CN1269968C - 降低实时荧光pcr仪器定量分析***误差的分析方法 - Google Patents

降低实时荧光pcr仪器定量分析***误差的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差的分析方法及应用，用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标，按式lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK计算X0值，绘制lnX0～tn的标准曲线，再计算出样品模板的初始拷贝数，测量tn值时，在仪器中设置连续扫描测量模式，对荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，每0.01秒～10.00秒的范围内选定特定的时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得动力曲线Rn～t，所达到阈值的荧光信号对应的时间为tn值，解决了现有分析方法***误差大等问题，广泛应用研究基因表达、基因工程、药物疗效、病原体检测和转基因成分检测等领域。

Description

降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差 的分析方法
技术领域  本发明涉及一种分析方法及应用，更具体地说，涉及一种降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差的分析方法及应用。
背景技术  在现有的聚合酶链反应(PCR)中，参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数(X0)的对数(lnX0)与该模板累积达到某一设定的值所经历的循环次数(n)具有线性关系，这是定量PCR的基础(Higuchi et al.1993)。在此基础上发展起来的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术，在其反应体系中加入荧光探针，每扩增一对模板，产生一个荧光分子，当荧光信号的强度(Rn)累积达到某一设定的阈值时，模板所经历的扩增循环数为CT。在整个扩增反应过程中，每次循环检测一次荧光信号的强度，以测定CT值，CT值与lnX0具有下述线性定量关系：
lnX0＝-ln(1+E)CT+lnK………(2)
这是实时荧光定量PCR的原理(Christian et al.1996)(式中E为扩增效率，K为常数)。测定已知X0的标准品的CT，制作lnX0～CT的标准曲线；测定样品的CT，可从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数。实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，具有特异性强，灵敏度高，PCR污染少和自动化程度高等优势，成为公认的最具应用前景的DNA定量分析技术。
现有的实时荧光定量PCR技术的主要缺陷是：定量分析结果的误差大，该技术公认的***误差达到了80％～100％，往往不能满足定量分析准确度的要求。
发明内容  本发明的目的在于提供一种降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差的分析方法和相应的计算方法，以及该分析方法的应用。该分析方法能大幅度提高定量分析结果的准确度、精确度和大幅度降低定量分析方法的检出限。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：研究出一种降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差的分析方法，分析过程中包括合成一对引物和一个荧光探针，和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行PCR扩增和荧光信号测定，具体方法是：(1)用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标进行实时荧光定量分析，tn和lnX0符合式(1)表达的线性关系：lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK(1)，式(1)中，E为扩增效率，K为常数，X0是参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数，tc是设定的实时荧光PCR每次循环所用的时间。以已知X0的标准样品测量tn，制作lnX0～tn的标准曲线，并测定样品的tn，再从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数；(2)测量tn值时，在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得仪器自动记录的其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。
以下对本发明的分析方法和计算模型进行具体说明：
实时荧光定量PCR技术的***误差来自于现有的实时荧光PCR商品仪器的测量程序。现有仪器设置的测量程序是直接根据式(2)的关系建立的，其测量指标是CT值，测量方式是在每次循环中，只检测一次荧光信号的强度，以Rn是否达到设定的阈值作为判定CT值的标准，即仪器能精确辨别CT的最小差值为1次。
以两个样品为例，其模板的初始拷贝数分别为X01和X02，测定其CT分别得到CT1和CT2，根据式(2)可以计算出当CT相差1次时，对应的初始拷贝数X0相差的倍数。
lnX01＝-ln(1+E)CT1+lnK………(3)
lnX02＝-ln(1+E)CT2+lnK………(4)
式(3)-(4)，得：
ln(X01/X02)＝-ln(1+E)(CT1-CT2)＝-ln(1+E)………(5)
E取其理论最大值为1，则式(5)为：
ln(X01/X02)＝-0.6931，即：(X01/X02)＝0.5000，X01＝0.5000 X02
X02-X01＝X02-0.5000 X02＝(1-0.5000)X02＝0.5000 X02
结果表明，两个样品的初始拷贝数相差1倍时，才可使测量的CT值相差1次。即当X01与X02间初始模板数的差异为0.5000倍的X02时，仪器才能精确辨别。当不同样品模板的初始拷贝数之差达不到1倍时，测量的CT值则不能精确地指示不同样品间模板初始拷贝数的差异，从而使定量测定结果存在着接近于100％的***误差。
本发明应用tn进行实时荧光PCR定量分析的原理：
设实时荧光定量PCR每次循环所用的时间为tc，则tn与CT和tc间具有下述关系：
tn＝CT×tc 即：tn/tc＝CT………(6)
将式(6)代入式(2)，得到tn与X0的定量关系：
lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK………(1)
由于tc为可人为设定的常数，式(1)表明lnX0与tn间也具有线性定量关系。依据式(1)的定量关系，测定已知X0的标准品的tn，制作lnX0～tn的标准曲线；测定样品的tn，可从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数。tn值的测量方法：在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描测量模式，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测。设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，仪器自动记录其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。如果每0.01秒的时间间隔检测一次荧光信号强度(Rn)，所以仪器能辨别tn最小差值的精确度为0.01sec。荧光信号的数学处理的模式：连续扫描测量的荧光信号符合PCR扩增反应的动力学方程，具有更精确的Rn～t(时间)的动力学曲线，非常便于进行信号的数学处理，如信号的积分或微分处理。经积分处理后，可使其数值增大，更易于仪器的辨别和检出；信号经微分处理后，可使仪器能更好地分辨信号与噪音，并使测量的噪音降低。
本发明较好的技术方案是：每0.01秒的时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次。由于准确测量tn值的最小单位为0.01sec，按目前模板延伸阶段经常选用的时间为1min计，改用时间标尺后，等同于将CT值的1个最小单位划分为6000个(60sec/0.01sec)更小的单位，可以更精确地确定测量值。
本发明的分析方法的应用：该方法用于测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数X0与tn的关系，用于测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数X0与tn的关系，用于测定血液样本中乙肝病毒HBV的初始拷贝数X0与tn的关系，用于测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数X0与tn的关系，和用于测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数X0与tn的关系。通过测定Lectin基因的拷贝数，可以定量测定样品中大豆成份的含量；通过测定Zein基因的拷贝数，可以定量测定样品中玉米成份的含量；通过测定35S或NOS的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成份的含量；通过测定HBV DNA片段的拷贝数，可以定量测定样本中HBV的载量。值得说明的是：由于不同植物品种中的35S基因经提取后可采用相同的实时荧光PCR条件进行定量测定，因此，大豆中35S的仪器测定条件可代表各植物品种中35S的仪器测定条件；同样，由于不同植物品种中的NOS基因经提取后可采用相同的实时荧光PCR条件进行定量测定，因此，玉米中NOS的仪器测定条件可代表各植物品种中NOS的仪器测定条件。
与现有技术相比，本发明具有如下明显的优点和效果：1、大幅度提高仪器测量的精确度：准确测量CT值的最小单位为1次，准确测量tn值的最小单位为0.01sec，按目前模板延伸阶段经常选用的时间为1min计，改用时间标尺后，等同于将CT值的1个最小单位划分为6000个(60sec/0.01sec)更小的单位，可以更精确地确定测量值；2、大幅度提高定量结果的准确度：改用tn作为测量指标后，仪器能辨别tn的最小差值为0.01sec。现有两个样品，其模板的初始拷贝数分别为X01和X02，测定其tn分别得到tn1和tn2，根据式(5)可以计算出当tn相差0.01sec时，对应的初始拷贝数X0相差的倍数：
ln(X01/X02)＝-ln(1+E)(CT1-CT2)＝-0.6931×(0.01/60)＝-1.155×10-4，(X01/X02)＝0.9999，即：X01＝0.9999 X02
仪器能精确指示的两个样品间初始拷贝数的差异值为：
X02-X01＝X02-0.9999 X02＝(1-0.9999)X02＝0.0001 X02
结果表明，当X01与X02间初始模板数的差异为0.0001倍的X02时，仪器就能精确辨别。新方法定量结果的准确度比现有方法提高5000倍；3、大幅度降低定量方法的检出限：实时荧光定量PCR方法的检出限主要取决于信噪比，信噪比越大，检出限越低。信号经数学处理后，可有效地提高信号水平，降低噪音水平，从而降低仪器的检出限，使仪器的检测能力更强；4、适用范围广：可广泛应用于研究基因表达、基因工程、药物疗效、病原体检测和转基因成分检测等领域。
具体实施方式  以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述：
实施例1：测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数与CT和tn的关系
A、原理概述：Lectin为大豆专有的内源基因，其拷贝数与样品中大豆成分的含量具有定量关系。通过测定Lectin基因的拷贝数，可以定量测定样品中大豆成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增大豆内源基因Lectin的引物和一条能与Lectin基因模板特异结合的TaqMan探针。该探针的两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将结合于模板上的探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号，每一个荧光分子的形成对应于每一个Lectin基因双链的扩增。当荧光信号累积达到仪器设置的检测阈值时，对应的PCR扩增的循环数为CT，对应的PCR扩增的循环时间为tn。在一定条件下，PCR扩增反应管中内源基因Lectin的初始模板拷贝数与CT值或tn值成线性关系。
标准样品经提取DNA后，取一定量的DNA提取物于PCR反应管中，加入Lectin的扩增引物和相应的TaqMan探针，用实时荧光PCR仪在确定的反应体系中和扩增条件下进行扩增反应。分别用CT或tn测量程序检测荧光信号强度，记录Rn(荧光信号强度)～C(循环次数)的动力学曲线或Rn～t(时间)的动力学曲线。从曲线上确定相应的CT值或tn值，分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
大豆样品经提取DNA后，取不同量的DNA提取物于PCR反应管中，制备成含Lectin基因模板初始拷贝数不同的溶液，按标准样品的测定条件，分别测定各溶液的CT值或tn值，分析模板初始拷贝数与CT值或tn值的关系，比较两者的差异。
B、实施详情：
1、材料：
1-1试剂：样品DNA提取试剂盒：Qiagen公司Dneasy Plant Mini
Kit；引物和探针：扩增Lectin基因所采用的引物和探针列于表1：
      表1  扩增内源Lectin基因的引物和探针序列
  检测基因 引物序列 探针序列
Lectin   正：5′-cct cct cgg gaa agttac aa-3′反：5′-ggg cat aga agg tgaagt t-3′ 5′-ccc tcg tct ctt ggt cgcgcc ctc t-3′
1-2仪器及反应体系：
PCR扩增仪：美国Biorad公司iCycler实时荧光PCR仪。
PCR反应体系：10×Buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/mL)2.0μL，dNTP(10mmol/mL)0.5μL，Primer-I(30μmol/mL)0.4μL，Primer-II(30μmol/mL)0.4μL，Probe(30μmol/mL)0.2μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，UNG酶(1U/μL)0.1μL，模板5μL，加水至25μL。
仪器测量条件：50℃3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每1.00秒检测一次荧光信号)，40cycles。
实时荧光PCR反应运行：按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器)，开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。按照仪器的操作说明书运行仪器，最后计算和打印结果。
1-3样品：包括大豆标准样品和大豆样品，其中大豆标准样品：美国Fluka公司Roundup ready soya标准样品(大豆成分含量100％)，大豆样品采用转基因巴西大豆。
2、方法：
2-1样品制备：称取约50g大豆样品，用湿热灭菌(121℃处理30min)或干热灭菌(180℃处理30h)的研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至约0.5mm左右。
2-2DNA的提取及制备：液氮研磨至粉末状，称取样品100.0mg，加入1.5mL或2.0mL离心管。采用Qiagen公司Dneasy Plant Mini Kit提取DNA，使用时按照操作说明书进行操作，最后定容至100μL。
2-3标准曲线的制作  以标准样品(100％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4样品测定  分别取样品DNA提取液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3结果与分析
3-1标准曲线方程
(1)Lectin基因模板的lnX0～CT标准曲线方程：
lnX0＝-0.7001CT+11.665
(2)Lectin基因模板的lnX0～tn标准曲线方程：
lnX0＝-0.7001(tn/60.00)+11.665
3-2样品测定结果
分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表2：
                                表2  样品溶液的测定结果
  编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  DNA溶液CTtn 0.4241458 0.6231424 0.8231399 1.0231380 1.2221364 1.4221351 1.6221339 1.8221330 2.0221320 2.2211312
注：DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较
从表2可见，测量样品的CT值时，样品2～4得到同一测量值，样品5～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中Lectin初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中Lectin初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例2：测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数与CT和tn的关系
A原理概述：
35S为转基因植物常用的外源启动子，其拷贝数与样品中转基因成分的含量具有定量关系。通过测定35S的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因35S的引物和一条能与35S模板特异结合的TaqMan探针。35S与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B实施详情：
1、材料
1-1试剂及样品  DNA提取试剂盒：Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针：扩增35S所采用的引物和探针列于表3：
             表3  扩增外源基因35S的引物和探针序列
  检测基因 引物序列 探针序列
35S   正：5′-cga cag tgg tcc aaaga-3′反：5′-aag acg tgg ttg gaacgt ctt c-3′ 5′-tgg acc ccc acc cac gaggag cat c-3′
1-2仪器  同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件：50℃3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.10秒检测一次荧光信号)40cycles。
1-3样品  转基因大豆标准样品：美国Fluka公司Roundupready soya标准样品(转基因大豆成分含量5.0％)，大豆样品为转基因巴西大豆。
2、方法
2-1样品制备  同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2DNA的提取及制备  同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3标准曲线的制作  以标准样品(GM％＝5％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4样品测定  分别取样品DNA提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析
3-1标准曲线方程
(1)35S模板的lnX0～CT标准曲线方程：
lnX0＝-0.6988CT+12.051
(2)35S模板的lnX0～tn标准曲线方程：
lnX0＝-0.6988(tn/60.00)+12.051
3-2样品测定结果
分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表4：
                                        表4  样品溶液的测定结果
  编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  DNA溶液CTtn 0.5261618.8 1.0251559.4 1.5251524.6 2.0251500.0 2.5241480.8 3.0241465.2 3.5241452.0 4.0241440.0 4.5231430.4 5.0231421.4
注：DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较
从表4可见，测量样品的CT值时，样品2～4得到同一测量值，样品5～8得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中35S初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中35S初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例3  测定血液样本中乙肝病毒(HBV)的初始拷贝数与CT和tn的关系
A原理概述：
乙型肝炎病毒(HBV)DNA片段的拷贝数与样本中HBV的载量具有定量关系。通过测定HBV DNA片段的拷贝数，可以定量测定样本中HBV的载量。采用购买的HBV PCR荧光定量检测试剂盒，按其操作流程进行测定。
B实施详情：
1、材料
1-1试剂及样品
HBV PCR荧光定量检测试剂盒(国药准字：S20020033)：深圳市匹基生物工程股份有限公司产品。
1-2仪器  PCR扩增仪：美国Biorad公司iCycler实时荧光PCR仪。按检测试剂盒操作流程进行测定。
仪器测量条件：37℃5min；94℃1min；95℃5sec，60℃30sec(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.01秒检测一次荧光信号)，42cycles。
1-3样品  1～4号标准品：(1～5)×104～(1～5)107copies/mL，随试剂盒配发；对照品：阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照样品，随试剂盒配发。
2、方法
2-1样品DNA的提取及制备  取强阳性对照品100μL，按检测试剂盒操作流程进行裂解，提取和分离DNA，制备样品DNA提取液100μL。
2-2标准曲线的制作  分别取1～4号标准品各2μL于PCR反应管中，按检测试剂盒操作流程测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-3样品测定  分别取样品DNA提取液1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析
3-1标准曲线方程
(1)HBV模板的lnX0～CT标准曲线方程：
            lnX0＝-0.3396CT+14.918
(2)HBV模板的lnX0～tn标准曲线方程：
            lnX0＝-0.3396(tn/30.00)+14.918
3-2样品测定结果
分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表5：
                                    表5  样品溶液的测定结果
  编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  DNA溶液HBV模板数CTtn   1.2264.427825.03   1.4308.527810.06   1.6352.626799.52   1.8396.626789.34   2.0440.726780.07   2.2484.825771.60   2.4528.825763.85   2.6572.925756.61   2.8617.025750.04   3.0661.024744.08
注：DNA溶液体积单位为μl，HBV模板数单位为copies/ml，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较
从表5可见，测量样品的CT值时，样品3～5得到同一测量值，样品6～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中HBV初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中HBV初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例4：测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数与CT和tn的关系
A原理概述：
NOS为转基因植物常用的外源终止子，其拷贝数与样品中转基因成分的含量具有定量关系。通过测定NOS的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因NOS的引物和一条能与NOS模板特异结合的TaqMan探针。NOS与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B实施详情：
1、材料
1-1试剂及样品  DNA提取试剂盒：Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针：扩增NOS所采用的引物和探针列于表6：
            表6  扩增外源基因NOS的引物和探针序列
  检测基因 引物序列 探针序列
NOS   正：5′-atc gtt caa aca ttt ggc a-3′反：5′-att gcg gga ctc taa tca ta-3′ 5′-cat cgc aag accggc aac agg-3′
1-2仪器  同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件：50℃3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.10秒检测一次荧光信号)，40cycles。
1-3样品  转基因玉米标准样品：美国Fluka公司Bt11 maize标准样品(转基因玉米成分含量2.0％)，转基因玉米样品：美国Fluka公司。
2、方法
2-1样品制备  同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2DNA的提取及制备  同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3标准曲线的制作  以标准样品(GM％＝2％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2.4样品测定  分别取样品DNA提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析
3-1标准曲线方程
(1)NOS模板的lnX0～CT标准曲线方程：
lnX0＝-0.7667CT+14.9752
(2)NOS模板的lnX0～tn标准曲线方程：
lnX0＝-0.7667(tn/60.00)+14.9752
3-2样品测定结果
分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表7：
            表7  样品溶液的测定结果
  编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  DNA溶液CTtn 0.5251506.0 1.0241451.7 1.5231419.9 2.0231397.4 2.5231380.0 3.0221365.6 3.5221353.6 4.0221342.8 4.5221333.8 5.0221326.0
注：DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较
从表7可见，测量样品的CT值时，样品3～5得到同一测量值，样品6～10得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中NOS初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中NOS初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例5：测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数与CT和tn的关系
A原理概述：
Zein为玉米专有的内源基因，其拷贝数与样品中玉米成分的含量具有定量关系。通过测定Zein基因的拷贝数，可以定量测定样品中玉米成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因Zein的引物和一条能与Zein模板特异结合的TaqMan探针。Zein与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B实施详情：
1、材料
1-1试剂及样品  DNA提取试剂盒：Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针：扩增Zein所采用的引物和探针列于表8：
                表8  扩增外源基因Zein的引物和探针序列
  检测基因 引物序列 探针序列
Zein   正：5′-tga ac cat gca tgc agt-3′反：5′-ggc aag acc att ggt ga-3′ 5′-tgg cgt gtc cgt ccctga tgc-3′
1-2仪器  同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件：50℃3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每10.00秒检测一次荧光信号)，40cycles。
1-3样品  玉米标准样品：美国Fluka公司(玉米成分含量100％)。玉米样品采用转基因玉米样品。
2、方法
2-1样品制备  同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2DNA的提取及制备  同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3标准曲线的制作  以标准样品(玉米成分含量＝100％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4样品测定  分别取样品DNA提取液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3结果与分析
3-1标准曲线方程
(1)Zein基因模板的lnX0～CT标准曲线方程：
lnX0＝-0.5685 CT+12.973
(2)Zein基因模板的lnX0～tn标准曲线方程：
lnX0＝-0.5685(tn/60.00)+12.973
3-2样品测定结果
分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表9：
                            表9  样品溶液的测定结果
  编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10
  DNA溶液CTtn 0.4221370 0.6221330 0.8211300 1.0211270 1.2211260 1.4201240 1.6201220 1.8201210 2.0201200 2.2191190
注：DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较
从表7可见，测量样品的CT值时，样品1～2得到同一测量值，样品3～5得到同一测量值，样品6～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中NOS初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中NOS初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。

Claims (7)

1、一种降低实时荧光PCR仪器定量分析***误差的分析方法，分析过程中包括合成一对引物和一个荧光探针，和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于：
(1)用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标进行实时荧光定量分析，tn和lnX0符合式(1)表达的线性关系：
lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK………(1)
式(1)中，E为扩增效率，K为常数，X0是参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数，tc是设定的实时荧光PCR每次循环所用的时间；
以已知X0的标准样品测量tn，制作lnX0～tn的标准曲线，并测定样品的tn，再从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数；
(2)测量tn值时，在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得仪器自动记录的其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。
2、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：每0.01秒的时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次。
3、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：该方法用于测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数X0与tn的关系。
4、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：该方法用于测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数X0与tn的关系。
5、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：该方法用于测定血液样本中乙肝病毒HBV的初始拷贝数X0与tn的关系。
6、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：该方法用于测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数X0与tn的关系。
7、根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：该方法用于测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数X0与tn的关系。
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