CN1873019A - 百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种百合病毒的多重逆转录－聚合酶链反应快速检测方法，通过设计并合成百合潜隐病毒(LSV)、百合花叶斑驳病毒(LMoV)、百合黄瓜花叶病毒(CMV)全序列引物，并对三种引物的浓度、三重PCR扩增温度、扩增时间和循环次数等条件进行优化，把3对引物加入同一个反应体系，就能从病毒模板中分别扩增出这3种百合病毒条带，达到一次PCR扩增就可检测出此3种病原的目的，为生物技术领域的病毒检测方法开辟了一条准确、高效、快捷的新途径，同时有效降低了百合病毒检测成本，加快了检测速度，拓宽了检测深度及广度，实现了百合病毒分子多重快速检测的高效性、灵敏性和特异性。具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物病毒的检测方法，尤其是百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)快速检测方法。
背景技术
百合是重要的经济作物，在我国已有悠久的栽培历史，随着近年来栽培规模的不断扩大，百合遭受病毒侵染的现象也越来越严重。研究表明；侵染百合的病毒多达16种，其中黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)是侵染百合的主要病毒病原，李坏死环斑病毒(PNRSV)在百合上也有发生。感病后的百合植株表现为：黄化、花叶、坏死条斑、褪绿条斑、脉明、黄化革质、畸形、褪绿斑驳、坏死斑点、花碎色等，严重影响了鲜切花的产量和质量。在百合病毒检测方面，较为常见的方法有血清检测法、电镜检测法和单个病毒的RT-PCR检测法。其中血清检测法单克隆抗体的制备和购买不易，费时费力，至少需要2-3天才能得出检测结果，因此限制了该法的运用；电镜检测法虽然成本低廉，但需要较为昂贵的大型仪器—电镜，只有极少单位有购买能力；单病毒的RT-PCR检测法的灵敏性较高，精确值可以实现极为微量的病毒RNA样品分析，但其检测只能对单一病毒做定性分析，若要对三个病毒进行检测，则会耗费较多的人力、物力和财力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能同时对3种百合病毒进行RT-PCR的快速检测方法，在大大提高检测速度的同时，能最大限度地节约检测成本，高效提取样品总RNA及CDNA转录，并实现检测的特异性、高效性和稳定性。
本发明通过如下的技术方案实现：一种百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法，包括引物设计、总RNA模板的制备、逆转录和cDNA合成、PCR扩增、扩增产物检测、结果判断，其特征在于：
(1)、设计下列用于多重逆转录聚合酶链式反应的引物：
LSVCP1-F：5’-ATGCAATCAAGACCAGCACA-3’
LSVCP2-R：5’-TCATCCATTATTTGCGTATC-3’
LMoV-F：5’-TGGGCACCTTGTGAATTACA-3’
LMoV-R：5’-TGCTGTATGCCTCTCCGTGT-3’
CMV-F：5’-CgTTCACATCTATCACCCTA-3’
CMV-R：5’-TACTTTCTCATgTCgCCTAT-3’
(2)、逆转录和cDNA合成
在Eppendorf PCR管中，依次加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 8.0μL
50～100pmol/μL互补引物 0.5μL
总RNA 2.0μL
70℃变性10min，冰上放置5min
5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL
10～20mmol/L dNTPs 4.0μL
40～80u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL
100～200u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL
将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中37℃反应1h，合成出cDNA，进行PCR扩增或保存于-20℃；
(3)、PCR扩增
依次在Eppendorf PCR管中加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 31.5μL
10×PCR缓冲液 5.0μL
10～20mmol/L dNTPs 2.0μL
20～25pmol/μL LSV上游引物 1.0μL
20～25pmol/μL LSV下游引物 1.0μL
25～30pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL
25～30pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL
40～45pmol/μL CMV上游引物 0.5μL
40～45pmol/μL CMV下游引物 0.5μL
5～10u/μL rTaq聚合酶 1.0μL
20～50ng cDNA 5.0μL
总体积 50.0μL
充分混匀，短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增，反应模式为递降式PCR，具体程序为：94～95℃预变性10min，前10个循环为94℃变性30s，退火(每循环降1℃，从64℃降至54℃)30s，72℃延伸60s，后20次循环为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，最后72℃延伸10min。
本发明的难点及优越性体现在：
1、针对百合栽培中常见的3种主要病毒，即黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)，用常规的检测方法难以将其同时快速检测的问题，本发明提供了多重RT-PCR快速检测方法，通过该检测方法将上述3种主要百合病毒在同一反应体系中同时检测出来，有效提高了检测速度，大大降低了检测成本，实现了百合病毒多重快速检测的高效性、灵敏和特异性，为花卉的检测技术体系提供技术支持。
2、本发明在进行多重PCR扩增时，针对扩增片段的大小确定出扩增条件，即本发明设计的3对引物大小分别为876bp(LSV)、552bp(LMoV)、335bp(CMV)，既考虑了可通过电泳方便区分不同结果，又减少了由于产物大小差异明显造成的大片段产物扩增困难。
3、本发明在设计LSV、LMoV和CMV三对引物时，同时确定了引物浓度，因为引物浓度可直接影响多重PCR的扩增效果，为了使各扩增片段能够同时得到均一的扩增，确定了PCR中的LSV、LMoV和CMV的最佳引物终浓度分别为20～25pmol/μL、25～30pmol/μL和40～45pmol/μL时，使三个片段都能扩增出来。
4、为保证多重PCR中每对引物均可获得较高的特异性和扩增效率，本发明采用递降式PCR(退火温度Tm从64℃递降至54℃)，将开始时的退火温度选择高于三对引物的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降低，并最终低于每对引物的Tm值，以确保第一个引物-模板杂交发生在最互补的反应物之间，即引物与目标片段之间，这样，尽管退火温度最终会降至非特异性杂交的Tm值，但此时的目的产物已开始几何倍数的扩增，在剩下的循环中处于远远超过非特异性PCR产物的地位。
5、本发明与多种检测技术相比可高效地同时检测和区分百合中存在的多种病毒，特别是在检测复合浸染对象时，可作为最佳的检测技术手段，也可用于百合原原种或脱毒核心种苗的定期快速检测。从提取RNA到得出三种病毒的PCR检测结果，可在6-7h内完成，检测时间较短，灵敏度较高，检测成本大为降低，且有较高的可靠性和重复性。
本发明经试验研究，其结果报告如下：
将只带有LSV或LmoV或CMV的病样、LSV+LmoV+CMV复合侵染的病样和百合健康植株分别进行三重RT-PCR扩增，试验方法同实施例。结果含有LSV、LmoV、CMV、LSV+LmoV+CMV的核酸样品均能扩增出与试验设计相符的约876bp、552bp、335bp的明显条带，而健康植株却不能扩增出任何条带，详见图1。
附图说明
图1为三重RT-PCR的特异性比较；
图2为带毒百合植株的LSV、LMOV和CMV三重RT-PCR检测结果；
图3为带毒百合种球的LSV、LMOV和CMV三重RT-PCR检测结果。
图1中，M：200bp分子量(Marker)，1：健康叶片，2：LSV+LMOV+CMV，3：CMV，4：LMOV，5：LSV。
图2中，M：200bp分子量(Marker)，1：带毒植株叶片，2：健康植物叶片。
图3中，M：200bp分子量(Marker)，1：健康种球，2：带毒种球。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例1
1、病毒分离物采集云南省农科院花卉研究所团结基地自然感病的百合植株中部的叶片，样品经DAS-ELISA检测证实被百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)复合侵染。
2、总RNA提取试剂盒采用上海华舜公司的RNAex Reagent SystemIV；逆转录酶、cDNA合成试剂盒、克隆试剂盒购自Promega公司；Taq酶、dNTP、溴酚蓝(6×Loading Dye Solution)购自TaKaRa公司；其它试剂及耗材分别购自Sangon公司、华美公司等。
3、常用缓冲液和仪器设备
5×TBE电泳缓冲液
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20mL
定容至1000mL，4℃保存
仪器设备
高速冷冻离心机5417C Eppendorf
PCR热循环仪MJ-200 Pharmacia Biotech
平板电泳仪 Beckman
凝胶成像分析*** Syngene
其它小型仪器 MJ
4、总RNA模板的制备
将0.05g感病百合植株的叶片组织和健康植株的叶片组织分别放入灭菌研钵，各加入1mL RNAex Reagent溶液研成匀浆，将匀浆液移入1.5mL离心管中，室温放置5min，使组织充***解，加入200μL氯仿，用力颠倒离心管以混匀，静置10min后，12000rpm离心10min，吸取上层水相，移至另一1.5mL离心管中，加入1/2体积的异丙醇，混匀，再加入1/2体积的RNA沉淀试剂，充分混匀，室温放置10min。7500rpm离心5min，弃上清，加入500mL75％乙醇洗2～3次，7500rpm离心30min，小心地弃上清，室温静置5～15min，使RNA沉淀恰好干燥，加入50μL双蒸水，备用；
5、逆转录和cDNA合成
在0.2mL的离心管中依次加入下列试剂：
双蒸水ddH2O 8.0μL
50pmol/μL互补引物 0.5μL
百合叶片总RNA 2.0μL
70℃变性10min，冰上放置5min
5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL
10mmol/L dNTPs 4.0μL
40u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL
200u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL
将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中37℃反应1h，转录出cDNA，用于进行PCR扩增或保存于-20℃待用；
6、PCR扩增
依次在0.2mL的Eppendorf离心管中加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 31.5μL
10×PCR缓冲液 5.0μL
10mmol/L dNTPs 2.0μL
20pmol/μL LSV上游引物 1.0μL
20pmol/μL LSV下游引物 1.0μL
25pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL
25pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL
40pmol/μL CMV上游引物 0.5μL
40pmol/μL CMV下游引物 0.5μL
5u/μL rTaq聚合酶 1.0μL
50ng cDNA 5.0μL
总体积 50.0μL
充分混匀，短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增。采用递降式PCR反应程序：
1＝95.0°for 10:00
2＝94.0°for 0:30
3＝64.0°for 0:30
-1.0°per cycle
4＝72.0°for 1:00
5＝Goto 2， 10times
6＝94.0°for 0:30
7＝53.0°for 0:30
8＝72.0°for 1:00
9＝Goto 6， 20times
10＝72.0°for 10:00
11＝end
7、扩增产物检测
将5×TBE以1∶5稀释成1×TBE工作液，与琼脂糖(Agarose)配制成1.2～1.5％(W/V)的溶液，加热使琼脂糖完全熔化。待凝胶液冷却至50℃～60℃时，加入适量的溴化乙锭(终浓度为0.5μg/μL)，灌制平台，冷却。将PCR产物按10∶1混合溴酚蓝(6×Loading Dye Solution)，点样20μL。按3～5V/cm的电压电泳，至溴酚蓝迁移至胶板长度的2/3处时，停止电泳。把胶板取出，放于凝胶成像***中进行观察、照相扩增结果。
8、结果判断
含有LSV、LMoV和CMV的感病百合植株叶片样品扩增出了3条带，长度约为876bp、552bp、335bp，而健康植株没有扩增出任何条带(图2)。
实施例2
1、分离物采集云南省隆格兰园艺责任有限公司自然感病的百合种球外层鳞片，样品经DAS-ELISA检测证实被百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)复合侵染。
2、总RNA提取试剂盒采用上海华舜公司的RNAex Reagent SystemIV；逆转录酶、cDNA合成试剂盒、克隆试剂盒购自Promega公司；Taq酶、dNTP、溴酚蓝(6×Loading Dye Solution)购自TaKaRa公司；其它试剂及耗材分别购自Sangon公司、华美公司等。
3、常用缓冲液和仪器设备
5×TBE电泳缓冲液
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/L EDTA(PH8.0) 20mL
定容至1000mL，4℃保存
仪器设备
高速冷冻离心机5417C Eppendorf
PCR热循环仪MJ-200 Pharmacia Biotech
平板电泳仪 Beckman
凝胶成像分析*** Syngene
其它小型仪器 MJ
4、总RNA模板的制备
将0.05g感病百合种球外层鳞片的表皮组织和健康种球外层鳞片的表皮组织分别放入灭菌研钵，各加入1mL RNAex Reagent溶液研成匀浆，将匀浆液移入1.5mL离心管中，室温放置5min，使组织充***解。加入200μL氯仿，用力颠倒离心管以混匀，静置10min后，12000rpm离心10min。吸取上层水相，移至另一1.5mL离心管中。加入1/2体积的异丙醇，混匀，再加入1/2体积的RNA沉淀试剂，充分混匀，室温放置10min。7500rpm离心5min，弃上清。加入500mL 75％乙醇洗2～3次，7500rpm离心30min，小心地弃上清。室温静置5～15min，使RNA沉淀恰好干燥，加入50μL双蒸水，备用。
5、逆转录和cDNA合成
取0.2mL的Eppendorf离心管，依次加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 8.0μL
100pmol/μL互补引物 0.5μL
百合种球总RNA 2.0μL
70℃变性10min，冰上放置5min
5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL
20mmol/L dNTPs 4.0μL
80u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL
100u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL
将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中37℃反应1h，转录出eDNA，进行PCR扩增或保存于-20℃。
6、PCR扩增
依次在0.2mL的Eppendorf离心管中加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 31.5μL
10×PCR缓冲液 5.0μL
20mmol/L dNTPs 2.0μL
25pmol/μL LSV上游引物 1.0μL
25pmol/μL LSV下游引物 1.0μL
30pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL
30pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL
45pmol/μL CMV上游引物 0.5μL
45pmol/μL CMV下游引物 0.5μL
10u/μL rTaq聚合酶 1.0μL
20ng cDNA 5.0μL
总体积 50.0μL
充分混匀，短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增。采用递降式PCR反应程序：
1＝95.0°for 10:00
2＝94.0°for 0:30
3＝64.0°for 0:30
-1.0°per cycle
4＝72.0°for 1:00
5＝Goto 2， 10times
6＝94.0°for 0:30
7＝53.0°for 0:30
8＝72.0°for 1:00
9＝Goto 6， 20times
10＝72.0°for 10:00
11＝end
7、扩增产物检测
将5×TBE以1∶5稀释成1×TBE工作液，与琼脂糖(Agarose)配制成1.2～1.5％(W/V)的溶液，加热使琼脂糖完全熔化。待凝胶液冷却至50℃～60℃时，加入适量的溴化乙锭(终浓度为0.5μg/μL)，灌制平台，冷却。将PCR产物按10∶1混合溴酚蓝(6×Loading Dye Solution)，点样10～20μL。按3～5V/cm的电压电泳，至溴酚蓝迁移至胶板长度的2/3处时，停止电泳。把胶板取出，放于凝胶成像***中进行观察、照相扩增结果。
8、结果判断
含有LSV、LMoV和CMV的感病百合种球样品扩增出了3条带，长度约为876bp、552bp、335bp，而健康种球样品没有扩增出任何条带(图3)。
结果表明：通过本发明在同一个反应体系中加入所设计的3对引物，仅经过一套50μL的反应体系，就可从相同或不同模板中分别扩增出LSV、LMoV和CMV 3种百合病毒条带，达到一次PCR扩增就可检测出此3种病原的目的，既简化了检测手续，又节约了检测成本，为分子病毒检测方法领域开辟了一条准确、高效、快捷的新途径。
Claims (1)
1、一种百合病毒的多重逆转录聚合酶链式反应快速检测方法，包括引物设计、总RNA模板的制备、逆转录和cDNA合成、PCR扩增、扩增产物检测、结果判断，其特征在于：
(1)、设计下列用于多重逆转录聚合酶链式反应的引物：
LSVCP1-F：5’-ATGCAATCAAGACCAGCACA-3’
LSVCP2-R：5’-TCATCCATTATTTGCGTATC-3’
LMoV-F：5’-TGGGCACCTTGTGAATTACA-3’
LMoV-R：5’-TGCTGTATGCCTCTCCGTGT-3’
CMV-F：5’-CgTTCACATCTATCACCCTA-3’
CMV-R：5’-TACTTTCTCATgTCgCCTAT-3’
(2)、逆转录和cDNA合成
在Eppendorf PCR管中，依次加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 8.0μL
50～100pmol/μL互补引物 0.5μL
总RNA 2.0μL
70℃变性10min，冰上放置5min
5×M-MLV逆转录缓冲液 4.0μL
10～20mmol/L dNTPs 4.0μL
40～80u/μL核糖核酸酶抑制剂 0.5μL
100～200u/μL M-MLV逆转录酶 1.0μL
将以上所有成分混匀，低速离心后，热循环仪中37℃反应1h，合成出cDNA，进行PCR扩增或保存于-20℃；
(3)、PCR扩增
依次在Eppendorf PCR管中加入以下试剂：
双蒸水ddH2O 31.5μL
10×PCR缓冲液 5.0μL
10～20mmol/L dNTPs 2.0μL
20～25pmol/μL LSV上游引物 1.0μL
20～25pmol/μL LSV下游引物 1.0μL
25～30pmol/μL LMoV上游引物 1.25μL
25～30pmol/μL LMoV下游引物 1.25μL
40～45pmol/μL CMV上游引物 0.5μL
40～45pmol/μL CMV下游引物 0.5μL
5～10u/μL rTaq聚合酶 1.0μL
20～50ng cDNA 5.0μL
总体积 50.0μL
充分混匀，短暂低速离心后置于PCR仪中进行扩增，反应模式为递降式PCR，具体程序为：94～95℃预变性10min，前10个循环为94℃变性30s，退火30s，即每循环降1℃，从64℃降至54℃，72℃延伸60s，后20次循环为94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，最后72℃延伸10min。
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