CN1261812A - 用于向组织中体内进行核酸载体最佳电转移的装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用弱电场提高转移效率而使核酸载体向细胞、尤其肌细胞和肿瘤细胞内体内转移显著增强的***和装置。本发明的装置用来提供一种最佳电压梯度,来增强核酸载体向细胞内的迁移,而不损伤细胞或组织。这些装置的特征在于独特的电极排列,和最大电压设置所限定的独特功率极限。

Description

用于向组织中体内进行核酸载体最佳电转移的装置

                          发明领域

本发明涉及使用弱电场提高转移效率而使核酸载体向细胞内、尤其肌细胞内体内转移的显著增强。本发明尤其涉及为了基因治疗实现这种核酸载体转移的方法、装置和组合物。本发明的装置用来提供一种最佳电压梯度，以增强核酸载体向细胞内的迁移，而不损伤细胞或组织。这些装置的特征在于独特的电极排列，和最大电压设置所限定的独特功率极限。

                         发明背景

                  用于基因输送的载体与方法

基因向特定细胞中的转移是基因治疗的基础。然而，一个问题是向待处理的宿主细胞中引入足量的核酸。目的基因必须在转染的细胞中表达。在此方面采用的一种方法是核酸在病毒载体中、尤其在反转录病毒、腺病毒或腺伴随病毒中的整合。这些***利用病毒发展的细胞侵入机制，以及对抗降解的保护。然而，该方法也存在问题。一是产生易于在宿主生物中传播的传染性病毒颗粒的危险，以及对于反转录病毒载体而言，***诱变的危险。此外，治疗性基因或疫苗基因在病毒基因组中的***能力仍然是有限的。最后，常常产生针对病毒载体的免疫应答，这由于免疫清除而使病毒的再施用无效，并且也可引起炎症。

另一种方法(Wolf等人，科学(Science)247，1465-68，1990；Davis等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，7213-18，1996；Felgner等人的美国专利号5,580,859)包括向肌肉或血流中施用一种质粒型核酸，无论其是否与利于其转染的化合物连接，如蛋白质、脂质体、荷电脂或阳离子多聚体如聚乙烯亚胺，它们是很好的体外转染剂(Behr等人，美国国家科学院院报86，6982-6，1989；Felgner等人，美国国家科学院院报84，7413-7，1987；Boussif等人，美国国家科学院院报92，7297-301，1995；美国专利5,676,954和欧洲专利425475)。

关于肌肉，由于Wolff等人的最初发表内容，见上文，显示肌肉组织中摄入以游离质粒形式注射的DNA的能力，所以许多研究者设法改进该方法(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗(Human Gene Ther.)4，419-431；Wolff等人，1991，生物技术(BioTechniques)11，474-485)。从这些试验中已显现某些趋势，特别是：

·机械手段的应用，其通过将DNA吸附于球上然后推射至组织(“基因枪”)使DNA进入细胞内(Sanders Williams等人，1991，美国国家科学院院报88，2726-2730；Fynan等人，1993，生物技术11，474-485)。已证明这些方法在接种策略中是有效的，但只接触表面组织层。对于肌肉而言，其应用需要外科方法来提供与肌肉的接近，因为颗粒不能穿过皮肤组织；

·DNA的注射，其不再为游离质粒形式，但与能用作载体的分子连接，以利于复合物进入细胞。在其它许多转染方法中使用的阳离子脂迄今为止已清楚在对肌肉的应用中是令人失望的，因为那些已试验的脂证明抑制转染(Schwartz等人，1996，基因治疗(Gene Ther.)405-411)。对于阳离子肽和多聚体同样如此(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431)。有利组合的唯一例子似乎是聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮与DNA的混合物。这些组合产生的增强相对于裸DNA注射只达到10倍以下(Mumper等人，1996，药物研究(Pharmaceutical Research)13，701-709)；

·对注射溶液的组织的预处理，试图增强DNA扩散和/或稳定性(Davis等人，1993，人类基因治疗4，151-159)或促进核酸的进入，例如，细胞增殖或再生现象的诱导。该处理尤其涉及局部麻醉剂或心脏毒素、血管收缩剂、内毒素或其它分子的应用(Manthorpe等人，1993，人类基因治疗4，419-431；Danko等人，1994，基因治疗1，114-121；Vitadello等人，1994，人类基因治疗5，11-18)。这些预处理方案难以控制。尤其是丁哌卡因，为了有效必须以非常接近致死剂量的浓度使用。试图增强扩散的高渗蔗糖的预注射不能提高肌肉中的转染水平(Davis等人，1993)。

已通过单独使用质粒DNA或通过与合成载体连接体内转染了其它组织(Cotten和Wagner的综述(1994)，生物技术的当前观点(Current Opinionin Biotechnology)4，705；Gao和Huang(1995)，基因治疗，2，710；Ledley(1995)，人类基因治疗6，1129)。研究的主要组织是肝脏、呼吸道上皮、血管壁、中枢神经***和肿瘤。在所有这些组织中，证实转基因表达水平太低以至于不能预见治疗性应用(例如，对于肝脏，见Chao等人(1996)，人类基因治疗7，901)，尽管最近对于血管壁中的质粒DNA转移有一些令人鼓舞的结果(Iires等人(1996)，人类基因治疗7，959和989)。在脑中转移效率很低，如同在肿瘤中一样(Schwartz等人，1996，基因治疗3，405；Lu等人，1994，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)1，245；Son等人，美国国家科学院院报91，12669)。

            用于基因输送的电穿孔和离子电渗疗法

电穿孔，或者用来透化细胞的电场的应用，通常在体外使用以促进培养细胞中的DNA转染。该现象依赖于达到阈电场强度。对于动物细胞，在大约800-1200伏特/cm的相对高强度的电场下观察到电透化作用。也建议在体内进行该技术，以便增强抗肿瘤剂如博来霉素在人实体瘤中的效能(美国专利号5,468,228，L.M.Mir)。应用极短持续时间(100微秒)的脉冲，这些电条件(800-1200伏特/cm)很好地适用于小分子的细胞内转移。应用这些条件(100微秒的脉冲)不引起核酸向肝脏中体内转移的增强，与无电脉冲时的DNA注射相比，证明低于1000伏特/cm的电场完全无效甚至是抑制性的(专利WO 97/07826和Heller等人，FEBS Letters，389，225-8，1996)。

此外，对于体内应用，该技术存在困难，因为如此强度的电场的使用能引起广泛的组织损伤。靶组织的损伤在癌症患者肿瘤治疗中不是一个问题，但当向非肿瘤组织的组织中、尤其是向横纹肌中施用核酸时就可能是一种主要缺点。

有三种基本类型的***用来在电穿孔和离子电渗疗法中施行电脉冲：外部电极、内部电极(包括导管)和外部与内部电极的组合。

                   外部电极

在一类装置中，在患者外部放置电极。参见，例如，Hofmann的美国专利号5,318,514；Hofmann的5,439,440；Hofmann的5,462,520；Hofmann的5,464,386；Hofmann等人的5,688,233；和Weaver等人的5,019,034；其公开内容在此引入作为参考。应用一种外部电极装置，电极与患者的表面组织区相接触。该装置中电极的使用可以是患者皮肤上的非侵入性使用，或者通过对经外科暴露的器官表面侵入性地使用。

Hofmann’514专利公开了一种装置，它用于向患者的预选的表面组织区内植入大分子如基因、DNA或药物。该装置具有一种头部组件，在第一种实施方案中，该组件包括位于开孔弹性体上的蛇形导体，这两者都被支撑于一种通常平面的支撑构件上。蛇形导体的相邻平行部分用作电极。为了对患者施用电脉冲，将头部组件置于与患者的预选表面组织区相接触，放置导体使之与皮肤接触。通过向弹性体输送可被弹性体吸收的液体，将携带大分子的液体介质转移到患者皮肤。然后按下一个开关，以从信号发生器向电极释放高压脉冲，使电极之间产生电场。电场深入皮肤的深度与电极之间的间隙成比例。该电场将液体注入组织区中。

在另一种实施方案中，头部组件包括许多一般垂直于平面支撑构件延伸的细针。这些针成排排列，并交错地与信号发生器的输出连接，使得每一个针与反极性的另一个针相邻。这些针穿透皮肤细胞的最外层，便于对目标区施用电脉冲。

Hofmann’440专利公开了一种装置，其包括用于产生电场的可调节间距的电极。这些电极被安装于一种可移动的联动装置上，以便使用者能操纵电极使其象钳爪一样彼此靠近或远离地移动。操作中，打开电极夹并将所选的待处理组织在电极夹之间夹紧。用一种合适的开关装置操控与电极连接的信号发生器，以在电极间的组织中产生电场。

                     内部电极

第二类电转移***利用可植入或可***的电极，这些电极被置于患者体内，向邻近植入/***电极的区域释放电场。参见，例如，Crandell等人的美国专利号5,304,120；Hofmann等人的5,507,724；Hofmann的5,501,662；Hofmann等人的5,702,359；和Hofmann的5,273,525；其公开内容在此引入作为参考。

Crandell’120专利公开了一种***患者所选血管中的导管。该导管包括许多轴向延伸、圆周间隔的电极，这些电极与血管内壁接触。然后将含有大分子的液体介质注入邻近电极的血管中，并对电极通电来施加预定的电信号进行电转移。间隔的电极可以是通电后产生希望的电场的蛇形带或平行带。

Hofmann’724专利是基于导管的电转移装置的另一种实例，其具有位于导管外面、以定距离间隔的电极，该导管***血管中与待处理的血管壁接触。

Hofmann’662专利公开了一对安装于圆柱形介电载体中以定距离间隔的电极。该电极位于血管中央周围，彼此离开预定的一致距离并靠近血管中央，使得血管中的血流在电极之间通过。将圆柱形介电载体外科植入周围的血管中。对电极施加预定的电信号，在电极之间的血流中产生电场。

Hofmann’525专利公开了一种双针注射器，其中的针作为施行电转移的电极。一旦将针***目标区中，即对电极施加电信号，以向目标区释放电场。Hofmann’359专利也公开了用于电转移的基于针的电极。

                  外部与内部电极的组合

第三类电转移装置结合了上述***的特征。这些装置利用至少一种内置电极和至少一种外置电极来向希望的组织区释放电场。参见，例如，Shapland等人的美国专利号5,286,254；Shapland等人的5,499,971；Shapland等人的5,498,238；Shapland等人的5,282,785；和Shapland等人的5,628,730；其公开内容在此引入作为参考。

这些装置的典型是Shapland’785专利中描述的一种装置，该专利公开了一种具有含药物输送壁(例如，由能通过药物或其它大分子的透性或半透性材料制成的壁)的药物腔的导管和一种位于导管内部、与药物输送壁相对的电极。第二个电极位于患者皮肤的远端。将含有目的大分子的液体输送至药物腔中，该药物腔置于当供给电流时在两种电极间产生的电场中。这样，大分子被输送至目标区。

上述专利中公开的其它特征包括：反转电极的极性，将过量的大分子以与输送中相反的方向排出(例如，Shapland’238和Shapland’785专利)；为了避免电诱导的心律不齐或异常的心脏节律，使向电极传送电流与心脏的心室去极化同步的***(例如，Feiring的美国专利号5,236,413和5,425,703和Shapland的专利号5,634,899)；以及使用一种超声波压电式传感器代替电极产生声波作为大分子输送的驱动力，称为声泳(例如，Shapland’238和Shapland’730专利)。

                    发明概述

尽管引用的所有研究提到需要高电场(大约1000伏特/cm)才能在体内有效，但最意外地和引人注目地，申请者现在证明，通过对组织施以低强度(低于600伏特/cm)如100-200伏特/cm及相对长持续时间的电脉冲，充分提高了核酸向组织中的体内转移，而没有不当的影响。此外，申请者发现，根据本发明的方法显著降低了在DNA向肌肉中转移的现有技术中观察到的质粒携带的转基因表达的高变异性。

因此，本发明涉及一种方法和装置，其用于向组织中如一种或多种横纹肌或肿瘤中进行体内核酸转移，其中通过向组织中直接施用或通过局部或全身施用使组织细胞接触待转移的核酸，并且通过对组织施加一次或多次电脉冲来确保转移，电脉冲的强度对于肌肉为1-400伏特/cm，对于组织如肿瘤为1-600伏特/cm。

因此，本发明提供一种***，如一种改进型装置，用于向多细胞真核生物的细胞中进行体内核酸转移，其中通过向组织中直接施用或通过局部或全身施用而使组织细胞接触待转移的核酸，并且通过对组织施加一次或多次电脉冲来确保转移，电脉冲由为提供特定强度而设置的本发明的装置所释放。特别地，对于核酸向肿瘤细胞的输送，电场强度可为1-600伏特/cm，对于核酸向肌细胞的输送为1-400伏特/cm。本发明的***(或装置)包括一种电脉冲发生器(或产生电脉冲的装置)，其中该电脉冲发生器产生脉冲时间超过1毫秒并且强度为1-400或1-600伏特/cm、频率为0.1-1000Hz的电脉冲；以及连接于电脉冲发生器的电极，用于在与电极体内接触的组织中产生电场。在一种特定实施方案中，电脉冲发生器产生强度为30-300伏特/cm的脉冲(对于向肌肉中的转移)，对于向肿瘤细胞和其它小细胞中的转移为400-600V/cm的脉冲。在另一种特定实施方案中，电脉冲发生器产生超过10毫秒的脉冲时间。在又另一种特定实施方案中，电脉冲发生器产生2-1000次的脉冲。

根据本发明，该***或改进型装置的电脉冲发生器能彼此之间不规律地产生脉冲，由此描述依赖脉冲持续时间的场强的函数是可变的，其附带条件是该***或装置从不提供高于(或低于)上述参数的电场。例如，描述电场随时间变化的函数的积分可大于1kV·msec/cm；在另一种实施方案中大于或等于5kV·msec/cm。

电脉冲发生器(脉冲发生装置)能产生选自方波脉冲、指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波的脉冲。优选地，电脉冲发生器产生方波脉冲。

本发明考虑了多种电极构造。例如，电极可以是置于待处理的组织上的一种外部电极，例如，用于向患者表面组织细胞中转移核酸。另外，电极可以是一种内部电极或组织穿入式电极，可植入待处理的组织中。这种内部电极可以是一种针，并可装配为一种注射器***，使核酸和电场的同时施用成为可能。在另一种实施方案中，本发明提供外部电极和内部电极两者。

可确定本发明的一种外部电极的尺寸，使之接触患者身体邻近大肌肉的外部部分。在一种特定实施方案中，这种电极是一种平板电极；在另一种实施方案中，它是一种半圆柱形极板电极。

在又另一种实施方案中，电极是一种动脉内或静脉内电极，例如，根据本发明改进的柔性导管装置。

用于本发明电极的优选材料是不锈钢。

通过改进现有技术设备特别是这些设备中用来产生电场的装置，能产生本发明的改进型装置，以产生本发明的电场。例如，通过修改电压门，使之不超过相当于400或600伏特/cm的电压，能使产生电脉冲的装置适于产生1-400或1-600伏特/cm的脉冲。在这种改进型装置的特定实施方案中，能将电压设置为恒定电压，并将电极以恒定间距放置。此外，通过在设备上贴标签，使之不超过相当于400或600伏特/cm的电压，能使产生电脉冲的装置适于产生1-400或1-600伏特/cm的脉冲。

因此，本发明的一个目的在于提供一种***，或改进现有装置，来提供这样的电场，该电场具有已发现最适于核酸转移而不损伤组织的电压梯度、脉冲宽度和脉冲数。

本发明的一个特殊目的在于在用于电穿孔的温和及低损伤条件下进行核酸的电转移(电压梯度超过600伏特/cm，通常超过1000伏特/cm)。

本发明的再另一个特殊目的在于提供比在离子电渗疗法所用极低强度电场下所能达到的有效得多的细胞内核酸输送。

本发明的又另一个优点是提供对肌细胞的有效、可重复的核酸输送。

如上所述，以及在发明详述中及在含附图的实施例中所更详细描述的，已经达到本发明的这些和其它目的。

                    附图简述

图1：高场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。

图2：中场强电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774转染的影响；平均值±SEM。

图3：弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNApXL2774转染的影响；平均值±SEM。

图4：弱场强及不同持续时间的电脉冲对小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNApXL2774转染的影响；平均值±SEM。

图5：低电场强度时小鼠颅侧胫骨肌中质粒DNA pXL2774电转移的效率；平均值±SEM。

图6：萤光素酶在小鼠颅侧胫骨肌中表达的动力学。有(■)和无(×)电转移时质粒pXL2774的施用；平均值±SEM。

图7：有(●)和无(□)电转移时随施用DNA的剂量而变化的表达水平。

图8：不同类型电极对电转移效率的影响。

图9：分泌型碱性磷酸酶血清浓度的动力学。有(■)和无(◆)电转移时质粒pXL3010的施用；平均值±SEM。

图10：有(空心直方条)或无(实心直方条)电转移时aFGF在肌肉中表达的动力学。

图11：质粒pXL3179和pXL3212的图谱。

图12：质粒pXL3388和pXL3031的图谱。

图13：质粒pXL3004和pXL3010的图谱。

图14：质粒pXL3149和pXL3096的图谱。

图15：质粒pXL3353和pXL3354的图谱。

图16：质粒pXL3348的图谱。

                       发明详述

如上指出，本发明通过对组织施以低强度的电脉冲提供大大增强的向组织中的体内核酸转移。例如，已发现低于600伏特/cm的电场增强核酸向肿瘤中的转移，而在肌肉中对于约0.5-1cm间隔放置的电极为低于400伏特/cm，优选地100-200伏特/cm。这些电场应用相对长的持续时间。此外，申请人发现，根据本发明的方法显著降低了在DNA向肌肉中转移的现有技术中观察到的转基因表达的高变异性。最后，已发现表达持续较长一段时间，例如，超过60天。在一个具体实例中，63天内检测到高水平的表达。

从在此提供的叙述中易于确定，申请人将这些条件下核酸向细胞内的体内转移称为“电转移”；在此使用的另外一种合适术语为“电转染”。这两个术语将核酸转移的最佳条件与“电穿孔”(使用高于800V/cm的电场)和离子电渗疗法(使用极低强度的电场)区别开来。

因此，本发明涉及用于向组织尤其是横纹肌中进行体内核酸转移的方法、***和设备(或装置)，以及组合物，其中通过向组织中直接施用或通过局部或全身施用而使组织细胞接触待转移的核酸，并且通过对该组织施加一次或多次电脉冲来确保转移，电脉冲强度为1-600伏特/cm(例如，对于肿瘤细胞)，对于肌细胞为1-400伏特/cm。换句话说，本发明尤其涉及用于电转移的***(即，设备或装置)。

根据一种优选实施方案，本发明的方法适用于这样的组织，其细胞具有特殊的几何形状，例如，大型的和/或细长形状的细胞，和/或对电势有天然反应性，和/或具有特殊的形态。

对于肌肉，场强优选地为4-400伏特/cm，对于肿瘤可达600伏特/cm，施加的总持续时间超过1毫秒(msec)，优选地10msec。在特定实例中，总持续时间为8msec或更长。在许多实例中，脉冲持续时间为20msec，并且发现超过40msec的持续时间是有效的。使用的脉冲数为，例如，1-1000次脉冲，优选地2-100次，更优选地4-20次，脉冲频率为0.1-1000赫兹(Hz)；更准确地为0.2-100Hz。在特定实施方案中，发现2Hz、3Hz和4Hz的频率是有效的。也能不规律地释放脉冲，描述依赖于时间的场强的函数是可变的。描述电场随时间变化的函数的积分大于1kV·msec/cm。根据本发明的一种优选实施方案，该积分高于或等于5kV·msec/cm。然而，应当指出，本领域的普通技术人员能轻易地理解，在上述亚电泳电压时必然达到该积分函数。

在从本发明出发的一个特殊实例中，本发明的装置能提供一种组合，包括至少一次短持续时间(少于1msec)的高压脉冲(高于400V/cm，优选地为500-800V/cm)，随后是一次或多次低得多的电场强度(低于200V/cm)的较长脉冲(超过1msec)。

根据本发明的一种优选实施方案，脉冲的场强为30-300伏特/cm。

电脉冲选自方波脉冲、产生的指数衰减波、短时振荡单极波、短时振荡双极波或其它波形的电场。根据本发明的一种优选实施方案，电脉冲为方波脉冲。

能通过本领域已知的任何方法来进行电脉冲的施用，例如：

·置于待处理的组织两侧的外部电极***，特别是，与皮肤接触的非侵入性电极，

·植入组织中的电极***，

·支持核酸和电场的同时施用的电极/注射器***。

对于体内进行的施用，有时必须借助于中间产物以确保非侵入性外部电极的电连续性。例如，这包括一种凝胶形式的电解质。合适凝胶的实例包括下文实施例中使用的凝胶，以及在医学中通常用来增强电接触的凝胶，如用于心电图或除纤颤器的。

核酸能通过任何合适的方法施用，但优选地是直接向组织中体内注射，或通过另一种局部的或全身的途径施用，该途径使核酸出现在施加电场的部位。如前所述，可用容许或有利于转移的试剂施用核酸。特别地，这些核酸可游离于溶液中或与合成试剂连接或由病毒载体携带。合成试剂可以是专业人员所知的脂类或多聚体，乃至使在靶组织膜上的固定成为可能的导向元件。在这些元件中，可提及携带糖、肽、抗体、受体和配体的载体。

可以想象，在本发明的这些条件下，核酸的施用可以先于、同时乃至晚于电场的施加，当然要在施用核酸之后仍继续施加电场。

本发明也涉及一种核酸和一种强度为1-600伏特/cm(优选地400伏特/cm)的电场，作为一种组合产物用于向哺乳动物细胞中尤其向人细胞中同时、分开或时间上交错地体内施用。对于向肌肉中的转移，场强优选地为4-400伏特/cm，更优选地，场强为30-300伏特/cm。对于向肿瘤和具有相似电转移接收特性的细胞中的转移，优选的电场强度为400-600V/cm；优选地约500(即，500±10％优选地5％)V/cm。本领域的普通技术人员能轻易地理解，这种组合定义了一种核酸结构，其中在电场存在下核酸相对于电场采用特定方向以及具有特定的二级和三级结构。此外，DNA与在靶组织中发现的胞外成分相结合，在琼脂糖凝胶或其它实验室条件下进行低场电泳能将该成分与DNA区别开来。

                  电转移***和装置

任何电转移***(即，装置或设备；在此交替使用这些术语)的主要元件由一种为了提供不超过600V/cm的脉冲而设计或改进的电脉冲发生器和电极组成。尤其用于向肌肉输送核酸的本发明的***或装置提供不超过400伏特/cm的脉冲。自然，实际电压取决于电极之间的距离。本领域众所周知，该距离影响通过靶组织的电阻率(resistivity)。因此，所施加的实际电压取决于电阻以至于电流，从而将总功率保持在可接受的水平内。在此使用的术语“可接受水平”意思是，总功率不引起不可逆的组织损伤，尤其是组织灼伤。因此，在优选的一方面，本发明的装置或者通过设定电压和电极距离控制可接受的电流，或者包括一种反馈装置来防止施加对电极间的距离而言太高的电压，从而施加太大的电流。本发明的***可包括示波器或其它计量装置来监测电压、电流或此两者。

在一种实施方案中，使用可商业获得的设备制备本发明的***。优选地，为了提供在此确定为最佳的特定电转移条件而改进这种设备。在另一种实施方案中，设计并制造一种新设备来实现本发明的目的。改进或制造的脉冲发生器的设计规格包括，但决不限于，机械或电气控制器的引入，来维持希望的电压梯度，即，对于向肌肉施用，低于600或400V/cm，优选地低于200V/cm。例如，机械控制器可包括，电压选择刻度盘上的一种止阻，其用来防止选择可产生过高电场的电压。此外，也能制造或改进该装置使这种电压不能被选择。在又另一种实施方案中，该装置可包括一种断路器或熔断器，当电压(从而电流)超过本发明的参数时断开。在又另一种实施方案中，微处理控制器能防止或克服过高电压的选择。在又另一种实施方案中，通过使用一种标签简单地改进脉冲发生器，该标签指导使用提供本发明的电场强度的特定电压范围。所有这些改进在本领域中都是常规，并利用标准电气与机械技术。

如上所述，为达到在此确定为最佳的电场强度而由本发明的***所释放的实际电压，部分地取决于电极间距。如果电极以固定的方式隔开，则电压(对于限定的组织，例如，肌肉、肝脏、心脏或肿瘤)可以是预定的恒定值。然而，如果希望改变电极的间距，则必须调节电压以保持恒定的电压梯度。其确定方法包括，测量电极间的距离，引入对电极的测量装置，该装置对调节后的间距提供(电压)值，或者使用反馈回脉冲发生器以自动提供修正电压的自动化测量装置(参见Hofmann的美国专利5,439,440)。

以下部分更完全地描述了可根据本发明改进的现有技术的脉冲发生器、电极和装置。

                    脉冲发生器

脉冲发生器(也称为“电压发生器”和“脉冲或电压发生装置”)是产生规定电压、持续时间、脉冲宽度、工作周期(脉冲和静止的总时间)和脉冲频率的电流的电气装置。这类装置在本领域中众所周知，包括可商业获得的脉冲发生器，如ELECTRO CELL MANIPULATOR ECM600、T800L和T820型电压发生器，其可购自BTX Instruments Division ofGenetronics，Inc.of San Diego，California，例如，如美国专利号5,704,908所述，在此全部引入作为参考。此外，如下文实施例中所公开的，脉冲发生器可以是可从法国Jouan获得的Electropulsator PS 15。在又另一种实施方案中，可使用美国专利号5,634,899所述的能产生一种或多种波形的电压发生器，该专利在此全部引入作为参考。该电压(发生器)能用来产生可变形状、强度和持续时间的脉冲。例如，200V/cm或400V/cm、5-20msec的脉冲，继之以更低强度更长时间的脉冲。该装置能进一步提供与本发明的电场结合的离子电渗电场。

本发明的脉冲发生器具有下列规格：

·产生1-600或1-400V/cm、优选地4-400V/cm、更优选地30-300V/cm的电压梯度。对于向肌肉中的电转移，本发明的装置所预期的特定电压梯度约为100V/cm和200V/cm；优选地低于200V/cm。对于向肿瘤细胞或相似细胞中的电转移，意外地发现400-600V/cm、最优地约500V/cm的电场是优选的。

·0.1-1000赫兹(Hz)的脉冲频率；在一种特定实施方案中，频率约为2Hz或更高，最高可达10Hz；优选地高于1Hz。在一种优选实施方案中，频率为3Hz或4Hz。

·脉冲时间(持续时间)长于1毫秒(msec)，含可变的工作时间；优选地脉冲时间长于5msec；更优选地长于10msec；更优选地长于20msec。

在优选的一方面，本发明的脉冲发生器产生至少两次、优选地4、6或8次脉冲。例如，它能产生8-1000次脉冲。如果患者开始感觉不适或者电场强度失去控制，脉冲发生器应能停止或关闭。这种停止可以是手动的或自动的，或此两者。

本领域的普通技术人员容易看出，外部信号如另一种装置、计算机等能产生脉冲。例如，对于核酸向心脏组织的输送，脉冲发生器最好与患者的心电图连接，以使脉冲与心搏同步。这种***优选地包括患者心节律的主动起搏，例如应用起搏器(参见Shapland的美国专利号5,634,899)。

                    电极

本发明的电极在组织中提供电场。阴极带负电荷；阳极带正电荷。通常，根据本发明，从一个电极到另一个电极有离子净流或流动(该流当然取决于离子种类的净电荷和电极的极化)。一般而言，带强净负电荷的核酸将向阳极移动。

根据本发明使用的电极必须有效地导电，优选地在所用条件下是惰性、非反应性且无毒性的。特别地，内部使用的电极不应与生物物质在任何可感知的程度上起反应，例如，避免从电极上释放可能有害或有毒的金属离子，或者避免降低电极效率的氧化。用于本发明的电极的一种优选材料是不锈钢，它有相当的非反应性、导电方面相当有效并且便宜，可以以合理的成本制造。更理想的电极，尤其对于内部使用而言，是金或铂。然而，这类贵金属电极非常昂贵。通过在其它导体上镀上这些材料能降低其成本。其它导电金属包括铜、银或氯化银、锡、镍、锂、铝和铁，及其汞合金。然而，某些材料如铝不能内部使用。电极也可由锆、铱、钛和某些形式的碳形成。

某些电极如银和铜具有抗菌活性，这是内部施用所希望的，以抑制感染。

能以适于靶组织的任何构造形成电极，不加限制地包括：直金属丝、盘绕金属丝(直金属丝和盘绕金属丝电极对于导管应用是理想的)、导电表面(例如，导管或气囊导管的导电表面；参见美国专利号5,704,908，在此全部引入作为参考)、金属条、针(或探针)、针的排列、表面电极或其组合。预期的电极组合包括(1)一个导管电极和一个针电极；(2)一个导管电极和一个表面电极；以及(3)一个针电极和一个表面电极。在一种特定实施方案中，可与注射器一起使用针电极来输送DNA。这种针电极可具有穿过其轴长的孔，允许核酸溶液穿过其长度来输送。对于核酸向大器官尤其大肌肉的输送，可使用两个表面电极。表面电极优选地与电解质组合物结合使用，如上所述，以确保例如通过皮肤的良好接触和导电性。

在一种有一个内部电极和一个外部电极的特定实施方案中，该外部电极可具有置于内部电极周围的多个“头”。实际上，一般对于上述任一构造，一个电极可具有多个“头”。

本发明进一步考虑到电极的排列；沿轴具有孔的针；具有规定的并校准的导电长度的针(用于向组织中提供恒定和可重复的导电区，无论针穿入组织中的深度如何)，其上半部和下半部电隔离；为了防止向组织中的尖到尖电弧而具有隔离的尖的针；以及在一个针周围含有产物的任何种类的袋/贮库。

如上对于针电极所述，平板电极可包含绝缘的边缘。

通常，排列电极使得靶组织直接位于它们中间。这样，核酸受到最高的场强。然而，由于电场流都在电极周围，所以使用电极间***产生的电场及电极间直接产生的电场是可能的。

                   现有技术的改进型装置

在一种特定实施方案中，根据本发明改进了对于患者而言电极外置的一种装置(参见，例如，Hofmann的美国专利号5,318,514；Hofmann的5,439,440；Hofmann的5,462,520；Hofmann的5,464,386；Hofmann等人的5,688,233；和Weaver等人的5,019,034)，即，在规定条件下提供电场，以提供本发明的一种改进型装置。该改进型装置可通过对患者皮肤应用电极而非侵入性地使用，或者通过对已被外科暴露的器官表面应用电极而侵入性地使用。

同样，可根据本发明改进一种电转移***，产生本发明的一种改进型装置，该电转移***利用置于患者内的可植入或可***电极来向邻近植入/***电极、尤其导管电极的区域释放电场(参见，例如，Crandell等人的美国专利号5,304,120；Hofmann等人的5,507,724；Hofmann的5,501,662；Hofmann等人的5,702,359；和Hofmann的5,273,525)。

自然地，可根据本发明改进如下电转移装置，提供本发明的一种改进型装置，该电转移装置结合了上述***的特征，例如，其使用至少一种内置电极和至少一种外置电极来对希望的组织区释放电场(参见，例如，Shapland等人的美国专利号5,286,254；Shapland等人的5,499,971；Shapland等人的5,498,238；Shapland等人的5,282,785；和Shapland等人的5,628,730)。

                 使用电转移***的基因治疗

根据本发明的方法可用于基因治疗，即，其中转移基因的表达且基因的调节或阻断有可能确保特定疾病的治疗。

优选地以基因治疗为目的处理组织细胞，它使以下方面成为可能：

·细胞自身功能异常的矫正(例如，用于与遗传缺陷有关的疾病如粘稠物阻塞症或肌肉萎缩症的治疗)；

·转基因产生的营养因子、神经营养因子、血管生成因子，或抗炎因子，对组织如肌肉、器官或骨的血管形成或神经分布的保护和/或再生；

·肌肉向分泌器官的转化，该器官分泌导致治疗效果的产物，如基因自身的产物(例如，血栓形成和止血调节因子、营养因子、生长因子、激素样胰岛素、***和瘦素(leptin)等等)，或者如通过加入治疗性基因在肌肉中合成的活性代谢物，例如，通过治疗性产物的分泌矫正遗传疾病；

·抗肿瘤基因的输送，如肿瘤抑制基因(成视网膜细胞瘤蛋白，p53、p71)、***基因(例如，HSV-胸苷激酶)、抗血管生成基因(例如，制管张素、endostatin、尿激酶的氨基端片段)、细胞周期阻断剂、凋亡基因(如BAX)、细胞内单链抗体和免疫刺激基因。

·核酸疫苗或免疫刺激剂基因。

对于在肌肉中表达对***性问题进行的基因治疗中使用电转移的特殊优点在于以下许多因素：

·转基因表达的显著稳定性，超过几个月，因此使肌肉内或分泌型治疗性蛋白质的稳定和持续的产生成为可能，

·容易进入肌肉组织，使在非关键器官中直接、快速和安全的施用成为可能，

·肌肉块的大体积，使多个施用部位成为可能。

·充分证明的肌肉的分泌能力。

补充的一个优点是与使用局部和靶向电场有关的局部处理所提供的安全性。

由于具有与使用弱电场有关的安全性，可对心肌应用本发明进行心脏病的治疗，例如，用人工起搏法确保安全的电转移(参见美国专利号5,634,899)。通过抑制平滑肌细胞增殖的基因的表达，如GAX蛋白，本发明也可用于再狭窄的治疗。

尤其对组织体内施加的低强度、长持续时间的电场组合，可增强核酸的转染，而不引起明显的组织恶化。这些结果提高了使用核酸的基因治疗中DNA转移的效率。

因此，与本发明有关的优点是，生理性和/或治疗性剂量的物质在组织中或邻近组织的产生，或在血流或淋巴循环中***性分泌。此外，本发明第一次使表达的转基因有效量的精细调节和控制成为可能，这是根据调节被转染组织的体积的可能性，例如，应用多个施用部位，乃至调节电极数量、形状、表面和排列的可能性。另一种控制因素起因于按如下调节转染率的可能性，即通过改变场强、脉冲的数量、持续时间和频率以及根据现有技术对核酸施用的量和体积的改变。本发明的一个特殊优点是对于DNA转移所获得的完美的剂量反应曲线，没有一种现有技术方法曾获得过这样的曲线。于是能获得与希望的组织内产生或分泌相当的转染水平。最后，与体内基因转移的化学或病毒方法相比，该方法使特别的安全性成为可能，在化学或病毒方法中无法完全消除和控制到达非靶器官的器官中。实际上，根据本发明的方法使控制被转染组织的局部化成为可能(与经受局部电脉冲组织的体积密切相关)，并因此产生通过组织的完全或部分切除而抑制转基因表达的可能性，这是可能的，因为某些组织不是必需的或能再生或者两者都是，如肌肉。使用方法的这种较大灵活性使根据动物种(人和兽医应用)、患者年龄及他或她的生理和/或病理状况优化方法成为可能。

与病毒法相比，根据本发明的方法进一步第一次使转染大的核酸成为可能，就转基因的大小而言，病毒法受适合壳体的病毒基因组大小的限制。这种可能性对于极大型基因如肌营养不良蛋白或含内含子和/或大型调节元件的基因的转移是必要的，例如，对于激素的生理调节性产生是必要的。这种可能性是人工酵母附加体或染色体或微型染色体的转移所必需的。

本发明的另一个目的在于将电压场的电脉冲与为了任意施用方式而配制的含有核酸的组合物相结合，使之可能通过局部、皮肤、口、***、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮途径等进入组织。本发明的药物组合物含有一种药学可接受的载体，其用于可注射的制剂，特别是，用于对希望的器官直接注射，或者用于其它任何施用方式。它尤其可包括无菌等渗溶液或干燥的特别是冻干的组合物，视情况而定，在后者中加入无菌水或生理盐水可产生可注射溶液。用于注射的核酸剂量以及施用次数和注射体积可适应于不同的参数，特别适应于施用方法、有关病理学、待表达的基因乃至寻求的治疗持续时间。

                    靶组织

本发明者发现，根据本发明的基因转移的最佳条件依靶组织而不同。例如，发现200伏特/cm的电场大大增强了基因向肌细胞中的转移。在这些条件下，也向肿瘤细胞中进行了有效的基因转移(在特定实验中，观察到基因转移增强3倍)，但基因向肿瘤细胞中的转移在400伏特/cm的电场中更有效(基因转移效率提高2个对数)。在进一步的实验中，500伏特/cm的电场强度对于基因向肿瘤细胞中的转移是最佳的。

因此，根据本发明，能制造一种***或改进型装置用于向肌细胞(和其它大细胞)中输送核酸，并能发展一种具有不同电场强度参数的***或改进型装置，用于向肿瘤细胞(和其它小细胞)中输送基因。

对于核酸向肌细胞的输送，本发明的***或装置将产生1-400伏特/cm、优选地4-400伏特/cm、更优选地30-300伏特/cm的电压梯度。在特定实施方案中，电压梯度为100-200伏特/cm。特别预期的是提供不超过200伏特/cm的电压梯度的***或装置。

对于核酸向肿瘤细胞的输送，本发明的***或装置将产生1-600伏特/cm、优选地100-600伏特/cm、更优选地400-600伏特/cm的电压梯度。在特定实施方案中，电压梯度为400-500伏特/cm，优选地约500V/cm。特别预期的是提供不超过600伏特/cm的电压梯度的***或装置。

                   核酸

核酸可以是合成或生物合成来源的，或者从病毒或原核细胞或源于单细胞生物(例如酵母)或多细胞生物的真核细胞中提取。它们可完全地或部分地与来源生物和/或合成***的成分一起施用。

核酸可以是脱氧核糖核酸或核糖核酸。它可包括天然或人工来源的序列，特别是基因组DNA、cDNA、mRNA、tRNA和rRNA、杂交序列或合成或半合成的寡核苷酸序列，无论修饰与否。这些核酸的获得可通过专业人员已知的任何方法，特别是通过克隆、通过化学合成乃至通过混合方法，包括经克隆获得的序列的化学或酶修饰。它们可被化学修饰。

特别地，核酸可以是有义或反义的或具有催化性质的DNA或RNA，如核酶。“反义”是指一种核酸具有与靶序列(如mRNA)互补的序列，通过与靶序列杂交而阻断其表达。“有义”是指一种核酸具有与靶序列同源或相同的序列，例如，与蛋白质转录因子连接并且参与特定基因表达的序列。根据一种优选实施方案，核酸含有一种目的基因和使该目的基因的表达成为可能的元件。核酸片段有利地为质粒的形式。

脱氧核糖核酸可以是单链或双链，如短寡核苷酸或较长的序列。它们可携带基因、调节转录或复制的序列或与其它细胞成分连接的区域，等等。这些基因可包括标记基因，即，产生一种可检测标记以研究细胞功能、迁移或基因功能的基因；治疗性基因；保护性抗原或免疫原基因；等等。根据本发明，“治疗性基因”特别是指编码一种RNA或编码一种具有治疗效果的蛋白质产物的任何基因。编码的蛋白质产物可以是蛋白质、肽，等等。该蛋白质产物可与靶细胞同源(即，当不表现病理时在靶细胞中正常表达的产物)。在此情况下，例如，转基因表达有可能克服细胞中的不充分表达或由于修饰引起的无活性或弱活性蛋白质的表达，或者也可能超量表达该蛋白质。治疗性基因也可编码具有提高的稳定性、改进的稳定性等的细胞蛋白质突变体。此蛋白质产物同样可与靶细胞异源。在此情况下，例如，表达的蛋白质可以完善或引入一种在细胞中缺陷的活性(肌病或酶缺陷的治疗)，或者有可能对抗一种病理，或者，例如在肿瘤治疗中刺激免疫应答。它可包含一种***基因(疱疹的胸苷激酶)用于癌症或再狭窄的治疗。

核酸优选地也包括支持和/或有助于治疗性基因和/或编码抗原肽的基因在组织中表达的序列。它可包含这样的序列，当这些序列能在转染的细胞中起作用时，它们天然地负责所考虑的基因的表达。也可包含不同来源的序列(负责其它蛋白质的表达，乃至合成的序列)。特别地，它可含有真核或病毒基因启动子序列。例如，可含有来源于希望转染的细胞基因组的启动子序列。在真核启动子中，可使用一种诱导或阻抑序列以支持基因的特定表达。可使用强或弱、组成型或诱导型启动子。普遍存在的(组成型)启动子包括HPRT、波形蛋白、α-肌动蛋白、微管蛋白等启动子。可使用组织特异性启动子(包括延伸因子-1-α、flt、flk)。诱导型启动子包括对激素起反应的启动子(如类固醇受体、视黄酸受体等)，或由抗生素(四环素、纳巴霉素等)调节的启动子或其它天然或合成的分子。同样可含有来源于病毒基因组的启动子序列。就此而论，例如，可提到EIA、MLP、CMV、RSV基因等的启动子。此外，通过添加活化、调节、允许条件性表达、瞬时或暂时表达、组织特异性表达或普通表达等的序列，可修饰这些表达序列。

此外，尤其在治疗性基因上游，核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入靶细胞分泌管的信号序列。该信号序列可以是治疗性产物的天然信号序列，但也可包括其它任何功能性信号或人工信号序列。核酸也可含有引导合成的治疗性产物进入特定细胞区室，如对于治疗线粒体遗传病进入线粒体。

                  治疗性基因与基因产物

在根据本发明的治疗性产物中，特别可提及酶、血液蛋白质、激素如胰岛素或生长激素、淋巴因子：白介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)等(法国专利号92 03120)、生长因子，例如血管生成因子，如VEGF或FGF。

对于神经病的治疗，可用本发明的***输送编码神经递质或其前体或合成神经递质、营养因子尤其神经营养因子的酶的基因，用于治疗神经退化病、创伤或损伤引起的对神经***的损害、或视网膜变性。例如，神经营养因子家族的成员包括但不限于：神经生长因子(NGF)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、NT4/5、NT6(包括等位变体和相同基因家族的成员)。其它神经营养蛋白包括睫状神经营养因子家族的成员，包括睫状神经营养因子(CNTF)、axokine、白血病抑制因子；其它因子包括IL-6和有关细胞因子；心营养蛋白及其相关基因；胶质衍生神经营养因子(GDNF)和相关基因；及***(IGF)家族的成员，如IGF-1、IFGF-2；成纤维细胞生长因子家族的成员，如FGF1(酸性FGF)、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9，等等；肿瘤生长因子家族的成员，如TGFβ；HARP/多效营养蛋白(pleiotrophin)，或骨生长因子；造血因子，等等。

其它目的基因编码有助于治疗的、分泌和非分泌的肌肉蛋白质，如肌营养不良蛋白或微型肌营养不良蛋白(法国专利号91 11947)或α-1-抗胰蛋白酶。

其它目的基因编码与凝血有关的因子：因子VII、VIII、IX；***基因(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶)；血红蛋白基因或其它蛋白质载体。

在又另一种实施方案中，可输送参与脂类代谢的蛋白质的相应基因，如选自载脂蛋白A-I、A-II、A-IV、B、C-1、C-II、C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的一种载脂蛋白类型，和代谢酶，例如：脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7-α-胆固醇羟化酶、磷脂酸磷酸酶，乃至脂类转移蛋白质，如胆固醇酯转移蛋白质和胆固醇酯转移蛋白质和磷脂转移蛋白质、HDL结合蛋白，或乃至选自例如LDL受体、乳糜微粒残余物受体和清除子受体等的一种受体。可进一步加入瘦素来治疗肥胖症。也可加入p53抗癌基因或其它肿瘤抑制基因如HSV-tk乃至GAX蛋白，限制平滑肌中的细胞增殖(再狭窄的治疗)。

其它目的基因包括血管生成因子，包括血管内皮生长因子(VEGF、VEGF-2、VEGF-3、血小板生长因子)和制管张素。另一方面，可实现编码血管生成、尤其肿瘤血管生成抑制剂的基因的输送，这类抑制剂如血管生成因子的可溶性受体、血管生成因子受体的特异性抑制剂(Tie2、尿激酶受体、flt1、KDR)、抗血管生成因子的抗体(包括单链Fv抗体)(例如，抗-VEGF或抗-FGF)、抗整联蛋白抗体、内皮肿瘤特异性毒素、血管生成的多肽抑制剂(尿激酶的氨基端片段-ATF、制管张素、endostatin、干扰素-α或β、白介素-12、血小板因子4、TNFα、血小板反应蛋白、血小板活化因子(PAI)-1、PAI2、TIMP1、催乳素片段，等等。

在可由一种组织分泌或由该组织产生的其它蛋白质或肽中，重要地是强调抗体、单链抗体的可变片段(ScFv)或具有识别能力的其它任何抗体片段，用于免疫治疗，例如，传染病、肿瘤和自身免疫病如胰岛硬化症(抗独特型抗体)的治疗。非限制性的其它目的蛋白质是：可溶性受体，例如，用于抗HIV治疗的CD4可溶性受体或TNF可溶性受体、用于治疗类风湿性关节炎的可溶性TNF受体(尤其是可溶性TNFα受体)和用于治疗肌无力的乙酰胆碱可溶性受体；底物肽或酶抑制剂，乃至受体激动剂或拮抗剂肽或粘着蛋白，例如，用于治疗哮喘、血栓症、再狭窄、转移瘤或炎症(例如用来减弱Th1细胞应答的IL-4、IL-10和IL-13)；以及人工的、嵌合的或截短的蛋白质。

在重要的目的激素中，可提到对于糖尿病的胰岛素、生长激素和降钙素。

为了增强抗肿瘤或抗感染免疫应答，可提供编码免疫刺激细胞因子的基因，这些细胞因子包括IL-2、IL-12、集落刺激因子(GM-CSF、G-CSF、M-CSF)、巨噬细胞炎性因子(MIP1、MIP2)、树突细胞活化因子(flt3配体)等。

McKusick，V.A.(《人类孟德尔式遗传，常染色体显性、常染色体隐性和X-连锁表型目录》(Mendelian Inheritance in man，catalogs ofautosomal dominant，autosomal recessive，and X-linked phenotypes)第8版，Johns Hopkins University Press(1988))和Stanbury，J.B.等人(《遗传性疾病的代谢基础》(The metabolic basis of inheriteddisease)第5版，McGraw-Hill(1983))已经叙述了其它目的基因。目的基因包括与氨基酸、脂类和其它细胞成分代谢有关的蛋白质。

因而可提及与糖类代谢疾病有关的基因，例如：果糖-1-磷酸醛缩酶、果糖-1，6-二磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、溶酶体α-1，4-葡糖苷酶、淀粉-1，6-葡糖苷酶、淀粉-(1，4：1，6)-转葡糖苷酶、肌磷酸化酶、肌果糖磷酸激酶、磷酸化酶-b-激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、丙酮酸脱氢酶复合体的所有酶、丙酮酸羧化酶、2-酮戊二酸乙二醛酶羧化酶和D-甘油脱氢酶。

也可提及：

-与氨基酸代谢疾病有关的基因，例如：苯丙氨酸羟化酶、二氢生物蝶呤合成酶、酪氨酸氨基转换酶、酪氨酸酶、组氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、谷胱甘肽合成酶、g-谷氨酰半胱氨酸合成酶、鸟氨酸-d-氨基转移酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、L-赖氨酸脱氢酶、L-赖氨酸酮戊二酸还原酶、缬氨酸转氨酶、亮氨酸异亮氨酸转氨酶、支链2-酮酸脱羧酶、异戊酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A脱氢酶、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶、乙酰乙酰辅酶A 3-酮硫解酶、丙酰辅酶A羧化酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、ATP：钴胺素腺苷转移酶、二氢叶酸还原酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、胱硫醚β-合成酶、肌氨酸脱氢酶复合体、属于甘氨酸分解***的蛋白质、β-丙氨酸转氨酶、血清肌肽酶和大脑高肌肽酶。

-与脂肪和脂肪酸代谢疾病有关的基因，例如：脂蛋白脂肪酶、载脂蛋白C-II、载脂蛋白E、其它载脂蛋白、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、LDL受体、肝甾醇羟化酶和“植烷酸”α-羟化酶。

-与溶酶体缺陷症有关的基因，例如：溶酶体α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)、溶酶体艾杜糖醛酸硫酸酯酶、溶酶体肝素N-硫酸酯酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶、乙酰辅酶A：溶酶体α-葡糖胺N-乙酰基转移酶、溶酶体N-乙酰基-α-D-葡糖胺6-硫酸酯酶、溶酶体半乳糖胺6-硫酸硫酸酯酶、溶酶体β-半乳糖苷酶、溶酶体芳基硫酸酯酶B、溶酶体β-葡糖醛酸酶、N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶、溶酶体α-D-甘露糖苷酶、溶酶体α-神经氨酸酶、溶酶体天冬氨酰氨基葡糖苷酶、溶酶体α-L-岩藻糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、溶酶体酸性神经酰胺酶、溶酶体鞘磷脂酶、溶酶体葡糖脑苷脂酶和溶酶体半乳糖脑苷脂酶、溶酶体半乳糖苷神经酰胺酶、溶酶体芳基硫酸酯酶A、α-半乳糖苷酶A、溶酶体酸性β-半乳糖苷酶和溶酶体氨基己糖苷酶A的α链。

也可非限制性地提及与类固醇和脂类代谢疾病有关的基因、与嘌呤和嘧啶代谢疾病有关的基因、与卟啉和血红素代谢疾病有关的基因、与***、肌肉和骨代谢疾病有关的基因，以及与血液和血细胞生成、肌肉(肌病)、神经***(神经退化病)或循环***(例如，局部缺血和狭窄的治疗)疾病有关的基因。

以上及以下的众多实例说明本发明应用领域的潜在范围。下文的实施例说明下列每种因子的表达。

NT3的电转移。向肌肉组织中电转移的非常希望的基因是神经营养蛋白3(NT3)。已经发现，用腺病毒载体或非病毒载体肌内输送的NT3提高了pmn小鼠的存活率(Haase等人，自然(Nature)3：429-436，1997)。对于肌萎缩性侧索硬化(ALS)，一般称为“Lou Gehrig氏病”，这是一种有用的动物模型。通过电转移输送NT3预期非常有利于用NT3基因疗法对该隐匿性疾病的治疗，电转移可确保该营养因子足够的、可重复的表达。

酸性FGF或VEGF的电转移.向肌肉组织中电转移的另一种非常希望的基因是酸性FGF(aFGF；ECGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。已发现这两者在治疗动脉闭塞病中是有效的。用aFGF或VEGF电转移增强的基因疗法对该疾病的治疗，预计将进一步提高血管生长的效率。通过以定步的方式施加电场，特别是通过主动心脏起搏，对心脏动脉闭塞病的治疗也将是可能的。

治疗性核酸也可以是一种基因或反义序列，其在靶细胞中的表达使控制细胞的基因表达和mRNA转录成为可能。例如，根据欧洲专利号140,308所述的方法，这些序列可在靶细胞中转录成RNA，与细胞mRNA互补，从而阻断其蛋白质翻译。治疗性基因也包括编码核酶的序列，其能选择性地破坏靶RNA(欧洲专利号321,201)。

                  免疫原性基因和疫苗

如上所述，核酸也可含有一种或多种编码免疫原性或抗原性肽的基因，它能在人或动物中引起免疫应答。在该特定实施方案中，本发明因而使应用于人或动物、尤其针对微生物、病毒或癌症的疫苗或免疫治疗性治疗成为可能。特别地，可包括EB病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(欧洲专利号185,573)、伪狂犬病毒、“合胞体形成病毒”、其它病毒的特异抗原肽，乃至特异的肿瘤抗原如MAGE蛋白(欧洲专利号259,212)或能刺激抗肿瘤反应的抗原，如细菌热激蛋白。

                        载体

在根据本发明的方法中，核酸可与任何类型的载体或这些载体的任意组合相连接，使增强基因转移成为可能，例如，非限制地，连接至载体如病毒、合成或生物合成的物质(例如，脂类、多肽、糖苷或多聚体)，乃至推动或非推动的球上。也可将核酸注射入组织中，该组织已经受一种目的在于增强基因转移的处理，例如，在局部或全身应用中药理学性质的处理，或酶、透化(表面活性剂的使用)、外科、机械、热或物理处理。

下列实施例试图以非限制性方式说明本发明。

                     实施例

实施例1：标准电穿孔条件

试验了标准电穿孔条件，例如，已在上文详细讨论的、在美国专利号5,468,223、5,304,120、5,507,724、5,273,525、5,318,514、5,439,440、5,462,520、5,464,386、5,019,034和5,389,069及国际专利公布WO97/07826中所用的条件，发现其引起横纹肌中核酸(质粒DNA)转移的低效率甚至抑制。

                     材料与方法

在本实施例中使用了下列产品：

DNA pXL2774(PCT/FR专利96/01414)是含有萤光素酶报道基因的质粒DNA。其它产品可在市场供应商处获得：***、噻拉嗪、生理盐水(NaCl0.9％)。

使用一种示波器和一种商品化电脉冲发生器(矩形或方形)(Electropulsator PS 15，Jouan，法国)。所用的电极是间距5.3mm的不锈钢扁平电极。

在C57B1/6小鼠中进行本实验。在实验前随机分配来自不同笼子的小鼠(“随机化”)。

用***和噻拉嗪的混合物麻醉小鼠。借助于Hamilton注射器纵向穿过皮肤向左爪和右爪的颅侧胫骨肌中注射质粒溶液(含500mg/ml NaCl0.9％的30mg/ml溶液)。用导电凝胶覆盖两个电极，将注射的爪置于电极之间与后者接触。

注射一分钟后通过方形脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲。示波器使得能检查所释放脉冲的强度(伏特)(实施例中所示的值代表最大值)、持续时间(毫秒)和频率(赫兹)，该频率为1Hz。释放8次连续脉冲。

为了评价肌肉的转染，质粒施用7天后使小鼠安乐死。然后取下左爪和右爪的颅侧胫骨肌，称重，置于裂解缓冲液中并研磨。离心获得的悬液以便获得澄清的上清液。借助于商品化发光计对10ml上清液进行萤光素酶活性的测定，该发光计中自动向溶液中加入底物。对于施用总容量悬液的肌肉，发光反应的强度以RLU(相对发光单位)表示。每个试验条件测试10个点：5只动物双侧注射。用非参数检验进行统计学比较。

                    结果与讨论

用标度为线性或对数的两幅图说明结果。

在第一种实验中，测试了800-1200伏特/cm的电场的作用，这是用于肿瘤电穿孔的条件(Mir等人，欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer)27，68，1991；美国专利5,468,223)。

根据图1观察到，相对于无电脉冲时注射DNA的对照组：

·有1200伏特/cm和0.1msec持续时间的8次脉冲时，萤光素酶活性的平均值低得多；

·有1200伏特/cm和1msec的脉冲时，三只动物死亡，萤光素酶活性的平均值低得多；

·有800伏特/cm和1msec的脉冲时，萤光素酶活性的平均值也显著降低。

大多数经受电场作用的肌肉都有可见的改变(脆并且外观苍白)。

实施例2：核酸的电转移

用C57B1/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间外，实验条件同实施例1。

结果显示于图2中。再现了实施例1的结果，即，在肌肉中检测到800伏特/cm、1msec持续时间的一系列8次脉冲对萤光素酶活性的抑制作用。应用600伏特/cm的电场，观察到肌肉组织的相同抑制与相同变化。然而，该电压时较短的脉冲宽度可能避免组织损伤而增强DNA转移。另一方面，十分明显和惊人地，电压的降低有可能不再明显地改变肌肉，而且，在400和200伏特/cm时，肌肉的转染水平平均高于对未经受电场的肌肉所获得的水平。应当指出，与对照组(不经受电场)相比，在200伏特/cm时萤光素酶活性值的离散显著降低(SEM＝平均值的20.59％，相比而言无电场时为43.32％(图2A))。

本领域的技术人员能轻易地确定，这些数据证实，根据本发明的发现能改进用于电转移的现有技术装置，以产生本发明的***或装置。尽管这种改进是简单的，但此改进产生的结果是完全意外的。在本实施例和下列实施例中所报告的质粒DNA转移实验证明，本发明的***或装置引起核酸转移效率和重复性两者的意外增强。

实施例3：电转移增强转基因表达

用C57B1/6小鼠进行本实验。除脉冲的电场强度及其持续时间及在DNA注射后释放脉冲25秒外，实验条件同前述实施例。

结果显示于图3中。由200伏特/cm下5msec的脉冲持续时间开始，用100伏特/cm下20msec的脉冲持续时间，转基因表达的萤光素酶平均值明显增高。

本实验也清楚地显示，当使用200和100伏特/cm的电压时，通过肌肉中的DNA电转染获得的萤光素酶活性平均值是电脉冲持续时间的函数。也发现，对于电转染的肌肉组，值的离散显著降低(图3A)。无电脉冲时(对照)，SEM为平均值的77.43％，而在5msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下，相对SEM降至14％，在20msec的脉冲时间、200伏特/cm的电场条件下降至41.27％，对于100伏特/cm时的电转移为30％-48％。

在本实验的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了89.7倍。

实施例4：表达的200倍增强

应用可变持续时间的200伏特/cm的电脉冲，在DBA2小鼠中进行本实验。本实验的其它条件与实施例3相同。

本实施例证实，在200伏特/cm下，当脉冲持续时间从5msec延长到更长持续时间时，萤光素酶活性的转染增强(图4和图5)。观察到SEM所表示的个体间变异性相对于未电转染的对照的降低。对于对照，SEM的相对值等于35％，对于1、5、10、15、20和24msec的脉冲系列，分别为25％、22％、16％、18％和26％。在本实验所用的最佳条件下，与无电脉冲时注射的对照相比，转基因表达增强了205倍。这些结果证实，在这些实施例所述条件下的电转移大大提高了效能和可重复性。

实施例5：电转移效率的定量

图5例证了相当于“脉冲数×场强×每次脉冲持续时间”乘积的参数的重要性。实际上，该参数对应于依赖时间的描述电场变化的函数的积分。

图5中的数据来自实验2、3和5的过程中获得的结果。评价了200V/cm和100V/cm的电场强度或无电场。数据显示，转染率随暴露于电场的总持续时间与场强的乘积而升高。“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过1kV×msec/cm时，获得核酸转移的增强。根据一种优选实施方案，“电场×脉冲总持续时间”乘积的值超过或等于5kV×msec/cm时，得到刺激。

实施例6：电转移的广泛适用性

已进行了进一步的实验证实上文实施例2-5的结果。的确，使用低压电脉冲在小鼠、大鼠和兔中观察到基因转移的重要和可重复的增强。所用的条件以前认为在所研究的其它细胞型如肿瘤、皮肤或肝细胞中无效。

在本实施例中改变并研究了下列参数：

-电场的特征：伏特/cm、脉冲的数量、频率、持续时间，确定对小鼠胫骨肌的最佳条件为200V/cm、1-2Hz、20ms的8次脉冲。

-电极的形状/类型：用非侵入式平板电极进行大多数实验；在兔实验中证明了针电极的可行性。

-DNA的量(使用对小鼠胫骨肌的最佳转移条件)。

-DNA的不同批次。

-不同的报道基因：萤光素酶、LacZ(小鼠)、FGF(大鼠)。

-不同的动物种：小鼠、大鼠、兔。

-不同的注射部位：小鼠的胫骨肌、腓肠肌、四头肌；大鼠的胫骨肌；兔的胫骨肌、四头肌和三头肌。

-注射部位与脉冲部位的距离。

-注射与施加电脉冲的时间选择。

-进行注射和脉冲施加的不同实验。

观察到的结果如下：

·相对于单纯的裸DNA注射，基因转移显著增强：在小鼠肌肉中从5-10倍到100倍乃至更高，在大鼠中100-250倍增强，在兔中100-50000倍，取决于对照的水平。

·结果的动物间离散/变异性的显著降低。必须在DNA注射之后且在同一部位施加电脉冲。可在脉冲前最多30分钟施用DNA载体，而不显著降低反应。这允许在邻近部位的多次DNA注射继之以一个单次脉冲。

·在小鼠中用LacZ进行实验并随后进行组织学分析的实验证实，该方法导致大约10倍的肌纤维表达该基因。在大鼠中应用FGF的数据也表明表达细胞数量的显著增加。

·使用分泌型碱性磷酸酶—一种分泌型报道蛋白基因—的实验也表明，对于血清中分泌的蛋白质有两个对数的增长倍数。

·转染效率对大小的反向依赖性。较小的质粒可被更有效地转移；然而，无论DNA大小如何，电转移装置惊人地提高了DNA转移效率，从而克服了用YAC、粘粒或人工染色体转染的重要障碍。

·对启动子和蛋白质加工的非依赖性。电转移效率不以任何方式依赖转基因启动子，这允许另一种水平的基因表达控制。此外，基因产物中分泌性或其它调节/加工序列的存在对电转移效率无影响。

这些实验显示，电转移有某些副作用，尽管与电穿孔条件相比这些作用是最小的。脉冲7天后证明有局部炎症反应和再生过程。这种炎症是较轻的且可逆的。在小鼠中电脉冲诱导一种一般性收缩。在大鼠中，这种作用更加降低并且局限于后肢。在兔中，预实验表明，这种收缩局限于经受脉冲的肌肉组。麻醉的大鼠或兔没有明显的疼痛反应(不叫)。麻醉恢复过程中，没有动物表现处理肢的任何明显疼痛。

这些实验证明了在本申请书所述条件下使用的电转移装置的优越性，这是根据核酸转移的增强、实验内变异性的降低及不利副作用的降低或消除。在以下实施例中更详细地描述了这些结果。

实施例7：随脉冲持续时间而变的转染

本实施例证明在电转移条件下延长脉冲持续时间对转染效率的影响。

除了使用Gentronics/BTX T820脉冲发生器(BTX，Genetronics的一个分公司，San Diego，California)之外，实验条件与使用C57B1/6小鼠的实施例1相同。BTX脉冲发生器能够施加持续时间可达100ms的方形脉冲。注射质粒pXL2774(WO 97/10343)(15μg)。表1指出，在200V/cm的恒定电场强度下，延长脉冲持续时间(T)提高了转染率。

这些数据为用于向肌肉输送核酸的电转移装置确定了最佳参数。这种装置优选地提供20msec或更长的脉冲，至少4次、更优选地8次脉冲。

          表1：电转移效率对脉冲持续时间的依赖性

脉冲持续时间(msec)	0	1	5	10	20	30	40	50	60	80
											试验A8次脉冲	11±5	39±6	211±26	288±46	1158±238	1487±421	2386±278
试验B4次脉冲	11±5	26.8±6	123±17	246±32	575±88	704±130		3440±1077
											试验C4次脉冲	15±8						2885±644		2626±441	1258±309

萤光素酶活性的中值+/-SEM，单位为百万RLU每一肌肉，N＝10。电转移条件：200V/cm场强，1Hz频率。

这些数据显示，在本申请所述最佳场强下进行电转移的装置通过延长脉冲持续时间能进一步提高DNA转移的效率。例如，将一系列8次脉冲的持续时间延长到至少40msec，或者对于一系列4次脉冲延长到50msec，显著增强了200V/cm时的转染效率。对于其它场强也能实现该装置的类似最优化。

实施例8：随脉冲数而变的转染

本实施例证明在电转移条件下增加脉冲数对转染效率的影响。

实验条件与使用C57B1/6小鼠的实施例1所述相同。表2显示，在脉冲持续时间为20ms的200V/cm时，与对照组(不施加电场)相比，转染效率明显提高，从单次脉冲开始，当脉冲数增加到2、4、6、8、12和16时继续增加，8-16次脉冲时最佳。也显示，与对照(0次脉冲)相比，所有电转染组方差(S.E.M.)降低。

                表2：转染效率对脉冲数

脉冲数	0	1	2	4	6	8	12	16
									平均值(×10-7)	69.57	147.91	281.02	438.62	678.44	818.73	929.20	889.75
S.E.M.	80.09	17.76	16.38	11.44	19.05	8.87	18.20	15.44

平均萤光素酶表达±S.E.M.，单位为百万RLU每一肌肉；每一组N＝10；200V/cm场强；1Hz频率。

这些数据显示，电转移装置通过更多次脉冲提高了DNA转移效率。在所试场强(200V/cm)下，装置最佳地提供4次或更多次、更好地8次或更多次的脉冲。通过改变脉冲数，电转移装置能调节核酸转移效率，从而调节表达水平。

实施例9：随频率而变的转染

本实施例显示，提高脉冲频率可增强转染效率。在临床应用中，施加较高频率脉冲的电转移装置通过降低施加电场的总持续时间而增加了患者的舒适度。因此，通过提高频率提高了效率和患者舒适度两者。

实验条件与使用C57B1/6小鼠的实施例1所述相同。注射质粒pXL2774(15μg)。在200V/cm场强、20ms持续时间的8次或4次脉冲下，从0.1Hz到4Hz变化频率。结果显示于表3中。

                     表3：转染效率对频率(Hz)

频率(赫兹)	0	0.1	0.2	0.5	1	2	3	4
									试验A8次脉冲	5±2	54±13	95±16	405±60	996±156	1528±257
试验B4次脉冲		114±14	163±24	175±26	337±53	587±90
									试验C8次脉冲	21±14				1294±189	2141±387	3634±868	2819±493
试验D4次脉冲					1451±228	1572±320	1222±126	2474±646

单位为百万RLU每一肌肉的平均萤光素酶活性±S.E.M.；每组N＝10；电场强度200V/cm；脉冲时间20msec。

结果证明，在所试电转移条件下，在较高频率(大于1Hz，优选地大于2Hz)时，转染效率提高。

实施例10：应用随时间变化指数递减的电场的电转染

本实施例显示应用指数降低的电场对体内核酸转移效率的影响。

在本实验中使用C57B1/6小鼠。在本实验中使用由质粒pXL2774衍生的质粒pXL3031(图12)，构建方法是引入修饰的Photinus pyralis萤光素酶(pGL3；Genbank登录号CVU47295)，使之位于巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子(Genbank登录号HS5IEE)和源自SV40病毒的多腺苷酸化信号(Genbank登录号SV4CG)的控制之下。注射10μg DNA。

装配在此使用的商品化电脉冲发生器(Equibio电脉冲发生器，EasyjectT Plus型，Kent，UK)，来释放随时间变化指数递减的电场脉冲。记录的施加电压为指数峰值电压。第二种可调节的参数是电容(单位为μF)，其控制所释放能量的量。

表4显示，当施加指数递减的电场脉冲时，与不施加电场的情况相比，能获得转基因表达的非常明显的增强。在对应于指数的不同时间常数的不同电压和不同能量下获得这一结果，前者可被仪器的可调节电容调节。本实施例确定的参数可应用于电转移装置。表4：应用时间变化指数递减的电场时的转染效率(相对于对照的萤光素酶活性)

	CapaμF150	CapaμF300	CapaμF450	CapaμF600	CapaμF1200	CapaμF2400	CapaμF3000
								40V/cm						1,23	11
100V/cm				16,5	2,8	6,5	23,9
								150V/cm				1,8	3,5	6,1
200V/cm		5,1		15,8	18,8	121,5	189,7
								300V/cm	32,1	90,5	48,7	760,4	56,2
400V/cm		795
								600V/cm	62
800V/cm	3,1	1,1

相对于对照水平的萤光素酶表达水平的提高，对照水平是通过在无电转移条件下注射质粒pXL3031而确定的。给出表达水平提高的平均值；每一试验N＝4-6只小鼠。

通过比较，使用200V/cm、每次20msec的8次脉冲、频率为1Hz的方波脉冲，萤光素酶活性的增加为44。

这些数据显示，施加随时间指数递减的电场的电转移装置在较低电场强度、较高电容(例如，200V/cm，3000μ法拉的电容)时能增强表达。

实施例11：一次短高压脉冲与几次长低压脉冲的组合

本实施例显示，在本实验中释放的电场可以是一种组合，该组合包括至少一次短时如50或100μs的500-800V/cm的强电场，和至少一次较长时间如长于1ms最高可达90ms的弱电场(＜100V/cm)。此处的弱电场值为80V/cm，以1Hz的4次脉冲施加，每次持续时间90ms。对于该实验，使用两种商品化电脉冲发生器(Jouan和Gentronix)。通过手工修改操作方式使得先由一种然后由另一种仪器向电极板释放电压在少于一秒钟之内发生。在此使用的编码萤光素酶的质粒为pXL3031，注射量为3μg。如表5所报告的那样改变电场强度。此外，实验条件与实施例1所述相同。

表5总结了该实验。这些数据表明，与对照组(不施加电场)相比，一次短高压脉冲或4次长低压脉冲，或者强电场脉冲之前的弱电场脉冲的施加，不提高转染效率。相反，在该实验中，一次短高压脉冲继之以1Hz、90ms持续时间、80V/cm的4次脉冲的组合，与对照组相比非常明显增强了转染。从这些数据看，看来一种优选的电转移装置将能提供一系列较高电场强度的较短脉冲。

       表5：不同强度和时间的脉冲的组合

电场条件	实验1(3μg pXL3031)	实验2(3μg pXL3031)
			对照(不施加电场)	320±126	75±27
A：500V/cm，1×0.1msec	-	169±63
			B：800V/cm，1×0.1msec	416±143	272±84
C：80V/cm，4×90msec，1Hz	1282±203	362,21±85,17
			条件：A，随后C	-	1479±276
条件：B，随后C	3991±418	1426±209
			条件：C，随后B	-	347±66

如前文实施例1所示，施加频率为1Hz、时间为1msec的600、800或1200V/cm的8次脉冲，导致肌肉损伤和抑制转染。本实施例中获得的结果显示，在特定条件下，使用高压电场而不引起损伤是可能的。确实，对肌肉的肉眼检查未能证明任何可见的变化。使用短时间的高压电场，随后较长时间的弱电场，提供了调节DNA转移效率的另一种方法。

实施例12：肌肉中萤光素酶表达的动力学

本申请的电转移装置的使用允许核酸以高水平转染并稳定表达至少四个月。

在本实验中使用C67B1/6小鼠。给小鼠肌内注射质粒pXL2774(15μg)。DNA注射之后是下列条件下电场的施加：200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。其它条件如实施例1所述。对在DNA注射后不同时间处死的10只小鼠的组别测定萤光素酶活性。对照鼠不暴露于电场。

图6中的数据显示，从质粒注射后第三小时开始萤光素酶的表达是可检测的，直到第三天(D3)一直增高。萤光素酶表达从第35天开始下降。对于用电场处理的组，值得注意的是，无论表达水平的测定时间如何，转染都非常明显地增强。在第121天(D121)，对照与处理组之间的差异更明显，这是由于转染的DNA的表达在电转移后仍保持，而对照肌肉中的表达下降。

更显著地，转基因的表达水平稳定至D121。从应用治疗性基因长期临床治疗的角度来看，该结果是特别有利的。

实施例13：电转染肌肉的组织学

在动力学实验过程中的组织学分析证实不存在严重的炎症反应。观察到巨噬细胞和淋巴细胞的存在所表明的中度炎症。到D121这种炎症反应大大降低，而转基因表达水平仍然稳定并且较高，如图6所示。

除了使用质粒pXL3004(图13)之外，在这些同样条件下进行组织学分析。该质粒是编码β-半乳糖苷酶的一种pCOR质粒(pXL2774；参见WO97/10343)。pXL2774质粒的修饰方法是，引入用核定位信号序列修饰的lacZ基因(参见Mouvel等人，1994，病毒学(Virology)204：180-189)，置于从质粒pCDNA3(Invitrogen，荷兰)获得的CMV启动子与SV40多腺苷酸化信号(Genbank登录号SV4CG)的控制之下。质粒施用7天后处死动物。组织学分析允许通过铝化洋红染色检测β-半乳糖苷酶转染的细胞(Xgal组织化学)和炎症病灶，以及通过氧化苏木精-曙红染色表征肌肉组织状况。对照小鼠不暴露于电场。

电透化与未电透化的肌肉之间的差异表现为：

·相对于对照(平均8.5，N＝8只小鼠)，在电转染的肌肉中表达β-半乳糖苷酶的肌原纤维的数量为9倍(平均76，N＝6只小鼠)。这些肌纤维中的大多数是静止的，含有位于外周的核。非常少有中心核肌原纤维(再生的)表达β-半乳糖苷酶。

·与对照相比，电透化的肌肉中β-半乳糖苷酶的表达区大至2倍(4mm)，具有从注射部位开始降低的表达梯度。

·在本研究中，应当指出，电透化的肌肉显示可逆数量的浸润(巨噬细胞和淋巴细胞)、具有核中心化的再生的大量肌纤维和充满吞噬细胞的巨噬细胞的大量坏死纤维。炎症、坏死和再生区对应于转染的肌原纤维周围区。该反应持续可达两周，并且自身逆转。肌肉中未转染的部分仍状况良好。

·在未电透化的肌肉中，少数坏死的及其它再生的肌原纤维位于注射部位周围，具有少数炎症病灶。

简言之，这些数据显示，尽管电转移条件导致可见的炎症，但炎症是不明显的，特别是对于核酸转移效率的惊人提高而言。此外，从动力学研究得到的数据证明炎症自身逆转，甚至当转基因表达仍稳定于高水平时，仍是如此。

实施例14：相对于电场施加时间的质粒注射时间的作用

本实施例证明，可在电场施加至少30分钟前、甚至长至一小时之前向组织(在此情况下，肌肉)中注射核酸。

对C57B1/6小鼠肌内注射质粒pXL2774(15μg或1.5μg)。在施加电场之前达120分钟或之后60秒钟注射DNA。表6报告了注射前或注射后的时间。所用的电场条件是：200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz频率。对照鼠接受质粒注射但不暴露于电场中。其它实验条件与实施例1相同。

数据报告于表6中。通过萤光素酶表达检测，电场施加前达一小时的DNA注射导致高转染效率的实现。每一肌肉注射15μg质粒所观察到的相同趋势，用低10倍剂量即1.5μg的DNA注射也可观察到。当在电场施加后注射质粒时，未观察到DNA转染效率的提高。表6：电场施加之前和之后注射质粒的电转移效率6A：无电场时注射DNA(对照)

相对于电场施加的注射时间	实验1pXL2774(15μg)	实验2pXL2774(15μg)	实验3pXL2774(1,5μg)	实验4pXL2774(15μg)	实验5pXL2774(1,5μg)
						0	7±4	8±6	0.4±0.2	22±15	1±1

6B：电场施加前注射DNA

时间	实验1	实验2	实验3	实验4	实验5
						-120分钟				20±5	2±1
-60分钟				106±22	10±3
						-30分钟	303±36	237±61	7±3	184±22	15±4
-5分钟	410±7
						-60秒	253±51
-20秒	492±122	201±43	9±3	123±23	12±2

6C：电场施加后注射DNA

时间	实验1	实验2	实验3	实验4	实验5
						+10秒				7±7
+20秒	11±6	0.4±0.1
						+60秒	8±7			17±15

与在此观测的结果相比，其中电场施加之前最高达一小时注射质粒DNA提供质粒的高水平表达，不同作者在体外观察到，在施加电场时存在质粒对于电穿孔是必要的。

实施例15：电转移的剂量-反应

本实施例所示的统计学分析允许对电转移条件下的剂量-反应进行比较。本研究证实，电转移装置的使用大大降低了质粒表达水平的变异性。

每个剂量的DNA用10只小鼠，用0.25-32μg DNA(质粒pCOR-pXL3031)的剂量在颅侧胫骨肌中两侧肌内注射给5周龄C57B1/6小鼠，该DNA携带位于启动子CMVh之下用于胞质表达的转基因萤光素酶。DNA剂量为0.25-32μg。注射后立即将两条腿中的一只暴露于具有1Hz频率、20ms的4次脉冲的250V/cm电场中。处理5天后处死动物，根据实施例1所述方案研究每一肌肉的组织提取物中转基因的表达。在这些电转移条件下，对肌肉的肉眼观察显示，经受处理的150块肌肉中只有对组织轻微热损伤的两条痕迹。

对于每一系列小鼠(n＝10)，随平均值而变的方差改变的比较清楚地显示，转基因表达的分布是对数正态分布。对经计算证实的结果的图解分析(图7)显示，该作用随注射的DNA剂量的对数而线性变化。

应用柯克兰检验，能证明对于每一回归(有及无电转移)存在方差的同质性，这是允许用残余方差进行所有计算的一个事实。电转移条件下线性的变异对于5％的置信度是不显著的。相反，在标准条件下(非电转移条件)，线性的变异非常显著(p＜0.01)，表明DNA转移效率的显著异质性。数据显示，与有电转移的情况相比，无电转移的情况下残余方差高5倍。

对于估计的残余方差的值，为了获得转染效率比较检验的相同能力，在非电转移条件下有必要使用5倍于电转移条件的动物。该分析显示使用电转移装置的清楚的优点。为了说明2、5或10倍转基因表达的变异(95％置信度)，与非电转移条件下的165、40或25只动物相比，在电转移条件下只需注射大约33、8或5只动物。下面在表7中显示了总结这种计算的表。表7：应用电转移装置进行统计学显著的质粒表达所需动物数的计算

效率比	P＝95％	P＝90％	P＝85％	P＝75％
					2510	3385	2875	2464	1964

这些数据显示，电转移技术不仅大大提高了转染率，而且显著降低了反应的变异性。该方法和用来实施该方法的装置允许对组织转染进行严格的分析研究，以及在治疗窗内治疗性基因的可重复输送。

对每一回归获得的斜率的比较检验没有显著意义。因而可以认为两种回归存在平行性有5％的危险。相对能力的计算显示，为了获得相同的作用，与使用电转移装置相比，在标准条件下每块肌肉必须注射约250倍的DNA(243±85，95％的置信区间)。这种结果可被解释为与标准DNA注射相比，对于应用电转移注射的相同剂量DNA，转基因表达有大约500倍的增强。

本实施例显示，应用两种编码萤光素酶的质粒，在注射的质粒剂量与电转染之间建立显著的线性相关性是可能的。无电转移时这种相关性是非常不显著的。统计学分析也证明电转染组方差的显著降低。因此，应用本发明的电转移装置通过改变注射质粒的量而有效且可预测地调节转基因的表达水平是可能的。

实施例16：应用不同电极的电转移

本实施例比较了装备有两类电极—平板电极和针电极—之一的电转移装置对核酸转移效率的影响。此外，以不同的植入方向测试了针电极。

向大鼠的三头肌中注射质粒pXL2774(150μg)。如实施例1所述以1.2cm的电极间距放置板式电极。对于针电极，电极间距为0.9cm。将针电极以相等的长度***肌肉组织中，使之或者平行于或者垂直于注射部位周围肌纤维的轴。无论电极类型或其取向如何，电场条件如下：200V/cm的强度；20msec的8次脉冲；2Hz的频率。

本实验的结果显示于图8中。数据显示，无论施加电场的方式如何，电转染是可比的。应用针电极和平板电极获得相似水平的转染。此外，电转移效率似乎不依赖于相对于肌纤维方向的针电极取向。

这些数据显示，一种电转移装置可使用板式或针电极，而与电极相对于靶组织的方向无关。对于向大型肌肉施用核酸，针电极的应用可能是优选的，用来确保总电压是适中的，例如对于200V/cm的电场强度以0.5cm放置针电极为100V。然而，非侵入性板式电极对于小肌肉例如手指可能是优选的，如用于对关节炎的基因治疗的输送。

实施例17：向不同肌肉和物种中的电转移

本实施例说明，电转移装置能用来实现核酸向不同动物种的多种不同类型肌肉中的转移。

调节电转移装置以对每一物种提供如表8所述的条件。结果也显示于表8中。表8：不同物种和肌肉中核酸转染的电转移增强

物种	质粒	电场条件	颅侧胫骨肌	腓肠肌	股直肌	臂三头肌	四头肌
								小鼠	10μgpXL3031	8×200V/cm20msec，2Hz	×28	×196	×342	×1121
大鼠	150μgpXL3031	8×200V/cm20msec，2Hz	×31			×160	×13,2
								兔	200μgpXL2774	4×200V/cm20msec，1Hz	×25417			×724	×3595

显示了使用电转移装置的萤光素酶表达水平相对于对照(无电转移)的相对提高。数据为每组10块肌肉的平均值。质粒施用7天后测定萤光素酶活性。

也在猴(Macaca fascicularis)中测试了电转移。包含编码成纤维细胞生长因子1(酸性成纤维细胞生长因子)(FGF1或aFGF)基因的质粒pXL3179(图11)来源于质粒pXL2774，其中人成纤维细胞干扰素信号肽与aFGF的cDNA相融合(sp-FGF1，Jouanneau等人，1991，PNAS88：2893-2897)，将其引入置于人CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号的控制之下。通过免疫组织化学测定aFGF的表达。肌内注射500μg质粒pXL3179三天后评价阳性细胞(表达aFGF的细胞)数。电场条件为200V/cm、每次20msec的8次脉冲、1Hz的频率。对照不用电场处理(电转移-)。

本实验的结果显示于表9中。数据清楚地证明，只在使用电转移装置提高DNA向肌肉组织中转移的效率之后才能检测到aFGF蛋白表达。有趣地，在这些条件下无电转移时未检测到表达。表9：猴肌肉中aFGF表达的免疫组织化学分析

	电转移-	电转移+
			三头肌	0	0
颅侧胫骨肌	0	30
			二头肌	0	4
四头肌	0	30

对猴不同肌肉中aFGF表达的免疫组织化学分析。数据表示在有(+)与无(-)电场的施加下肌内注射500μg编码aFGF的质粒pXL3179三天后的阳性数。

实施例18：大鼠膈肌中的电转移

利用本发明的电转移装置提供转基因的长期、稳定表达的能力，在影响膈功能的退行性疾病尤其肌营养不良的治疗中具有重要的含义。

在这些实验中，麻醉(1mg/kg largactyl和150mg/kg***的混合物)后通过沿胸骨的切口露出膈。在半膈中进行注射(在50μl 20mM NaCl和5％葡萄糖中的50μg质粒pXL2774)。然后将平板电极沿注射途径置于膈平面的任一侧，电极间距为1mm。所用的电场条件如下：160V/cm或300V/cm；每次20msec持续时间的8次脉冲；1Hz的频率。注射不到1分钟后对肌肉施加电场。然后闭合动物的切口。

结果显示于表10中。表10：向大鼠膈肌中的电转移

V/cm	0	160	300
				RLU总数	48±33	920±474	51±29

萤光素酶表达的值为萤光素酶活性的平均值±S.E.M.，单位为百万RLU每块肌肉。每组N＝12。本实施例证明了在160V/cm的电场强度下施加8次20msec脉冲后膈中转基因表达的显著改善(使用曼-惠特尼非参数检验p＜0.003)。

实施例20：分泌型碱性磷酸酶基因的电转移

本实施例证明了转染并表达编码分泌型蛋白质的基因的能力。例如，在***性基因疗法中以及为了产生一种免疫应答(DNA疫苗)而使用分泌型蛋白质。在循环中发现了在此所示的浓度升高的分泌型基因，并且其存在是稳定的。

在本实施例中，向成年C57B1/6小鼠两条颅侧胫骨肌之一注射编码碱性磷酸酶的质粒pXL3010(图13)。质粒pXL3010来源于ColE1，其中引入来源于pSEAP-basic(Clontech；Genbank登录号CVU09660)的编码分泌型碱性磷酸酶(SeAP)的基因，置于CMV启动子(pCDNA3；Invitrogen，荷兰)和SV40多腺苷酸化信号的控制之下。在标准条件下进行电场的施加，即，质粒注射后施加20秒的20msec持续时间、1Hz频率及200V/cm的8次方波脉冲。7天后用商品化化学发光测定(Phosphalight，Tropix，Bedford，Massachusetts，US)对采自眼睛(眼眶后血管丛穿刺)的血样进行血清碱性磷酸酶浓度的测定。对经受或未经受电场的少数肌肉注射非编码的质粒(压载(ballast)DNA)可证实血清碱性磷酸酶的缺乏并非起因于转基因表达。

对于所注射质粒的不同量，通过在这些条件下施加电场使转基因表达提高的作用是清楚的(表11)。通过提高所注射质粒的量达到磷性磷酸酶的高血清浓度是可能的。在本实验中，相对于常规转染这一结果在注射后持续一长段时间。表11：有无电转移时SeAP从小鼠肌肉中的表达

质粒pXL3010μg	质粒pUC19μg	电转移-	电转移+
				0.1	0	0.03±0.01(n＝5)	1.23±0.21(n＝10)
0.3	0	0.05±0.02(n＝5)	1.92±0,33(n＝10)
				1	0	0.16±0.04(n＝5)	7.58±1.18(n＝10)
10	0	1.52±0.59(n＝10)	262.87±54.97(n＝10)
				400	0	15.64±10.77(n＝5)	2203.11±332.34(n＝5)
0.1	9.9	0.088±0.015(n＝5)	21.39±3.54(n＝10)
				0.3	9.7	0.90±0.49(n＝5)	95.67±16.15(n＝10)
1	9	0.26±0.09(n＝5)	201.68±32.38(n＝10)
				10	0	0.21±0.05(n＝10)	357.84±77.02(n＝10)

该表中报告血清中SeAP的平均值±S.E.M.，单位为ng/ml。

该表中报告血清中SeAP的平均值±S.E.M.，单位为ng/ml。

注射400μg质粒(在两侧并以30分钟间隔两次注射54μl中的100μgDNA)在有电转移时产生2.2μg/ml血清浓度的碱性磷酸酶，而与之相比对于对照为0.016μg。此外，压载DNA的使用进一步提高了小量质粒pXL3010(≤1μg)的电转染水平，压载DNA使得可以以恒定量的DNA作用，而与质粒量无关(每只鼠总共10μg的DNA)。

随后也进行了SeAP表达的动力学。在此情况下，DNA剂量为15μg，对每块肌肉两侧注射(每只鼠30μg)。结果显示于图9中。转染7天后，观察到由于pXL3010电转移引起的显著和稳定(至少两个月)的SeAP血清浓度。

这些结果证实，使用本发明的装置在肌肉中转移核酸使分泌型转基因的高且稳定水平的表达成为可能。因此，使用肌肉作为器官进行分泌型目的蛋白质的产生是可能的，直接作用于肌肉本身的治疗性基因(如肌营养不良蛋白基因或血管生成因子)的直接表达也是可能的。

实施例21：***基因的电转移

本实施例证明，使用本发明的装置可向肌肉转移治疗性基因，并且基因产物的表达引起一种可检测的且有意义的生理反应。在此情况下，可检测到***的表达，表达的蛋白质诱导受体动物血细胞比容的增加。

对C57B1/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧注射含有编码***的基因的质粒pXL3348(图16)。质粒pXL3348来源于质粒pXL2774，其中引入鼠***基因(NCBI：193086)置于人CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号控制之下。质粒注射后立即施加电场(200V/cm、20msec的8次脉冲、1Hz的频率)。

表12报告了本实验的结果。表12：红细胞生成素的表达及其效应

	D7时红细胞生成素的血清水平(mIU/ml)		D24时红细胞生成素的血清水平(mIU/ml)
					质粒	电转移	电转移	电转移-	电转移+
pXL3348(1μg)	0	3.0±1.6	0	1.12±0.8
					pXL3348(10μg)	0,9±0,9	61.8±15.8	0	74.1±28.9
pUC19(1μg)		0		0

	D7时血细胞比容的％增加		D24时血细胞比容的％增加
					质粒	电转移-	电转移+	电转移-	电转移+
pXL3348(1μg)	38.5±0.5	35.0±3.6	50.8±2.3	81±0.5
					pXL3348(10μg)	32.0±3.2	26.0±4.1	69.0±5.1	83.0±1.0
pUC19(1μg)		30.8±2.3		43.2±0.9

平均值±S.E.M.；每组N＝4-5只小鼠。

在D24，对于常规转染的小鼠，1μg质粒的注射与血细胞比容的轻度增加相关，对于电转染的小鼠则非常高。应用10μg质粒，对照组血细胞比容增加。对于电转染组，血细胞比容明显更高，而方差较低。应用较少量的DNA(1μg)观察到相似的结果。

实施例22：VEGF(血管内皮生成因子)基因的电转移

对C57B1/6或SCID小鼠在颅侧胫骨肌中两侧注射15μg质粒pXL3212(图11)，一种编码VEGF的质粒pCOR hVEGF。质粒pXL3212来源于质粒pXL2774，其中引入编码VEGF的cDNA(Genbank登录号HUMEGFAA)，置于人CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号控制之下。用商品化电脉冲发生器(Jouan)以20msec持续时间、200V/cm、2Hz频率的8次脉冲进行电转染。血样采自眼眶后血管丛，置于干燥试管中。质粒注射前一天及注射后7天采集血样。用Quantikine试剂盒(R&D System)进行人VEGF的免疫酶定量测定。在小鼠血清中进行补充的人VEGF系列。这些系列的结果显示于表13中。表13：小鼠血清中人VEGF的表达

小鼠株	天	转染方法	人VEGF(ng/L)
				C57BL6	D-1	简单注射	未检测到
C57BL6	D+7	电转移	393±110
				SCID	D-1	简单注射	未检测到
SCID	D+7	电转移	99±26

C57B1/6或SCID小鼠中VEGF的血清浓度(ng/升)。质粒注射前一天从小鼠中获得对照鼠血清。实施例23：凝血因子IX基因的电转染除了对C57BL6或SCID小鼠中每块肌肉注射15μg编码凝血因子IX的质粒pCor hFIX(pXL3388；图12)外，本实验条件与实施例22相同。pXL3388质粒来源于质粒pXL2774，其中引入编码人因子IX(克里斯马斯氏因子；Genbank登录号HUMFIXA)的cDNA，置于CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号控制之下。电转移条件如下：200V/cm、2Hz频率、20msec持续时间的8次脉冲。质粒注射7天后测定因子IX水平。血样采自眼眶后血管丛，置于含有柠檬酸三钠的试管中，并将试管贮存于冰中。

下面的表(表14)显示，只在如下C57BL6或SCID小鼠的血液中发现了人因子IX，其颅侧胫骨肌注射有pXL3388质粒，并使用本发明的电转移装置施加电场。表14：人因子IX的表达

小鼠株	注射	电转移	人因子IX(μg/L)
				C57BL/6	pXL3388	+	69±12
C57BL/6	pXL3388	-	未检测到
				C57BL/6	NaCl 0.9％	+	未检测到
SCID	pXL3388	+	66±5
				SCID	pXL3388	-	未检测到

C57B1/6或SCID小鼠中因子IX的浓度。

在不使用本发明的电转移装置时，在小鼠血液中无法检测到人因子IX。

实施例24：酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因的电转移

除了在C57BL6或SCID小鼠中每块肌肉注射15μg编码FGF的质粒pCorCMV aFGF(pXL3096；图14)外，实验条件同实施例22一样。通过引入形成三股螺旋的序列，pXL3096质粒从质粒pXL2774(TH；Wils等人，1997，基因治疗4：323-330)衍生得到，其中编码人成纤维细胞干扰素信号肽与编码FGF1的cDNA间融合体(sp-FGF1；Jouanneau等人，见前文)的基因位于CMV-IE启动子控制之下，随后是HSV胸苷激酶的转录的、非翻译的前导序列，和SV40多腺苷酸化信号。使用下列电转移条件：20msec持续时间的8次脉冲，200V/cm，2Hz频率。用免疫组织化学法显示FGF的存在。

图10显示C57B1/6小鼠转染的结果，表15显示SCID小鼠的结果。对于电转染的肌肉，在随机选择的截面中表达FGF的纤维数总是明显高于只接受pXL3096质粒简单注射的对照肌肉。电转染后FGF的表达在D8达到最大。在D21和D35，对于对照组，FGF的存在实际上不可检测，而在电转染组中观察到大量阳性纤维。表15：SCID小鼠中aFGF的表达

	电转移	颅侧胫骨肌(左)	颅侧胫骨肌(右)
				pXL3096(15μg)	++	600700	450300
pXL3096(15μg)	---	330	000
				pXL3096(1.5μg)	+++	8020110	7035100
pXL3096(1.5μg)	--	00	01

对每个小鼠测定肌肉截面中通过免疫组织化学检测的aFGF阳性纤维数。肌肉截面从肌肉中部获得。

通过免疫组织化学显示的阳性纤维数确定，几乎只在接受电转移装置处理的小鼠中才检测到aFGF的表达。此外，在较低DNA剂量以及较高剂量时aFGF表达都是可检测的。

实施例25：神经营养因子-3(NT3)基因的电转移

对5周龄C57B1/6和幼Xt/pmn小鼠在颅侧胫骨肌中单侧注射12.5μg编码神经营养因子NT3的质粒pXL3149(图14)。pmn小鼠是肌萎缩性侧索硬化(ALS；Lou Gehrig氏病)的一种模型，其特征在于早期和快速的运动神经元退化，及大约40天的平均预期寿命。质粒pXL3149来源于质粒pXL2774，其中引入鼠NT3基因(Genbank登录号MMNT3)，置于人CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号控制之下。小鼠处理7天后在PBS缓冲液中研磨肌肉，离心(12000×g)制备上清液，研究其中NT3的表达，并通过ELISA测定(Promega试剂盒)定量。

C57B1/6小鼠接受12.5μg质粒DNA注射。半数小鼠在注射后立即经受电场(250V/cm，1Hz频率、20ms的4次脉冲)。对20块肌肉的平均值(按95％置信区间计算)为，当没有电转移时的77±11pg/肌肉，有电转移时为2.7±0.9ng/肌肉。未测定内源NT3水平。

对于4-5天龄Xt/pmn杂合小鼠中NT3的表达发现相似的数据。这些小鼠在不同肌肉多点注射(腓肠肌，25μg；颅侧胫骨肌，12.5μg)后接受每只动物130μg DNA的注射。使用下列电转移条件：20msec持续时间的4次脉冲，500V/cm，1Hz。质粒施用和电场施加7天后在这些小鼠中检测到NT3。表16报告了该实验的结果。表16：Xt/pmn小鼠中NT3的表达

	NaCl 0,9％(对照)		pXL3149
					电转移	-	+	-	+
血浆	0(n＝2)	0(n＝2)	46±10(n＝4)	1599±639(n＝4)
					腓肠肌	3619±102(n＝4)	1619±150(n＝2)	3647±1078(n＝8)	19754±3818(n＝8)
颅侧胫骨肌	1415±363(n＝4)	1453±375(n＝2)	1400±155(n＝8)	16826±3135(n＝8)

NT3的平均值±S.E.M.(pg每块肌肉或pg/ml血浆)。

在此处所试的实验条件下，在腓肠肌和颅侧胫骨肌中检测到基础水平的NT3。在标准DNA转移条件下，质粒pXL3149的注射提高了NT3表达水平。当使用本发明的装置时，观察到组织和血浆中NT3量的极大增长。因此，对于施用的任意量的DNA质粒，为提高转染效率应用本发明的装置大大提高了肌肉中和血浆中表达的转基因产物的量。这种提高对于NT3表达特别重要，用于实现神经营养性基因治疗。

实施例26：人生长激素基因的电转移

C57B1/6小鼠在颅侧胫骨肌中单侧接受质粒pXL3353(图15)或质粒pXL3354(图15)注射(10μg)。质粒pXL3353来源于质粒pXL2274，其中引入基因组人生长激素基因(从转录起始信号延伸到BamHI位点的hGH的XbaI/Sph片段，所述位点在多腺苷酸化信号后224个碱基对处)，置于人CMV-IE启动子和SV40多腺苷酸化信号控制之下。使用下列引物进行30个循环的扩增后通过反转录从人垂体mRNA文库中获得hGH cDNA：

5’互补寡核苷酸：

5’-GGGTCTAGAGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGAC-3’

该寡核苷酸含有一个Kozak XbaI序列。

3’互补寡核苷酸：

5’-GGGATGCATTTACTAGAAGCCACAGCTGCCTC-3’

该寡核苷酸含有一个NsiI位点和终止密码子。

将扩增的片段克隆到质粒pCR2.1(TA克隆试剂盒，Invitrogen)中并测序。将含有hGH cDNA的681个碱基对的XbaI/NsiI片段与pSL3353的XbaI/NsiI片段相连接，产生质粒pXL3354。

电转移条件如下：200V/cm；20msec持续时间的8次脉冲；1Hz频率。质粒DNA注射后立即施加电场。小鼠处理7天后检测12000×g离心后缓冲PBS中研磨肌肉上清液中hGH的存在。通过ELISA(BoehringerManheim)测定hGH的量。

表17中报告了该实验的结果。表17：人生长激素的表达

	基因组hGH注射(pXL3353)		hGH cDNA注射(pXL3354)
					电转移	-	+	-	+
颅侧胫骨肌	87.1±9.3(n＝10)	1477.6±67.6(n＝10)	2820.0±487.5(n＝10)	15739.1±915.5(n＝10)

hGH表达的平均值(皮克/肌肉)±S.E.M.。

这些结果显示，本发明的电转移装置的应用使人生长激素的更高表达成为可能。无论是施用基因组克隆还是编码hGH的cDNA，都观察到这种表达的增强。

实施例27：疫苗转基因的电转移

本实施例报告，本发明的电转移装置增强了用于基因(或DNA)接种的基因输送。在本实施例中，使用下列产品：VR-HA，一种含有流感病毒(A/PR/8/34株)血凝素基因的质粒DNA。mVRgBDT是一种含有人巨细胞病毒(Towne株)糖蛋白B(gB)基因的质粒DNA。其它产品从市场供应商处获得：***、噻拉嗪和生理氯化钠溶液(NaCl 0.9％)。用9周龄雌性Balb/c小鼠进行本实验。在实验前随机分配来自不同笼子的小鼠(“随机化”)。

使用示波器和一种商品化电脉冲发生器(矩形或方形)(Electropulsator PS 15，Jouan，法国)。所用的电极是间距5mm的不锈钢板式电极。

用***和噻拉嗪的混合物麻醉小鼠。用Hamilton注射器纵向穿过皮肤向左腿颅侧胫骨肌中注射质粒溶液(50μl 20μg/ml或200μg/ml于NaCl 0.9％中的溶液)。用导电凝胶覆盖两个电极，将注射的腿置于电极之间与其接触。注射20秒钟后，用方波脉冲发生器垂直于肌肉轴施加电脉冲。用示波器监测电场：200V/cm，20ms持续时间，1Hz频率，8次连续脉冲。

为了评价免疫应答的刺激，按照下列免疫方案：

D0→采集免疫前血清标本

D1→第一次注射，有或无电转移

D21→采集免疫血清标本

D22 →强化注射，有或无电转移

D42→采集免疫血清标本

D63→采集免疫血清标本

血清标本采自眼眶后窦。用ELISA测定特异性抗体的量。用单侧注射的10只动物在10个点测试每一实验条件。

表18中显示针对流感血凝素的抗体效价的结果。表18：抗流感血凝素抗体反应

	电转移	D0	D21	D42	D63
						VR-HA(1μg)	-	＜50	132±739	1201±4380	1314±2481
VR-HA(1μg)	+	＜50	1121±1237	10441±7819	8121±5619
						(p)			(0.0135)	(0.0022)	(0.0033)
VR-HA(10μg)	-	＜50	781±666	5113±16015	4673±8238
						VR-HA(10μg)	+	＜50	4153±2344	74761±89228	41765±52361
(p)			(0.0002)	(0.0005)	(0.0007)

在不存在(-)或存在(+)电转移装置所提供的电场时，1μg或10μgVR-HA DNA注射后获得的针对流感血凝素的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(对于注射1μg DNA并暴露于电场的组N＝8，在D63检测)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较注射DNA然后用电场处理或不处理的组，获得值(p)。

这些结果显示，在用电转移装置处理的组中针对流感血凝素的抗体效价大大提高，大约10倍。实际上，只接受1μg DNA并用电转移装置处理的小鼠比接受10μg DNA但不用电场处理的小鼠具有更高的抗血凝素效价。

图19显示针对CMV糖蛋白B的抗体反应的结果。表19：抗CMV糖蛋白B抗体反应

	电转移	D0	D21	D42	D63
						VR-gB(10μg)VR-gB(10μg)(p)	-+	＜50＜50	73±138200±119(0.0558)	755±17663057±1747(0.0108)	809±13632112±1330(0.0479)

在不存在(-)或存在(+)电转移装置所提供的电场时，10μg VR-gB DNA注射后获得的针对CMV糖蛋白B的抗体效价。该结果是每组10只动物的几何平均值(N＝9，暴露于电场)±标准误。通过用非参数曼-惠特尼检验两两比较注射DNA然后用电场处理或不处理的组，获得值(p)。

这些结果显示，与对照组相比，用电场处理的组中到第42天(D42)抗-gB效价升高了4倍。此外，如以前所观察到的，与未处理的(对照)小鼠相比，用电转移装置处理的小鼠的变异(标准误)大大降低。

实施例28：用于肿瘤细胞转染的电转移装置

下列实施例说明了电转移装置的一种应用，用来增强核酸向肿瘤组织中的输送。特别地，通过改进本发明的电转移装置，来提供比为核酸向肌肉中的电转移所优选的更高的电压，能实现肿瘤细胞(及大多数其它细胞)的有效体内转染。本实施例证明了电转移对不同肿瘤的作用，这些肿瘤或者是人源的，植入裸(免疫缺陷)鼠中，或者是鼠源的，植入C57B1/6(免疫活性)小鼠中。已证明了低强度电场脉冲对以下两方面的作用：A)通过肿瘤内注射的质粒DNA转染，和B)肿瘤内注射后转基因编码的蛋白质向血浆中的分泌。

                      材料与方法

将肿瘤移植物植入重18-20g的雌性裸鼠或C57B1/6小鼠的一侧。20mm³人肺癌(H1299)或结肠腺癌(HT29)肿瘤植入裸鼠中。鼠纤维肉瘤(LBP)细胞(10⁶个细胞)或黑素瘤(B16)或肺癌(3LL)肿瘤(20mm³)植入C57B1/6小鼠中。根据肿瘤大小将小鼠分类，并分为均匀的组。

用***和噻拉嗪的混合物麻醉小鼠。在肿瘤达到目标体积后肿瘤内注射质粒pXL3031(胞质萤光素酶)或pXL3031(分泌型碱性磷酸酶)。用Hamilton注射器向肿瘤中心纵向注射质粒溶液(40μl 250μg/ml于20mMNaCl、5％葡萄糖中的DNA溶液)。用导电凝胶覆盖肿瘤的侧表面，并将肿瘤置于两个电极之间，注射20-30秒后，用方形脉冲发生器施加电脉冲。用示波器控制电压强度、单位为毫秒的持续时间和单位为赫兹的频率为200-800伏特/cm、20msec和1赫兹释放的8次脉冲。使用示波器和一个商品化电脉冲(矩形或方形)发生器(Electro-pulsateur PS15，Jouan，法国)。电极为以0.45-0.7cm分隔的不锈钢板式电极。

为了评价萤光素酶的肿瘤转染，质粒注射两天后使小鼠(一般每实验组10只小鼠，取决于条件)安乐死。取出肿瘤，称重，并在裂解缓冲液中压碎。离心获得的悬液，以获得澄清的上清液。用一种商品化发光计测定10μl上清液中的萤光素酶活性，该发光计中自动加入底物。其结果以每一肿瘤的总RLU(相对光单位)表示。

在DNA注射后的第1、2和8天(D1、D2、D8)，如上文实施例20所述测定分泌型碱性磷酸酶(SeAp)的血浆水平。

                     结果与讨论

向人肺癌肿瘤中的电转移。在第一个实验中，使用通常用于肌内基因电转移的条件：200V/cm的电场，1赫兹频率的8次脉冲，并将获得的结果与在300-500伏特/cm的较高电压下获得的结果相比较。第二个实验的目的在于确定为了获得最大转染而必须施加的最佳电压条件，或者400-800伏特/cm的电压。结果显示于表20中。表20：向人肺癌肿瘤中的电转移

RLU/肿瘤
				试验1	试验2
伏特/cm	平均值           SEM	平均值           SEM
			0200300400500600800	32 807 758      6 790 565129 744 454     39 119 425585 033 326    134 810 5345 266 632 345 1 473 785 460	44  723 317    10 163 3188  488 242 519 3 881 651 20114 201 644 540 6 162 551 2697  401 041 930 5 323 128 04711 884 115 963 4 048 340 474

将质粒pXL3031注射入在雌性裸鼠中达到200-300mm³目标体积的H1299人肺癌肿瘤中。报告形式为萤光素酶表达的平均值与SEM。

根据表20可以看出，相对于随后不施加电场而注射DNA的对照组：

·以依赖于200-400伏特/cm的施加电压的方式增强基因转移，直到达到平台期，这对应于获得的最大转染，开始于500伏特/cm；

·在较高电压(600和800伏特/cm)下，分别引起皮肤或较深的灼伤；然而，转基因的表达不降低。

·电转移引起的基因转移的增强为大约240-320倍。

向人结肠腺癌肿瘤中的电转移。表21说明了两个实验的结果。与无电转移的对照组相比，强度为600伏特/cm的电场的施加使得达到最佳转染率，而与无电转移时的转染水平无关。转染分别提高了6-23倍，从400到600伏特/cm.结果相当相似。表21：向人结肠腺癌肿瘤中的电转移

RLU/肿瘤
				试验1	试验2
伏特/cm	平均值         SEM	平均值           SEM
			0400500600	4 043 062   1 827 23716 037 136   5 420 57214 096 640   7 629 21224 223 872   9 217 062	634 999      338 3115 537 359    3 571 43314 607 850    6 392 841

将质粒pXL3031注射入在雌性裸鼠中达到100-200mm³目标体积的HT29人结肠腺癌肿瘤中。报告形式为萤光素酶表达的平均值与SEM。该实验中电极间距为0.45cm。

向鼠纤维肉瘤肿瘤中的电转移。表22说明了两个实验的结果。与无电转移的对照组相比，强度为300-600伏特/cm的电场的施加使基因转移提高了30-70倍，与所施加的电压无关。表22：向鼠纤维肉瘤肿瘤中的电转移

RLU/肿瘤
				试验1	试验2
伏特/cm	平均值            SEM	平均值          SEM
			0300400500600	581 270       348 64526 296 355    14 811 82642 498 832    31 152 74416 966 612    12 754 188	394 922     129 39511 579 942   4 615 33210 431 574   3 495 1186 034 954   1 818 46510 952 214   7 093 932

将质粒pXL3031注射入在雌性C57B1/6小鼠中达到100-200mm³目标体积的鼠LPB纤维肉瘤肿瘤中。报告形式为萤光素酶表达的平均值与SEM。

鼠黑素瘤肿瘤的电转移。表23中说明其结果。与无电转移的对照组相比，强度为500伏特/cm的电场的施加使基因转移提高了24倍。表23：鼠黑素瘤肿瘤的电转移

RLU/肿瘤
		伏特/cm	平均值         SEM
0300500600	1 318 740      667 58814 275 486    7 625 26232 249 218   12 605 04117 215 505    6 241 666

将质粒pXL3031注射入在雌性C57B1/6小鼠中达到200-300mm³目标体积的鼠B16黑素瘤肿瘤中。报告形式为萤光素酶表达的平均值与SEM。

鼠肺癌肿瘤的电转移。该实验结果报告于表24中。表24：鼠肺癌肿瘤的电转移

RLU/肿瘤
		伏特/cm	平均值           SEM
0300500600	121 080        37 3223  715 877     2 936 873470 499 612   237 588 44353  275 350    23 857 181

将质粒pXL3031注射入在雌性C57B1/6小鼠中生长5天后达到30mm³目标体积的鼠3LL肺癌肿瘤中。报告形式为萤光素酶表达的平均值与SEM。

强度为500伏特/cm的电场的施加使基因转移最优地提高了3885倍。这些令人印象深刻的结果与如下事实有关：与以前试验的其它肿瘤相比，在无电转移的条件下这些肿瘤极难被裸DNA转染。

分泌型转基因向人肺癌肿瘤中的电转移。该实验结果显示于表25中。表25：分泌型转基因向人肺癌肿瘤中的电转移

	血浆碱性磷酸酶水平
			评价时间	0伏特/cm(平均值±SEM)	500伏特/cm(平均值±SEM)
D1D2D8	1.42±0.071.40±0.011.31±0.01	8.90±1.749.04±1.551.67±0.12

将质粒pXL3031(表达SeAP)注射入在雌性裸鼠中达到200-300mm³目标体积的人H1299肺癌肿瘤中。报告萤光素酶表达的平均值与SEM。施加500V/cm的单一电场，并在质粒注射1天、2天和8天后检测血浆中的SeAP水平。

该实验结果证明了在电转移条件下肿瘤细胞转染后血浆中SeAp水平的惊人、短暂的升高。对肿瘤施用免疫刺激基因如GM-CSF或IL-2可能引起有效量细胞因子的产生。而且，这些数据与以上报告的萤光素酶表达数据相结合，提示含***基因如HSV-胸苷激酶的分泌型细胞因子的施用将引起强抗肿瘤反应。此外，SeAP的数据提示，抗血管生成基因如尿激酶的氨基端片段(ATF)或制管张素(或endostatin)的电转移介导的转染也是一种有效的肿瘤基因疗法。

该数据进一步证明，用于治疗性基因向肿瘤细胞中电转移的装置提供400-600伏特/cm的最适电场强度，可能最佳为500V/cm±10％(即，450-550V/cm)。

本发明的范围不限于在此所述的特定实施方案。实际上，从前面的叙述和附图来看，除在此所述的之外本发明的多种修改对于本领域的技术人员将是显然的。这些修改在附加的权利要求书的范围之内。

应当进一步理解，为核酸或多肽指定的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量或分子量值都是近似的，并为叙述而提供。

在此引用了许多出版物，其公开内容全部引入作为参考。

Claims (37)

1.一种用于向多细胞真核生物细胞中进行体内核酸转移的***，其中通过直接向组织施用或通过局部或全身施用使组织细胞与待转移的核酸接触，并且通过对组织施加一次或多次强度为1-600伏特/cm的电脉冲来确保转移，该装置包括：

a)一种电脉冲发生器，其中该电脉冲发生器产生脉冲时间长于1毫秒且强度为1-600伏特/cm、频率为0.1-1000Hz的电脉冲；和

b)与电脉冲发生器连接的电极，用来在与电极接触的组织中产生电场。

2.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器产生强度为1-400伏特/cm的脉冲。

3.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器产生强度为30-300伏特/cm的脉冲。

4.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器产生长于10毫秒的脉冲时间。

5.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器产生2-1000次的脉冲。

6.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器彼此之间不规律地产生脉冲，由此描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。

7.根据权利要求6的***，其中描述电场随时间变化的函数的积分超过1kV·msec/cm。

8.根据权利要求7的***，其中所述积分超过或等于5kV·msec/cm。

9.根据权利要求1的***，其中电脉冲发生器产生选自方波脉冲、指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波的脉冲。

10.根据权利要求1的***，其中该电脉冲发生器产生方波脉冲。

11.根据权利要求1的***，其中一个电极是用来置于待处理组织上的外部电极。

12.根据权利要求1的***，其中一个电极是可植入待处理组织中的内部电极。

13.根据权利要求1的***，其中一个电极是用来置于待处理组织上的外部电极，一个电极是可植入待处理组织中的内部电极。

14.根据权利要求13的***，其中确定该外部电极的尺寸使之接触患者身体邻近大肌肉的外部部分。

15.根据权利要求14的***，其中该电极是一种平端平板电极。

16.根据权利要求14的***，其中该电极是一种半圆柱形平板电极。

17.根据权利要求1的***，其中一个电极是动脉内或静脉内电极。

18.根据权利要求12的***，其中所述内部电极是一种注射器***，它使得能同时施用核酸与电场。

19.根据权利要求18的***，其中一个电极是用来置于待处理组织上的外部电极。

20.根据权利要求1的***，其中所述电极是一种不锈钢电极。

21.一种用于向多细胞真核生物细胞中进行体内核酸转移的改进型装置，其中该装置包括用于产生电脉冲的装置，它与在组织中体内产生电场的电极相连接，其中这种改进包括改进用于产生电脉冲的装置，以产生时间超过1毫秒、强度为1-600伏特/cm、频率为0.1-1000Hz的脉冲。

22.权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生强度为1-400伏特/cm的脉冲。

23.权利要求21的装置，它是一种柔性的导管装置。

24.权利要求21的装置，它是一种通过组织穿入式电极向组织中植入核酸的装置。

25.权利要求24的装置，其中该组织穿入式电极为一种针。

26.权利要求21的装置，它是一种向患者表面组织细胞中转移核酸的装置。

27.权利要求21的装置，其中通过调整电压门使之不超过相当于600伏特/cm的电压，使得用于产生电脉冲的装置适于产生1-600伏特/cm的脉冲。

28.权利要求27的装置，其中将电压设置为恒定电压，并将电极以恒定间距安置。

29.权利要求21的装置，其中通过在装置上贴标签使之不超过相当于600伏特/cm的电压，而使得用于产生电脉冲的装置适于产生1-600伏特/cm的脉冲。

30.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生强度为30-300伏特/cm的脉冲。

31.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生强度为400-600伏特/cm的脉冲。

32.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生长于10毫秒的脉冲时间。

33.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生2-1000次的脉冲。

34.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置彼此之间不规律地产生脉冲，从而描述依赖于脉冲时间的场强的函数是可变的。

35.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生选自方波脉冲、指数衰减波、短时振荡单极波和短时振荡双极波的脉冲。

36.根据权利要求21的装置，其中用于产生电脉冲的装置产生方波脉冲。

37.根据权利要求21的装置，其中电极为一种不锈钢电极。

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