CN1285753A - 透皮给药微粒疫苗组合物 - Google Patents

透皮给药微粒疫苗组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN1285753A
CN1285753A CN98812843A CN98812843A CN1285753A CN 1285753 A CN1285753 A CN 1285753A CN 98812843 A CN98812843 A CN 98812843A CN 98812843 A CN98812843 A CN 98812843A CN 1285753 A CN1285753 A CN 1285753A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
compositions
adjuvant
vaccine
main body
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98812843A
Other languages
English (en)
Inventor
D·萨菲尔
W·F·斯瓦因
G·J·威德拉
R·J·德拉珀
D·陈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Powderject Vaccines Inc
Original Assignee
Powderject Vaccines Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Powderject Vaccines Inc filed Critical Powderject Vaccines Inc
Publication of CN1285753A publication Critical patent/CN1285753A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0021—Intradermal administration, e.g. through microneedle arrays, needleless injectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了一种提高所选抗原的免疫反应的方法。该方法需要透皮给药微粒佐剂组合物,优选使用无针注射器***。本发明还描述了由药物组合物形成结晶粒子,然后将其输送到主体的方法。该结晶组合物特别适宜使用无针注射器***透皮给药疫苗。

Description

透皮给药微粒疫苗组合物
本发明涉及微粒组合物。更具体地说，本发明涉及递送微粒组合物的方法，即由药物组合物形成结晶粒子，然后将其递送到主体的方法。该微粒组合物特别适宜使用无针注射器***透皮给予疫苗。
在非肠道递送技术中，将药物递送到皮肤表面内和通过皮肤表面(透皮给药)的能力具有许多优点。特别是，与传统给药***相比，透皮给药安全、方便和无伤害，并且避免了与非肠道递送相伴的主要问题，如针刺疼痛、被处理的个体感染的危险性、偶尔被针杆和一次性使用的针给保健工作者带来的污染或感染的危险性。此外，该递送还对所给药的血浓度给予了高度控制。
最近，已描述了一种新型透皮给药药物***，它需要使用无针注射器以控制剂量，从而将含固体药物的微粒射入无伤皮肤和通过无伤皮肤。特别是，Bellhouse等人拥有的US5630796描述了一种无针注射器，它递送以超声气流传送的药物粒子。将该无针注射器(也称之为“PowderJect无针注射设备”)用于透皮给予粉状药物化合物和组合物，用于将基因物料递送到活细胞(例如基因疗法)和用于将生物药品递送到皮肤、肌肉、血液或淋巴。也可以将无针注射器与外科结合用于向器官表面、固体肿瘤和/或手术腔(例如肿瘤床或切除肿瘤之后的空腔)递送药物和生物制剂。使用该设备可以安全且容易地递送能够适宜以大致为固体、微粒形式制备的药物试剂。
一个具体的无针注射器通常包括一细长管状喷嘴，它具有起初封住该喷嘴中的气道并大致放在该喷嘴上游端处的可破裂膜片。待传送的药剂粒子经处理位于该可破裂膜片处并使用一发动装置传送，该发动装置将一气压作用在该膜片上游一面，该气压足以破裂该膜片并在喷嘴中产生超声气流(含药物粒子)以从其下游端递送。因此可以将这些粒子以1-8马赫数的传送速度从无针注射器传送，该传送速度可以通过破裂可破裂膜片容易地获得。
另一种无针注射器的结构通常包括如上所述的相同元件，只是代替在超声气流中传送的药物粒子，喷嘴下游端配备有一双稳态膜片，该膜片可在静止“反向”位置(其中膜片在下游面上有一凹面以含药物粒子)和活动“外翻”位置(其中膜片上游面的超声冲击波作用的结果，使得其下游面向外凸出)之间移动。在这种方式中，膜片凹面中所含的药物粒子以超声初速度从透皮给药设备推到目标皮肤或粘膜表面。
使用上述无针注射器结构对粒径范围通常约为0.1-250μm的粒子进行透皮给药。大于约250μm的粒子也可以由该设备传送，其上限是粒子大小对皮肤细胞带来事与愿违的伤害。所传送的粒子渗透的实际距离取决于粒子大小(例如名义粒径是假定粒子为球形)、粒子密度、粒子冲击皮肤表面的初速度、以及皮肤密度和运动粘度。用于无针注射的靶子粒子密度通常为约0.1-250g/cm3，注射速度通常为约200-3000m/sec。
无针注射器的特别独特的特性是所传送粒子渗透深度的严格控制能力，由此使得目标给药到达不同位置。例如，可以选择粒子特征和/或设备操作参数，从而提供例如不同的真皮内或皮下传送的渗透深度。一种途径需要选择粒子大小、粒子密度和初速度以提供约2-10kg/sec/m，更优选约4-7kg/sec/m的动量密度(例如，粒子动量除以粒子正面面积)。对动量密度的这种控制能够达到药物粒子的精确控制的、组织选择性的传送。
上述***提供了一种将疫苗抗原传送到皮肤或组织中或通过皮肤或组织的独特装置。但是，为了增加抗原效力，许多抗原需要使用免疫佐剂。免疫佐剂起着增加细胞间和体液的免疫反应。这些佐剂包括贮存佐剂、吸附和/或沉淀所给抗原和用于在注射位置留住抗原的化合物。典型贮存佐剂包括铝化合物和油包水型乳液。
贮存佐剂尽管增加了抗原性，但是当皮下或肌内注射时，经常招致严重持久的局部反应，例如风湿性肉芽肿、脓肿和瘢痕形成。其它佐剂，例如脂多糖和胞壁酰二肽，可以由注射引起生热反应和/或莱特尔氏综合征(流感类症状、弥散性关节不适和有时前眼色素层炎、关节炎和尿道炎)。因此，需要有一有效和安全连续传送佐剂的方法，从而提高给定抗原的免疫反应。
本发明提供了独特佐剂和疫苗组合物和传送微粒药物组合物的独特***，该药物组合物包括疫苗和其它药剂。本发明也提供了制备微粒药物组合物的新型方法。
在一个实施方式中，提供了一种提高所选抗原免疫性的方法。该方法包括：
(a)将有效量的抗原投向脊椎动物主体；和
(b)给予足以提高抗原免疫性的量的微粒佐剂组合物，其中将佐剂传送进或通过脊椎动物主体的皮肤或组织，其中还使用透皮给药技术进行给药。
抗原和佐剂可以出现在相同或不同组合物中，并且可以给药到脊椎动物主体的相同或不同位置。而且，可以在佐剂组合物之前或之后或与之同时给予抗原。
在特别优选的实施方式中，使用无针注射器传送装置给予佐剂和/或抗原。
在另一实施方式中，本发明涉及在脊椎动物主体中引起免疫反应的方法。该方法包括将微粒疫苗组合物透皮给药到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中。该微粒疫苗组合物包括：
(a)有效量的所选抗原；和
(b)其量足以提高抗原免疫性的佐剂。
在又一实施方式中，本发明涉及适宜使用透皮给药技术传送到脊椎动物主体皮肤或组织中或通过其中的微粒佐剂组合物。可以将该微粒佐剂组合物通过向脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中给予足以引起生理效应的量的微粒佐剂组合物用于引起生理效应。
在另一实施方式中，提供了一种将传统药物制剂转变成最好使用无针注射器透皮给药的结晶粒子的方法。因此，在本发明的一个方面，将液态药物制剂(例如，或者以含水形式，或者以重组冻干产物)与适宜赋形剂例如糖混合，然后干燥得到结晶组合物。该赋形剂经选择，使其在所得结晶产物中具有足够的刚度、结构和密度。可以直接将现在具有足够密度的结晶组合物用于无针注射给药技术，或者可以进一步加工以提供更细分和/或均匀的结晶组合物。
在本发明的再一实施方式中，将结晶药物组合物传送到主体，以便带来所希望的处理。在一具体方面，通过无针注射将结晶疫苗组合物传送到主体，以便在主体中具有生物反应。在一优选实施方式中，将该结晶疫苗组合物传送到主体，从而在主体中引起特定抗原免疫反应。
在本发明的又一实施方式中，提供了结晶药物组合物。该结晶药物具有足够的颗粒结构、刚度和/或密度特性，这使其适宜使用无针注射器***传送到皮肤或粘膜组织中或通过其中。可以使用本发明的方法制备本发明的结晶药物组合物，并且因此包括疫苗组合物。
根据本文公开的内容，本领域普通技术人员可以容易地想到本发明的这些和其它实施方式。
附图简述
图1A和1B描述了在微粒疫苗制剂中评价粒子大小对IgG抗体反应影响的实施例1的结果。
图2-4描述了由使用无针注射器传送结晶Hib共轭疫苗组合物免疫的老鼠获得的血清的酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。在图2中，将PRP-CRM197共轭物用作捕获相，在图3中，将白喉毒素用作捕获相，在图4中，将PRP-HSA共轭物用作捕获相。
图5描述了主体中以微粒或液态形式接受降低剂量的Hib共轭疫苗组合物的IgG抗体反应。
图6A和6B描述了以微粒或液态形式提供Hib共轭免疫组合物的免疫过程。
图7描述了以微粒或液态形式传送的失活流感病毒疫苗组合物的抗体反应。该数据代表来自混合血清的血清IgG滴定度几何平均数。
图8A和8B描述了在用以微粒或液态形式传送的失活流感病毒疫苗组合物免疫的主体中流感病毒刺激研究的结果。图8A中的主体接受25μg失活病毒，然而图8B中的主体接受5μg的失活病毒。该数据代表起初体重减轻的平均百分数。
图9描述了在用以微粒或液态形式传送并以铝为佐剂的失活流感病毒疫苗组合物免疫的主体中流感病毒刺激研究的结果。该数据代表8个动物起初体重减轻的平均百分数。
图10描述了在用以微粒或液态形式传送并以PCPP为佐剂的失活流感病毒疫苗组合物免疫的主体中流感病毒刺激研究的结果。该数据代表8个动物起初体重减轻的平均百分数。
图11A和11B描述了在用以微粒(图11A)或液态形式(图11B)传送并以CpG为佐剂的失活流感病毒疫苗组合物免疫的主体中流感病毒刺激研究的结果。该数据代表8个动物起初体重减轻的平均百分数。
图12描述了在用以微粒或液态形式传送并以MPL为佐剂的失活流感病毒疫苗组合物免疫的主体中流感病毒刺激研究的结果。该数据代表8个动物起初体重减轻的平均百分数。
在详细描述本发明之前，应理解为本发明并不限制在具体药物制剂或加工参数中，自然可以进行改变。也应理解本文中所用的术语仅仅是为了描述本发明具体实施方式，并不打算用于限制本发明。
必须注意的是，在本说明书和附加的权利要求书中，单数形式“一”和“这”包括复数指示物，除非另有清楚说明。因此，例如“一种药剂”包括两种或多种药剂的混合物，“一种抗原”包括两种或多种抗原的混合物，“一种赋形剂”包括两种或多种赋形剂的混合物，等等。A．定义
除非另有说明，本文中所用的所有科技术语与本发明所属的本领域普通技术人员通常所理解的意思相同。尽管可以将许多与本文中所述相同或相似的方法和材料用于本发明的试验中，本文中所描述的是优选材料和方法。
在描述本发明时，使用以下术语，并打算定义如下。
“透皮给药”意思是将粒子传送到目标组织，从而提供局部、区域或全身反应。这与将物质直接通过细胞膜加入活细胞和设计在胞内水平进行手术的组织中形成对比。优选地，所给物质的粒子大小大于目标组织中出现的细胞尺寸。通常，对哺乳动物细胞而言，大于10μm的粒子将获得该所希望的效果。适宜的粒子大小范围将在以下讨论。
因此，术语“透皮”给药意思是真皮内(例如进入真皮或表皮)、透皮(例如“经皮”)和透粘膜给药，即通过试剂通道给药到皮肤或粘膜组织内或通过其中。参见例如Transdermal Drug Delivery：DevelopmentalIssues and Research Initiarives，Hadgraft and Guy(eds.)，MarcelDekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals andApplications，Robinson and Lee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)和Transdermal Delivery of Drugs,Vols.1-3，Kydonieus and Berner(eds.)，CRC Press，(1987)。
“无针注射器”意思是透皮输送微粒组合物的器械，没有传统上***皮肤的针。对本发明所用的无针注射器的讨论将贯穿全文。
本文中所用的术语“药剂”意思是任意化合物或组合物，当将其给药到有机体(人体或动物体)时将通过局部和/或全身作用诱导所需药理和/或生理效应。因此该术语包括传统上认为是药物和疫苗的那些化合物或化学试剂，以及包括例如肽、激素、核酸、基因结构等分子的生物药剂。
“抗原”意思是含一个或几个表位的分子，该表位将刺激宿主免疫***产生细胞抗原特定免疫反应或体液抗体反应。因此，抗原包括蛋白质、多肽、抗原蛋白质片段、低聚糖、多糖等。而且，该抗原可以得自任意已知病毒、细菌、寄生虫、植物、原生动物或真菌，也可以是整个有机体。该术语还包括肿瘤抗原。同样地，在例如DNA免疫应用中表达抗原的低聚核苷酸或聚核苷酸也包括在该抗原范围内。也包括合成抗原，例如多表位、旁侧表位和其它重组物或合成所得抗原(Bergmann等人(1993)Eur.J．Immunol.23：2777-2781；Bergmann等人(1996)J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.和Cell Biol.75：402-408；Gardner等人(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，June 28-Junly 3，1998)。
术语“疫苗组合物”意思是任意含抗原的药物组合物，该组合物可以用于预防或治疗主体中的疾病或症状。因此该术语既包括亚单位疫苗，即含抗原的疫苗组合物，该抗原是在性质上与抗原相关的整个有机体分离和离散的，也包括含有整个已被杀死、稀释或失活的细菌、病毒、寄生虫或其它微生物的组合物。
本文中所使用的病毒疫苗组合物包括，但不限于，含或来自以下科的成员：细RNA病毒科(例如脊髓灰质炎病毒等)、杯状病毒科、披膜病毒科(例如风疹病毒、登革热病毒等)、黄素病毒科、冠状病毒科、呼肠孤病毒科、双RNA病毒科、弹状病毒科(例如狂犬病病毒等)、丝状病毒科、副粘病毒科(例如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒等)、正粘病毒科(例如甲、乙和丙型流感病毒等)、布尼病毒科、沙粒样病毒科、反转录病毒科(例如，HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ、HIV-1和HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和其它病毒。此外，病毒抗原可以来自***状瘤病毒(如HPV)、疱疹病毒、肝炎病毒、例如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、δ型肝炎病毒(MDV)、E型肝炎病毒(HEV)和G型肝炎病毒(HGV)、以及蜱传播脑炎病毒。参见，例如Virology，3rdEdition(W.K.Joklik ed.1988)，Fundamental Virology，2ndEdition(B.N.Fields and D.M.Knipe，eds.1991)，描述了这些及其它病毒。本文中所用的茵苗组合物包括，但不限于，含或得自引起如下的有机体的那些：白喉、霍乱、肺结核、破伤风、百日咳、脑膜炎和其它致病状态，包括甲型、乙型和丙型脑膜炎双球菌、乙型流感嗜血杆茵(HIB)、并且抗寄生疫苗组合物的幽门螺杆菌的例子包括得自引起疟疾和Lyme疾病的有机体。
含所选抗原和佐剂一起的组合物、或与主体佐剂共给药的疫苗组合物，当它具有比没有给予佐剂的等量抗原更大的引起免疫反应的能力时，显示出“提高的免疫原性能”。由于抗原更强的免疫原性或者由于在所给抗原的主体中必需更低剂量或更少剂量的抗原达到免疫反应，因此疫苗组合物可以呈现出“提高的免疫原性能”。这种提高的免疫原性可以通过以下测定：将佐剂组合物和抗原控制剂给药到动物体，使用标准测定比较抗体滴定度和/或相对这两者的细胞间免疫性，该标准测定例如有本领域公知的放射免疫测定、酶联免疫吸附测定、CTL测定等。为了本发明的目的，佐剂的“有效量”应是提高共给药抗原免疫反应的量，以便抗原呈现出如上所述提高的免疫原性。
类似地，抗原的“有效量”是刺激所给抗原的主体中免疫反应的量。免疫反应可以是体液的、细胞间的和/或防护性免疫反应。
本文中所使用的术语“共给药”如当佐剂与疫苗抗原共给药时，意思是或者同时或者并行运送佐剂和抗原，例如当两者在相同组合物中出现或者两者在几乎同时但在不同位置在分开的组合物中给药，以及佐剂和抗原在分开组合物中在不同时间输送。例如，可以在相同或不同位置在输送抗原之前或之后输送佐剂组合物。在输送佐剂和输送抗原之间可以间隔几分钟，到几小时，到几天。而且，尽管使用透皮给药法如无针注射器将制剂组合物给药到皮肤，但是可以使用传统给药技术，如通过传统的注射器和传统的疫苗枪给药疫苗组合物。
本文中所使用的术语“处理”包括任意以下的：预防感染或再感染，减少或消除症状，以及减少或完全消除病原体。处理可以起预防(感染之前)或治疗(感染之后)作用。
“脊椎动物主体”意思是任意亚门心形成员，特别是哺乳动物，包括，但不限于，人类和其它灵长类。该术语没有指示具体年龄。因此，成年和新生个体都应包括在内。
药物，单独或与其它药物或试剂一起，典型地制成可以含一种或几种附加材料如载体、运载体和/或赋形剂的药物组合物。“载体”、“运载体”和“赋形剂”通常是指惰性、无毒且不与组合物中其它组分以有害方式交互作用的材料。可以使用这些材料以增加微粒药物组合物中的固体量，例如使用啧雾干燥或冷冻干燥技术制备的那些。通常所用“赋形剂”或“载体”的例子包括药物级葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、葡聚糖、淀粉、纤维素、磷酸钠或钙、硫酸钙、柠檬酸或酒石酸(和其药学上可接受的盐)、甘氨酸、高分子量聚乙二醇(PEG)、和其组合。用作稳定剂的例证赋形剂包括通常可获得的低温防护剂和抗氧化剂。B．通用方法
本发明提供了给药微粒药物组合物，特别是疫苗组合物。可以使用透皮无针注射器给药设备向主体输送这些微粒组合物。以微粒(粉)形式向组织如皮肤透皮给药疫苗组合物的能力在通常依赖传统针和注射器注射技术的现有接种方法基础上有很大改进。就此而言，几乎所有目前的疫苗都是通过肌肉注射给药的。但是，所注射的疫苗需要局部穿流***，以便开始免疫反应。肌肉注射的大部分疫苗组合物将很快扩散到周围组织并循环，因此损失或被稀释。相反地，当例如皮肤透皮给药疫苗组合物时，这样的损失不将发生。这是由于皮肤上层的血管供应差，因此具有更强保留抗原的能力。由于微粒疫苗组合物在皮肤中的溶解过程慢，因此它更好地保留在皮肤中。皮肤中的细胞组分还可有利于加强透皮给药的疫苗的性能。这是由于存在表皮层中朗格罕氏细胞和皮肤的皮下层中树状细胞的密集网络。这些细胞对开始和保持免疫反应是很重要的。通过在这些免疫细胞附近输送疫苗组合物，可以达到比传统肌肉注射更强的免疫反应。这些免疫细胞也可以捡起该疫苗并移到局部穿流***，从而开始免疫反应。
微粒组合物向皮肤或粘膜组织的透皮给药也加强了常用免疫调节剂如佐剂的安全性和功效。免疫调节剂通常是疫苗和免疫治疗的重要组分。免疫调节剂有许多功能，包括例如强化免疫、抑制免疫和调节免疫。免疫的强化加强了疫苗或免疫治疗的功效。免疫的强化也使免疫***能够对更小剂量的疫苗组合物作出反应。例如，将铝(Alum)佐剂免疫调节剂用于配制白喉和破伤风毒素疫苗，从而加强它们的免疫原性。一些具有抑制免疫性能的免疫调节剂也用于处理某些疾病，如自免疫疾病和器官移植。免疫调节剂也可以指导免疫***产生或者Th1-或者Th2-型反应，或者将一种已建立的反应转换到另一种。该免疫调制性能对免疫疗法非常重要。例如，具有偏向Th2-型反应的免疫***的主体易于有变应性***反应。因此将可以帮助提高Th1-型反应的免疫调节剂用于免疫疗法以使这些个体脱敏。
就传统疫苗组合物而言，典型地通过肌肉注射输送免疫调节剂。这种注射方法的问题之一是免疫调节剂到达体循环之后的毒性。为此原因，许多免疫调节剂都不能用于人体中。由于大部分注射物很快从注射位置扩散，因此通常为了有效地进入循环，肌肉注射也需要高剂量的免疫调节剂(相对透皮给药免疫调节剂而言)。就此而言，可能需要一佐剂以在注射位置或局部穿流***中产生其活性，从而提高免疫性能。
根据本发明，免疫调节剂向皮肤或粘膜组织的透皮给药因以下原因而有利。首先，皮肤和粘膜是免疫***非常有效的部位。如上所述，在皮肤各层中存在免疫细胞的密集网络(例如，表皮层中的朗格罕氏细胞和皮肤层的树状细胞)。粘膜上皮细胞含有大量上皮内树状细胞。这些细胞对开始和保持免疫反应、使它们免疫调制引发目标是很重要的。通过在这些细胞非常近的地方输送免疫调节剂，同时避免由于扩散而快速消失，达到比通过肌肉注射更强的免疫调制效果是可行的。免疫调节剂的有效剂量也可以大大降低。较低剂量有利于降低与许多免疫调节剂相关的毒性。
因此，在一个实施方式中，本发明需要一以传统制药形成结晶粒子(适宜透皮给药)的步骤。尽管本发明的方法可以广泛地用于任意药物组合物，本文具体参照使用液态(含水)或重组干燥疫苗组合物作为原料的方法例证本发明。
制备和贮存疫苗药物的一种常规方法涉及冻于法(冷冻干燥)。冻干法涉及一从物料中除去水分的技术，并涉及在非常低的温度下快速冷冻，接着在高真空度下通过升华快速脱水。该技术典型地产生具有开放式基质结构的低密度多孔粒子。这些粒子化学上是稳定的，但是当将其加入含水环境中时便快速重组(分解和/或进入溶液)。
由灵敏或热敏生物分子制备和贮存疫苗组合物的另一方法是喷雾干燥。喷雾干燥涉及使用一喷嘴、喷丝盘或其它设备将一种或几种固体的溶液雾化，接着从小滴中蒸发溶剂。更具体地说，喷雾干燥涉及将高度分散的液态药剂(例如溶液、浆液、乳液等)与适宜体积的热空气混合进行蒸发并干燥液态小滴。经喷雾干燥的药剂的特征通常是带小孔的均匀球形粒子。这些粒子的密度低并且溶解速度快。
在本发明的一个方法中，将液态组合物(含水或重组经喷雾干燥或冻干的组合物)转变成适宜输送入和/或通过皮肤或粘膜组织的干燥、结晶粉末。可以将该液态组合物与具有加强结晶形成、粒子结构、刚度和/或密度特性的适宜载体或赋形剂混合。优选的载体或赋形剂包括药物级糖和类似物，包括例如海藻糖。然后将该组合物在适宜蒸发条件下进行干燥，得到结晶组合物。然后可以将该结晶从干燥表面或容器中移出，例如使用研钵和研棒轻轻破碎。然后可以将所得结晶粉末放入适宜给药的药剂盒中，从而使用无针注射器将其给药到主体。
尽管在本发明中没有限制，但是上述的方法可以用于获得大小在约0.1-约250μm，优选约10-约250μm并且粒子密度为约0.1-约25g/cm3的结晶粒子。可以将这些结晶粒子用于处理或预防各种疾病。
在另一实施方式中，本发明涉及给药微粒组合物，特别是佐剂和疫苗组合物。如上所述，佐剂和疫苗组合物可以为结晶形式，或者可以以非结晶的微粒形态给药。
本发明所用的抗原可以使用本领域技术人员已知的各种方法生产。特别是，可以使用标准提纯技术由天然源直接分离抗原。或者，可以使用已知技术重组地生产抗原。参见，例如Sambrook，Fritsch＆Maniatis，Molecular Cloning：ALaboratoryManual，Vols.Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ，SecondEdition(1989)；DNA Cloning,Vols.Ⅰ，and Ⅱ(D.N.Glover ed.1985)。也可以所述氨基酸序列为基础经过例如固相肽合成法的化学聚合物合成法合成本文中所用的抗原。这些方法对本领域技术人员为已知。参见，例如J.M.Stewart and J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Co.，Rockferd，IL(1984)and G.Barany andR.B.Merrifield，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，editors E.Gross and J.Meienhofer，Vol.2，Academic Press，NewYork，(1980)，pp.3-254，for solide phase peptide synthesistechniques：and M.Bodansky，Principles of Peptide Synthesis，Spinger-Verlag，Berlin(1984)and E.Gross and J.Meienhofer，Eds.，The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，supra，Vol.1，forclassical solution synthesis。
一旦获得之后，将感兴趣的抗原形成如本文所述的微粒疫苗组合物并将其给药到主体，通常与用于提高抗原免疫反应的免疫学佐剂一起。如上所解释的，该佐剂可以出现在相同或独立组合物中，可以与疫苗组合物同时给药，或者在抗原给药之前或之后给药。此外，可以在相同或不同位置进行佐剂给药。
不幸的是，大多数已知佐剂的毒性高。因此，目前仅仅适宜人体使用的佐剂是Alum，铝盐组合物。
但是，许多佐剂用于动物研究并且正对人体使用的几种佐剂进行临床前和临床研究。
令人惊奇的是，通常被认为是人体使用毒性太高的佐剂可以用本方法给药。不被具体理论所束缚，很清楚，使用透皮给药方法向皮肤给药佐剂，允许皮肤的表皮层中朗格罕氏细胞和皮层中树状细胞相互作用。这些细胞对开始并保持免疫反应是重要的。因此，可以通过向这些细胞或其附近对准给药获得提高的佐剂效果。此外，由于皮肤上层的血管化差，进入体循环的佐剂的量降低，因此降低了毒效。而且，由于皮肤细胞不断地脱落，残留佐剂被消除而不是被吸附。而且，输送佐剂的量可以比使用传统技术如肌肉注射输送的量要少。因此，本发明可以有效地使用各种佐剂，而没有相伴的毒性。这些佐剂包括，但不限于，由例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等铝盐(Alum)形成的佐剂；如Complete FreundsAdjuvant(CFA)和Incomplete Freunds Adjuvant(IFA)的水包油和油包水乳液制剂；由细菌细胞壁组分形成的佐剂，例如包含单磷酰类脂A(MPL)(Imoto等人(1985)Tet.Lett.26：1545-1548)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CMS)的佐剂；得自ADP-核糖基化细菌毒素的佐剂，一组人体的强效毒素包括白喉毒素、百日咳毒素(PT)、霍乱毒素(CT)、大肠杆菌不耐热毒素(LT1和LT2)、假单胞茵属A型内毒素、肉毒杆菌C2和C3毒素、以及来自产气荚膜梭菌、螺状梭菌和艰难梭菌的毒素、特别是ADP-核糖基化细菌毒素突变体例如CRM197、无毒性白喉毒素突变体(参见，例如Bixler等人(1989)Adv.Exp.Med．Biol.251：175和Constantino等人(1992)Vaccine)；如Quil A(US5057540)或由例如ISCOMs(免疫刺激复合物)的皂甙产生的粒子的皂甙佐剂；细胞因子，例如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞克隆刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；胞壁酰肽如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-非胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3羟磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等；得自CpG族分子、CpG二核苷酸和包含CpG构图的合成低聚核苷酸的佐剂(参见，例如Krieg等人Vature(1995)374：546和Davis等人J．Immunol.(1998)160：870-876)，例如TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO：1)和ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO：2)；和合成佐剂，如PCPP(聚[二(羧基苯氧基)膦嗪](Payne等人Vaccines(1998)16：92-98)。这些佐剂可从许多供应商如Accurate Chemicals、RibiImmunechemicals、Hamilton，MT、GIBCO、Sigma，St.Louis，MO商购获得。
一旦获得之后，将有或者没有感兴趣抗原的佐剂使用任意适宜造粒技术形成适宜透皮给药的粒子，这些技术例如有风干(结晶)、冷冻干燥(冻干)、喷雾干燥或超临界流体技术。如上所述，也可以将该组合物制成结晶组合物。
它们形成之后，使用适宜的透皮给药技术将该粒子透皮给药到哺乳动物组织。适宜透皮给药感兴趣物质的各种粒子加速设备在本领域中为已知，并且在本发明的实施中会找到用处。特别优选的透皮给药***使用无针注射器将含固态药物的粒子以控制剂量发射到完整皮肤和组织中或通过其中。参见，例如Bellhouse等人的US5630796，它描述了一种无针注射器(也称之为“PowderJect_无针注射设备”)。其它无针注射器结构在本领域中为已知并在本文中有描述。
以与剂量配制相匹配的方式将粒子给药到主体中，并且其量为达到所需生理反应的有效量。产生的该反应应具有预防和/或治疗效果。因此，例如，如果正输送抗原或疫苗组合物，输送量应足够产生免疫反应。如果佐剂与抗原共输送，那么其输送量应足以提高共输送的抗原的免疫反应。显而易见，待给药组合物的量依赖于所输送的具体物质、待处理的主体和待预防或处理的疾病。
通常，约0.5μg-1000μg的佐剂、更优选1μg-约500μg的佐剂和最优选约5μg-约300μg的佐剂对提高所给抗原的免疫反应是有效的。因此，例如，对CpG而言，本方法所使用的剂量范围为约0.5-50μg、更优选1-约25μg和最优选5-约20μg。类似地，对Alum或PCPP来说，本文所使用的剂量为约25μg-约500μg、优选约50-约250μg和最优选约75-约150μg。对MPL来说，本方法所使用的剂量范围为约10-250μg、优选约20-150μg和最优选约40-约75μg。
本领域技术人员使用常规方法就可以容易地测定其它佐剂的剂量。给药量取决于包括共给药抗原，以及该佐剂用作免疫刺激剂的能力的许多因素。
类似地，如果透皮以相同或不同组合物形式给药抗原，通常以50ng-1mg和更优选1μg-约50μg抗原用于产生免疫反应。所需精确量依待处理主体的年龄和常规健康状况、处理条件和特定抗原或所选抗原的苛刻度、给药位置，以及其它因素而变化。本领域技术人员可以通过阅读该说明书和通过常规试验容易地测定适宜的有效量。
剂量处理可以是单位剂量或多剂量。对疫苗组合物而言，多剂量是一种：接种疫苗的第一阶段可以为1-10个单独剂量，接着在以下时间间隔给以其它剂量，选择保持和/或强化免疫反应，例如第二剂量在1-4个月，如果需要的话，在几个月之后给予以后的剂量。剂量机制还，至少部分，由主体的需要所决定并依赖医师的判断。而且，如果希望预防疾病的话，通常在用感兴趣的病原体第一次感染之前给予该组合物。如果希望治疗的话，例如减少症状或复发，通常在第一次感染之后给予该组合物。C．试验
下面是实施本发明的具体实施方式的例子。这些实施例仅仅用于说明目的，无论如何并不打算限制本发明的范围。
已尽努力确保所用数据的精确度(例如，量、温度等)，但是自然应允许有一定的试验误差和偏差。C.1 粒子制品和粒子形成技术
                        实施例1
                      微粒疫苗组合物
进行以下研究是为了评定不同的赋形剂和造粒方法对所得微粒疫苗组合物的物理性能和这些再制疫苗免疫原性的影响。选择白喉毒素(dT)、提纯的亚单位蛋白抗原与包括甘露糖醇(外加聚乙烯吡咯烷酮(PVP))、蔗糖和海藻糖的不同赋形剂配制。还包括两种制粉技术，冷冻干燥和风干(蒸发干燥)。为了试验每种制品，使用3”直径的不锈钢筛将所得微粒组合物按以下粒子部分分类：＜20μm，20-38μm，38-53μm和53-75μm。
微粒疫苗组合物的物理特性包括对大小分布、渗透能、光学显微镜检查、扫描电子显微镜检查、绝对密度、孔大小分布、表面积分析和X-射线粉末衍射的评价。
为了测定用无针注射设备(例如PowderJect_无针注射设备)输送或通过传统注射器/针注射的再制疫苗的免疫原性，在0和4周接种Balb/C老鼠(雌性，6-8周龄)。用PowderJect_无针注射设备接种的老鼠接受配备有1mg赋形剂的5μg疫苗。用传统针和注射器腹膜内注射对照老鼠。加强两周过去之后，从8只老鼠中收集血清并汇集，通过ELISA测定dT抗体。
微粒组合物的物理特性的结果如下：(1)风干方法产生高密度结晶粒子，而冷冻干燥时产生相对低的密度的非晶形粉末；(2)粒径分布显示不依赖赋形剂和所用成粒方法。这些粒子经筛选分成5类(＜20μm，20-38μm，38-53μm、53-75μm和＞75μm)，并且每一部分的质量分布大致相等。
免疫原性评价的结果描述在下面的表1和2和图1中。由此可以看出，不同微粒疫苗组合物之间的免疫原性非常相似(所有制品以及相同制品的不同大小部分之间)。通过无针注射器给药的所有微粒组合物引起比对照组(传统针和注射器给药)更高的抗体滴定度。海藻糖赋形剂显示出比其它制品稍好，20-53μm部分显示出更高的免疫原性(参见图1)。但是，＜20μm和＞75μm粒子部分都比对照(含水组合物、传统针和注射器给药)的免疫原性要高。也可看出结晶疫苗组合物粒子的无针注射(PowderJect_)给药产生比对照(传统针和注射器)注射方法高的血清转化率(参见表2)。就此而言，在单个PowderJect_接种之后97％(162个中有157个)的动物产生血清抗体，然而对照组的血清转化率为37.5％(8个中有3个)。
                                        表1
                               dT的IgG抗体(混合血清)
    赋形剂 成粒方法 粒径(μm) 给药方法    引发   加 强
    盐水 对照     - 注射器和针     1220  111600
    海藻糖 风干    ＜20     PJ*     1550  616380
    海藻糖 风干   20-38     PJ     5460  1390700
    海藻糖 风干   38-53     PJ     7295  1282100
    海藻糖 风干   53-75     PJ     2690  577080
    海藻糖 风干    ＞75     PJ     2310  620460
 海藻糖/甘露糖醇 冷冻干燥   20-38     PJ     1590  441140
 海藻糖+甘露糖醇 冷冻干燥   38-53     PJ     4590  686540
 海藻糖+甘露糖醇 冷冻干燥   53-75     PJ     2850  657780
 海藻糖+甘露糖醇 冷冻干燥    ＞75     PJ     1940  282630
    蔗糖 风干   20-38     PJ     4650  1160220
    蔗糖 风干   38-53     PJ     3040  515760
    蔗糖 风干   53-75     PJ     1750  372160
    蔗糖 风干    ＞75     PJ     5230  759240
    蔗糖 冷冻干燥   20-38     PJ     1525  618100
    蔗糖 冷冻干燥   38-53     PJ     2950  614780
    蔗糖 冷冻干燥   53-75     PJ     7830  802850
    蔗糖 冷冻干燥    ＞75     PJ     1800  780710
 山梨聚糖/PVP 冷冻干燥   20-38     PJ     3700  494330
 山梨聚糖/PVP 冷冻干燥   38-53     PJ     2810  609940
 山梨聚糖/PVP 冷冻干燥   53-75     PJ     4580  935700
 山梨聚糖/PVP 冷冻干燥    ＞75     PJ     1590  447630
PJ=PowderJect_注：0星期血清的滴定度＜200。所有dT接种剂量为5μg。
                                        表2
                                     血清转化率
    赋形剂 成粒方法                 血清已转化的动物/所有动物
＜20  20-38  38-53  53-75   ＞75
    海藻糖 风干  4/4   7/8   7/8   7/8   8/8
海藻糖+山梨聚糖 冷冻干燥   -   8/8   8/8   8/8   7/8
    蔗糖 风干   -   7/8   8/8   7/7   7/7
    蔗糖 冷冻干燥   -   8/8   8/8   8/8   6/8
 山梨聚糖/PVP 冷冻干燥   -   8/8   7/8   8/8   7/8
    DT/注射    -  3/8
C.2结晶疫苗组合物的形成和评价
             实施例2
       结晶疫苗组合物的配制
使用以下方法结晶许多传统疫苗组合物。
由ATCC以冻干粉末获得肺炎球菌胶囊多糖#14(CP14)。将1ml体积的注射用水分散在2mg小瓶的CP14中，按厂商的说明书所述将所得悬浮液在4℃下整夜连续混合。制得100μl等分试样混合物，在需要之前保持冷冻。称取许多99.5mg的海藻糖(Sigma)粉并与解冻的等分试样CP14悬浮液混合，得到总共500μg的CP14。将约1200μl的注射用水用于溶解CP14/海藻糖混合物，并将该溶液充分混合。然后将100μl该等分试样溶液分散在称量舟皿的表面上，并放在通风橱提供的恒定气流中。然后在接下来1-2天内将小滴蒸发干燥，从而形成结晶产物。从称量舟皿移去该结晶并使用研钵和研棒轻轻粉碎。
将一含有吸附在0.5mg氢氧化铝(Alum)上20μgHepB表面抗原的标准成年用小瓶Engerix-B_(Smith Kline Beecham)与10mg海藻糖混合，将所得溶液充分混合。将100μl小滴分散在称量舟皿上，并经本文上面所述的干燥。在约36小时的蒸发干燥之后，使用刮刀从称量舟皿仔细移去结晶疫苗残余物。然后使用研钵和研棒轻轻粉碎该结晶组合物直到较大结晶大小明显降低。将1.25±0.25mg等分试样分散在药盒中，得到2.5μg标准剂量的乙型肝炎表面抗原。
获得从人体血浆提纯的大量乙型肝炎表面抗原(HbsAg)(BiodesignInternational)。将该HbsAg与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。接着在用氮气冲洗的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的HbsAg疫苗组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
获得含有PRP-CRM197共轭疫苗组合物的定量HibTITER_(WyethLederle)。该组合物含有与CPM197突变体白喉毒素载体共轭的聚核糖基磷酸核糖(来自乙型流感嗜血杆菌的多糖)，本文称之为“Hib共轭疫苗组合物”。将该Hib共轭疫苗组合物与海藻糖混合，并将所得溶液充分混合。然后将该溶液分散在称量舟皿上，经如上所述干燥。蒸发干燥之后，从称量舟皿获得结晶疫苗残余物，使用研钵和研棒将该结晶组合物轻轻粉碎，称其适宜剂量并放入由无针注射器给药的药盒中。
由Spafas(Storrs，CT)获得大量流感病毒，PR8菌株。此外，从Dr.Yoshihero Kawaoka，Veterinary School，University of Wisconsin(Madison，Wisconsin)获得大量流感病毒，Aichi菌株。将每种病毒经过标准***处理(1∶4000，在4℃下48小时)失活。然后将失活病毒(或者PR8或者Aichi)与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，并倒入玻璃陪替氏培养皿中，在通风橱下风干2天。接着在用氮气冲洗的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的整个失活病毒疫苗组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
获得大量白喉毒素(Accurate Chemical＆Scientific Corp.，由Statems Serum Institute，Denmark生产)。将该毒素与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。接着在用氮气冲洗的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的白喉毒素疫苗组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
                        实施例3
                    用结晶疫苗组合物接种
设备：除非另有说明，用于皮肤给药研究的无针注射器给药设备(或者PowderJect_ND设备系列或者Oral PowderJect_设备系列)是从PowderJect Technologies，Ltd.，Oxford，UK获得的。该PowderJect_ND设备通常描述在US5630796中。该Oral PowderJect_设备通常描述在国际申请WO96/20022中。本文所使用的设备中的气体钢瓶典型地填充有40-60 bar压力的氦气，尽管也可以使用30-80 bar的压力。在操作中，开动该设备以释放气体钢瓶中的压缩氦气，使含粒子的负荷药盒的膜破裂。产生超声条件，并且所得高速气流将粒子作为弹丸推射到目标组织表面内。改变气体钢瓶中氦气的压力可以控制渗透的深度。对传统针和注射器给药而言，一次性注射器配备有26.5号针头。
老鼠和接种：从经授权的卖主(例如HSD)购买7周龄的雌性Balb/c老鼠或Swiss Webster老鼠，在接种前在老鼠装置中适应1周。通过腹膜内(IP)注射混合有10mg/kg赛拉嗪的100mg/kg***将老鼠麻醉，将目标位置处腹膜皮肤通过剔削去毛。相对接种疫苗位置并相靠轻轻挤压该无针注射器设备。典型的免疫机制构成是：两次接种疫苗，间隔4周，在每次接种之前和加强过去两周之后在麻醉下经过后眼眶出血收集血液。
ELISA：通常，通过ELISA测定再制疫苗的抗体反应。在4℃下整夜以每个孔用于PBS中的0.1μg测定抗原涂敷96孔的板。将这些板用含0.1％Brij-35的TBS冲洗3次，用稀释在含1％BSA的PBS的试验血清培养1.5小时。将含相对特定抗原的高水平抗体的血清标准液添加到每一板上并用于使最终数据分析的滴定度标准化。然后冲洗板并用对老鼠免疫球蛋白IgG或IgG亚类有特效的生物素标注的山羊抗体(1∶8000于PBS中，Southern Biotechnology)在室温下培养1小时。接着再冲洗三次，将该板用链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶共轭物(1∶8000于PBS中，Southern Biotechnology)在室温下培养1小时。最后，冲洗这些板并用TMB底物药盒(从Bio-Rad，Richmond，CA获得)显影。使用Softmax Pro4.1程序(Molecular Devices)用超过平均背景0.1倍的A450作为校准最高稀度测定试验血清的终点滴定度。由接受除试验血清之外的所有试剂的孔测定平均背景的吸光度。
1．用结晶肺炎球菌胶囊多糖#14(CP14)接种。以给药途径(腹膜内(IP)或真皮内(ID))和表3所示试验基质的制剂为基础随机形成Balb/c老鼠试验组。使用上述结晶CP14疫苗组合物使这些老鼠得到引发及引发之后的第4周加强，然后在加强10天之后出血。就该加强而言，注射老鼠麻醉剂麻醉这些老鼠，使其在再加强给药之前能够后眼眶出血。对无针注射器给药而言，通过修剪除去毛皮，使用来自PowderJect_无针注射器给药设备的60 bar气压进行给药。然后分析血清样品以测定肺炎球菌的抗体滴定度。
                                      表3
  组号     n    给药途径 压力(bar)         制剂 CP剂量(μg)
   Ⅰ     3     N/S-IP    ---  CP14+海藻糖和Alum     5
   Ⅱ     3     N/S-IP    ---     CP14+海藻糖     5
   Ⅲ     3     N/S-IP    ---     CP14+Alum     5
   Ⅳ     4     PJ-ID     60     CP14+海藻糖     5
   Ⅴ     4     PJ-ID     60     CP14+海藻糖     10
   Ⅵ     4     PJ-ID     60     CP14     50
   Ⅶ     2     PJ-ID     60     仅海藻糖     0
2．用结晶乙型肝炎(HepB)表面抗原疫苗组合物接种。将结晶HepB疫苗组合物(如上所述)按如下给药(以2.5μg糖类剂量)到老鼠。以疫苗组合物为基础将8只Balb/c老鼠分成2群，给药技术使用：(1)使用针-注射器腹膜内输送传统(液态)Engerix-B_疫苗组合物(n=2)；(2)使用PowderJect_无针注射器真皮内输送该结晶疫苗组合物(n=6)。PowderJect_设备的输送压为40-60 bar。引发3周之后将所有动物加强，加强10天之后出血。
然后使用给药加强10天后获得的血液样品通过ELISA测定乙型肝炎表面抗原的抗体滴定度。结果描述在下表4中。滴定度大于约10mIU/mL被认为是保护血清了。由此可以看出，经过无针注射器接受结晶组合物的6只动物中有5只被该结晶疫苗组合物保护。
                             表4
老鼠编号     给药途径    Po(bar)     评价
    1  针-注射器(IP)     ---      ---
    2  针-注射器(IP)     ---      ---
    3  PowderJect_(ID)     40   引发：给药差
    4  PowderJect_(ID)     40     引发：良好
    5  PowderJect_(ID)     40     引发：好
    6  PowderJect_(ID)     60     引发：好
    7  PowderJect_(ID)     60     引发：好
    8  PowderJect_(ID)     60  引发：轻微出血
使用相同结晶HepB表面抗原疫苗组合物的接下来加强足够大大增加接受无针注射的动物中的所有抗体滴定度(经过PowderJect_设备)，结果所有6只动物都得到结晶疫苗组合物的保护。
3．用结晶流感嗜血杆菌聚核糖基磷酸核糖共轭疫苗组合物(Hib共轭物)接种。按如下向老鼠给药上述结晶Hib共轭疫苗组合物。以给药技术、剂量和配制为基础将Swiss Webster老鼠分成试验组：(1组，2μg(PRP糖)的液态Hib共轭疫苗组合物，使用传统针和注射器经过IP给药，n=3)；(2组，2.5μg(PRP糖)的结晶Hib共轭疫苗组合物，使用PowderJect_无针注射器给药到皮肤，n=6)；和(3组，对照(未作过试验的)，n=3)。所有经过接种的动物接受一引发，接着在引发之后第4周进行加强。在加强后第2周收集血清样品，汇集并使用ELISA测定固定PRP-CRM197的抗体滴定度。
由于人体和老鼠抗嗜血杆菌多糖(Hbps)抗体粘合的观测差异，因此Phipps等人(1990)J.Immunol.Methods 135：121-128所描述的HbO-HAELISA适宜用于测试老鼠血清。适宜测定老鼠抗HbPs抗体的评价条件注于下表5中。所有其它评价条件如Phipps等人所述。
                                 表5
    人体     老鼠
抗原涂敷缓冲剂     PBS     50mM HEPES
血清稀释缓冲剂   PBS/0.3％吐温20/0.01M EDTA    50mM HEPES/0.1％Brij35/1％FBS
血清培养时间和温度   60分钟，室温     整夜，4℃
二级抗体共轭物   抗-人体Ig*AP   抗-老鼠IgG*AP
二级共轭物缓冲剂   PBS/0.05％吐温20   50mM HEPES/0.1％Brij35/1％FBS
    冲洗缓冲液   PBS/0.1％吐温20  50mM HEPES/0.1％Brij 35
*评价显示出使用该ELISA测定老鼠血清中的定量抗体值高于使用放射抗原结合评价(RABA)测定的，特别是对于在RABA中血清滴定度低于10μg/mL的。
ELISA的结果示于下表6中。由此可以看出，该结晶疫苗组合物具有与传统疫苗组合物相比可比较的结果。
为了进一步表征接受Hib共轭疫苗组合物的动物中的免疫反应，进行下面的研究。将6只老鼠一组的三个试验组汇集如下：(1组，2μg剂量(PRP糖)的结晶Hib共轭疫苗组合物，使用PowderJect_无针注射器设备真皮内给药)；(2组，2μg剂量(PRP糖)的传统液态Hib共轭疫苗组合物，使用针和注射器腹膜内(IP)给药)；和(3组，对照)。动物经引发，然后4周后经加强。将加强2周之后收集的血清汇集，使用上述ELISA技术评价系列稀度。在一级ELISA中，将PRP-CRM197共轭物用作捕获相。该一级ELISA的结果报道于下表7中，并描述在图2中。由此可以看出，结晶组合物具有与传统疫苗给药大致相同的反应。
                                      表7疫苗反应
 稀度     IP*       PJ*   未作过试验的
  1  100    1.09(0.024)   1.131(0.012)   0.058(0.019)
  2  300    0.934(0.053)   0.989(0.003)   0.02(0.016)
  3  900    0.8015(0.0445)   0.774(0.004)   0.02(0.014)
  4  2700    0.449(0.071)   0.502(0.002)   0.015(0.013)
  5  8100    0.279(0.006)   0.277(0.004)   0.01(0.001)
  6  24300    0.129(0.0315)   0.115(0.005)   0.009(0.001)
  7  72900    0.0545(0.0018)   0.041(0.001)   0.017(0.008)
  8  218700    0.109(0.005)   0.062(0.02)   0.073(0.021)
*(IP)=腹膜内针和注射器给药，(PJ)=PowderJect_无针注射器给药为了评价免疫反应的特异性，使用白喉毒素作为捕获相进行二级ELISA。在这一点上，CRM197为白喉毒素突变型，但CRM197具有高度交叉活性。因此将抗血清连结到白喉毒素上用作评价反应朝向CRM197载体蛋白。结果报道于下表8中，并描述在图3中。再次，该结晶疫苗组合物提供了与传统疫苗组合物相比可比较的结果。
                           表8
    1       2     3     4
    稀度 未作过试验的     PJ*     IP*
 1     100     0.21     1.856     1.8
 2     300     0.102     1.846     1.64
 3     900     0.117     1.688     1.616
 4    2700     0.084     1.38     1.194
 5    8100     0.072     0.931     0.797
 6   24300     0.077     0.578     0.512
 7   82900     0.072     0.3     0.269
 8  248700     0.072     0.165     0.17
*(IP)=腹膜内针和注射器给药，(PJ)=PowderJect_无针注射器给药
为了检测PRP-特异性抗体反应，使用PRP-人体血清白蛋白(PRP-HSA)共轭物作为固体(捕获)相进行三级ELISA。由于这些老鼠没有用PRP-HSA共轭物赋予免疫性，并且在其它上下文中没有受到过HSA攻击，因此抗-PRP抗体的出现使得抗体连结。该ELISA的结果报道于下表9中，并描述于图4中。由此可以看出，该结晶和传统(液态)Hib共轭疫苗组合物具有可比较的结果。
                           表9
    1     2     3     4
血清稀度 未作过试验的     PJ*     IP*
 1     200     0.184   1.244     1.649
 2     400     0.143   0.731     0.956
 3     800     0.113   0.455     0.625
 4    1600     0.097   0.259     0.322
 5    3200     0.075   0.159     0.171
 6    6400     0.064   0.105     0.094
 7   12800     0.064   0.078     0.068
*(IP)=腹膜内针和注射器给药，(PJ)=PowderJect_无针注射器给药
为了检测通过PowderJect_给药或传统针-注射器注射的降低剂量的Hib共轭疫苗的抗体反应，进行以下研究。用液态Hib共轭疫苗组合物或结晶Hib共轭疫苗组合物在4周间隔内对Swiss Webster老鼠(雌性，6-8周龄)接种两次(引发和加强)。对四个剂量(每一剂量分别为1μg、0.2μg、0.04μg和0.01μg)的Hib共轭组合物进行试验。就无针注射器接种而言，将每一疫苗剂量与1mg海藻糖配制。对照老鼠用传统针和注射器经腹膜内注射。在每次接种之前以及加强2周之后收集血液样品。如上所述通过ELISA评价PRP和CRM197的抗体。将加强2周之后收集的血清汇集，使用上述ELISA技术评价混合血清。结果描述于图5中。由此可以看出，在1μg剂量中，IgG滴定度显示出在由PowderJect_无针注射器给药进行免疫的老鼠和使用传统针和注射器进行免疫的老鼠之间可比较。在0.01-0.2μg剂量范围内，在使用PowderJect_设备免疫的老鼠中的抗体水平显示出比相应针和注射器给药组的老鼠的高。此外，也在经过免疫的动物中测定CRM197的抗体反应。在用PowderJect_设备赋予免疫性的组中显示出剂量依赖型反应(见图5)。对照老鼠(通过传统针和注射器注射赋予免疫性的那些动物)对以较高剂量(1μg和0.2μg)接种有反应，但在较低剂量下没有反应。这些数据说明使用PowderJeet_无针注射设备的微粒疫苗组合物的透皮免疫比使用传统针和注射器注射技术的液态疫苗组合物给药更有效，特别是以低剂量给药抗原。
为了评价由结晶Hib共轭疫苗组合物提供的免疫性的持续时间，进行以下研究。用两个剂量(引发和加强)的Hib共轭结晶疫苗组合物间隔4周接种Swiss Webster老鼠(雌性，6-8周龄)。就PowderJect_无针注射器接种而言，将1μg疫苗与1mg海藻糖赋形剂配制。作为对照，用5μg液态Hib共轭疫苗组合物采用传统针和注射器给药技术经腹膜注射老鼠。在每次接种之前、加强2周后和之后每月一次收集血液样品。使用上述ELISA技术评价PRP和CRM197的抗体特异性。ELISA评价的结果示于图6A和6B中。由此可以看出，PowderJect_给药1μg结晶Hib共轭疫苗组合物对PRP和CRM197产生的血清抗体水平与通过传统针和注射器注射给药的5μg共轭物引起的水平相当。抗体在加强两周后达到最大值，持续8个月没有大的降低。这些结果说明用PowderJect_设备的微粒疫苗组合物的透皮给药产生可与液态疫苗组合物的传统针和注射器给药相比较的长效血清抗体反应。
4．用结晶失活流感病毒疫苗组合物接种。为了检测使用PowderJect_给药结晶疫苗组合物或传统针或注射器注射液态疫苗组合物的降低流感疫苗剂量的抗体反应，进行以下研究。为了评价5个不同剂量的上述结晶失活流感病毒(Aichi菌株)组合物，建立五个Balb/c老鼠(雌性，6-8周龄)试验组。这五个组在0、4和10.5周分别接受25μg、5μg、1μg、0.2μg或0.04μg失活流感病毒。就PowderJect_透皮给药而言，将每一剂量的疫苗与1mg海藻糖配制。还建立五个对照老鼠组。这些对照老鼠在0、4和10．5周分别以液态疫苗组合物(通过传统针和注射器注射经腹膜内给药)接受接种25μg、5μg、1μg、0.2μg或0.04μg失活流感病毒。第三次接种2周后，将8只老鼠的血清收集并汇集，并且ELISA检测流感病毒抗体。
加强2周后，再次使用上述ELISA技术检测混合血清中抗Aichi病毒的抗体滴定度。ELISA的结果描述在图7中。由此可以看出，结晶组合物的PowderJect_透皮给药和液态组合物的传统针和注射器注射都为剂量依赖型抗体反应。但是，在相同剂量的疫苗下，PowderJect_接种比针和注射器注射引起更高的抗体滴定度，这说明对皮肤的PowderJect_给药结晶疫苗加强了疫苗性能。
再试验血混合血清的细胞凝集抑制活性(HI)。该HI活性评价的结果描述在下表10中。由此可以看出，接种疫苗的动物的血清中HI滴定度为剂量依赖型。接受PowderJect_给药和传统针和注射器注射的动物的HI滴定度在较高疫苗剂量(25μg、5μg和1μg)下是相同的。但是，在较低疫苗剂量(0.2μg和0.04μg)下仅仅在接受来自PowderJect_***的结晶组合物的动物中产生HI滴定度。
                      表10
        在所汇集的第12周血清中HI抗体滴定度
流感疫苗(μg)  PowderJect_给药 注射器和针注射
    25     40     80
    5     20     20
    1     20     10
    0.2     10     -
    0.04     10     -
为了评价对接下来流感病毒刺激的防护性，在第12周通过鼻内滴注1×106PFU(100×LD60)适应老鼠的Aichi流感病毒以刺激已接种的动物。更具体地说，最后免疫10天之后，通过腹膜注射混合有10mg/kg赛拉嗪的100mg/kg***麻醉老鼠。将50μl盐水中1 ×106成粒单位(PFUs)的流感病毒慢慢滴注入鼻腔口中。这些老鼠本能地吸入该液体。然后让这些老鼠恢复。在刺激之前和刺激14天后每天测定这些动物的体重。每天监控动物的症状和存活情况。减轻25％预刺激体重并濒临死亡的动物用二氧化碳使其安乐死。
在刺激后14天内每天记录存活情况和体重减轻。在刺激后3-7天内所有动物都减轻体重。存活者到14天恢复它们的体重。防护性研究的结果示于下表11中。接受含25μg和5μg失活病毒疫苗组合物的动物存活统计分别示于图8A和8B中。由此可以看出，在25μg剂量下，PowderJect_给药结晶组合物对必死性比经过传统针和注射器注射给药时的液体组合物具有更好的防护性。由抗体反应和存活情况之间的相互关系看出死亡动物具有较低的抗体滴定度。在5μg剂量下，与通过传统针和注射器注射接受相同剂量的动物中没有防护性相比，PowderJect_给药结晶组合物对必死性提供了部分防护性。因此，经过PowderJect_设备透皮给药结晶组合物比传统针和注射器注射提供了更好的防护性。
                表11
            流感刺激试验
流感疫苗(μg)      存活数/总数
PowderJect_   注射器和针
    25     7/8      5/8
    5     3/8      0/8
    1     0/8      0/8
    0.2     0/8      0/8
    0.04     0/8      0/8
注：接受0、4和10周的3级接种疫苗的老鼠在第12周经100×LD50适应同种老鼠的流感病毒刺激。数据显示刺激后2周的防护性。
5．用结晶白喉毒素(dT)疫苗组合物接种。为了检测PowderJect_给药结晶组合物的降低剂量的dT疫苗的抗体反应，并与由传统针和注射器注射获得的那些抗体反应相比较，进行下面的研究。建立Balb/c老鼠(雌性，6-8周龄)的两个试验组。这些动物在0和4周接受接种液态dT疫苗组合物(由针和注射器注射给药)或结晶疫苗组合物(由PowderJect_无针注射设备给药)。对两种疫苗剂量进行试验，即含5μg和1μg白喉毒素的疫苗组合物。就PowderJect_接种而言，将每一剂量的疫苗与1mg海藻糖配制。用传统针和注射器腹膜内注射对照老鼠。最后接种2周后，从8只老鼠收集血清并汇集，由上述的ELISA技术测定dT抗体。
ELISA的结果示于下表12中。由此可以看出，透皮给药含1μgdT的结晶组合物所致的血清抗体反应比由传统针和注射器注射接受的相同剂量的液态疫苗组合物的动物中的高15倍。这说明粒子间的皮肤给药对给药dT疫苗是有效的。在5μg剂量下，通过PowderJect_设备接受结晶组合物的动物中的血清抗体水平与通过传统针和注射器注射接受液态组合物的动物中所见到的相同。
表 12
通过ELISA测定所汇集的第6周血清中dT的IgG滴定度
dT(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_) 血清IgG滴定度(注射器/针)
1 8130 570
5 188830 149560
C.3微粒佐剂组合物的形成和评价
                      实施例4
              微粒佐剂组合物的形成
将许多传统佐剂组合物配制成依据本发明方法的微粒(粉)型。使用任意的传统造粒方法可以容易地再制这些和其它佐剂。佐剂组合物中的适宜赋形剂包括海藻糖、蔗糖、琼脂糖、甘露糖醇、或这些和/或其它糖的混合物。造粒技术可以包括风干、冻干、喷涂和超临界流体方法。但是，除非有其它说明，在下面试验中所用的所有佐剂制品都是用本发明的结晶方法(具体如上所述的节C.1和C.2)制备的。
微粒佐剂组合物的生产如下。
获得大量氢氧化铝和磷酸铝佐剂(“Alum佐剂”)(由SuperfowBiosectora/s生产，从Accurate Chemical and Scientific Corp.获得)。该Alum佐剂与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。在用氮气冲洗过的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的Alum佐剂组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
获得大量MPL佐剂(由明尼苏达沙门氏茵R595提纯的单磷酰类脂A)(RIBI ImmunoChem Research，Inc.)。将该MPL佐剂与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。在用氮气冲洗过的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的MPL佐剂组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
获得大量CpG佐剂(20聚合成低聚核苷酸，CpG-1：ATCGACTCTCGAGCGTTCTC，SEQ ID NO.1和CpG-2：TCCATGACGTTCCTGATGCT，SEQ ID NO.2)(GIBCO-BRL)。将该CpG佐剂与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。在用氮气冲洗过的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的CpG佐剂组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
获得大量PCPP佐剂(合成聚合物-聚[二(羧基苯氧基)膦嗪])(VirusResearch Institute)。将该PCPP佐剂与海藻糖和dI水溶液混合。将所得溶液轻轻混合，倒入玻璃陪替氏培养皿中并在通风橱下风干2天。在一用氮气冲洗过的干燥器(Nalgene Plastic干燥器)中再干燥一天。通过刮除术收集该干燥固体组合物，然后使用研钵和研棒粉碎。将所得干燥粉末称重，将干燥物料总量除以需配制剂量的数量得到每一剂量中干燥物质的量。配制的PCPP佐剂组合物的粒径分布在很大范围(1-100μm)内变化。典型地，每一剂量需要约1-2mg干燥物料，称量差异为约10％或更低。
                         实施例5
                  用微粒佐剂组合物接种
用于输送微粒组合物的设备(即PowderJect_无针注射设备)和用于输送对照(液体)组合物的设备(即传统针和注射器)如上述实施例3中所述。将试验动物(雌性Balb/c老鼠)经如上处理，也如上所述输送疫苗组合物，将如上所述的相同ELISA技术用于以下研究。用于以下研究的结晶和对照(液体)疫苗组合物是上面实施例2中所述的失活的完整流感病毒(Aichi 菌株)组合物和白喉毒素组合物。如上面实施例3中所述用适应老鼠的Aichi流感菌株进行病毒刺激研究(在流感研究中)。
1．用微粒Alum佐剂组合物进行接种研究。将该微粒Alum佐剂组合物用作具有结晶失活流感疫苗组合物的佐剂并经PowderJect_无针注射给药***输送。用与100μg微粒Alum佐剂组合物一起或没有微粒Alum佐剂组合物的5μg或1μg结晶失活疫苗组合物接种老鼠。使用传统针和注射器用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂皮下(“S/C”)接种对照动物。在进行三次接种(在0、4和10.5周)之后，在第12周从8只老鼠中汇集血清，并通过上述ELISA技术检测流感病毒抗体。
ELISA研究的结果报道于下表13中。进行以Alum为佐剂的流感疫苗的皮肤给药，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的动物相比较时，血清抗体反应大大提高。经PowderJect_设备接受微粒组合物的动物中的血清抗体水平与用相同疫苗/佐剂组合物采用传统技术接种的动物的相同。因此可以将Alum佐剂以粉状输送到皮肤，从而加强流感疫苗的免疫原性。
表 13
在所汇集的第12周血清中通过ELISA测定的总IgG滴定度
铝(μg) 流感疫苗(μg) 血清IgG滴定度(Powder Ject_) 血清IgG滴定度(注射器/针)
无 5 6790 1505
无 1 873 804
100 5 27180 19198
100 1 2539 9966
为了评价接下来流感病毒刺激的防护性，在第12周通过鼻内滴注1×106PFU(100×LD50)适应老鼠的Aichi流感病毒以刺激已接种的动物。更具体地说，最后免疫10天之后，通过腹膜注射混合有10mg/kg赛拉嗪的100mg/kg***麻醉老鼠。将50μl盐水中1×106成粒单位(PFUs)的流感病毒慢慢滴注入鼻腔口中。这些老鼠本能地吸入该液体。然后让这些动物恢复。在刺激之前和刺激之后每天测定这些动物的体重。每天监控动物的症状和存活情况。减轻25％预刺激体重并濒临死亡的动物用二氧化碳使其安乐死。
在刺激后14天内每天记录存活情况和体重减轻。这些结果报道于下表14中并描述在图9中。由此可以看出，接受以Alum为佐剂的疫苗的老鼠中的存活比例比单独接受疫苗的老鼠中的存活比例大得多。PowderJect_给药以Alum为佐剂的流感疫苗组合物微粒比注射器和针注射更好地防止体重减轻(见图9)。最初，两组老鼠都减轻18％的体重，但是经过PowderJect_设备接受微粒组合物的动物以比皮下接种的老鼠快的速度恢复体重，这说明向皮肤透皮给药微粒免疫调节剂要优于传统针和注射器给药方法学。
                              表14
                      抵抗流感刺激的防护性
   铝(μg) 流感疫苗(μg)     存活数/总数(PowderJect_)  存活数/总数(注射器和针)
   无     5      3/8      0/8
   无     1      0/8      0/8
  100     5      8/8      7/8
  100     1      5/7      6/8
   - 未作过试验的老鼠                  2/16
注：数据为14天后存活的动物数对所刺激动物总数。
同样将该微粒Alum佐剂组合物用作结晶白喉毒素(dT)疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与100μg微粒Alum佐剂一起或没有微粒Alum佐剂的5μg或1μg结晶dT疫苗组合物使用PowderJect_设备通过透皮给药接种老鼠。使用传统针和注射器给药***用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂皮下接种对照动物。在0和4周进行接种。第6周从8只老鼠中收集血清并汇集，并通过上述ELISA技术检测dT抗体。
ELISA研究的结果报道于下表15中。由此可以看出，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的对照动物相比较时，经过PowderJect_给药设备接受以Alum为佐剂的dT疫苗组合物微粒的动物中的血清抗体反应大大提高。这些血清抗体水平与用传统装置接受该液态疫苗/佐剂组合物的动物所见到的相同。
表 15
在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG滴定度
铝(μg) dT(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_) 血清IgG滴定度(注射器/针)
无 1 8130 570
100 1 58085 142120
同样通过ELISA测定dT的IgG亚类滴定度，结果报道于下表16中。由此可以看出，通过PowderJect_设备透皮给药以Alum为佐剂的dI疫苗组合物微粒主要引起IgG1反应。用传统针和注射器注射看到相同的IgG亚类分布。这说明Alum佐剂促进了通过皮肤给药该疫苗的Th2型免疫反应。因此，使用本发明的方法可以将微粒Alum佐剂输送到皮肤并用于控制共给药疫苗的免疫反应类型。
表 16
在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
铝(μg) dT(μg) PowderJect_ 注射器/针
IgG1 IgG2a IgG1 IgG2a
无 5 140640 2170 114800 745
100 5 249070 810 359320 1145
2．微粒PCPP佐剂组合物的接种研究。将微粒PCPP佐剂组合物用作结晶失活流感疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与100μg微粒PCPP佐剂组合物一起或没有微粒PCPP佐剂组合物的5μg或1μg结晶失活流感疫苗组合物接种老鼠。使用传统针和注射器用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂经S/C接种对照动物。在进行三次接种(在0、4和10.5周)之后，在第12周从8只老鼠中汇集血清，并通过上述ELISA技术检测流感病毒抗体。同样用肉眼和手评价注射位置的毒性征兆(例如，形成肉芽肿)。
肉芽肿是给予许多佐剂之后所见到的局部毒效的常见形式。皮下注射液态以PCPP为佐剂的流感疫苗组合物导致在注射位置处的皮下组织形成肉芽肿。相反，用PowderJect_给药微粒组合物以粗手和肉眼检测察觉不到肉芽肿。这些数据建议透皮给药微粒PCPP佐剂降低或甚至避免了通常与PCPP相关的毒性。
为了评价接下来流感病毒刺激的防护性，在第12周通过鼻内滴注1×106PFU(100×LD50)适应老鼠的Aichi流感病毒以刺激已接种的动物。如上所述进行刺激。连续14天每天记录存活情况和体重减轻。存活比例示于下表17中，体重描述在图10中。由表17可以看出，与没有佐剂的疫苗相比，将微粒PCPP佐剂与结晶流感疫苗(以5μg剂量)一起给药将将大大增加存活比例。以相同疫苗剂量从对照(液态)动物看到相同的防护性。但是，从图10中看出，PowderJect_药以PCPP为佐剂的流感疫苗微粒比使用传统针和注射器***的皮下注射更好地防止了体重减轻。就此而言，两组老鼠最初都减轻约15％的体重，但是经过PowderJect_接种的老鼠以比皮下接种的老鼠快的速度恢复体重，在接受1μg剂量流感疫苗(有或没有佐剂)的动物中当以微粒或液体形式输送时看不到大的防护性。
同样将该微粒PCPP佐剂组合物用作结晶白喉毒素(dT)疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与100μg微粒PCPP佐剂一起或没有微粒PCPP佐剂的5μg或1μg结晶dT疫苗组合物使用PowderJect_设备通过透皮给药接种老鼠。使用传统针和注射器给药***用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂皮下接种对照动物。在0和4周进行接种。第6周从8只老鼠中收集血清并汇集，并通过上述ELISA技术检测dT抗体。
ELISA研究的结果报道于下表18中。由此可以看出，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的对照动物相比较时，经过PowderJeot_给药设备接受以PCPP为佐剂的dT疫苗组合物微粒的动物中的血清抗体反应大大提高。这些血清抗体水平与用传统装置接受该液态疫苗/佐剂组合物的动物所见到的相同。
                           表17
                   抵抗流感刺激的防护性
 PCPP(μg) 流感疫苗(μg)  存活数/总数(PowderJect_)  存活数/总数(注射器和针)
 无     5      3/8      0/8
 无     1      0/8      0/8
 100     5      6/8      7/7
 100     1      2/8      2/8
- 未作过试验的老鼠               2/16
注：数据为14天后存活的动物数对所刺激动物总数。
表 18
在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG滴定度
PCPP(μg) dT(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_) 血清IgG滴定度(注射器/针)
无 1 8130 570
100 1 248550 284415
同样通过ELISA测定dT的IgG亚类滴定度，结果报道于下表19中。由此可以看出，通过PowderJect_设备透皮给药以PCPP为佐剂的dT疫苗组合物微粒主要引起IgG1反应。用传统针和注射器注射可以看到相同的IgG亚类分布。这说明PCPP佐剂促进了通过皮肤给药该疫苗的Th2型免疫反应。因此，使用本发明的方法可以将微粒PCPP佐剂输送到皮肤并用于控制共给药疫苗的免疫反应类型。
表 19
在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
PCPP(μg) dT(μg) PowderJect_ 注射器/针
IgG1 IgG2a IgG1 IgG2a
无 5 140640 2170 114800 745
100 5 308160 3620 585810 3225
3．微粒CpG佐剂组合物的接种研究。将微粒CpG佐剂组合物用作结晶失活流感疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与100μg微粒CpG佐剂组合物一起或没有微粒CpG佐剂组合物的5μg或1μg结晶失活流感疫苗组合物接种老鼠。使用传统针和注射器用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂经S/C接种对照动物。在进行三次接种(在0、4和10.5周)之后，在第12周从8只老鼠中汇集血清，并通过上述ELISA技术检测流感病毒抗体。
ELISA研究的结果报道于下表20中。经过PowderJect_设备进行以CpG为佐剂的流感疫苗微粒的给药，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的动物相比较时，血清抗体反应大大提高。此外，经PowderJect_设备接受微粒组合物的动物中的血清抗体水平与用相同疫苗/佐剂组合物采用传统技术接种的动物的相同。因此，可以将CpG佐剂以粉状输送到皮肤，从而加强流感疫苗的免疫原性。以该方式给药大大加强了由CpG佐剂提供的免疫增强效果。
                           表20
        在所汇集的第12周血清中通过ELISA测定的总IgG滴定度
CpG(μg) 流感疫苗(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_) 血清IgG滴定度(注射器/针)
    无     5     6790     1505
    无     1     873     804
 10μg     5     6066     874
 10μg     1     2862     ＜100
同样通过ELISA测定流感病毒的IgG亚类滴定度，结果报道于下表21中。由此可以看出，PowderJect_给药无佐剂的微粒流感疫苗组合物主要引起IgG1反应。用传统针和注射器注射该液态疫苗组合物可以看到相同的IgG亚类分布，只是通过这种途径的滴定度低得多。这些数据说明流感疫苗本身引起Th2型免疫性。PowderJect_给药以CpG为佐剂的流感疫苗组合物微粒主要产生IgG2a抗体。这说明CpG促进Th1反应。因此，皮肤是给药CpG佐剂或以CpG为佐剂的疫苗的优选位置。
                           表21
      在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
CpG(μg) 流感病毒(μg)    PowderJect_   注射器/针
 IgG1  IgG2a  IgG1  IgG2a
    无     1  367  ＜200 ＜200 ＜200
    10     1 ＜200  1858 ＜200 ＜200
    无     5  16340  ＜200 ＜200 ＜200
    10     5  714  8711 ＜200  547
为了评价接下来流感病毒刺激的防护性，在第12周通过鼻内滴注1×106PFU(100×LD50)适应老鼠的Aichi流感病毒以刺激已接种的动物。如上所述进行刺激。连续14天每天记录存活和体重减轻。存活比例报道于下表22中。体重数据描述在图11A和11B中。由表22可以看出，当用以CpG为佐剂并经PowderJect_设备透皮给药时，看到接受微粒疫苗组合物(在1μg和5μg剂量下)的动物的存活比例为100％。相反，在1μg剂量时皮下注射该液态组合物得不到任何防护性。因此，将以CpG为佐剂的流感疫苗微粒输送到皮肤的PowderJect_给药比皮下注射更有效。
                             表22
                     抵抗流感刺激的防护性
CpG(μg) 流感疫苗(μg)  存活数/总数(PowderJect_)  存活数/总数(注射器和针)
   无     5      3/8      0/8
   无     1      0/8      0/8
   10     5      7/7      7/8
   10     1      8/8      3/8
- 未作过试验的老鼠                      2/16
注：数据为14天后存活的动物数对所刺激动物总数。
现在参照图11A和11B，PowderJect_给药以CpG为佐剂的流感疫苗微粒比使用传统针和注射器给药的皮下注射更好地防止了体重减轻。就此而言，看到用以CpG为佐剂的1μg或5μg结晶流感疫苗接种的老鼠最初体重减轻不到10％，并且这些老鼠很快恢复体重，相反，皮下注射提供的防护性小得多。具体地说，在皮下注射液态以CpG为佐剂的疫苗(以5μg剂量)的老鼠中最初体重减轻接近20％，并且皮下注射液态以CpG为佐剂的疫苗(以1μg剂量)不提供任何防护性。在该对照组中的所有动物到第5天体重减轻约25％，到第7天就死亡了。这些数据建议当使用PowderJect_***向皮肤给药时CpG是更有效和强效的免疫调节剂。
同样将该微粒CpG佐剂组合物用作结晶白喉毒素(dT)疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与10μg微粒CpG佐剂一起或没有微粒CpG佐剂的5μg或1μg结晶dT疫苗组合物使用PowderJect_设备通过透皮给药接种老鼠。使用传统针和注射器给药***用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂皮下接种对照动物。在0和4周进行接种。第6周从8只老鼠中收集血清并汇集，并通过上述ELISA技术检测dI抗体。
ELISA研究的结果报道于下表23中。由此可以看出，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的对照动物相比较时，经过PowderJect_给药设备接受以CpG为佐剂的dT疫苗组合物微粒的动物中的血清抗体反应大大提高。经过PowderJect_给药设备接受微粒组合物的动物中的血清抗体水平比用传统针和注射器接种相同疫苗/佐剂组合物(以液态)的动物中的滴定度高10倍。因此，以微粒形式输送CpG加强了共给药dI疫苗组合物的免疫原性。
                               表23
          在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG滴定度
 CpG(μg)    dT(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_)  血清IgG滴定度(注射器/针)
 无     1     8130     570
 10     1     614470     33680
 无     5     188830     149560
 10     5     1483450     116660
同样通过ELISA测定dT抗原的IgG亚类滴定度，结果报道于下表24中。由此可以看出，PowderJect_给药无佐剂的微粒流感疫苗组合物主要引起IgG1反应。用传统针和注射器注射该液态疫苗组合物可以看到相同的IgG亚类分布，只是通过这种途径的滴定度低得多。这些数据说明流感疫苗本身引起Th2型免疫性。PowderJect_给药以CpG为佐剂的流感疫苗组合物微粒主要产生IgG2a抗体。这说明CpG促进。Th1反应。用传统针和注射器注射该疫苗组合物(但以液态)可以看到相同的IgG亚类分布，只是通过这种途径的滴定度低得多。因此，皮肤是给药CpG佐剂或以CpG为佐剂的疫苗的优选位置。
                           表24
    在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
CpG(μg)    dT(μg)    给药     IgG亚类滴定度
    IgG1  IgG2a
    无     1     SC     7625 ＜200
    无     1     PJ     605 ＜200
    10     1     SC   297600  14165
    10     1     PJ   41850  2350
    无     5     SC   140640  2170
    无     5     PJ   114800  745
    10     5     SC   41050  140200
    10     5     PJ  166130  4000
SC=皮下注射，PJ=PowderJect_设备。在0和4周进行接种。
4．液态和微粒MPL佐剂组合物的接种研究。在首先的研究中，将液态MPL佐剂组合物用作佐剂与结晶失活流感疫苗组合物混合(经过PowderJect_无针注射给药设备输送)。用与50μg液态MPL佐剂组合物一起或没有该佐剂组合物的5μg或1μg结晶失活流感疫苗组合物接种老鼠。当使用MPL佐剂时，使用27号针皮下注射该液态MPL组合物，5分钟之后在相同位置用PowderJect_设备给药结晶疫苗。使用传统针和注射器将相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂经S/C接种对照动物。在进行三次接种(在0、4和10.5周)之后，在第12周从8只老鼠中汇集血清，并通过上述ELISA技术检测流感病毒抗体。
ELISA研究的结果报道于下表25中。经过皮肤给药该以MPL为佐剂的流感疫苗，当与接受相同剂量疫苗但没有佐剂的动物相比较时，血清抗体反应大大提高。经PowderJect_设备接受微粒组合物的动物中的血清抗体水平与用相同疫苗/佐剂组合物采用传统技术接种的动物的相同。因此，可以将MPL佐剂以粉状输送到皮肤，从而加强流感疫苗的免疫原性。
                             表25
       在所汇集的第12周血清中通过ELISA测定的总IgG滴定度
MPL(μg) 流感疫苗(μg) 血清IgG滴定度(PowderJect_)  血清IgG滴定度(注射器/针)
    无     5     6790     1505
    无     1     873     804
    50     5     20042     10089
    50     1     1158     2490
注：在0、4和10.5周进行接种。MPL是使用27号针经皮下注射的，5分钟后使用PowderJect_设备向相同位置给予疫苗粉。
同样通过ELISA测定流感病毒的IgG亚类滴定度，结果报道于下表26中。由此可以看出，PowderJect_给药无佐剂的微粒流感疫苗组合物主要引起IgGl反应。用传统针和注射器注射该液态疫苗组合物可以看到相同的IgG亚类分布，将皮下注射MPL佐剂和PowderJect_给药结晶流感疫苗组合物相结合产生了IgGl和IgG2a抗体，这说明皮肤给药MPL引起流感疫苗的平衡Th1/Th2反应。用传统针和注射器注射该液态疫苗组合物可以看到相同的IgG亚类分布。
表 26
在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
MPL 流感 PowderJect_ 注射器&针
(μg) (μg) IgG1 IgG2a IgG1 IgG2a
无 5 16340 <200 <200 <200
50 5 18985 1848 9548 3700
为了评价接下来流感病毒刺激的防护性，在第12周通过鼻内滴注1×106PFU(100×LD50)适应老鼠的Aichi流感病毒以刺激已接种的动物。如上所述进行刺激。连续14天每天记录存活和体重减轻。存活比例示于下表27中，并且体重数据描述在图12中。由表27可以看出，用以50μgPML为佐剂(经皮下针和注射器注射给药)的5μg结晶疫苗组合物(经PowderJect_设备给药)接种的动物中看到100％的存活率。然而在接受相同疫苗和佐剂的对照(经传统针和注射器给药)组中6只老鼠只有4只存活。在通过PowderJect_和传统针和注射器给药接受1μg疫苗组合物和50μgMPL的动物中看到部分防护性。
                              表27
                      抵抗流感刺激的防护性
  MPL(μg)   流感疫苗(μg)  存活数/总数(PowderJect_)  存活数/总数(注射器和针)
  无     5      3/8      0/8
  无     1      0/8      0/8
  50     5      7/7      4/6
  50     1      3/8      5/8
  -  未作过试验的老鼠                     2/16
注：数据为14天后存活的动物数对用106PFUs的病毒所刺激的动物总数。
现在参照图12，PowderJect_给药与MPL佐剂一起的结晶流感疫苗比使用传统针和注射器给药的皮下注射相同疫苗/佐剂组合更好地防止了体重减轻。在接受5μg疫苗剂量(经透皮PowderJect_给药)和50μgMPL佐剂的动物中最大体重减轻为10％，但是，这些动物很快恢复体重。相反，接种液态组合物(S/C)的动物体重减轻接近20％，并且它们的体重恢复速度慢得多。
在其次的研究中，将微粒MPL组合物用作结晶白喉毒素(dT)疫苗组合物的佐剂并经过PowderJect_无针注射给药***输送。用与50μg微粒MPL佐剂一起或没有该佐剂的5μg或1μg结晶dT疫苗组合物使用PowderJect_设备通过透皮给药接种老鼠。使用传统针和注射器给药***用相同疫苗/佐剂组合物的含水制剂皮下接种对照动物。在0和4周进行接种。第6周从8只老鼠中收集血清并汇集，并通过上述ELISA技术检测dT抗体。
接着透皮给药以MPL为佐剂的dT疫苗组合物微粒，血清抗体反应稍高于接受相同剂量疫苗但没有MPL的对照动物的。在经透皮PowderJect_给药接种的动物中的血清抗体水平与通过传统针和注射器注射接种相同疫苗/佐剂组合物的动物的滴定度相同。
通过ELISA检测dI的IgG亚类滴定度。结果报道于下表28中。由此可以看出，PowderJect_给药无佐剂的dI疫苗主要引起IgG1反应。用传统针和注射器注射看到相同的IgG亚类分布。当以微粒形式从PowderJect_设备给药时，该以MPL为佐剂的dT疫苗组合物产生IgG1和IgG2a抗体。用传统针和注射器注射看到相同的IgG亚类分布。这说明可以将MPL向皮肤的PowderJect_给药用于诱导平衡的Th1/Th2型免疫性。
                        表28
    在所汇集的第6周血清中通过ELISA测定的IgG亚类分布
MPL(μg) dT(μg)   给药     IgG亚类滴定度
 IgG1     IgG2a
    无     5     SC  140640     2170
    无     5     PJ  114800     745
    50     5     SC  258390     10150
    50     5     PJ  353300     2925
老鼠种=Balb/c，SC=皮下注射，PJ=PowderJect_设备。在0和4周进行接种。
因此，本发明公开了透皮给药疫苗和佐剂组合物的新型方法。还说明了新型加工的(结晶)药物组合物和制备和使用它的方法。尽管详细描述了本发明的优选实施方式，应理解为可以在不背离附加权利要求书中所记载的本发明的精神和范围内进行明显的改变。

Claims (70)

1．一种提高所选抗原免疫性的方法。该方法包括：
(a)将有效量的抗原给予脊椎动物主体；和
(b)给予足以提高抗原免疫性的量的微粒佐剂组合物，其中将佐剂传送进或通过脊椎动物主体的皮肤或组织，其中还使用透皮给药技术进行所述给药。
2．权利要求1的方法，其中抗原为微粒形式并且使用透皮给予技术将其输送进或通过脊椎动物主体的皮肤或组织。
3．权利要求1的方法，其中使用无针注射器给予设备给药微粒佐剂组合物。
4．权利要求1的方法，其中抗原和佐剂出现在各自组合物中。
5．权利要求1的方法，其中抗原和佐剂出现在相同组合物中。
6．权利要求1的方法，其中将抗原和佐剂给予到脊椎动物主体的不同位置。
7．权利要求1的方法，其中将抗原和佐剂给予到脊椎动物主体的相同位置。
8．权利要求1的方法，其中在佐剂组合物之前给予抗原。
9．权利要求1的方法，其中在佐剂组合物之后给予抗原。
10．权利要求1的方法，其中将抗原与佐剂组合物同时给予。
11．权利要求1的方法，其中抗原为病毒抗原。
12．权利要求11的方法，其中病毒抗原为病毒蛋白。
13．权利要求11的方法，其中病毒抗原为病毒粒子。
14．权利要求1的方法，其中抗原为亚单位疫苗组合物。
15．权利要求1的方法，其中抗原为细菌抗原。
16．权利要求15的方法，其中细菌抗原为细菌蛋白或多糖。
17．权利要求1的方法，其中抗原为活的减弱有机体。
18．权利要求17的方法，其中减弱有机体为病毒。
19．权利要求17的方法，其中减弱有机体为细菌。
20．权利要求1的方法，其中微粒佐剂组合物以适宜透皮给药的结晶形式提供。
21．权利要求1的方法，其中佐剂为CpG低聚核苷酸。
22．权利要求21的方法，其中CpG低聚核苷酸包括序列TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO：1)。
23．权利要求21的方法，其中CpG低聚核苷酸包括序列ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO：2)。
24．一种在脊椎动物主体中引起免疫反应的方法，所述方法包括将微粒疫苗组合物透皮给予到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中，其中该微粒疫苗组合物包括：
(a)有效量的所选抗原；和
(b)其量足以提高抗原免疫性的佐剂。
25．权利要求24的方法，其中使用无针注射器给予设备给药微粒疫苗组合物。
26．权利要求24的方法，其中抗原为病毒抗原。
27．权利要求26的方法，其中病毒抗原为病毒蛋白。
28．权利要求26的方法，其中病毒抗原为病毒粒子。
29．权利要求24的方法，其中疫苗组合物为亚单位疫苗组合物。
30．权利要求24的方法，其中抗原为细菌抗原。
31．权利要求30的方法，其中细茵抗原为细菌蛋白或多糖。
32．权利要求24的方法，其中抗原为活的减弱有机体。
33．权利要求32的方法，其中减弱有机体为病毒。
34．权利要求32的方法，其中减弱有机体为细菌。
35．权利要求24的方法，其中微粒疫苗组合物以适宜透皮给药的结晶形式提供。
36．权利要求24的方法，其中佐剂为CpG低聚核苷酸。
37．权利要求36的方法，其中CpG低聚核苷酸包括序列TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO：1)。
38．权利要求36的方法，其中CpG低聚核苷酸包括序列ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO：2)。
39．适宜使用透皮给药技术输送到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中的微粒佐剂组合物。
40．一种佐剂在生产用于透皮给药到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中的微粒组合物中的用途。
41．根据权利要求40的用途，其中微粒组合物包括所选抗原，并且佐剂提高该抗原的免疫原性。
42．根据权利要求40的用途，其中使用无针注射器给药设备将该微粒组合物输送到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中。
43．根据权利要求40的用途，其中抗原为病毒抗原。
44．根据权利要求43的用途，其中病毒抗原为病毒蛋白。
45．根据权利要求43的用途，其中病毒抗原为病毒粒子。
46．根据权利要求40的用途，其中抗原为亚单位疫苗组合物。
47．根据权利要求40的用途，其中抗原为细菌抗原。
48．根据权利要求47的用途，其中细菌抗原为细菌蛋白或多糖。
49．根据权利要求40的用途，其中抗原为活的减弱有机体。
50．根据权利要求49的用途，其中减弱有机体为病毒。
51．根据权利要求49的用途，其中减弱有机体为细菌。
52．根据权利要求40的用途，其中微粒组合物以适宜透皮给药的结晶形式提供。
53．根据权利要求40的用途，其中佐剂为CpG低聚核苷酸。
54．根据权利要求53的用途，其中CpG低聚核苷酸包括序列TCCATGACGTTCCTGATGCT(SEQ ID NO：1)。
55．根据权利要求53的用途，其中CpG低聚核苷酸包括序列ATCGACTCTCGAGCGTTCTC(SEQ ID NO：2)。
56．一种在脊椎动物主体中引起生物效应的方法，包括将足够引起生物效应的量的权利要求39的微粒佐剂组合物给药到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中。
57．一种形成结晶药物组合物的方法，所述方法包括：
(a)将液态药剂与适宜药物级的糖混合以提供一组合物；
(b)将该组合物在对结晶形成有利的适宜蒸发条件下干燥，因此获得具有提高的密度特性的结晶组合物；和
(c)收集该结晶组合物。
58．权利要求57的方法，其中药物组合物为疫苗组合物。
59．一种适宜输送到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中的结晶药物组合物。
60．权利要求59的组合物，其中所述组合物为疫苗组合物。
61．权利要求60的组合物，其中所述组合物包括一抗原和其量足够提高结晶药物组合物密度的赋形剂。
62．权利要求61的组合物，其中抗原为病毒抗原。
63．权利要求61的组合物，其中抗原为细菌抗原。
64．一种处理一主体的方法，所述方法包括将权利要求59的结晶药物组合物输送到所述主体的皮肤或组织中或通过其中，其中以足够在主体中引起预防或治疗效果的量输送该结晶组合物。
65．权利要求64的方法，其中药物组合物为包括感兴趣的抗原的疫苗组合物。
66．权利要求65的方法，其中疫苗组合物为亚单位疫苗组合物。
67．权利要求65的方法，其中疫苗组合物包括病毒抗原。
68．权利要求65的方法，其中一组合物包括细菌抗原。
69．权利要求64的方法，其中使用无针注射器将该结晶组合物输送到主体中。
70．一种药剂在生产用于透皮给药到脊椎动物主体的皮肤或组织中或通过其中的微粒组合物中的用途。
CN98812843A 1997-12-02 1998-12-02 透皮给药微粒疫苗组合物 Pending CN1285753A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6714697P 1997-12-02 1997-12-02
US8268698P 1998-04-22 1998-04-22
US60/067,146 1998-04-22
US60/082,686 1998-04-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1285753A true CN1285753A (zh) 2001-02-28

Family

ID=26747529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98812843A Pending CN1285753A (zh) 1997-12-02 1998-12-02 透皮给药微粒疫苗组合物

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1035867A1 (zh)
JP (1) JP2001524533A (zh)
CN (1) CN1285753A (zh)
AU (1) AU756828B2 (zh)
CA (1) CA2312900A1 (zh)
HU (1) HUP0101139A3 (zh)
IL (1) IL136488A0 (zh)
NZ (1) NZ504894A (zh)
WO (1) WO1999027961A1 (zh)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7223739B1 (en) 1995-06-07 2007-05-29 Powderject Vaccines, Inc. Adjuvanted genetic vaccines
WO2000047227A2 (en) 1999-02-09 2000-08-17 Powderject Vaccines, Inc. Mycobacterium tuberculosis, immunization
ATE306938T1 (de) * 1999-06-29 2005-11-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Verwendung von cpg als adjuvans für hivimpstoff
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
ATE285806T1 (de) 1999-10-11 2005-01-15 Felton International Inc Universelle antiinfektionsschutzvorrichtung für nadellose injektoren
CN100333794C (zh) * 1999-11-03 2007-08-29 宝德杰克特疫苗有限公司 佐剂化的基因疫苗
DE69942161D1 (de) * 1999-11-03 2010-04-29 Powderject Vaccines Inc Genetische Adjuvanz-Impfstoffe
IL149458A0 (en) * 1999-11-10 2002-11-10 Powderject Vaccines Inc Induction of mucosal immunity by vaccination via the skin route
US7887506B1 (en) 1999-11-23 2011-02-15 Pulse Needlefree Systems, Inc. Safety mechanism to prevent accidental patient injection and methods of same
CA2412197A1 (en) * 2000-06-08 2001-12-13 Powderject Vaccines, Inc. Powder compositions
GB0022742D0 (en) 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20050019340A1 (en) 2000-10-18 2005-01-27 Nathalie Garcon Vaccines
US8466116B2 (en) * 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
DK1944318T3 (da) 2003-07-21 2011-06-14 Transgene Sa Multifunktionelle cytokiner
US20090317420A1 (en) 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
WO2006032475A2 (en) 2004-09-22 2006-03-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Staphylococcal immunogenic compositions
US11707520B2 (en) 2005-11-03 2023-07-25 Seqirus UK Limited Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CA2628152C (en) 2005-11-04 2016-02-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Adjuvanted vaccines with non-virion antigens prepared from influenza viruses grown in cell culture
CA2628397C (en) * 2005-11-04 2013-08-20 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Changing th1/th2 balance in split influenza vaccines with adjuvants
PL1951299T3 (pl) 2005-11-04 2012-07-31 Novartis Ag Szczepionki przeciw grypie zawierające kombinacje adiuwantów cząsteczkowych i czynników wzmacniających immunogenność
US7527801B2 (en) 2005-11-22 2009-05-05 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Norovirus and Sapovirus antigens
CA2633772C (en) 2005-12-22 2015-09-15 Ralph Leon Biemans Pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
EP1998802A2 (en) 2006-03-30 2008-12-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20100015168A1 (en) 2006-06-09 2010-01-21 Novartis Ag Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
SI2086582T1 (sl) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo, ki obsega emulzijo olja v vodi kot adjuvans
US20100183667A1 (en) 2006-10-12 2010-07-22 Glaxo Smithkline Biologicals S.A. Vaccine Comprising an Oil in Water Emulsion Adjuvant
EP2152304B1 (en) 2007-05-02 2018-08-22 The Regents of the University of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
BRPI0813307C1 (pt) 2007-06-26 2021-05-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina
CA2699513C (en) 2007-09-12 2018-03-13 Novartis Ag Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
EP2537857B1 (en) 2007-12-21 2017-01-18 GlaxoSmithKline Biologicals SA Mutant forms of streptolysin O
SI2271360T1 (sl) 2008-04-16 2015-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cepivo
EP2349209A2 (en) 2008-09-26 2011-08-03 Nanobio Corporation Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
WO2010057197A1 (en) 2008-11-17 2010-05-20 The Regents Of The University Of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
AU2010204139A1 (en) 2009-01-12 2011-08-11 Novartis Ag Cna_B domain antigens in vaccines against gram positive bacteria
KR101825697B1 (ko) 2009-02-10 2018-02-05 노파르티스 아게 감소된 양의 스쿠알렌을 포함하는 인플루엔자 백신
CN102438650A (zh) 2009-03-06 2012-05-02 诺华有限公司 衣原体抗原
EP2944320A1 (en) 2009-06-15 2015-11-18 National University of Singapore Influenza vaccine, composition, and methods of use
CA2765511C (en) 2009-06-16 2015-05-12 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
JP5633152B2 (ja) * 2010-02-16 2014-12-03 東ソー株式会社 アジュバント
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
BR112012025364A2 (pt) 2010-04-07 2015-09-22 Novartis Ag método para geração de partícula semelhante a vírus de parvovírus b19
GB201009861D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Novartis Ag OMV vaccines
US8658603B2 (en) 2010-06-16 2014-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inducing an immune response
MX2013000163A (es) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Metodos y composiciones inmunogenicas derivadas de norovirus.
GB2482691B (en) * 2010-08-10 2013-08-14 Nemaura Pharma Ltd Structures for transdermal drug delivery
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
MX339058B (es) 2011-05-17 2016-05-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna contra streptococcus pneumoniae.
US20130189303A1 (en) 2011-08-02 2013-07-25 Yan Zhou Recombinant swine influenza virus and uses thereof
WO2013038385A2 (en) 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Escherichia coli vaccine combination
WO2014008475A2 (en) 2012-07-05 2014-01-09 The Ohio State University Compositions and methods related to viral vaccines
EP2912069B1 (en) 2012-10-23 2019-07-31 Emory University Gm-csf and il-4 conjugates, compositions, and methods related thereto
BR112015009229B1 (pt) 2012-10-24 2021-07-20 Platelet Targeted Therapeutics, Llc Composição tendo como alvo a expressão de genes para plaquetas, uso de uma célula tronco compreendendo a referida composição para tratar hemofilia e método in vitro ou ex vivo para gerar uma célula tronco modificada
CA2928700C (en) 2013-11-01 2019-01-15 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
WO2015071769A2 (en) 2013-11-13 2015-05-21 University Of Oslo Outer membrane vesicles and uses thereof
WO2015071763A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Oslo Universitetssykehus Hf Ctl peptide epitopes and antigen-specific t cells, methods for their discovery, and uses thereof
EP3077410B1 (en) 2013-12-03 2021-02-03 Virometix AG Proline-rich peptides protective against s. pneumoniae
JP7158853B2 (ja) 2014-10-10 2022-10-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 対象における食物アレルギーまたは呼吸器アレルギーを処置するための、かつ上記対象の鼻腔内に投与するための免疫原性組成物
AR102548A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y uso
AR102547A1 (es) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Vacunas contra la enfermedad de manos, pies y boca y métodos de fabricación y su uso
US10647964B2 (en) 2015-03-05 2020-05-12 Northwestern University Non-neuroinvasive viruses and uses thereof
CN108348593B (zh) 2015-08-31 2022-08-16 泰克诺瓦克斯股份有限公司 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2017201390A1 (en) 2016-05-19 2017-11-23 The Regents Of The University Of Michigan Novel adjuvant compositions
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
WO2018096396A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
BR112019024300A2 (pt) 2017-05-22 2020-06-16 Topadur Pharma Ag Ativadores de guanilato ciclase solúvel com modo duplo de ação e inibidores da fosfodiesterase e usos dos mesmos
TW201925222A (zh) 2017-06-23 2019-07-01 美商醫院疫苗公司 免疫原性組成物
WO2019048928A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 University Of Oslo VACCINE MOLECULES
EP3678699A1 (en) 2017-09-07 2020-07-15 University Of Oslo Vaccine molecules
KR20200083571A (ko) 2017-11-03 2020-07-08 다케다 백신즈 인코포레이티드 지카 바이러스를 비활성화시키기 위한, 그리고 비활성화의 완결도를 결정하기 위한 방법
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof
GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
BR112021009958A2 (pt) 2018-11-28 2021-08-17 Topadur Pharma Ag modo duplo de ação de ativadores de guanilato ciclase solúveis e inibidores de fosfodiesterase e seus usos
WO2021245192A1 (en) 2020-06-04 2021-12-09 Topadur Pharma Ag Novel dual mode of action soluble guanylate cyclase activators and phosphodiesterase inhibitors and uses thereof
US20230233667A1 (en) 2021-09-08 2023-07-27 Affinivax, Inc. Coronavirus vaccine

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US509188A (en) * 1893-11-21 Barton b
US4629782A (en) * 1984-12-21 1986-12-16 Syntex (U.S.A.) Inc. Crystalline form of N-acetylmuramyl-L-α-aminobutyryl-D-isoglutamine
CA1337047C (en) * 1988-08-18 1995-09-19 Peter Dodd Cooper Gamma inulin compositions
DK0390435T3 (da) * 1989-03-29 1994-03-21 Takeda Chemical Industries Ltd Blanding indeholdende en forbindelse fra vitamin B gruppen, og fremstilling deraf
US5091188A (en) * 1990-04-26 1992-02-25 Haynes Duncan H Phospholipid-coated microcrystals: injectable formulations of water-insoluble drugs
WO1994009819A1 (en) * 1992-11-03 1994-05-11 Secretech, Inc. Microcrystalline cellulose as an immune adjuvant
TW360548B (en) * 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
EP0914440B1 (en) * 1996-04-19 2007-01-10 Merial Ltd. Nucleic acid vaccination for parvoviral infections

Also Published As

Publication number Publication date
EP1035867A1 (en) 2000-09-20
CA2312900A1 (en) 1999-06-10
HUP0101139A2 (hu) 2001-07-30
HUP0101139A3 (en) 2003-11-28
WO1999027961A1 (en) 1999-06-10
JP2001524533A (ja) 2001-12-04
IL136488A0 (en) 2001-06-14
AU756828B2 (en) 2003-01-23
AU1619999A (en) 1999-06-16
NZ504894A (en) 2002-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1285753A (zh) 透皮给药微粒疫苗组合物
Amorij et al. Pulmonary delivery of an inulin-stabilized influenza subunit vaccine prepared by spray-freeze drying induces systemic, mucosal humoral as well as cell-mediated immune responses in BALB/c mice
ES2273391T3 (es) Composicion de vacuna para administracion a una superficie mucosal.
US20140242115A1 (en) Inactivating pathogens with oxidizing agents for vaccine production
US20110159047A1 (en) Stable powder formulations of alum-adsorbed vaccines
Qiao et al. Recombinant lactic acid bacteria as promising vectors for mucosal vaccination
CN1404399A (zh) 调节包括与粘膜体表面接触的疫苗抗原的物质的作用的新的非抗原性粘膜佐剂制剂
US20060228375A1 (en) Induction of mucosal immunity by vaccination via the skin route
Chen et al. Nanotechnologies applied in biomedical vaccines
CN101123982B (zh) 脂质和一氧化二氮组合作为用于增强疫苗功效的佐剂
CN110327314B (zh) 一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂
AU784781B2 (en) Induction of mucosal immunity by vaccination via the skin route
EP1972347A1 (en) Stable vaccine powder formulations
Sahni et al. Vaccine Delivery: current Routes of Administration and Novel Approaches
WO2011014418A1 (en) Vaccine stabilizer
Saluja Novel perspectives for influenza vaccine formulation and administration: L. lactis cell wall derived adjuvant, stable dry powder vaccines and mucosal vaccine delivery
CN1426309A (zh) 佐剂化的基因疫苗
CN111588841A (zh) 一种可气溶胶化的seb类毒素疫苗干粉吸入剂
CN117018175A (zh) 一种呼吸道合胞病毒腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用
RU2123331C1 (ru) Способ получения живой коревой вакцины
CN111690055A (zh) 抗非洲猪瘟病毒和cd多克隆小分子抗体及制备方法和应用
CN1621090A (zh) 特异性卵黄免疫球蛋白口服冻干制剂及其制备方法及用途
RU2402348C1 (ru) Вакцина антирабическая сухая для крупного и мелкого рогатого скота
MXPA00005348A (es) Administracion transdermica de composiciones particuladas para vacunas
CN113209286A (zh) 一种乙脑疫苗鼻粘膜递送***

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned
C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned