CN1278737A - 减少多肽自结合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了减小多肽药物自结合趋向的方法。该方法利用组氨酸化合物并可使用经皮释放技术使多肽药剂更有效释放。

Description

减少多肽自结合的方法
技术领域
总的来说，本发明涉及药物的经皮释放。更具体地说，本发明涉及减少多肽药物自结合以帮助其经皮释放的方法。
发明背景
治疗剂的经皮(即通过皮肤)释放提供了一种舒适、方便且无损伤的给药技术。该方法与常规药物释放方式相比有多个优点。例如，避免了口服给药中遇到的吸收和(例如肝脏)代谢速率不稳定，并消除了其他一些固有不便-例如胃肠刺激等。经皮释放还可以高度控制特定药物的血液浓度，是具有狭窄治疗指数、短暂半衰期和强活性的药物的极其引人注目的给药途径。
经皮释放可以是被动的，也可以是主动的。由于大小、离子电荷特性和疏水性等因素的影响，许多药物不适合被动经皮释放。克服这种局限的一个方法是使用低水平的电流以积极地将药物通过完整皮肤转运到体内。这种技术称作“电转运”或“离子电渗”药物释放。由于所施加电流的幅度、时间选择和极性可以使用标准电组件容易地进行调节，因此该技术提供了比被动经皮药物释放更好控制的方法。在这点上，电转运药物通量可能比相同药物的被动经皮药物通量大50％到数个数量级。
电转运设备一般使用至少两个电极。这两个电极均被置于与身体的一部分皮肤密切电学接触。一个电极叫做作用电极或给体电极，治疗剂从此电极释放到身体内。另一个电极叫做对电极或返回电极，它起着密闭通过身体的电路的作用。电极通过与电源、例如电池相连而形成与患者的皮肤相连接的电路，所述电极通常是与能控制通过该设备的电流的电路***相连。
根据将要经皮释放的物质的电荷，作用或给体电极可以是阳极或阴极。因此，如果将要释放到体内的离子物质是带正电荷的，则正电极(阳极)将是作用电极，而负电极(阴极)将充当对电极，形成回路。另一方面，如果将被释放的离子物质是带负电荷的，则阴极将是作用电极，而阳极是对电极。另外，阳极和阴极可能均用于将带有适当电荷的药物释放到体内。在这种情况下，两个电极都看作是作用或给体电极。换句话说，阳极可以将带正电荷的药剂释放到体内，同时阴极可以将带负电荷的药剂释放到体内。
现有电转运设备还需要一个将被释放到体内的治疗剂的贮器或来源。这种药物贮器与该电转运设备的阳极或阴极相连，以作为一种或多种所需物质或药剂的固定或可更新的来源。贮器和来源的实例包括Jacobsen的美国专利4，250，878中所述的囊袋；Webster的美国专利4，382，529中所述的预制凝胶体；和Sanderson等的美国专利4，722，726的附图中公开的保存药物液体溶液的玻璃或塑料容器。
由于肽类、多肽和蛋白质在用常规给药途径如口服释放给药时常遇到一些问题，因此本文中特别感兴趣的是它们的经皮释放。多肽和蛋白质分子口服给药时，极易在胃肠道中被蛋白酶降解并受到肝脏的广泛代谢。因此，这些物质通常需要胃肠外给药，以在患者的血液中达到治疗浓度。最传统的胃肠外给药技术是皮下注射和静脉内给药。然而，多肽和蛋白质在它们的生物学活性方面是天生作用短暂的，需要频繁注射，经常是一天数次，以维持所需的治疗有效浓度。患者经常感到这种治疗方案不方便且令人痛苦。这种治疗还存在例如感染的危险。
现已作出许多努力去寻找多肽和蛋白质药物(除胃肠外注射以外)的其他有效给药途径。特别令人感兴趣的是具有较少副作用以及更好的患者配合性的给药途径。这样的途径一般包括“屏护”口服给药，其中多肽／蛋白质通过胃的低pH环境后从胶囊或其他容器中释放，通过粘膜组织，例如用吸入器通过肺粘膜组织、或用鼻喷雾剂通过鼻粘膜组织释放，和通过可植入泵释放。不幸的是，这些可供选择的多肽／蛋白质释放途径仅取得有限的成功。
许多研究人员已公开了多肽和蛋白质的电转运释放。R．Burnette等(药物科学杂志(1986)75：738)的早期研究涉及一种小的三肽分子-促甲状腺素释放激素的体外皮肤渗透过程。已发现电转运通量高于被动扩散通量。Chien等(药物科学杂志(1988)78：376)的体外和体内研究显示，加压素和胰岛素经电转运进行经皮释放是可能的。还参见Maulding等，美国法定发明注册号No．H1160，它公开了降钙素在小型猪体内的电转运释放。
然而，多肽和蛋白质的经皮释放也遇到了技术上的困难。例如，由于电极和药物溶液或电解质盐溶液间的接触面上的水解可能导致发生皮肤刺激。这种水解的产物-阳极上的水合氢离子和阴极上的羟离子，与类似电荷的药物离子竞争释放到皮肤内，从而改变了皮肤的pH值并引起皮肤刺激。Phipps等的美国专利5，533，971中更详细地描述了此问题，并报道使用氨基酸缓冲液，包括组氨酸缓冲液，来减少皮肤刺激。
此外，某些多肽，特别是对于所治疗动物来说不是天然的那些，可能会引起皮肤反应，例如过敏或刺激。许多多肽也不稳定并迅速降解。关于这点，1993年7月8日出版的国际申请W0 93／12812中描述了使用组氨酸缓冲液来化学稳定生长激素制剂。另外，某些多肽药物在水溶液中迅速聚集，这可能引起释放和可溶性问题。
例如，含水胰岛素在药物制剂相当浓度时易形成二聚体，它们又依次自结合成四聚体、六聚体、叠式(stacked)六聚体和其他聚合物，同时溶解性下降。这些聚集体可能阻塞连续释放设备的机械部分并难以(即使并非不可能)经皮释放。胰岛素制剂中惯用于稳定和延长胰岛素活性的金属离子如锌离子的存在加剧了这种趋向。
已进行了尝试来减少蛋白质诸如胰岛素的自结合。例如，Ogiso等(生物药理学通报(1996)19：1049-1054)报道在猪胰岛素低聚物经皮吸收之前使用Gly-HCl缓冲液来促进其离解。Bringer等(糖尿病(1981)30：83-85)报道，二羧基氨基酸Asp和Glu在它们的等电pH值下可减少胰岛素在溶液中的聚集。实验者解释说，要使用这些氨基酸来阻止聚集，似乎酸性pH(3．5)是必需的。然而，胰岛素在酸中是化学不稳定的。Sibalis等的美国专利4，940，456中描述了用于电解经皮转运的胰岛素组合物，它包括脲、丙基脲、碘化钾、高氯酸钠或盐酸胍作为离解剂。
据报道已研究出自结合趋向减小了的胰岛素类似物。例如，Balschmidt等的美国专利5，164，366描述了缺失某些氨基酸的胰岛素类似物，诸如缺失PheB24和PheB25。1992年8月6日公开的国际专利申请WO 92／12999描述了一些选定氨基酸残基被Asp和G1u残基取代的人胰岛素类似物。1987年3月18日公开的欧洲专利申请214，826B1中报道了特别是在B9-B12区域和B26-B28位置具有氨基酸取代的胰岛素类似物，其中取代天然氨基酸的残基是更亲水的。优选的氨基酸取代基包括Asp，Glu，Ser，Thr，His和Ile。然而，这些类似物中许多表现出生物活性降低。
因此，在经皮释放方面，仍期望有降低多肽药物如胰岛素自结合的方法。
发明的公开
因此，本发明提供了一种防止胰岛素和其他生物活性多肽自结合、同时有助于这些分子溶解的方法。该方法使用组氨酸化合物，凭藉自结合的减少，使得蛋白质更有效地以治疗有效量经皮释放，诸如通过电转运和被动经皮释放。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种减少多肽形成低聚物的方法。该方法包含将多肽与适量的、足以减小所述多肽的自结合趋向的组氨酸化合物结合。在特别优选的方法中，组氨酸化合物是L-组氨酸或L-甘氨酰组氨酸，多肽是有或没有锌的胰岛素化合物，诸如无锌人胰岛素化合物或人LysB28ProB29胰岛素类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种减少人胰岛素化合物形成六聚体和更大物质的方法。该方法包含将胰岛素化合物与约pH7-约pH8的组氨酸化合物混合。组氨酸的浓度至少为约10毫摩尔浓度(mM)。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种利用电转运通过身体表面释放多肽药剂的方法。该方法包含：
(a)提供一种包含多肽和组氨酸化合物的组合物，其中组氨酸化合物以足以降低多肽自结合趋向的量存在于该组合物中；和
(b)利用电转运通过身体表面释放该组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种利用电转运通过身体表面释放人胰岛素化合物的方法。该方法包含：
(a)提供一种包含胰岛素化合物和约pH7-约pH8下的组氨酸化合物的组合物，其中组氨酸化合物的浓度为约10毫摩尔浓度至约250毫摩尔浓度；和
(b)利用电转运通过身体表面释放该组合物。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种利用被动经皮释放通过身体表面给药人胰岛素化合物的方法。该方法包含：
(a)提供一种包含所述胰岛素化合物和组氨酸化合物的组合物，其中所述组氨酸化合物以足以降低所述胰岛素自结合趋向的量存在于所述组合物中；和
(b)利用被动经皮释放通过身体表面给药所述组合物。
本领域技术人员根据本文的公开可容易地实施本发明的这些以及其他实施方案。
附图的简要描述
图1显示了在pH7．5下组氨酸浓度升高对每六聚体键合两个锌的野生型人胰岛素的溶解性的影响。
图2是可用于本发明的一种代表性电转运药物释放设备的图解图。
图3是可用于本发明的一种代表性被动经皮药物释放设备的横断面图。
图4是可用于本发明的另一种被动经皮药物释放设备的横断面图。
图5是利用来自实施例中表Ⅲ的240mM组氨酸的数据所作的、无锌LysB28proB29人胰岛素的平均分子量作为胰岛素浓度的函数图。
图6是利用来自实施例中表Ⅲ的0mM组氨酸的数据所作的、无锌LysB28ProB29人胰岛素的平均分子量作为胰岛素浓度的函数图。
图7是利用来自实施例中表Ⅳ的240mM组氨酸的数据所作的、无锌野生型人胰岛素的平均分子量作为胰岛素浓度的函数图。
图8是利用来自实施例中表Ⅳ的0mM组氨酸的数据所作的、无锌野生型人胰岛素的平均分子量作为胰岛素浓度的函数图。
发明详述
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域中公知的常规蛋白质化学、电化学和生物化学方法。这些技术在文献中有充分的说明。参见，例如：T．E．Creighton，蛋白质：结构与分子特性(W．H．Freeman and Company，1993)；A．L．Lehninger，生物化学(WorthPublishers，Inc．，1975)；J．S．Newman，电化学***(PrenticeHall，1973)；和A．J．Bard与L．R．Faulkner，电化学方法、基础与应用(John Wiley ＆ Sons，1980)。
必须注意的是，在本说明书和所附的权利要求书中使用的不定和指定单数形式包括复数的指示物，除非在文章中另有清楚的说明。因此，例如，“一种多肽”包括两种或多种多肽的混合物，等等。
本文中使用下列氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A)    精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)  天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)  谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)    甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)    异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)    赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)  苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)    丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)    色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)    缬氨酸：Val(V)
Ⅰ．定义
在描述本发明时将使用下列术语，并且这些术语的定义如下。术语“多肽”、“多肽药剂”和“多肽药物”在本文中可交换使用，代表氨基酸残基的任何生物活性聚合物。这些术语包括肽、寡肽、二聚体、多聚体等。这样的多肽可以是天然来源的，或者可以通过合成或重组产生。这些术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。
本文中定义的多肽药物或药剂一般由上面所列20种天然氨基酸中的一种或多种组成，并且还可包括数种已知氨基酸类似物中的任何种类，这些氨基酸类似物可以是天然产生的，也可以是合成的类似物，例如但不限于：高异亮氨酸，2-(亚甲基环丙基)甘氨酸，S-甲基半胱氨酸，S-(丙烯基)半胱氨酸，高丝氨酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，高精氨酸，3-(3-羧基苯基)丙氨酸，环己基丙氨酸，含羞草氨酸，2-哌啶酸，4-甲基谷氨酸，刀豆氨酸，2，3-二氨基丙酸等。多肽还可以中性或盐形式存在，例如，酸加成盐(与类似多肽的游离氨基形成的)，它们是与诸如盐酸或磷酸等无机酸形成的，或者是与诸如乙酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成的。从游离羧基形成的盐还可以是从无机碱形成的，所述无机碱是诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，也可以是从诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸等有机碱形成的。下文中将列出本发明中可使用的多肽药剂的实例。
本文中所用的术语“胰岛素化合物”是指具有与天然胰岛素或胰岛素原相似或相同分子结构的化合物，包括具有与天然胰岛素或胰岛素原相似或相同的三级构象的分子，并且它们保持了胰岛素活性，即调节血糖水平的能力。这样的化合物可以包括相对于天然分子的氨基酸添加、取代和缺失，只要这些修饰不破坏胰岛素活性即可。具有相对于天然胰岛素的氨基酸取代的胰岛素化合物的实例包括LysB28ProB29人胰岛素和AspB28人胰岛素。另外，出于本发明的目的，胰岛素化合物还可以从任何哺乳动物来源产生，诸如人、牛、犬、马、羊、猪、鲸鱼等。胰岛素化合物可以直接从来源有机体的胰腺提纯，或者可以通过重组或合成产生。参见，例如：Brange，J．，胰岛素的盖仑制剂，胰岛素和胰岛素制剂的物理化学和药学方面(Springer-Verlag)中的有关得到胰岛素的各种方法。
此外，本文中使用的术语“胰岛素化合物”表示有或没有结合金属的胰岛素化合物。关于这一点，已发现金属，诸如锌和钙，可延长胰岛素的活性并提高分子的物理稳定性。因此，用于本发明方法的胰岛素化合物非限制性地包括无金属的胰岛素，以及与适宜金属结合的胰岛素，包括但不限于具有从约2Zn2+分子／六聚体到约4Zn2+分子／六聚体的胰岛素。参见，例如：美国专利4，476，118中对这种化合物以及它们的制备方法的描述。下面将更充分地描述本发明所用的胰岛素化合物的其他实例。
本文中所用的术语“组氨酸化合物”是指氨基酸L-His，以及如下所定义保留了减小所给多肽形成低聚物的能力的L-His的氨基酸类似物。这样的类似物非限制性地包括含有His的二肽和三肽，诸如但不限于His-Gly，Gly-His，Ala-His，3-甲基-His，1-甲基-His，肌肽，His-Ser和His-Ala。
当组氨酸化合物的存在使得多肽自结合生成低聚物如四聚体、六聚体、叠式六聚体和其他聚合物的现象被阻止(例如，低聚物的形成至少被部分阻止)或逆转(例如，已聚集的多肽被离解)时，组氨酸化合物即是“减少了所给多肽的低聚物的形成”。组氨酸化合物减少低聚物形成的能力可以通过评定在所讨论的组氨酸化合物存在或不存在时低聚物质的存在情况来确定。这种形成可以使用分析超速离心来确定(参见，例如：现代分析超速离心，Schuster和Laue编辑，1994，Birkh@user；和生物化学与聚合物科学中的分析超速离心，Harding，Rowe和Horton编辑，1992年，The Royal Societyof Chemistry)，诸如实施例中描述的沉降平衡研究，分光光度测定(参见，例如：Ogiso等，生物药理学通报(1996)19：1049-1054)，渗透压测定法，凝胶过滤等。有关这些方法的描述，参见例如：Valdes和Ackers，酶学方法学，第6l卷(酶结构，H部分，Hirs和Timasheff编辑)Academic Press，1979，125-142页。
术语“被动经皮释放”是指在没有应用电动势的帮助下，一种或多种将经***循环分布的药学活性多肽药剂通过身体表面(例如皮肤)的释放。被动经皮释放可以使用许多手段完成，非限制性地包括直接应用于皮肤、经皮贴片、提供控制释放的膜调节***、粘附型扩散控制***、基质分散型***和微量贮器***。这些***是本领域中已知的，并且在Remington：药剂学与实践(Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995)中进行了详细讨论。可以使用渗透增强剂来促进通过皮肤的吸收。这种渗透增强剂包括溶剂诸如水，包括甲醇、乙醇、2-丙醇等的醇，烷基甲基亚砜，吡咯烷酮，月桂氮  酮(1aurocapram)，丙酮，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，四氢呋喃(tetrahydrofurfuryl)；表面活性剂；和诸如脲、N，N-二乙基-间甲苯甲酰胺等化学制剂。
本文中所用的术语“电转运”、“离子电渗疗法”和“离子电渗”是指利用对含药剂贮器的施加电动势将一种或多种药学活性多肽药剂通过身体表面(例如皮肤)释放．该药剂可以通过电迁移、电穿孔、电渗透或其任意组合释放。电渗透也被称作电流体运动、电对流和电诱导的渗透。一般说来，物质电渗透到组织中导致含有该物质的溶剂迁移，这是将电动势施加到治疗物质贮器的结果，即，通过其他离子物质的电迁移诱导溶剂流动。在电转运过程中，皮肤可能发生某些改变或变化，诸如在皮肤上形成瞬变的小孔，也称作“电穿孔”。通过改变或变化身体表面(例如，在皮肤上形成小孔)而增强的物质的任何电协助转运也包括在本文所用的术语“电转运”内。因此，本文中使用的术语“电转运”、“离子电渗疗法”和“离子电渗”是指：(1)带电荷的药剂通过电迁移释放，(2)不带电荷的药剂通过电渗透过程释放，(3)带电荷或不带电荷的药剂通过电穿孔释放，(4)带电荷的药剂通过电迁移和电渗透相结合的方法释放，和／或(5)带电荷和不带电荷的药剂的混合物通过电迁移和电渗透相结合的方法释放。
利用标准测量方法测定，当通过身体表面(例如皮肤或粘膜)的多肽电转运通量在组氨酸化合物的存在下与不存在组氨酸化合物时的电转运通量相比增加了时，多肽显示“增强的电转运”。例如，经皮电转运通量可以使用本领域中公知的许多体内或体外方法评定。体外方法包括在电转运通量室的供体和受体区室之间夹紧适宜动物的一块皮肤(例如，人尸皮肤)，使该皮肤块的角质层侧面向供体区室。使欲释放的含有药物的溶液或凝胶与角质层接触，并向各位于区室之一中的两电极施加电流。通过在受体区室中对药物的量采样来计算经皮药物通量。用于优化经皮电转运药物释放的两种成功模型是Riviere的分离的猪皮肤瓣模型(Heit等，药物科学杂，志(1993)82：240-243)，和使用无毛啮齿动物或豚鼠的分离的无毛皮肤。参见Hadzija等，药物与药理学杂志(1992)44：387-390。还参见，例如Ogiso等，生物药理学通报(1996)19：1049-1054，其中有关评估胰岛素经皮吸收方法的描述。
Ⅱ．实现本发明的方式
本发明涉及使用组氨酸化合物来减少多肽分子的自结合，由此与未经处理的多肽的释放相比增强多肽分子的经皮释放。因此该方法可提高大量物质经皮释放的效率，并使原本不适合这种释放的分子可以经皮释放。另外，该方法提高了如此处理过的多肽药剂的溶解性，并减小了可能因内源性物质的聚集而发生免疫反应的可能性。
本发明可用于各种各样的具有聚集趋向的蛋白质和多肽药剂，诸如许多来源于真核生物、原核生物和病毒的多肽，以及合成肽。这样的多肽非限制性地包括抗生素和抗病毒剂肽类药物，抗肿瘤药，免疫调节剂，肽激素诸如胰岛素、胰岛素原、生长激素、GHRH、LHRH、EGF、抑生长素、SNX-111、BNP、促胰岛素(insulinotropin)、ANP和糖蛋白激素诸如FSH、LH、PSH和hCG。
本发明已使用胰岛素和胰岛素类似物进行例示，但并不限于胰岛素化合物。选择胰岛素来说明本发明是基于其具有自结合成六聚体结构和称之为“叠式六聚体”的聚合物结构的趋向。这种结合抑制了该多肽的经皮释放并可在释放部位引起刺激。
本发明所用的胰岛素化合物的实例包括任何商业上可获得的胰岛素，诸如来自Sigma，st．Louis，M0的重组人胰岛素，它们配制成锌胰岛素的中性溶液或悬液。这种胰岛素制剂中每六聚体结合最少两个锌离子，并且胰岛素浓度为约0．2至约3．0 mM(1mgmL-1-18mg mL-1)。不过，本文中也可使用包括高达约17mM胰岛素的更高浓度胰岛素的胰岛素制剂。本发明方法中也可使用没有金属如锌的胰岛素，浓度可以在约0．1-30mM范围内。作为本文中的胰岛素化合物使用的胰岛素类似物包括商业上可获得的人胰岛素类似物，诸如LysB28和ProB29胰岛素，可从Lilly(Indianap01is，IN)公司作为 Humalog 胰岛素lispro注射剂得到，在实施例中有进一步描述；含有精蛋白的胰岛素化合物，诸如NPH(NeutralProtamine Hagedorn)和中性精蛋白锌胰岛素(可从多个制造商处获得)；和慢胰岛素及两相胰岛素(可从多个制造商处获得)。参见，例如：Remington：药剂学与实践，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年中有关这些以及其他胰岛素化合物的描述。
本文中可使用的其他胰岛素类似物包括但不限于：诸如Marki等在生理学与化学杂志(1979)360：1619-1632中描述的那些类似物，它们在A链的2、5、6、7、8和11位氨基酸以及B链的5、7、13和16位氨基酸上有取代；硫酸化胰岛素，诸如Albisser等在美国药典约定，Rockyille，MD(Gueriguian等编辑)，84-95页中描述的那些；脱Phe胰岛素(B链的N-末端氨基酸删除)；还缺失某些氨基酸的胰岛素类似物，诸如缺失PheB24或PheB25(Balschmidt等的美国专利5，164，366)；具有氨基酸取代、特别是在B9-B12区和B26-B28位上有氨基酸取代的胰岛素类似物，其中取代天然氨基酸的残基是更亲水的，并且一般是Asp，Glu，Ser，Thr，His和Ile(1987年3月18日公开的欧洲专利申请214，826 B1)；具有被Asp和Glu残基取代的选定氨基酸残基的人胰岛素类似物(1992年8月6日公开的国际专利申请WO 92／12999)，等等。
本发明中可使用的组氨酸化合物包括L-His及其类似物，诸如但不限于含有His的二肽和三肽，诸如His-Gly，Gly-His，Ala-His，3甲基-His，1甲基-His，L-肌肽(也叫做β-Ala-His)，His-Ser和His-Ala。适宜组氨酸化合物的选择在本领域中是公知的，大半根据所讨论的特定多肽来确定。
组氨酸化合物一般将在其等电点下存在，并且浓度为约1mM至330mM，更优选约10mM-约250mM，最优选约25mM-约250mM。最佳组氨酸浓度取决于许多因素，包括胰岛素浓度、其他盐(例如NaCl)的浓度、是否有锌存在、是否存在防腐剂、多肽形成低聚物的趋向，等等。一般说来，组氨酸的浓度至少为约10mM。蛋白质制剂领域的那些技术人员可以容易地针对在特定应用或制剂中所用的特定变量(例如，胰岛素浓度、盐浓度、是否存在锌、有或没有防腐剂)确定出最佳组氨酸浓度。
多肽将以治疗有效量存在，也就是足以达到所需治疗结果的量。所需的精确量将根据受治疗者的不同而变化，取决于受治疗者的种类、年龄和一般状况，所治疗疾病的严重程度，以及有关系的特定多肽药物。本领域技术人员可以使用例如标准剂量应答曲线等容易地确定治疗有效剂量。例如，如果多肽是胰岛素，它一般将以约0．1-约30mM的浓度存在，更优选为0．2-约20mM浓度，最优选为约0．3-约17mM浓度，该浓度取决于所用的具体胰岛素化合物以及分子中是否包括结合锌。
当L-His与商业上可获得的人胰岛素(一般包括六聚体和叠式六聚体形式的胰岛素)一起使用时，胰岛素通常将以约0．2mM-约17mM(1mg mL-1-100mg mL-1)的浓度存在，而L-His以约25-250mM的浓度存在。本领域技术人员可以容易地确定本发明方法中使用的胰岛素和L-His的合适用量。
本发明中可使用的多肽药物可以是带负电荷的、带正电荷的、或者是中性的，其选择除了其他因素以外将取决于所用的特定组氨酸化合物，以及所需pH。这些参数的确定是本领域技术人员公知的。例如，当L-His用作组氨酸化合物且该组合物的pH为7-8时，胰岛素化合物将是带负电荷的。
一般而言，最终溶液的pH值将在约pH6至约pH8．5范围内，更优选为pH7-约pH8。不过，溶液的pH值也可以根据该方法中使用的特定多肽和组氨酸化合物而改变。
多肽和组氨酸化合物一般存在于诸如水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等可药用赋形剂中，由此形成溶液或悬液。如果需要，将被给药的药物组合物中还可以含有少量无毒辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、单月桂酸脱水山梨糖醇酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯等。适宜赋形剂和添加剂的选择多半根据所用的多肽和组氨酸化合物来确定。有关多肽制剂的讨论，参见，例如：Remington：药剂学与实践，Mack PublishingCompany，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年。
对于胰岛素制剂，这样的物质非限制性地包括：防腐剂，诸如对羟基苯甲酸甲酯和酚类(间甲酚)；等渗剂，诸如甘油或盐，包括但不限于NaCl(一般浓度为约1至约100mM NaCl)；以及其他添加剂和缓冲剂，诸如乙酸钠，NaPO4，等等。有关胰岛素制剂的讨论，参见，例如：Brange，J．，膜岛素的稳定性(Kluwer AcademicPublishers)；Brange，J．，膜岛素的盖仑制剂，胰岛素和胰岛素制剂的物理化学和药学方面(Springer-Verlag)；以及Remington：药剂学与实践，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，第19版，1995年。
一旦制备了预期的带有组氨酸的多肽制剂，就可以使用数种经皮药物释放***中的任何一种将其释放到受治疗者体内，并且释放不限于使用一种特定***。在例如Myers等的美国专利5，312，326中、Theeuwes等的美国专利5，080，646中、Gyory等的美国专利5，387，189中、和Gyory等的美国专利5，169，383中描述了电转运药物释放***的实例，这些文献公开的内容结合在此作为参考。
图2说明了一种可以与本发明方法联合使用的代表性电转运释放设备。设备10包含一个上壳16，一个电路板组件18，一个下壳20，阳电极22，阴电极24，阳极贮器26，阴极贮器28和皮肤相容性粘合剂30。上壳16具有帮助设备10保持在患者皮肤上的侧翼15。上壳16优选由可注射模压的弹性体(例如乙烯乙酸乙烯酯)组成。印制电路板组件18包括一个与分立元器件40和电池32连结的集成电路19。电路板组件18通过两个穿过开口13a和13b的小杆(图2中未显示)与上壳16相连，将这两个小杆的末端加热／熔化，以将电路板组件18热力定桩到上壳16上。下壳20利用粘合剂30与上壳16相连，粘合剂30的上表面34与下壳20和上壳16包括侧翼15的底表面粘合。
在电路板组件18的下面(部分)显示出的是钮扣式电池32。也可以使用其他类型的电池为设备10提供动力。
设备10一般由电池32，电子回路19、40，电极22、24，和药物／化合物贮器26、28组成，它们共同集合成一个独立单元。电路板组件18的输出(图2中未显示)通过下壳20上形成的凹窝25、25，上的开口23、23’与电极24和22电接触，是利用电传导性粘合带42，42’实现的。电极22和24依次与药物贮器26和28的顶侧44，44直接机械和电接触。药物贮器26，28的底侧46’，46通过粘合剂30中的开口29’，29与患者的皮肤接触。
设备10可选地具有使患者能通过电转运自我给予一定剂量药物的特性。压下按钮开关12，电路板组件18上的电回路将预定的DC电流输送到电极／贮器22、26和24、28达预定长度的释放期。按钮开关12方便地位于设备10的顶侧，并容易通过衣服启动。优选在短时间例如3秒钟内双压按钮开关12以激活设备释放药物，由此减小设备10意外启动的可能性。优选的是，该设备利用LED14开始发光和／或发出可听得见的声音信号形式例如“报警器”传送给使用者一个可以看见和／或可以听见的确认药物释放间隔开始的信号。药物通过电转运经患者的皮肤，例如在手臂上，在预定的释放间隔内释放。
阳电极22优选由银组成，阴电极24优选由氯化银组成。贮器26和28均优选由聚合物水凝胶材料组成。电极22，24和贮器26，28保持在下壳20上的凹窝25’，25中。
按钮开关12、电路板组件18上的电子回路和电池32被粘合性地“密闭”在上壳16和下壳20之间。上壳16优选由橡胶或其他弹性材料组成。下壳20优选由可容易地模压成凹窝25，25’并剪切形成开口23，23’的塑料或弹性片材料(例如聚乙烯)组成。所装配的设备10优选是耐水的(即，防止飞溅的)，最优选是防水的。该***具有容易与身体一致的低轮廓，由此允许在穿用部位及其附近自由移动。贮器26和28位于设备10的与皮肤接触的一侧并分离开足够的距离，以防止在正常的操作和使用过程中发生意外的电短路。
设备10利用圆周形粘合剂30与患者的身体表面(例如皮肤)附着，该粘合剂30具有上侧34和与身体接触的一侧36。粘附侧36具有粘附性能，可确保设备10在使用者正常活动过程中保持在身体的适当位置上，也允许在预定的穿用期(例如24小时)后合理地移开。粘合剂上侧34附着于下壳20，并保持下壳20与上壳16粘合。
贮器26和28一般包含凝胶基质，药物溶液均匀分散于至少贮器26和28之一中。可以使用在大约1×10-4M-1．0M范围内或更大浓度的药物，在该范围较低部分内的药物浓度是优选的。凝胶基质的合适聚合物可以实质上包含任何非离子型合成的和／或天然产生的聚合物材料。当活性剂是极性的和／或能离子化时，优选有极性特性，以增强药剂的溶解性。可选地，该凝胶基质将是可水膨胀的。合适的合成聚合物的实例包括但不限于：聚(丙烯酰胺)，聚(丙烯酸2-羟乙基酯)，聚(丙烯酸2-羟丙基酯)，聚(N-乙烯基-2-吡咯烷酮)，聚(正羟甲基丙烯酰胺)，聚(双丙酮丙烯酰胺)，聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)，聚(乙烯醇)和聚(烯丙醇)。羟基官能缩聚物(即，聚酯，聚碳酸酯，聚氨酯)也是合适的极性合成聚合物的例子。适合用作凝胶基质的极性天然产聚合物(或其衍生物)的例子是纤维素醚，甲基纤维素醚，纤维素和羟基化纤维素，甲基纤维素和羟基化甲基纤维素，树胶诸如瓜尔胶，槐树胶，刺梧桐树胶，黄原胶，明胶，及其衍生物。离子聚合物也可用于基质，只要可获得的抗衡离子是药物离子或其他与活性剂带相反电荷的离子。
因此，本发明的多肽／组氨酸制剂将被加入到药物贮器中，例如刚刚描述的凝胶基质中，并使用可选地如上文中例举的电转运药物释放***对患者给药。可以用许多方式加入药物溶液，即，通过将溶液浸渗到贮器基质中，通过在形成水凝胶之前将药物溶液与基质材料混合，或类似方法。
在本发明的其他实施方案中，可以用被动经皮释放来给药本发明的多肽／组氨酸制剂。本领域技术人员将意识到，本发明可以与各种各样的被动经皮释放***联合使用，在这一点上本发明没有限制。有关被动***的例子可以参照，但不限于：Campbell等的美国专利4，379，454，Gale等的美国专利4，588，580，Campbell等的美国专利4，832，953，Gale等的美国专利4，698，062，Campbell等的美国专利4，867，982，和Hunt等的美国专利5，268，209，其中所公开的任何一种***都可用于本发明。图3和图4说明了被动经皮释放设备的两个实例。
在图3中，被动经皮释放设备88包含一个贮器90，该贮器中含有将被经皮释放的制剂。贮器90优选为其中含有分散的制剂的基质形式。贮器90夹在一个衬垫层92和一个可选的速率控制膜94之间，药剂可渗透衬垫层92。在图3中，贮器90由足够粘稠以维持其形状的一种材料诸如聚合物形成。如果用较低粘性的材料形成贮器90，诸如用含水凝胶，则衬垫层92和速率控制膜94应沿外周密封在一起以防止泄漏。位于膜94下的是皮肤穿孔设备2，在其面对皮肤的表面上具有连接介质65，它通过设备2中的开口(未显示)延伸，与膜94接触。设备88利用围绕设备2外周的接触粘合层96并可选地通过前面所描述的任何一个实施方案中的锚定元件附着于身体表面。在大多数情况下，连接介质65一开始就含有药剂。在粘合层96的暴露表面上通常提供一个可剥离的释放衬垫(未显示)，并在将设备10应用于身体表面之前将其除去。
另一方面，如放大的图4中所示，经皮治疗设备98可以利用一个有弹性的粘性覆盖层100粘附到身体表面。设备98由一个含有药剂的贮器90组成，该贮器优选为其中含有分散的药剂的基质形式。连接介质65通过开口8延伸，与贮器90接触。或者，贮器90中的基质可以在一开始就通过开口8延伸到与连接介质65接触，或者贮器和连接介质也可以是同一器件。可渗透的衬垫层102与贮器90的一个表面相邻。粘性覆盖层100使设备保持在身体表面上。粘性覆盖层100可以与设备98的其他部分一起制造，或者以分离形式制造。对于某些制剂，粘性覆盖层100可能比图3中所示的接触粘合层96优选。例如，当药剂贮器中含有对接触粘合层96的粘合性能有不利影响的物质(例如油性表面活性剂)时就是这样。可渗透的衬垫层102优选稍大于贮器90，从而可以防止贮器90中的药剂与覆盖层100中的粘合剂发生不利的相互作用。可选地，可以在贮器90的身体表面一侧提供一个与图3中的膜94相似的速率控制膜(图4中未显示)。设备98通常也提供一个可剥离的释放衬垫(未显示)，并在将设备98应用于身体表面之前将其除去。
贮器90的制剂可以是含水的或不含水的。该制剂设计成以所需通量释放药剂。含水制剂一般包含水和约1至约60重量％的亲水聚合物作为胶凝剂，诸如羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基甲基丙烯酸酯和隐形眼镜中所用的聚合物。典型的非含水制剂由硅树脂液、硅橡胶、烃类聚合物、聚异丁烯、橡胶或矿物油组成。含有矿物油的凝胶一般还含有1-2重量％的胶凝剂诸如胶态二氧化硅。
其中带有药剂的贮器基质应当是与所释放的药剂、吸收抑制剂(如果有的话)和它们的任何载体相容的。当使用含水基***时，贮器基质优选为亲水聚合物(例如水凝胶)。当使用非含水基***时，贮器基质优选由疏水聚合物组成。合适的聚合物基质是经皮药物释放领域中公知的。
当需要恒定的药剂释放速率时，该药剂以过饱和的浓度存在于基质或载体中，超过的量是***的药剂释放期的所需长度的函数。不过，药剂也可以以低于饱和的浓度存在，只要多肽／组氨酸制剂和吸收抑制剂(如果有的话)是以足以减少或消除药剂对皮肤的刺激的用量和给药持续时间对相同身体表面部位连续和广泛地给药。
除了药剂以外，连接介质还可含有染料，颜料，惰性填充剂，渗透增强剂，赋形剂增粘剂，中性聚合物，表面活性剂，试剂，缓冲剂，增塑剂，和本领域中公知的药物产品或经皮释放设备中的其他常规组分。
存在于贮器中的药剂的量和贮器的大小一般没有限制，该量等于或大于释放形式存在时可有效带来所需的局部和／或***生理学和／或药理学作用的药剂量。
其中药剂被释放的优选形式一般决定了要使用的释放***的类型，反之亦然。也就是说，通过扩散释放药剂的被动***或通过电转运释放药剂的电力***的选择主要由药剂的形式决定。例如，对于被动释放***，一般已认识到：当药剂通过角质层扩散时，药剂优选以其游离碱或酸形式释放，而不是以水溶性盐的形式释放。另一方面，对于电转运释放设备，现已认识到：药剂一般应可溶于水。人们普遍认为：通过完整皮肤的被动和电转运经皮药物释放的通道是不同的，被动释放通过皮肤的脂质区(即，疏水区)发生，而电转运释放通过亲水通道或诸如与毛囊和汗腺有关的那些小孔发生。在穿透皮肤的情况下，预期会有通过生成的水性通道的实质性被动流。在穿透皮肤的情况下，用于被动释放的药剂一般是亲水的(例如，水溶性盐形式)，而用于电转运释放的药剂优选形式也是亲水的(例如，水溶性盐形式)。对于被动释放，可以使用离子化药剂(例如水溶性的)和非离子化药剂(例如亲水的)的混合物。
在有关胰岛素被动经皮释放的一个优选实施方案中，制剂将含有组氨酸缓冲液和无锌且没有防腐剂诸如间甲酚或苯酚的胰岛素化合物，和自结合趋向降低了的野生型人胰岛素或胰岛素类似物，诸如人LysB28proB29胰岛素类似物。这样的制剂使以能更快速扩散的低分子量形式存在的胰岛素分子的比例增加到最大程度。
该多肽／组氨酸制剂还可以使用渗透和压力驱动***释放，所述***通过由溶剂传送的连接流动释放药剂。在这样的***中，药剂优选在该载体溶剂中具有足够的溶解性。本领域技术人员将认识到：本发明可以与各种各样的渗透和压力驱动***联合使用，在这一点上本发明不限于特定的设备。有关渗透和压力驱动***的实例，可以参考以下文献：Eckenhoff的美国专利4，340，480，Theeuwes等的美国专利4，655，766，Eckenhoff的美国专利4，753，651，Gross等的美国专利5，279，544，Theeuwes的美国专利4，655，766，Gross等的美国专利5，242，406，和Eckenhoff的美国专利4，753，651，其中公开的每一种***均可用于本发明。
尽管本发明已结合其优选的具体实施方案进行了描述，但应理解：前面的描述以及后面的实施例是为了说明而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、优点和改动对本领域技术人员来说是显而易见的。
Ⅲ．实验
材料
人胰岛素(通过在大肠杆菌中表达而制得)、β-乳球蛋白、L-组氨酸(碱)和丝氨酰胺(Serinamide)从Sigma(St．Louis，M0)购得。Sigma胰岛素制剂含有约0．4％Zn，相当于约2个锌原子／胰岛素六聚体。 Humalog(LysB28ProB29人胰岛素类似物)以及Humlin(人胰岛素注射剂)，二者均是重组DNA来源并由Lilly(Indianapolis，IN)制造，它们是从商业药房中购得的。L—组氨酸(碱)从J．T．Baker(Phillipsburg，NJ)以及Sigma(St．Louis，MO)得到。冰醋酸从J．T．Baker(Phillipsburg，NJ)得到。盐酸从Mallinckrodt(Paris，KY)购得。氯化钠(NaCl)由Aldrich(St．Louis，MO)提供。溶菌酶从Worthington Biochemical公司(Freehold NJ)得到。L-甘氨酰基-L-组氨酸二肽由Bachem Bioscience公司(Kingof Prussia，PA)合成。
方法
无锌的人胰岛素的制备
可从商业来源获得的所有人胰岛素含有约2个结合锌分子／胰岛素六聚体。与野生型人胰岛素(可从Sigma获得或作为 HumulinR 获得)和LysB28ProB29类似物(可作为 Humalog获得)结合的锌可以通过对10mM乙酸在4℃下长时间透析而除去。在使用 HumlinR 和Humalog的情况下，可注射胰岛素的pH在透析之前首先使用冰醋酸和1N盐酸从中性pH调节到pH3．5。然后将透析后的胰岛素冷冻干燥。对冷冻干燥物质的锌分析表明残余的锌少于0．03锌／六聚体。
L-组氨酸和L-甘氨酰基-L-组氨酸缓冲液的制备
用Milli-Q水(Millipore，Medford，MA)来制备所有缓冲液。这些缓冲液在使用前通过0．22μm醋酸纤维素酯膜过滤。252mM L-组氨酸溶液的pH值在22℃下约为pH7．62±0．1，1M L-甘氨酰基-L-组氨酸缓冲液的pH值在22℃下约为pH7．68±0．1。
丝氨酰胺缓冲液的制备
制备100mM丝氨酰胺缓冲液母液并将pH调节至7．5+0．1。
存在于L-组氨酸和L-甘氨酰基-L-组氨酸缓冲液中的胰岛素的制备
制备用分析超速离心进行的每个实验所用的胰岛素母液。母液的浓度通过将等分试样稀释到6M盐酸胍(Pierce，Rockford，IL)中并用分光光度计(Aviv，14DS型，Lakewood，NJ)检验其吸光度而确定。在使用276nm处摩尔消光系数1．109mL mg-1cm-1确定样品的浓度之前修正样品的光散射吸光度。对于含有组氨酸的制剂，胰岛素母液用250mM或330mM L-组氨酸制成。对于L-甘氨酰基-L-组氨酸，胰岛素母液用260mM和／或1M L-甘氨酰基-L-组氨酸缓冲液制备。一般说来，对于含有约2锌／六聚体的野生型胰岛素，用L-组氨酸或L-甘氨酰基-L-组氨酸制备不超过10mM(约60mg mL-1)的母液。对于没有组氨酸的制剂，用10mM NaCl制备含有7．1 mg mL-12锌／六聚体的野生型胰岛素的母液，用NaOH将其调节至pH7．5。在无锌的野生型和／或LysB28proB29人胰岛素类似物的情况下，可以用0．1M NaCl，pH7．5和／或250 mM组氨酸，0．1M NaCl，pH7．5制备不超过17 mM(约100mg mL-1)的母液。在22℃下，在1M甘氨酰-组氨酸缓冲液中的胰岛素母液的pH约为7．68±0．1，在250mM组氨酸中为7．62±0．1。在进行分析超速离心操作之前，用有或没有适量NaCl的组氨酸或甘氨酰-组氨酸缓冲液稀释该胰岛素母液，以使胰岛素的浓度在最低2 mg mL-1(0．35mM)到最高40 mg mL-1(7mM)之间变化。胰岛素溶解于其中的L-组氨酸缓冲液的终浓度在10mM至252mM之间变化。对于L-甘氨酰基-L-组氨酸，存在于250和750mM缓冲液中的含有2锌／六聚体的野生型胰岛素制剂用超速离心机进行检验。此外，向一些存在于L-组氨酸或L-甘氨酰基-L-组氨酸缓冲液中的胰岛素样品中加入终浓度为50和100mM的氯化钠。
溶菌酶＆β-乳球蛋白的制备
用含有0、100或250mM L-组氨酸的0．15M NaCl制备溶菌酶溶液(15mg mL-1)。含有组氨酸的溶液在21℃下的pH为7．60±0．1；没有L-组氨酸的溶菌酶溶液的pH用稀碱调节至相同pH。类似地，在0．15M NaCl中的β-乳球蛋白的pH用稀碱调节至与在250mM L-组氨酸中的β-乳球蛋白的pH相同，为pH7．74±0．1。
在分析超速离心机中的沉降平衡研究
各种胰岛素制剂的沉降平衡实验在32℃下使用分析型超速离心机(XL-A或XL-I型；Beckman，Palo Alto，CA)进行。
使用瑞利干涉光学和／或扫描UV／可见光学在不同转速下得到所有样品的沉降平衡数据。对于后者，在数个波长处检测胰岛素样品的吸光度扫描，例如在248、288、291和295nm。在操作开始时，用设在上述波长的单色仪装置得到的扫描数据估计摩尔消光系数值。用这些值来计算不同条件下胰岛素的摩尔结合平衡常数。吸光度扫描中的每个数据点记录为径向距离增加0．002cm时的10次扫描的平均值。对于干涉光学***，使用675nm的光得到胰岛素以及溶菌酶样品的沉降平衡数据。在1cm路径中1mg mL-1多肽溶液的条纹置换测定为2．77条纹(McMeekin等，生物化学与生物物理学研究通讯(1962)7：151-156；Doty和Geiduschek，393-460页，在蛋白质1A中，由Neurath和Bailey编辑，Academic Press，NY(1943)；Perlmann和Longsworth，美国化学会会志(1948)70：2719-2724)。用该值来计算胰岛素和溶菌酶样品的摩尔结合常数。人胰岛素的单体分子量测定为5796g mol-1，使用残基微分比容的Cohn和Edsall值根据氨基酸组成计算出的微分比容为0．727mL g-1。在溶菌酶的情况下，单体的分子量测定为14315g mol-1，微分比容值为0．703mL g-1(Sophianopoulos等，生物化学杂志(1962)237：1107)。对于β-乳球蛋白，在280nm处得到UV吸光度扫描数据，单体的分子量测定为18400 g mol-1。后者的微分比容为0．747mL g-1(Kelly和Reithel，生物化学(1971)10：2639-2644)，用于计算摩尔结合常数的消光系数为0．97mL g-1cm-1(Wetlaufer和Lovrien，生物化学杂志(1964)243：596)。所有蛋白质在L-组氨酸的存在下的有效浮力分子量使用已占体积模型计算(Jacobsen等，生物化学(1996)35：13173-13179)，其中BAM值简单地设定为单体分子量乘以微分比容。L-组氨酸和L-甘氨酰基—组氨酸的微分比容测定为0．641mL g-1(370-381页，蛋白质、氨基酸和肽(1943)，Cohn和Edsall编辑，Hafner Publishing，N．Y．)。
离心后，从干涉和吸光度扫描得到的数据用已知方法进行分析，包括Shire等，生物化学(1991)30：7703-7711中的基于公式9的算法。所用的算法包括一种改进方法，其中拟合参数用(BM1)1／2代替(B)1／2。此分析得到了使用者指定模型的结合常数的估计值。该模型可以是理想单体的(最简单的模型)或者可以是与一种、两种、三种或更多种特定大小的聚集体处于化学平衡的单体的。最可能的模型是将实验吸光度与理论吸光度之间差值的平方和减至最小的模型，即，差值的均方根最小的模型。
实施例1
L-组氨酸对胰岛素溶解性极限的影响
为了确定L-组氨酸对2锌／六聚体野生型人胰岛素的溶解性极限的影响，将不同浓度的胰岛素与L-组氨酸混合。如图1中所示，在缓冲液中使用L-组氨酸提高了含有胰岛素的缓冲溶液的最大胰岛素浓度。没有L-组氨酸，在pH7．5，10mM NaCl和室温下，带有2锌／六聚体的胰岛素达到的最高浓度为7．1mg mL-1或1．2mM。有250mM组氨酸在其等电点下存在时，胰岛素溶液的浓度高达16．5mM，表现出浓度升高了15倍。
实施例2
不存在NaCl时等电点下的L-组氨酸和L-甘氨酰基-组氨酸对胰岛素自结合的影响
为了确定不存在NaCl时L-组氨酸和L-甘氨酰基-组氨酸在其等电点对自结合的影响，如上所述进行沉降平衡研究。如表1中所示，L-组氨酸浓度升高使得六聚合平衡常数降低。在pH7．5下，不存在任何组氨酸时，沉降平衡数据(在32℃和转速为18K-48K下收集的)可以拟合二聚体六聚体结合模型，Ink2-6值为52．6。非理想系数B考虑因缓冲液的离子强度非常低而引起的非理想作用。假定存在单一分子量物质，使用最简单的模型进行数据分析，得到M平均／M1值为5．5，提示不存在任何组氨酸时胰岛素聚集体的平均大小稍小于六聚体。在锌的存在和中性pH下，3个胰岛素二聚体装配形成六聚体的观察结果与公开的数据(Brange，胰岛素的盖仑制剂(1987)SpringerVerlag)一致。将在pH7．6±0．1、20-252mM组氨酸存在时在多种转速下收集的沉降平衡数据拟合二聚体六聚体结合模型。随着组氨酸的浓度从20mM升高至252mM，观察到六聚合化平衡常数降低。用胰岛素观察组氨酸的作用，离心池中的胰岛素的浓度从最低0．01mM(0．1mg mL-1)至最高13mM(75mg mL-1)。尽管事实表明组氨酸极大地提高了胰岛素的溶解性(在250mM his，pH7．5±0．1中，溶解性极限为16．5mM)，但在这些条件下并非所有聚集的胰岛素都是二聚体和六聚体。在用超速离心机检验的最高胰岛素加载浓度(6mM)下也发现了多六聚体的聚集体。当样品在20k rpm转速下达到平衡时，仅有80％的最初加载到池中的胰岛素保留在溶液中。剩余20％胰岛素在池底部聚结成大的不溶的聚集体。粗略的计算显示这些聚集体的平均分子量超过100000，相当于约3个胰岛素六聚体。
甘氨酰-组氨酸是组氨酸类似物中的一种，检测其对胰岛素自结合的影响。在250mM时，甘氨酰-组氨酸也减小了胰岛素形成六聚体的趋向，但不如组氨酸那么有效。利用单一物质模型对使用干涉光学在50k转速下获得的沉降平衡进行分析，结果显示，在甘氨酰-组氨酸中胰岛素的平均分子量是四聚体的分子量(表1)。作为对比，在252mM组氨酸(在超速离心机中检验的最高浓度)下，胰岛素的平均分子量是二聚体的分子量。用也调节至pH7．5±0．1的另一种缓冲液丝氨酰胺取代组氨酸没能减小野生型胰岛素在中性pH下发生自结合的能力。
表Ⅰ．使用二聚体-六聚体结合模型进行分析，在32℃和pH7．5±0．1下不存在氯化钠时，各种缓冲液对野生型人胰岛素(带有2锌／六聚体)的自结合的影响缓冲液       I．S．    Mavg／M1    Ink2-6    r．m．s．    B没有添加剂1  2．8      5．5        52．6     0．006       1．8E-6丝氨酰胺1    22        5．2        25．0     0．0080      1．7E-638mM组氨酸1      3．3      4．2        20．7     0．0080      5．5E-620mM组氨酸2      5．6      3．3        18．3     0．0144      7．7E-6113mM组氨酸3      6．3      2．3        14．2     0．006       ～0240mM组氨酸4      6．3      2．6        14．4     0．0235      2．0E-6252mMgly-his5     27．5     4．3        18．2     0．0464      7．9E-7250mM
I．S．是缓冲液的离子强度，单位mM
B(g-2L mol)是非理想系数，基于胰岛素二聚体计算
r．m．s．是实验数据与理论数据之间差值的均方根
Mavg／M1是对于单一物质非理想模型，沉降物质的平均分子量除以胰岛素单体的分子量
Ink2-6是从三个二聚体形成六聚体时的结合常数的自然对数
1对0．34mM胰岛素样品在18k，24k，28k，34k和48k转速下于291nm检测UV吸光度扫描得到的
2对0．69mM胰岛素样品在15k，20k，25k和30k转速下于291nm检测UV吸光度扫描得到的
3对0．35mM胰岛素样品在24k，28k，34k和48k转速下于291nm检测UV吸光度扫描得到的
4从6mM胰岛素样品在50k转速下的干涉光学得到的
5从3和6mM胰岛素样品在50k转速下的干涉光学得到的
实施例3
在NaCl的存在下L-组氨酸和L-甘氨酰基-组氨酸在等电点对带有2锌／六聚体的野生型人胰岛素自结合的影响
为了确定存在NaCl时L-组氨酸和L-甘氨酰基-组氨酸在其等电点对胰岛素自结合的影响，如上所述进行实验。当用氯化钠使pH7．5样品的离子强度增加至约100mM时，在没有组氨酸缓冲液的情况下，野生型人胰岛素大部分以六聚体存在。如表II中所示，当胰岛素样品中组氨酸的浓度从50mM升高至226mM时，六聚合化平衡常数有适度的降低。该作用没有不存在盐时观察到的(参见表I)那么显著。在226mM，即在100mM离子强度下检测的最高组氨酸浓度下，基于单一胰岛素物质的假设计算出的Mavg／M1值约为6。相反，不存在NaCl时，在pH 7．6+0．1的252mM组氨酸中胰岛素主要为二聚体。此外，在226mM组氨酸和100 mM NaCl存在下，不论开始时加载的胰岛素浓度如何，以等于或小于十二聚物的平均大小沉降的胰岛素的终浓度为约2mM。其余胰岛素样品在20k转速时聚结到池的底部。因此，在含有100mM NaCl的组氨酸缓冲液中形成极大聚集体的胰岛素的百分数远高于没有NaCl的组氨酸缓冲液中的百分数值。在后者的情况下，产生大聚集体沉积的胰岛素浓度范围是约4．8mM。
这些结果显示，组氨酸对胰岛素自结合的影响取决于介质的离子环境。初步实验数据提示，从2个六聚体形成胰岛素十二聚物的吉布斯自由能作为缓冲液离子强度的平方根的函数升高。
在L-甘氨酰-L-组氨酸的情况下，向野生型人胰岛素样品中加入50mM NaCl(使总离子强度升高至77．5mM)得到的六聚合化平衡常数与在226mM组氨酸和100mM NaCl中对胰岛素观察到的结果接近(表Ⅱ)。组氨酸在其等电点是两性离子，并且其对胰岛素的作用似乎是特异性的。例如，如表Ⅱ中所示，在pH7．5±0．1下，在约100mM离子强度下，使用另一种两性离子-牛磺酸没能降低胰岛素的六聚合化平衡常数。
表Ⅱ．使用二聚体-六聚体结合模型进行分析，在32℃和pH7．5+0．1下，50和100mM氯化钠存在时，L-组氨酸和L-甘氨酰基-L-组氨酸对2锌／六聚体的野生型人胰岛素的自结合的影响50mM NaCl缓冲液     I．S．    Mavg／M1    Ink2-6    r．m．s．组氨酸1a   56        4．8        14．3      0．009240mMgly-his2   77．5     4．4        16．7      0．087247mM100mM NaCl缓冲液      I．S．    Mavg／M1    Ink2-6    r．m．s．没有添加剂3 103       5．8        23．9     0．007牛磺酸4     103       5．8        24．6     0．010113mM组氨酸4     104       4．8        21．1     0．00950mM组氨酸5     106       4．5        20．7     0．012113mM组氨酸6     105       4．4        19．6     0．007206mM组氨酸1b    106       6．4        15．6     0．009226mM
1a对3mM和6mM胰岛素样品在20k和30k转速下于295nm检测吸光度扫描得到的
1b用Ink6等链常数为4．24的二聚体-六聚体-等链(isodesmic)六聚体理想模型对3mM和6mM的胰岛素样品在20k和30k转速下于295nm检测吸光度扫描得到的
2从3和6mM胰岛素样品在50k转速下的干涉光学得到的
3对0．35mM胰岛素样品在18k，24k，34k和48k转速下于291nm检测UV吸光度扫描得到的
4对0．7mM胰岛素样品在15k，20k，25k，30k和40k转速下于288nm检测UV吸光度扫描得到的
5对胰岛素样品在15k，20k，25k，30k和40k转速下于288nm(0．35mM)和248nm(0．7mM)检测UV吸光度扫描得到的
6对0．35mM胰岛素样品在15k，20k，25k和30k转速下于248nm检测UV吸光度扫描得到的
Ink6iso是形成等链六聚体的结合常数的自然对数
实施例4
在等电点下的L-组氨酸对野生型无锌胰岛素和无锌LysPro胰岛素类似物的自结合的影响
如上所述，在32℃下，用XL-I分析型超速离心机，对天然的野生型人胰岛素(无锌，来自Sigma和 HumulinR 以及无锌的LysB28ProB29胰岛素类似物(从Lilly公司的 Humalog精制)作为组氨酸(pH7．5)浓度升高的函数进行沉降平衡研究。在多种转速下获得干涉数据，将其汇总，并使用拟合多种模型的非线性回归进行全面分析。在100mM NaCl，pH7．5的存在下，从都不含锌的野生型和LysB28ProB29人胰岛素获得的数据均可以拟合含有单体、二聚体、六聚体和等链六聚体的模型。
如表Ⅲ中所示，对于无锌的LysPro类似物，Ink12值没有随组氨酸的浓度发生显著改变，但Ink6iso显示随着组氨酸浓度的升高显著降低。结果提示组氨酸对LysPro胰岛素类似物的自结合性能有影响。表示蛋白质聚集程度的简洁方法是从结合平衡常数计算平均分子量。文献中详细描述了数种这样的平均值(参见，例如：“生物化学和聚合物科学中的分析超速离心”，S．E．Hardin，A．J．Rowe和J．C．Horton编，Royal Society of Chemistry，Cambridge，1992)。一种是Mn或称数均分子量，定义为C总／∑(ci／Mi)，其中ci是分子量为Mi的第ⅰ种物质的重量浓度。第二种平均值类型，Mw，叫做重均分子量，定义为∑ciMi／c总。不过也可定义更高的分子量平均值，诸如Mz，其中Mz=∑ciMi 2／∑ciMi。图5显示了LysPro胰岛素类似物在240mM组氨酸存在下的这三种平均值的浓度依赖性(从表Ⅲ中240mM组氨酸的InK12，InK26和InK6iso值计算)，而图6显示了不存在组氨酸时的类似图形(从表Ⅲ中0mM组氨酸的InK值计算)。图7显示了在240mM组氨酸存在下无锌野生型胰岛素的类似图形(从表IV中240mM组氨酸的InK12，InK26和InK6iso值计算)，而图8显示了不存在组氨酸时的类似图形(从表Ⅳ中0mM组氨酸的InK值计算)。
这些图形证明，组氨酸的存在实质上降低了胰岛素的平均分子量，并且这种作用对于LysPro类似物更明显。
    表ⅢLysB28proB29人胰岛素类似物(无锌)在100mM NaCl，pH7．5中，32
℃下
每种条件5种转速(12，18，24，34，50k)得到干涉数据，将其汇总并全面分析。
[his] In(K12) In(K26) In(K6iso) rms [胰岛素]范围
0 6．50 14．1 6．07 0．049 1×10-5-9．0mM
10 6．7 14．0 6．02 0．112 1×10-5-7．3mM
20 5．88 14．2 5．85 0．205 1×10-5-10．0mM
40 6．0 14．1 5．66 0．177 1×10-5-10．0mM
80 6．74 13．6 5．86 0．171 1×10-5-11．0mM
160 6．59 13．5 5．62 0．171 1×10-5-10．6mM
240 6．71 13．2 5．00 0．151 1×10-5-11．2mM
In(K6iso)=6．01-0．0037[组氨酸]，p=0．004In(K12)是从2个胰岛素单体形成二聚体时的结合常数的自然对数In(K26)是从3个二聚体形成胰岛素六聚体时的结合常数的自然对数In(K6iso)是形成叠式六聚体时的结合常数的自然对数每种条件下胰岛素的加载浓度为4mM。在离心过程中，胰岛素在整个离心池中重新分配。表中记录的[胰岛素]范围反映了对于每种条件在各种转速下观察到的[胰岛素]的范围。
    表Ⅳ野生型人胰岛素(无锌)在100mM NaCl，pH7．5中，32℃下
每种条件5种转速(12，18，24，34，50k)得到干涉数据，将其汇总并全面分析。
[his] In(K12) In(K26) In(K6iso) rms [胰岛素]范围
0 8．8 18．7 7．24 0．093 1×10-5-4．7mM
10 10．1 17．9 7．17 0．069 1×10-5-4．5mM
20 7．9 19．1 7．00 0．102 1×10-5-4．8mM
40 8．8 18．8 7．00 0．085 1×10-5-4．6mM
80 8．5 18．8 6．69 0．065 1×10-5-4．2mM
160 10．0 18．0 7．05 0．021 1×10-5-2．1mM
224 9．9 16．6 6．65 0．125 1．5×10-5-15mM
240 8．5 18．5 6．58 0．073 1×10-5-4．2mM
In(K12)=9．06(均值)(s．e．m．=0．273)(对[组氨酸]没有明显依赖性)In(K6iso)=7．116-0．002[组氨酸]，p=0．02除了224mM组氨酸以外的每种条件下，胰岛素加载浓度为2mM。在224mM组氨酸下，所报道的数据是通过将从1、3和6mM胰岛素加载浓度下得到的3个数据合并后得到的。
实施例5
在其等电点时L-组氨酸对其他蛋白质自结合的影响
使用上述方法还研究了L-组氨酸对溶菌酶和β-乳球蛋白的自结合的影响。对溶菌酶和β-乳球蛋白已进行了充分研究，它们在碱性pH下主要以单体-二聚体平衡存在(Kim等，化学评论(1977)77：659-690)。用单体-二聚体-四聚体***比用一个更简单的单体-二聚体***能更好地模拟在碱性pH下的溶菌酶沉降平衡数据(Holladay，博士论文(1973)Emory大学)。没有L-组氨酸的溶菌酶在4℃下的自结合行为通过对14k，18k和30k rpm下的干涉条纹数据进行全面分析来评定。表V中给出了结果。
Beckman XL-I***的条纹测量中的预期干扰约为0．02-0．04条纹。用理想的单体-二聚体-四聚体(1-2-4)***最好地描述了4℃下的数据。注意：任何含有二聚体大小以上的聚集体的模型得到基本上相等的In(K12)估计值。既然有关L-组氨酸对溶菌酶二聚合的影响的这些结果(在下文中)没有表现出模型依赖性，于是用理想的1-k2-4***进行模拟。包括第二维里系数在内并没有显著降低差值的r．m．s．。等链Ⅰ型具有以相同结合常数存在的所有聚集体。Ⅱ型只有均等(even)聚集体存在。Ⅲ型具有与假定等链的随后结合步骤不同的二聚合常数。Ⅳ型假定仅存在均等聚集体，并且二聚合常数与假定等链的随后结合步骤不同。等链模型的公式是本领域中公知的，并已进行了描述(Tang等，生物物理学与化学(1977)7：121-139)。注意等链模型IV的In(K14)为17．9，接近于用1-2-4模型得到的估计值。对于所有等链模型来说，预计超过四聚体的聚集体的量非常小。
表VI中给出了L-组氨酸对溶菌酶二聚合的影响。表VI中的结果是利用理想的1-2-4模型(单体-二聚体-四聚体)并对相差4krpm的两种转速进行全面分析得到的。表Ⅶ中给出了L-组氨酸在三种温度下对β-乳球蛋白二聚合的影响。对于这两种蛋白质来说，看起来温度的升高使得二聚合平衡常数适度降低。有关此分析，隐含假定在L-组氨酸的存在下任何聚集体的有效浮力分子量是单体的有效浮力分子量的整数倍。这意味着任何聚集体的BAM范围是单体的BAM范围的整数倍。由于在现实中聚集体的整个形状很可能与单体的形状不太相同，因此有可能溶菌酶和β-乳球蛋白的二聚合常数的适度降低反映了“聚集体的浮力分子量是单体的浮力分子量的整数倍”这一假设是失败的。不过必须注意：In(K12)的返回值没有表现出对单体浮力分子量的几个百分点的变化敏感。
表Ⅴ自结合模型的选择对溶菌酶在150mM NaCl，pH7．6，4℃下的In(K12)的影响，来自对在14k，18k和30k转速下得到的干涉数据的全面分析模型             In(K12)    In(K附加)    差值r．m．s．1-2              6．728     n．a．       0．1141-2-4            5．431     17．9(1-4)   0．036非理想型1-2-4    5．436     18．0        0．036等链Ⅰ型         5．552     n．a．       0．048等链Ⅱ型         5．582     n．a．       0．054等链Ⅲ型         5．247     5．716       0．037等链Ⅳ型         5．577     5．966       0．041
1-2表示其中单体与二聚体平衡存在的模型
1-2-4表示其中单体与二聚体和四聚体平衡存在的模型
InK1-2是从2个单体形成一个二聚体的平衡常数
InK1-4是从4个单体形成一个四聚体的平衡常数
表VI使用3mm中心板(centerpiece)在多种转速下测定L—组氨酸对溶菌酶在pH7．6，150mM NaCl下的自结合的影响
使干涉数据全面地拟合含有平衡存在的单体-二聚体-四聚体的模型而得到的。InK1-2和InK1-4分别是从单体形成二聚体和四聚体时的平衡常数。
2圆括号中的值是InK的引导标准误差(bootstrap standarderror)
表Ⅶ使用3mm中心板在多种转速下测定在pH7．6，150mM NaCl下L-组氨酸对β-乳球蛋白的自结合的影响
          4℃              20℃             32℃
          InK1             InK1             InK1缓冲液        14k&18K          16k&20K          22k&26K没有添加剂    11．34(0．12)    10．26(0．12)    9．28(0．03)
          [0．008]         [0．010]         [0．008]250 mM his    9．52(0．06)     8．48(0．02)     8．03(0．02)
          [0．005]         [0．009]         [0．005]
1使吸光度数据全面地拟合基线偏移量(baseline offset)浮动的理想单体-二聚体模型而得到的。圆括号中给出了InK值的引导标准误差。方括号中的数字表示差值的均方根。
基于上述实验，显然组氨酸和组氨酸类似物能降低有或没有锌的胰岛素和胰岛素类似物的自结合。在含有2锌／六聚体的野生型胰岛素的情况下，在所检测的浓度范围内，pH7．5下的沉降平衡数据可以拟合不存在NaCl的非理想二聚体-六聚体模型，或拟合100mM NaCl存在下的理想二聚体-六聚体模型(当加载胰岛素浓度低于1mM时)。另外，无论是否存在NaCl，组氨酸浓度对天然人2锌／六聚体胰岛素的InK26值有显著影响。不存在锌时，组氨酸对LysPro类似物的影响比对野生型胰岛素的影响更显著。组氨酸也能降低完全不相关的其它蛋白质诸如溶菌酶和β-乳球蛋白的自结合。
因此，本文公开了降低多肽药剂自结合并提高其溶解性的方法。尽管已稍详细地描述了本发明的优选实施方案，但应理解：可以进行明显的改变而不背离如所附的权利要求书定义的本发明的精神和范围。

Claims (28)

1、一种减少多肽形成低聚物的方法，所述方法包含将所述多肽与量足以减小所述多肽的自结合趋向的组氨酸化合物混合。
2、权利要求1所述的方法，其中的组氨酸化合物是L-组氨酸。
3、权利要求1所述的方法，其中的组氨酸化合物是L-甘氨酰-组氨酸。
4、权利要求1-3任一项所述的方法，其中的多肽是胰岛素化合物。
5、权利要求4所述的方法，其中的胰岛素化合物是人胰岛素化合物。
6、权利要求5所述的方法，其中的胰岛素化合物是无锌的人胰岛素化合物。
7、权利要求6所述的方法，其中的胰岛素化合物是人LysB28ProB29胰岛素类似物。
8、权利要求4所述的方法，其中胰岛素六聚体的形成减少。
9、权利要求4所述的方法，其中组氨酸化合物的浓度至少为约10mM。
10、权利要求4所述的方法，其中组合物的pH约为pH7-8。
11、多肽和组氨酸化合物在制备可用于经电转运通过身体表面释放多肽药剂的组合物中的用途，其中所述组氨酸化合物以足以减小所述多肽自结合趋向的量存在于所述组合物中。
12、权利要求11所述的用途，其中的组氨酸化合物是L-组氨酸。
13、权利要求11所述的用途，其中的组氨酸化合物是L—甘氨酰-组氨酸。
14、权利要求11-13任一项所述的用途，其中的多肽是胰岛素化合物。
15、权利要求14所述的用途，其中的胰岛素化合物是人胰岛素化合物。
16、权利要求15所述的用途，其中的胰岛素化合物是无锌的人胰岛素化合物。
17、权利要求15所述的用途，其中的胰岛素化合物是人LysB28ProB29胰岛素类似物。
18、权利要求14所述的用途，其中胰岛素六聚体的形成减少。
19、权利要求14所述的用途，其中组氨酸化合物的浓度为约10mM至约250mM。
20、权利要求14所述的用途，其中组合物的pH约为pH7-8。
21、权利要求20所述的用途，其中胰岛素化合物与组氨酸化合物的摩尔比为约1∶10-约1∶1000。
22、人胰岛素化合物和组氨酸化合物在制备可用于经被动经皮释放通过身体表面释放多肽药剂的组合物中的用途，其中所述组氨酸化合物以足以减小所述多肽自结合趋向的量存在于所述组合物中。
23、权利要求22所述的用途，其中的组氨酸化合物是L-组氨酸。
24、权利要求22所述的用途，其中的组氨酸化合物是L-甘氨酰一组氨酸。
25、权利要求22所述的用途，其中的胰岛素化合物是无锌的人胰岛素化合物。
26、权利要求22所述的用途，其中的胰岛素化合物是人LysB28ProB29胰岛素类似物。
27、权利要求22所述的用途，其中组氨酸化合物的浓度为约10mM至约250mM。
28、权利要求22所述的用途，其中组合物的pH约为pH7-8。
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