CN110564830B - 一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法。其主要过程如下：1.制备含有目标cDNA的标准样本，在标准样本和待测样本中加入内标DNA；2.对标准样本和待测样本进行荧光定量PCR，并在扩增指数期内终止反应，然后测定样本扩增产物的荧光光谱；3.在标准样本的起始浓度与荧光光谱之间建立定量分析模型；4.利用定量分析模型计算出待测样本中的目标cDNA含量。本发明消除了PCR扩增效率不一致对荧光定量PCR结果的影响，具有完备的理论基础和操作性，提高了荧光定量PCR分析结果的准确度。

Description

一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法

技术领域

本发明属于核酸定量领域，具体涉及一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法。

背景技术

在临床诊断、生物医学研究以及现代分子生物学领域中实时荧光定量PCR是低丰度mRNA检测最常用的技术之一^[1-3]。目前实时荧光定量PCR主要有两种检测方法：一种是基于序列特异性探针，如TaqMan荧光探针^[4]，即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测***可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步；另一种是基于染料非特异性结合双链DNA，如SYBR green I荧光染料^[5]，即在PCR反应体系中，加入过量SYBR green I荧光染料，SYBR green I荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR green I染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。另外，根据组织中待测样本中mRNA的含量范围和定量所需的准确度^[6]，在实时荧光定量PCR有两种定量策略，即相对定量和绝对定量。相对定量^[7-9]是测定目标基因相对于参考基因表达量。在某些情况下，目标基因表达的相对变化量可能比其绝对变化量更有用。方法^[7]是目前应用最广泛的相对定量方法之一。绝对定量^[10,11]是通过在目标基因起始浓度或拷贝数的对数值与其PCR扩增循环阈值(c_t)之间建立标准曲线来定量分析未知样本中目标基因的起始浓度或拷贝数。循环阈值(c_t)指的是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环次数。在病原体检测^[12]，病毒载入量计算^[13]，转基因食品检测^[14]，基因表达研究^[15]等领域需要应用绝对定量的方法精确定量分析目标DNA或RNA的起始浓度。

目前大部分实时荧光定量PCR的相对定量和绝对定量的模型是建立在循环阈值(c_t)的基础上。这些相对定量和绝对定量模型一般假设在达到循环阈值之前目标序列的PCR扩增效率是恒定不变的，并且所有待测样本的扩增效率是相同的^[16-18]。然而，在实际反应条件下，上述条件是很难得到满足的。基于循环阈值(c_t)的定量模型对PCR扩增效率的变化非常敏感，扩增效率微小的变化往往会导致定量结果出现较大误差。目前也出现了一些对上述苛刻条件或多或少有所放松的实时荧光定量PCR数据分析方法。例如，Ramarkers等^[17]在样本PCR扩增反应过程中监测到的荧光信号强度的对数值与PCR循环次数之间建立了一个线性模型。用荧光强度表示的目标基因的起始拷贝数可通过计算该线性模型的截距而求得。然而，该线性模型成立的前提条件是样本的PCR扩增曲线包含一个由扩增效率恒定的4～6个扩增循环组成的“线性窗口”。很显然，这一前提条件在实际应用中也很难得到满足。另外，Lievens等^[18]提出了一名叫全过程动力学PCR(full process kinetics-PCR，FPK-PCR)的新方法。该方法认为PCR扩增效率与循环次数相关。全过程动力学PCR可用于深入理解实时荧光定量PCR数据，重构荧光数据，以及比较目标序列在不同样本中的相对表达。但该方法应用涉及到一个复杂且必不可少的基线扣除步骤，从而大大地降低其定量分析结果的准确度。

发明内容

实时荧光定量PCR过程中存在扩增效率不一致的现象，扩增效率微小的变化往往会导致定量结果出现较大误差，从而影响定量分析结果的准确度。为了消除实时荧光定量PCR技术中扩增效率不一致的影响，提高荧光定量PCR分析结果的准确度，本发明所采用的技术方案是：一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

(1)配制一系列不同浓度的目标cDNA标准样本，在每个标准样本和待测样本中均加入内标DNA；

(2)利用TaqMan探针检测方法对标准样本和待测样本进行PCR扩增，并在扩增指数期内终止扩增反应，然后测定样本扩增产物的荧光光谱；

(3)在标准样本中目标cDNA的起始浓度与样本的荧光光谱之间建立定量分析模型；

(4)利用定量分析模型计算待测样本中的目标cDNA含量。

进一步地，为了保证目标链和内标链反应效率一致，步骤(1)中内标DNA的Q-PCR产物中的序列碱基数和鸟嘌呤加胞嘧啶(G+C)含量与目标cDNA的Q-PCR产物一致。

进一步地，为了使目标cDNA和内标DNA的PCR扩增曲线有重叠的指数扩增区间，内标DNA的量既不能太多也不能大少，步骤(2)中若标准样本的浓度范围较窄，则可在标准样本和待测样本中均加入固定浓度的内标DNA，其浓度值可取该浓度范围的中间值；若标准样本的浓度范围较宽，则在浓度低的标准样本中加入相应较低浓度的内标DNA，在浓度高的标准样本中加入相应较高浓度的内标DNA。

进一步地，步骤(3)中所述的荧光定量PCR扩增，采用的方法为TaqMan探针法。其中，目标cDNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是HEX，内标DNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是FAM，两条TaqMan荧光探针所标记的淬灭荧光基团均为Dabcyl。

进一步地，步骤(3)中所述的在扩增指数期内终止扩增反应，可以是所有样本的PCR扩增反应终止于同一循环圈数，也可以是不同样本的PCR扩增反应终止于不同的循环圈数。

进一步地，步骤(3)中所述的测定样本扩增产物的荧光光谱是指采用荧光光谱仪，在560nm的发射波长下，扫描样本扩增产物在400～550nm范围内的荧光激发光谱。

进一步地，步骤(4)中所述的在标准样本中目标cDNA的起始浓度与样本的荧光光谱之间建立定量分析模型，建立过程如下：

(a)当对含有一定量的内标DNA和目标cDNA的第k个标准样本进行PCR扩增时，在其扩增的指数区检测到的荧光光谱可以用下式表达：

其中，x_k代表第k个标准样本在第n_k个PCR循环圈数时所测得的荧光光谱；N_a,k代表第k个样本中目标cDNA的起始浓度或目标cDNA的拷贝数；N_b,k代表第k个样本中内标DNA的起始浓度或内标DNA的拷贝数，每个样本的N_b,k可以是不同的，也可以是相同的；r_a和r_b分别代表单位浓度的目标cDNA和内标DNA与它们各自的Taqman荧光探针结合后的荧光光谱响应；d_k代表背景干扰信号；E_j,k代表第k个标准样本在其第j个PCR循环圈数时的扩增效率。在上述公式中，荧光光谱必须是在目标cDNA和内标DNA均处于PCR循环扩增反应的指数期采集的，以确保同一个样本内的目标cDNA和内标DNA的扩增效率一致；

定义则上述公式可以简化为：

(b)简化后的公式符合光谱形变定量理论【Journal of Chemometrics,2018,32(11):e2913】，其中的乘子参数p_k可使用改进的光程估计与矫正方法估算出来【AnalyticalChemistry,2011,84(1):320-326；“用于复杂非均匀混合物的光谱定量分析方法”，中国专利号：ZL201110280639.6】。然后建立以下两个校正模型：p_k＝α₁+x_k·β₁和采用多元线性校正方法如偏最小二乘回归(partial leastsquares，PLS)估计出模型参数α₁、β₁、α₂、和β₂。

(c)将模型参数α₁、β₁、α₂、和β₂代入下列公式中，得到定量分析模型：

其中N_a,test为待测样本中目标cDNA的含量，N_b,test为待测样本中内标DNA的含量，x_test是指添加有N_b,test内标DNA的待测样本的荧光光谱数据。

以下对本发明做出进一步说明。

本发明从研究传统实时荧光定量PCR技术的局限性出发，将本发明研究人员构建的光谱形变定量理论推广应用于荧光定量PCR领域，从而发展了一种基于内标法和定量分析模型的新型荧光定量PCR方法。

本发明建立的基于内标法和定量分析模型的新型荧光定量PCR方法能够消除PCR扩增效率变化对定量分析结果的影响。

本发明利用改进的光程估计与矫正方法【Analytical Chemistry,2011,84(1):320-326；“用于复杂非均匀混合物的光谱定量分析方法”，中国专利号：ZL201110280639.6】来估计出除目标cDNA起始浓度变化以外其他因素(如模板特性与质量、引物特异性、酶的活性、反应条件控制等)的变化导致PCR扩增效率变化对标准样本PCR扩增反应后的混合物的荧光光谱信号产生的乘子效应。

本发明采用“双校正模型”策略【Analytical Chemistry,2011,84(1):320-326；“用于复杂非均匀混合物的光谱定量分析方法”，中国专利号：ZL201110280639.6】来消除由于PCR扩增效率变化对待测样本PCR扩增反应后的混合物的荧光光谱产生的乘子效应。

本发明与传统实时荧光定量PCR的操作步骤主要区别在于：本发明在样本PCR扩增指数期终止扩增反应，然后检测样本扩增反应产物混合物的荧光光谱数据。

本发明对PCR扩增反应的扩增效率没有任何不切实际的假设和要求。本发明提出采用一独特的多变量方法来代替荧光定量PCR中常用的单变量数据分析方法。如图1所示，在目标序列的每一个样本中加入一定量的内标DNA，并对内标DNA和目标序列同时进行PCR扩增反应。当内标DNA和目标序列同时扩增到指数期时，终止PCR扩增反应，获取扩增反应产物混合物的荧光光谱。

本发明取得的有益效果是：在目标序列起始浓度或拷贝数与相应荧光光谱之间建立了能消除荧光定量PCR过程中扩增效率不一致影响的定量分析模型，并将其应用于从未知样本的相应荧光光谱中获取目标序列的起始拷贝数，提高了荧光定量PCR分析结果的准确度。

附图说明

图1为本发明方法的简要步骤图；

图2为不同浓度目标cDNA(seq_a)样本的PCR扩增曲线(实线：10pg/μL，长划线：150pg/μL，双点划线：300pg/μL，点划线：640pg/μL，点虚线：2560pg/μL)；

图3为PCR循环阈值c_t与样本中目标cDNA(seq_a)浓度的对数值lg[seq_a]之间的关系图(a：seq_a的浓度范围在10～10240pg/μL之间，b：seq_a的浓度范围在10～500pg/μL之间)；

图4为不同浓度目标cDNA(seq_a)样本中加入150pg/μL内标DNA(seq_b)后经过24次PCR扩增循坏后测得的荧光光谱(虚线：[seq_a]＝10pg/μL；实线：[seq_a]＝400pg/μL)；

图5为本发明用改进的光程估计与矫正方法从添加有固定量内标DNA(seq_b)的目标cDNA(seq_a)标准样本经24次PCR扩增循环后测得的荧光光谱中估算出来乘子效应参数p_k；

图6为建立在添加有固定量内标DNA(seq_b)的目标cDNA(seq_a)标准样本经24次PCR扩增循环后测得的荧光光谱数据基础上的校正模型对校正样本和验证样本中目标cDNA(seq_a)含量的预测结果；

图7为建立在添加有固定量内标DNA(seq_b)的目标cDNA(seq_a)标准样本经各自扩增循环指数期的中间值后测得的荧光光谱数据基础上的校正模型对校正样本和验证样本中目标cDNA(seq_a)含量的预测结果。

具体实施方式

以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域普通技术人员如何实施和再现本发明。为了教导本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域普通技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将落在本发明的保护范围内。

对比例1：未加内标cDNA目标样本的荧光定量PCR

1.试剂和材料

目标cDNA(seq_a)：

5′-TCAACACCTTACGGCTTTAGGGAGAACCTTACGCTATTCCAGACAGCCACGAGGTCCAGATCGCTTGCCCAAATATGAGATCGGCCGCAAGCATGCAAGCCTGGAGTATCGGTCATGGGAAGGTAACCTCTATAAACATGAGAAATTAGGTAGACGCGTATCGTAGGAAGCGTTCGATTTGCGGCGCCACTTTATTGCCCAACCTTTGCCCGTATACGAATTGGACCCCCATTGACATAATTTTCACAGTATTCTACCGGTATAGCACTCGCGTGAGAAATGAGACTGGGCGACCTGTTTATGGCCACGGGAGGCTTGTTTCTTACGAATCCGGTGTATGGTTGAATAACA-3′(SEQ ID NO.1)

Seq_a的上游引物：5′-ATGCAAGCCTGGAGTATCGG-3′(SEQ ID NO.2)

Seq_a的下游引物：5′-TCATTTCTCACGCGAGTGCT-3′(SEQ ID NO.3)

Seq_a的Tagman荧光探针：5′-HEX-AGACGCGTATCGTAGGAAGCGTTCGATTTGC-Dabcyl-3′

2.未添加内标seq_b的目标seq_a样本的PCR扩增反应

首先用灭菌水配制目标cDNA(seq_a)两个不同浓度范围的样本集。其中，浓度范围较宽的样本集中seq_a的浓度分别为：10、20、40、80、160、320、640、1280、2560、5120、和10240pg/μL；浓度范围较窄的样本集中seq_a的浓度分别为：10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500pg/μL。对每一个样本，按以下方式配制三个平行20μL PCR反应混合溶液：10μL(2×)probe mastermix、10μM seq_a的上游和下游引物各0.3μL、0.2μL 10μM seq_a的Taqman探针、1μL不同浓度的seq_a标准样本溶液和适量的灭菌水。使用Bio-Rad实时PCR仪对上述混合溶液进行PCR循环扩增反应，监测循环扩增反应过程中荧光信号强度的变化(激发波长：535nm，发射波长：553nm)，并确定每个样本的c_t值。PCR循环扩增反应的条件如下：在95℃将混合溶液预热2min后进入循环，95℃保持15s，61℃保持30s，25℃保持30s，循环次数为40圈。

3.实验结果

如图2所示，目标cDNA(seq_a)浓度相同的平行样本的PCR扩增曲线之间可能存在较明显的差异，目标cDNA(seq_a)浓度不同的样本的PCR扩增曲线却可能十分相近。这说明受模板的特性和质量、引物特异性、酶的活性、反应条件的控制等因素影响，PCR扩增效率不是恒定不变的，而是会发生变化，从而会严重影响传统实时荧光定量PCR的定量分析结果。

如图3a所示，当目标cDNA(seq_a)浓度范围内较宽时(即，10～10240pg/μL)，样本的PCR扩增循环阈值c_t和seq_a初始浓度的对数值(lg[seq_a])之间的相关系数仅为0.76。这意味着seq_a初始浓度的对数值与c_t之间的关系严重偏离线性模型。如图3所示，当目标cDNA(seq_a)浓度范围内较窄时(即，10～500pg/μL)，样本的PCR扩增循环阈值c_t和seq_a初始浓度的对数值(lg[seq_a])之间的相关系数提高到了0.94。这说明样本中目标cDNA(seq_a)的初始浓度变化区间较小时，样本之间扩增效率的差异有所减小。但是，样品管之间的扩增效率的差异仍会导致目标cDNA(seq_a)浓度相同的三个平行样本的循环阈值c_t之间出现较大差异。显然，由于传统实时荧光定量PCR技术是基于样本PCR扩增反应的循环阈值c_t与目标cDNA初始浓度对数值成线性关系这一假设进行定量分析的，因此扩增效率的差异对循环阈值c_t的影响会导致其对目标cDNA(seq_a)初始浓度的定量分析结果存在较大的误差。

实施例1：模拟样本中目标cDNA的定量分析

本实施例将详细阐述使用本发明对生物样本中目标cDNA进行荧光PCR定量分析的步骤和过程。

1.试剂和材料

目标cDNA(seq_a)：

5′-TCAACACCTTACGGCTTTAGGGAGAACCTTACGCTATTCCAGACAGCCACGAGGTCCAGATCGCTTGCCCAAATATGAGATCGGCCGCAAGCATGCAAGCCTGGAGTATCGGTCATGGGAAGGTAACCTCTATAAACATGAGAAATTAGGTAGACGCGTATCGTAGGAAGCGTTCGATTTGCGGCGCCACTTTATTGCCCAACCTTTGCCCGTATACGAATTGGACCCCCATTGACATAATTTTCACAGTATTCTACCGGTATAGCACTCGCGTGAGAAATGAGACTGGGCGACCTGTTTATGGCCACGGGAGGCTTGTTTCTTACGAATCCGGTGTATGGTTGAATAACA-3′(SEQ ID NO.1)

内标DNA(seq_b)：

5′-AAGTGCAGTAAAACACTTGGTGACTATGCTCGGTTCTGCCTACTCTGTCACCTTCCGTCGAAAGTATTCGCTCCGAGAGAATTGGGCTATTGCGCGAACATTTTTAAGATGACTAACAGTGTTTCAAAGGTCTGCCCAGACTTACGCATCAACAAGTCGTCTCTGAACCATTCCGCGGTCGCGTCACGTGAATACCGTTCCGCAAGGTGGAGCAACTCTGTTTGGCAGCTGGCCAGAACAACAGTACACTAGTAAGCCGGAGGGTAGAGTCGGGAGCAGCTGGCACCTCAGGCGGTCGTCAGTTTACAGAAAACTGTGGTGCTAAGGGAGAGGAGAAACAGAGTTATTCTC-3′(SEQ ID NO.4)

Seq_a的上游引物：5′-ATGCAAGCCTGGAGTATCGG-3′(SEQ ID NO.2)

Seq_a的下游引物：5′-TCATTTCTCACGCGAGTGCT-3′(SEQ ID NO.3)

Seq_a的Tagman荧光探针：5′-HEX-AGACGCGTATCGTAGGAAGCGTTCGATTTGC-Dabcyl-3′；

Seq_b的上游引物：5′-CTCTGTCACCTTCCGTCGAA-3′(SEQ ID NO.5)

Seq_b的下游引物：5′-ACCTTGCGGAACGGTATTCA-3′(SEQ ID NO.6)

Seq_b的Tagman荧光探针：5′-FAM-TATTCGCTCCGAGAGAATTGGGCTATTGCGC-Dabcyl-3′

2.目标seq_a样本与内标seq_b混合溶液的PCR扩增反应

用灭菌水配制浓度为150pg/μL的seq_b储备液。对seq_a的浓度分别为10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500pg/μL的每一个样本，按以下方式配制三个平行20μLPCR反应混合溶液：10μL(2×)probe mastermix、10μM seq_a的上游和下游引物各0.3μL、0.2μL 10μM seq_a的Taqman探针、10μM seq_b的上游和下游引物各0.3μL、0.2μL 10μMseq_b的Taqman探针、1μL不同浓度的seq_a标准样本溶液、1μLseq_b储备液和适量的灭菌水。使用Bio-Rad实时PCR仪对上述混合溶液进行PCR循环扩增反应。PCR循环扩增反应的条件如下：在95℃将混合溶液预热2min后进入循环，95℃保持15s，61℃保持30s，25℃保持30s。PCR循环扩增反应的循环次数按两种方式设置：1)将所有样本的循环次数设置为一固定值(如：24圈)。该固定循环次数应处于所有样本PCR扩增反应的指数期；2)不同浓度目标cDNA样本的循环次数均不相同，每一个样本的PCR扩增反应循环次数设置为该样本PCR扩增反应的指数期的中间值。PCR扩增反应达到预先设置的循环次数后，终止反应，然后将三个平行样本的扩增产物混合，从中取50μL与60μL灭菌水混匀后用配有氙灯的F-7000荧光光谱仪(日立公司，日本)进行荧光检测，发射波长为560nm，PMT电压为900v，扫描范围为400～550nm，激发和发射的狭缝宽度均为5nm。每个样本检测3次。

3.校正模型的建立

将采用内标法进行PCR扩增反应所获得的样本荧光光谱分为校正集和验证集，校正集中目标cDNA(seq_a)初始浓度分别为10、50、150、250、350、450、500pg/μL；验证集中目标cDNA浓度分别为100、200、300、400pg/μL。根据光谱形变定量理论在校正集样本荧光光谱数据和目标cDNA(seq_a)初始浓度之间建立校正模型，校正模型参数是根据校正模型对验证集样本预测结果的均方根误差最小化的准则来确定的。

4.实验结果

由于目标cDNA(seq_a)和内标DNA(seq_b)与它们各自的Taqman探针结合后产生的荧光响应不同，因此样本中目标cDNA(seq_a)初始浓度的变化会导致所测得的荧光光谱的相应变化(图4)。

图5给出了由改进的光程估计与校正方法从采用内标法进行PCR扩增反应所获得的校正样本荧光光谱中估算出乘子效应参数p_k。p_k代表的是在样本中加入的内标DNA(seq_b)的量与累积的扩增效率的乘积。由于在每个样本中加入的内标DNA(seq_b)的量是一个恒定值，因此p_k的变化反应了样本之间扩增效率的变化。本发明方法在理论上已经考虑了样本之间扩增效率的变化对样本荧光谱的影响，因此样本之间扩增效率的变化不会影响其定量分析结果的准确度。

图6为建立在添加有固定量内标DNA(seq_b)的目标cDNA(seq_a)标准样本经24次PCR扩增循环后测得的荧光光谱数据基础上的校正模型对校正样本和验证样本中目标cDNA(seq_a)含量的预测结果。该校正模型对校正集和验证集的预测结果的平均相对误差分别为18.0％和7.9％。

图7为建立在添加有固定量内标DNA(seq_b)的目标seq_a标准样本经各自扩增循环指数期的中间值后测得的荧光光谱数据基础上的先进校正模型对校正样本和验证样本中目标cDNA(seq_a)含量的预测结果。该校正模型对校正集和验证集的预测结果的平均相对误差分别为15.7％和6.0％。

实施例1在消除了扩增效率不一致的影响后，图6和图7结果中相对误差在合理的范围内，和对比例1中图3给出的结果相比，图6和图7显示本发明提供的校正模型给出的预测结果明显更接近于它们的真实浓度，提高了实验结果的准确度。

实施例2：HepG2细胞样本中KRAS基因的定量分析

本实施例根据KRAS基因(NM 033360.3：1917-2060)设计并合成目标cDNA(seq_c)和内标DNA(seq_d)，然后使用本发明方法对HepG2细胞样本中KRAS基因进行准确定量分析。

1.试剂和材料：

目标cDNA(seq_c)：

5′-ACATTAAAAGATTATTTGGGCCAGTTATAGCTTATTAGGTGTTGAAGAGACCAAGGTTGCAAGGCCAGGCCCTGTGTGAACCTTTGAGCTTTCATAGAGAGTTTCACAGCATGGACTGTGTCCCCACGGTCATCCAGTGTTGTCATGCATTGGTTAGTCAAAATGGGGAGGGACTAGGGCAGTTTGGATAGCTCAACAAGATACAATCTCACTCTGTGGTGGTCCTGCTGACAAATCAAGAGCATTGCTTTTGTTTCTTAAGAAAACAAACTCTTTTTTAAAAATTACTTTTAAATATTAACTCAAAAGTTGAGATTTTGGGGTGGTGGTGTGCCAAGACATTAATTTTTTTTTTAAACAATGAAGTGAAAAAGTTTTACAATCTCTAGGTTTGGCTAGTTCTCTTAACACTGGTTAAATTAACATTGCATAAACA-3′(SEQ IDNO.7)

内标DNA(seq_d)：

5′-AGTGTTAGTATGGCTGAAAGGCACTGCCTGCTCACGGTGGCAAGTCACACTCCAAGTGCTGCCGCCGAAAATGTCCGTAGATCGACATCTAACAACAACGCGCGTGAGTGCAGGTCACCACAGACCCCTAGTTCTCGCAACTCCTTGTAAACCGGGCAGTTGCTTGGATGAACCATGAACGGGGACTAATATTCCAAGGAGATGCATATCCATCCAGTACGGACAAACTAGGTAGTAAACGCTGAACAAGTTCGGGGGTACACTGGGGCAATGAGATCACAAATACCCGTGTTTACACGTGATGCATCCCATTCGAAGCTCAATCTCCTGGGTAGTACAAACAGGCCATAAGTGATACAGATGCATCGGTATCAGAACTCGCACGGGCGACGTGGTTTGGCTGCAGGCCGGTGCTCTCCGTGCT-3′(SEQ ID NO.8)

Seq_c的上游引物：5′-GTTTCACAGCATGGACTGTG-3′(SEQ ID NO.9)

Seq_c的下游引物：5′-GCTCTTGATTTGTCAGCAGG-3′(SEQ ID NO.10)

Seq_c的Tagman荧光探针：5′-HEX-AAATGGGGAGGGACTAGGGCAGTTTGGATAG-Dabcyl-3′；

Seq_d的上游引物：5′-TCACCACAGACCCCTAGTTC-3′(SEQ ID NO.11)

Seq_d的下游引物：5′-CCCCGAACTTGTTCAGCGTT-3′(SEQ ID NO.12)

Seq_d的Tagman荧光探针：5′-FAM-AACCGGGCAGTTGCTTGGATGAACCATGAAC-Dabcyl-3′。

2.人体肝癌细胞HepG2的cDNA制备：

首先将细胞用PBS缓冲液清洗两次，然后在1000rpm下离心1min，收集细胞，加入1mL TRIzol(英杰公司，美国)裂解5min，然后于0.2mL氯仿中充分混合15s后室温静置5min，再于4℃以12000rpm离心10min，收集悬浮液，并将其与0.5mL于4℃预冷的异丙醇混合，并于4℃以12000rpm离心10min，弃去上层水相，RNA沉淀物用75％乙醇清洗两次，沉淀风干后分散于无酶水中，再经过逆转录获得含有KRAS基因的cDNA；

3.目标KRAS gene(seq_c)样本与内标seq_d混合溶液的PCR扩增反应：

用灭菌水配制浓度为0.0500pg/μLseq_d储备液和11个浓度在0.0125～0.1375pg/μL之间的seq_c(KRAS基因)标准样本。经逆转录获得的含有KRAS基因的cDNA样本用灭菌水以4:1、3:2、2:3和1:4的比例进行稀释，得到5个含不同浓度KRAS基因cDNA的HepG2细胞样本(注：其中一个样本为没有被稀释的原样本)。对每个seq_c的标准样本和HepG2细胞样本，按以下方式配制四个平行20μL PCR反应混合溶液：10μL(2×)probe mastermix、10μM seq_c的上游和下游引物各0.3μL、0.2μL 10μM seq_c的Taqman探针、10μM seq_d的上游和下游引物各0.3μL、0.2μL 10μM seq_d的Taqman探针、4μL不同浓度的seq_c标准样本(或HepG2细胞样本)、4μLseq_d储备液和适量的灭菌水。使用Bio-Rad实时PCR仪对上述混合溶液进行PCR循环扩增反应。PCR循环扩增反应的条件如下：95℃保持5s，4℃保持5min，95℃保持30s，然后进入循环，95℃保持5s，60℃保持30s，25℃保持30s，循环次数为26次(由于seq_c的浓度范围较小，26次循环处于所有样本PCR扩增曲线的指数区域)。反应结束后，将四个平行样本的扩增产物混合，从中取50μL与60μL灭菌水混匀后用配有氙灯的F-7000荧光光谱仪(日立公司，日本)进行荧光检测，发射波长为560nm，PMT电压为900v，扫描范围为400～550nm，激发和发射的狭缝宽度均为5nm。每个样本检测3次。

4.校正模型的建立：

将11个seq_c(KRAS基因)标准样本分为校正集和验证集，其中，校正集样本seq_c的浓度分别为0.0125、0.0375、0.0625、0.0875和0.1375pg/μL；验证集样本seq_c的浓度分别为0.0250、0.0500、0.0750、0.1125和0.1000pg/μL。根据光谱形变定量理论在校正集样本荧光光谱数据和seq_c初始浓度之间建立先进的校正模型(校正模型参数是根据校正模型对验证集样本预测结果的均方根误差最小化的准则来确定的)，然后将其用于HepG2细胞样本中KRAS基因的定量分析。

表1为本发明方法对HepG2细胞样本中KRAS基因的定量分析结果。本发明的定量结果与绝对定量测得的浓度基本相符，其回收率均在91.2～118％之间。这些结果进一步证明了在去除了扩增效率不一致的因素后，本发明从目标cDNA与内标DNA混合溶液在其PCR指数扩增期测量的荧光光谱数据中提取样品中目标cDNA初始浓度信息的能力。

表1：本发明方法对HepG2细胞样本中KRAS基因的定量分析结果

a.第一个样本中KRAS基因的实际浓度为采用绝对定量的实时荧光定量PCR技术反复测定所得，其他四个样本的实际浓度是根据该数据按稀释比例计算所得。

b.括号内的数字为标准偏差

与现有实时荧光定量PCR技术相比，本发明具有如下特点：1)本发明是建立在合理的假设基础上，所有公式均是通过严格的数学推导获得的，因此本发明具有理论基础扎实的优点；2)本发明仅需要在反应体系中加入适量的内标DNA和在PCR扩增指数期终止扩增反应后检测样本扩增反应产物混合物的荧光光谱数据，具有实现简单的优点；3)本发明所涉及的较高级的数学知识仅包括PLS多元线性回归方法和改进的光程估计与矫正方法，而这些方法的原理已经十分成熟、计算过程比较简单，且已有现成的软件可供使用(ChemoShooter V2018，软著登字第3737019号)，因此本发明具有使用简单的优点。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

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[22]Martens H,Martens M.Multivariate Analysis of Quality:AnIntroduction；John Wiley and Sons:Chichester,2001

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南工业大学

<120> 一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tcaacacctt acggctttag ggagaacctt acgctattcc agacagccac gaggtccaga 60

tcgcttgccc aaatatgaga tcggccgcaa gcatgcaagc ctggagtatc ggtcatggga 120

aggtaacctc tataaacatg agaaattagg tagacgcgta tcgtaggaag cgttcgattt 180

gcggcgccac tttattgccc aacctttgcc cgtatacgaa ttggaccccc attgacataa 240

ttttcacagt attctaccgg tatagcactc gcgtgagaaa tgagactggg cgacctgttt 300

atggccacgg gaggcttgtt tcttacgaat ccggtgtatg gttgaataac a 351

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atgcaagcct ggagtatcgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tcatttctca cgcgagtgct 20

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

aagtgcagta aaacacttgg tgactatgct cggttctgcc tactctgtca ccttccgtcg 60

aaagtattcg ctccgagaga attgggctat tgcgcgaaca tttttaagat gactaacagt 120

gtttcaaagg tctgcccaga cttacgcatc aacaagtcgt ctctgaacca ttccgcggtc 180

gcgtcacgtg aataccgttc cgcaaggtgg agcaactctg tttggcagct ggccagaaca 240

acagtacact agtaagccgg agggtagagt cgggagcagc tggcacctca ggcggtcgtc 300

agtttacaga aaactgtggt gctaagggag aggagaaaca gagttattct c 351

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctctgtcacc ttccgtcgaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

accttgcgga acggtattca 20

<210> 7

<211> 436

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

acattaaaag attatttggg ccagttatag cttattaggt gttgaagaga ccaaggttgc 60

aaggccaggc cctgtgtgaa cctttgagct ttcatagaga gtttcacagc atggactgtg 120

tccccacggt catccagtgt tgtcatgcat tggttagtca aaatggggag ggactagggc 180

agtttggata gctcaacaag atacaatctc actctgtggt ggtcctgctg acaaatcaag 240

agcattgctt ttgtttctta agaaaacaaa ctctttttta aaaattactt ttaaatatta 300

actcaaaagt tgagattttg gggtggtggt gtgccaagac attaattttt tttttaaaca 360

atgaagtgaa aaagttttac aatctctagg tttggctagt tctcttaaca ctggttaaat 420

taacattgca taaaca 436

<210> 8

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

agtgttagta tggctgaaag gcactgcctg ctcacggtgg caagtcacac tccaagtgct 60

gccgccgaaa atgtccgtag atcgacatct aacaacaacg cgcgtgagtg caggtcacca 120

cagaccccta gttctcgcaa ctccttgtaa accgggcagt tgcttggatg aaccatgaac 180

ggggactaat attccaagga gatgcatatc catccagtac ggacaaacta ggtagtaaac 240

gctgaacaag ttcgggggta cactggggca atgagatcac aaatacccgt gtttacacgt 300

gatgcatccc attcgaagct caatctcctg ggtagtacaa acaggccata agtgatacag 360

atgcatcggt atcagaactc gcacgggcga cgtggtttgg ctgcaggccg gtgctctccg 420

tgct 424

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtttcacagc atggactgtg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

gctcttgatt tgtcagcagg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tcaccacaga cccctagttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ccccgaactt gttcagcgtt 20

Claims (3)

1.一种基于内标法和定量分析模型的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备含有目标cDNA的标准样本，分别在标准样本和待测样本中加入内标DNA；

(2)对标准样本和待测样本进行PCR扩增，在扩增指数期内终止反应，然后测定样本扩增产物的荧光光谱；

(3)在标准样本的起始浓度与荧光光谱之间建立定量分析模型；

(4)利用定量分析模型计算待测样本中的目标cDNA含量；

步骤(3)中所述定量分析模型，建立过程如下：

(a)当第k个标准样本进行PCR扩增时，在其扩增的指数区检测到的荧光光谱用下式表达：

其中，x_k代表第k个标准样本在第n_k个PCR循环圈数时所测得的荧光光谱数据；N_a,k代表第k个样本中目标cDNA的起始浓度或目标cDNA的拷贝数；N_b,k代表第k个样本中内标DNA的起始浓度或内标DNA的拷贝数；r_a和r_b分别代表单位浓度的目标cDNA和内标DNA与它们各自的Taqman荧光探针结合后的荧光光谱响应；d_k代表背景干扰信号；E_j,k代表第k个标准样本在其第j个PCR循环圈数时的扩增效率；定义

则上述公式可以简化为：

(b)使用光程估计与矫正方法计算出乘子参数p_k，然后建立以下两个校正模型：p_k＝α₁+x_k·β₁和采用多元线性校正方法计算出模型参数α₁、β₁、α₂、和β₂；

(c)将模型参数α₁、β₁、α₂、和β₂代入下列公式中，得到定量分析模型：

其中N_a,test为待测样本中目标cDNA的含量，N_b,test为待测样本中内标DNA的含量，x_test是指添加有N_b,test内标DNA的待测样本的荧光光谱数据；

所述步骤(1)中，内标DNA的Q-PCR产物中的序列碱基数和GC含量与目标cDNA的Q-PCR产物一致。

2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR方法，其特征在于：步骤(2)中所述的荧光定量PCR扩增，采用的方法为TaqMan探针法。

3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR方法，其特征在于：TaqMan探针法中，目标cDNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是HEX，内标DNA的TaqMan荧光探针标记的发光基团是FAM，两条TaqMan荧光探针标记的淬灭荧光基团均为Dabcyl。