多糖25、黄精多糖5。
上述灵芝、枸杞及黄精复合多糖通过以下方法制备获得： 
（1）制备灵芝多糖：选取灵芝药材3kg，加入水50L，加热煮沸提取，共提取5次，每次提取4小时，合并提取液并浓缩至约5L得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋和对流水进行透析大约2天后得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入等体积的三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，其中三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为20%，温度为4℃，去蛋白时间约为3~4h，除去蛋白沉淀取上清液采用氢氧化钠水溶液（其中氢氧化钠的质量百分含量约为10%）中和至中性得中性上清液，将中性上清液进行透析大约2天后得透析液b2，将透析液b2浓缩至大约3L得浓缩液a3，在浓缩液a3中边搅拌边加入乙醇水溶液进行醇沉处理，其中乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为80%，用量约为浓缩液a3的3倍，静置过夜，离心收集沉淀，沉淀分别用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，40℃真空干燥，所得沉淀物即为灵芝多糖；
（2）制备枸杞多糖及黄精多糖，制备方法同灵芝多糖；
（3）将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照灵芝多糖200、枸杞多糖25及黄精多糖5的质量份配比混匀，即制备获得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
实施例7
灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖的制备方法同实施例10，分别取灵芝多糖 55g、枸杞多糖5 g及黄精多糖1g混合均匀，得复合多糖组分P1。
实施例8
灵芝多糖和枸杞多糖的制备方法同实施例1，分别取灵芝多糖 100g、枸杞多糖15 g及黄精多糖1 g混合均匀，得复合多糖组分P2。
实施例9
灵芝多糖和枸杞多糖的制备方法同实施例1，分别取灵芝多糖 125g、枸杞多糖10 g及黄精多糖4 g混合均匀，得复合多糖组分P3。
实施例10
以上述实施例1-9中提供的复合多糖为主要功效成分制备保健食品，通过常规工艺，可以制成药剂学上所说的多种剂型，如胶囊剂、片剂、粉剂、颗粒或口服液等。
第二部分复合多糖及复合多糖辅助抑制肿瘤活性实验
实施例11复合多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性
C2C12细胞株购自中科院细胞库，C2C12- pGF1-BRE细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。C2C12- pGF1-BRE细胞用含10 % Gibco胎牛血清DMEM 培养基培养，置于37℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养，以1×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔100 μL。贴壁24 h后吸去60 μL培养基，加配置好相应浓度的多糖样品（P1、P2、P3）50 μL，终浓度分别为0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL，10 μL BMP2调整至终浓度200 ng/mL。同时设空白组和BMP2组对照。给药16 h后吸去培养基，加20 μL Reporter Lysis 1X Buffer，将溶解的细胞裂解液20 μL转移至白板，加入40 μLluciferase底物，于3分钟内读板，读取RLU值。采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x ±s) 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。
实施例12复合多糖对NF-кB报告基因的荧光素酶的活性
THP-1细胞株购自中科院细胞库，THP-1/pGF1-NF-кB细胞株由中国科学院上海药物研究所丁侃实验室构建，保存于液氮中。THP-1/pGF1-NF-кB细胞用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基培养。置于37 ℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养，以5×104细胞/孔的密度接种于96孔板内，每孔50 μL容积。加入受试样品50 μL（P1、P2、P3），终浓度分别为0.5 mg/mL、0.1 mg/mL、0.02 mg/mL，同时设立空白组和LPS对照组。加入LPS溶液10 μL，终浓度为1 μg/mL，置于37 ℃饱和湿度、含5% CO2的恒温箱中培养过夜。培养过夜后，每空加入100 μLBright-GloTM Luciferase Assay System底物，于酶标仪读板，读取RLU值。
采用SPSS 统计软件进行统计学处理。数据均以均数±标准差(.x ±s) 表示，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。 
实施例13 复合多糖能抑制小鼠S180移植瘤生成的活性
试验动物：ICR小鼠，6周龄，雌性，体重20 ± 1 g，购自上海SLAC公司。
a) 复苏S180细胞，RPMI 1640 + 10% FBS培养传2代后，收集细胞，用PBS重悬至1 ~ 2 × 106 cells/0.2 mL/mouse，i.p.接种。 
b) 观察到第一代的种鼠肚子较大后（一般约8 ~ 9天左右），可以传代。传代时取1 mL注射器，种鼠腹部消毒后直接将针头***抽取腹水即可，注意不要把针头插得很深，尽量浅一点，还可以把老鼠拎起来，利用重力，让腹水集中在某处便于抽取，一般抽0.5 mL就可以了，注意放置于冰上，不用离心，直接用生理盐水稀释3 ~ 6倍后，接种到新的老鼠腹腔，腹水颜色为白色或者略有发黄都是正常的，但是血性腹水说明不好，需要注意调整。第二代以后，尽量6 ~ 7天的时候传代，不要等的时间太久，否则腹水容易血性，三代后可用于实验。 
c) 第0天开始实验时，抽取的腹水需要量比较多，一处死种鼠后，小心地用消毒眼科剪刀镊子剥开腹部皮肤，注意不要弄破肌肉，然后，用镊子拎起腹部的肌肉，用剪刀剪开一个小口，然后用玻璃滴管或者去掉针头的注射器吸取腹水。然后经过一定的稀释后（一般为1：1 ~ 1：4，细胞浓度为1 ~ 5 × 107 cells/mL之间），接种到小鼠的腋下。腋下接种24 h后，随机分组，每组6只，腹腔注射（i.p.）不同剂量的多糖溶液（P1、P2、P3），同时设溶媒组以及阳性药CTX组，每天1次，连续给药10天。 
d) 第11天结束实验，断颈处死小鼠，剥去肿瘤，称瘤重以及淋巴器官质量，计算淋巴器官指数： 
淋巴器官指数 = 淋巴器官重g / 100 × 体重g。
使用OriginPro 8或者GraphPad Prism 4软件行数据处理。两组数据间比较使用t-test以及Two-way ANOVO方法，而多组间比较则用One-way ANOVO方法进行统计学分析。p < 0.05具有统计学意义。 
将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照不同比例配制成复合多糖，该复合多糖调节肿瘤微环境生物活性测定结果见表1、表2和表3。结果表明，将灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖按照3种不同比例配制成的复合多糖在0.5 mg/mL浓度下同时具有抑制血管生成、免疫激活及抑制小鼠S180移植瘤生长等生物活性。三两种多糖合用，进行有效优化，从而得出最佳比例并进行组合搭配，当灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖的质量配比为灵芝多糖 125、枸杞多糖10 及黄精多糖4 时，抗肿瘤活性效果最好，通过配伍发挥了药物间的相辅相成作用，可明显提高疗效。 
综上实验证明该多糖复合物可通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫激活及抑制小鼠移植瘤生长等多途径发挥调节肿瘤微环境活性。 
表1 3种不同配比复合多糖可抑制BMP2诱导的带有BRE报告基因的荧光素酶的活性 
表2. 3种不同配比复合多糖能激活带有NF-кB报告基因的荧光素酶的活性
表3. 3种不同配比复合多糖能抑制小鼠S180移植瘤的生长
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：其活性成分由灵芝多糖、枸杞多糖及黄精多糖复配而成，所述各组分的质量份配比为灵芝多糖10 ~250、枸杞多糖1~ 50、黄精多糖 2 ~10。
2.根据权利要求1所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：所述各组分的质量份配比为灵芝多糖50~150、枸杞多糖20~ 40、黄精多糖4 ~8。
3.根据权利要求2所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：所述各组分的质量份配比为灵芝多糖125、枸杞多糖10、黄精多糖4。
4.根据权利要求1、2或3所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：所述的灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖通过以下方法制备获得：选取灵芝、枸杞或黄精原料，采用沸水提取多次，合并提取液并浓缩得浓缩液a1，将浓缩液a1采用透析袋进行透析得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2，在浓缩液a2中加入三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，取上清液进行中和、透析处理得透析液b2，将透析液b2浓缩得浓缩液a3，在浓缩液a3中加入乙醇水溶液进行醇沉处理，所得沉淀物经干燥处理即为灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖。
5.根据权利要求4所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：采用沸水提取时，共提取1~5次，每次提取时沸水的用量为灵芝、枸杞或黄精原料总质量的10~20倍，每次提取时间为4~5h。
6.根据权利要求4所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：所述的三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为15~35%，其用量与浓缩液a2的体积相同，进行蛋白沉淀的时间为3~4h。
7.根据权利要求4所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖，其特征是：所述的乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70~95%，乙醇水溶液的用量为浓缩液a3总体积的2~4倍。
8.权利要求1、2或3所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）选取灵芝、枸杞或黄精原料，采用沸水提取多次，合并提取液并浓缩得浓缩液a1；
（2）将浓缩液a1采用透析袋透析得透析液b1，将透析液b1浓缩后得浓缩液a2；
（3）在浓缩液a2中加入三氯乙酸水溶液进行蛋白沉淀后离心，取上清液进行中和、透析处理得透析液b2，将透析液b2浓缩得浓缩液a3；
（4）在浓缩液a3中加入乙醇水溶液进行醇沉处理，所得沉淀物经干燥处理即为灵芝多糖、枸杞多糖或黄精多糖；
（5）将灵芝多糖、枸杞及黄精多糖按照上述计量比混匀，即制得灵芝、枸杞及黄精复合多糖。
9.根据权利要求8所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖的制备方法，其特征是：步骤（1）中采用沸水提取时共提取1~5次，每次提取时沸水的用量为灵芝、枸杞或黄精原料总质量的10~20倍，每次提取时间为4~5h；步骤（3）中所述三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的体积百分含量为15~35%，其用量与浓缩液a2的体积相同，进行蛋白沉淀时间为3~4h；步骤（4）中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为70~95%，乙醇水溶液的用量为浓缩液a3总体积的2~4倍。
10.权利要求1、2或3所述的具有调节肿瘤微环境功效的灵芝、枸杞及黄精复合多糖在制备具有调节肿瘤微环境功效的保健食品中的应用。
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