CN1246126A - 抗菌活性多肽 - Google Patents

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CN1246126A CN97181783A CN97181783A CN1246126A CN 1246126 A CN1246126 A CN 1246126A CN 97181783 A CN97181783 A CN 97181783A CN 97181783 A CN97181783 A CN 97181783A CN 1246126 A CN1246126 A CN 1246126A
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Abstract

选自肽(Ⅰ)的多肽和它的功能衍生物以及药用可接受盐；包括一种或多种这些多肽的药物组合物；以及使用此类多肽抑制动物体内微生物生长的方法。FLPLIGRVLSGIL－酰胺，LLPIVGNLLKSLL－酰胺，LLPILGNLLNGLL－酰胺，LLPIVGNLLNSLL－酰胺，VLPIIGNLLNSLL－酰胺，FLPLIGKVLSGIL－酰胺，FFPVIGRILNGIL－酰胺，LSPNLLKSLL－酰胺，LLPNLLKSLL－酰胺，FVQWFSKFLGRIL－酰胺。

Description

抗菌活性多肽
本发明涉及用于治疗的新多肽以及它们的功能衍生物和药用可接受盐。新的多肽各自本身或者一种或多种肽的结合具有抗细菌或真菌的用途。
蛙的皮肤分泌物含有许多不同类型的抗细菌肽(Barra，D.&Simmaco，M.(1995)在生物技术动态(Trends Biotechnol.)13，205-209发表了综述：两栖动物的皮分泌物：抗菌肽的潜在资源)。特别是，已经从蛙属的几个种中分离到多种这样的肽。它们在靠近COOH-末端都含有2个半胱氨酸残基，形成分子内的二硫化物键。可以将这些肽区分为4种不同的类型。一类是brevinin 1系列，包括来自Ranabrevipoda porsa的brevinin 1(Morikawa，N.，Hagiwara，K.&Nakajima，T.(1992)从蛙Rana brevipoda porsa皮中获得的独特的抗菌肽Brevinin 1和Brevinin 2，Biochem.Biophys.Res.Commun.189，184-190)，从侧褶蛙(Rana esculenta)中获得的Brevinin 1E(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽.编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269，11956-11961)，从牛蛙(Rana catesbeiona)中获得的ranalexin(Clark，D.P.，Durell，S.，Maloy，W.L.& Zasloff，M.(1994)，Ranalexin，来自牛蛙(Rana catesbeiana)皮的一种新的抗菌肽，结构上类似细菌抗生素，多粘菌素，J.Biol.Chem.269，10849-10855)，以及从粗皮蛙(Rana rugosal)中获得的gaegurin 5和6(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，从朝鲜蛙，粗皮蛙皮中获得的抗菌肽生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)205，948-954)。这些肽是由20-24个氨基酸残基组成。除它们有抗菌活性外，Brevinin 1E和ranalexin也有高溶血活性。第2类是Brevinin 2肽，其含有29-34个氨基酸。除来自R.brevipoda porsa的Brevinin 2外(Morikawa，N.，Hagiwara，K.& Nakajima，T.(1992)，从蛙Rana brevipoda porsa皮中获得的独特的抗菌肽Brevinin-1和Brevinin-2，Biochem.Biophys.Res.Commun.189，184-190)，从侧褶蛙中获得的几种肽(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)，从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，gaegurins 1-3(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)从朝鲜蛙，粗皮蛙皮中获得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.205，948-954)以及从粗皮蛙中获得的皱褶菌素A和B(Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)，新的抗菌肽，从粗皮蛙皮中获得的皱褶菌素A，B和C的分离和鉴定，Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)都属于这一类。第3类是从侧褶蛙中获得的37个残基的肽esculentin 2(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)，从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽.编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)和gaegurin 4(Park，J.M.，Jung，J.-E.& Lee，B.J.(1994)，从朝鲜蛙，粗皮蛙皮中获得的抗菌肽，Biochem.Biophys.Res.Commun.205，948-954)以及从粗皮蛙中获得的皱褶菌素C(Suzuki，S.，Ohe，Y.，Okubo，T.，Kakegawa，T.& Tatemoto，K.(1995)，新的抗菌肽，从粗皮蛙皮中获得的皱褶菌素A，B和C的分离和鉴定，Biochem.Biophys.Res.Commun.212，249-254)。最后一类是从侧褶蛙皮分泌物中获得的esculentin 1(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，它是目前已鉴定的所有蛙属肽中抗菌活性最高的46个氨基酸的肽。此外，它对白色念珠菌(Candidaalbicans)，酿酒酵母(Saccharomyces core visiae)和绿脓杆菌(Pseudomonas areuginosa)也有抗菌活性。
本发明的目的之一是提供相对小的抗菌活性多肽。
本发明的另一个目的是提供具有抗细菌或真菌用途的新的多肽。
本发明的再一个目的是提供含有包含在药用可接受载体中的一种或多种这样多肽的药用组合物。
本发明还有一个目的是提供一种抑制动物如哺乳动物包括人体内微生物生长的方法。
对于通过以下本发明内容公开所明了的本发明的这些目的以及其他目的提供下面新的肽：
F L P L I G R V L S G I L-酰胺
L L P I V G N L L K S L L-酰胺
L L P I L G N L L N G L L-酰胺
L L P I V G N L L N S L L-酰胺
V L P I I G N L L N S L L-酰胺
F L P L I G K V L S G I L-酰胺
F F P V I G R I L N G I L-酰胺
L S P N L L K S L L-酰胺
L L P N L L K S L L-酰胺
F V Q W F S K F L G R I L-酰胺
以下是特别优选的多肽：
F L P L I G R V L S G I L-酰胺
L L P I V G N L L K S L L-酰胺
F L P L I G K V L S G I L-酰胺
F F P V I G R I L N G I L-酰胺
F V Q W F S K F L G R I L-酰胺
上述多肽的功能性衍生物和药用可接受盐也包括在本发明范围内。
本发明多肽各自本身可单独使用或与两种或多种多肽结合使用。
这类多肽可应用于治疗，例如抗菌使用，包括抗细菌或真菌使用。
本发明也提供了使用一种或多种上述公开的多肽来制造抗菌活性药物。
而且，本发明提供了一种药物组合物，包括活性组分即有效剂量的一种或多种上述多肽和药用可接受载体或稀释剂。所说的载体或稀释剂适于口服，静脉，肌肉或皮下给药。
本发明也提供了cDNA克隆，其序列是选自以下公开的克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17所显示的序列。
最后，本发明提供了一种抑制动物如哺乳动物包括人体内微生物生长的方法，包括给与抗微生物侵染引起紊乱的动物受者抗菌量的一种或多种上述多肽或其组合物的步骤。
这种方法可以通过口服给药缓释形式的上述组合物直接作用于肠。此方法也可以通过注射可注射剂量形式的组合物给药。
关于“它们的功能衍生物”的表述，已知在本发明技术领域使用小的氨基酸替代物制成的多肽并不影响或实际上并不影响多肽的功能。根据本技术领域常规方法成功地确定可接受的替代物。这样，所有的多肽具有实际上同样的氨基酸序列，实质上同样的螺旋结构和实质上一样的生物活性，例如抗菌和溶解活性，这些都在本发明的范围内。
本发明多肽的药用可接受盐也在本发明的范围内。这些盐可由技术人员以常规方法制成。例如根据常规方法可制备多肽的碱盐。当包括权利要求书的本发明公开中使用术语多肽时，是指包括多肽的功能性衍生物和药用可接受盐。
依据本发明活性多肽可以配制在人或兽药中使用，用于治疗或预防用途。活性制剂通常以口服，直肠或非经肠道给药，例如通过药物制剂形式或组合物形式注射，所述药物制剂或组合物包含活性成分与药用可接受载体结合，载体可以是固体，半固体或液体，或如口服给药时使用胶囊形式。也可以采用局部用药方式。药物制剂的实例可以是已知的片剂，滴剂，溶液和栓剂。通常，活性成分构成制剂的小部分，例如约0.1-约50％重量份。
为制备应用于口服的剂量单位形式的药物组合物，本发明多肽可以与固体，粉末或其他载体混合，例如乳糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露糖醇，淀粉如马铃薯淀粉，玉米淀粉，millopectine，纤维素衍生物或明胶，以及可以包括润滑剂如硬脂酸镁或钙，或由聚乙二醇蜡压缩成片剂或糖衣药丸。剂量单位也可以肠溶衣包被形式存在。
使用几层载体或稀释剂可制成缓释片剂。
将口服或注射使用的液体制剂做成elexirs，糖浆或悬浮液形式，例如含有0.1-20％重量份的活性物质，糖以及乙醇，水，甘油，丙二醇和可能的其它常规类型的添加剂的混合物溶液。
活性成分的给药剂量在一宽范围内变化并且取决于不同因素例如紊乱的严重程度，病人的年龄和体重，并且可以分别进行调整。
根据本发明，在寻找新的多肽过程中，使用了哈士蟆(Ranatempororia)皮，这种动物是一种在欧洲中部许多地方发现的红色蛙。从这种蛙皮中获得的cDNA文库是用编码来自侧褶蛙的esulentin 1前体信号肽DNA片段筛选的。由此方法用潜在编码新肽前体的***片段分离出几个克隆。从哈士蟆皮分泌物中分离得到的新肽称为temporins，发现其自身或协同结合使用时有生物活性如抗细菌活性。
通过下面公开的非限定实施例描述本发明。参见附图解释发明内容，其中：
图1表示3个克隆的核苷酸序列和存在其中的***片段以及推导出的氨基酸序列；和
图2表示哈士蟆皮分泌物的反相HPLC图。
                     材料和方法
酶和试剂。Merck公司的分析纯化学试剂，Carlo Erba公司的HPLC用溶剂，Perkin Elmer公司的序列分析用化学试剂。Difco公司的抗菌测定培养基，Sigma公司的琼脂糖(A6013)。Boehringer Mannheim公司的限制性内切酶和DNA修饰酶，Pharmacia公司的脱氧核糖核苷酸。DNA序列用“序列测定试剂盒”(version 2.0，U.S.Biochemicals)测定，使用[a-35S]dATP。合成的肽买自TANA实验室(Huston，USA)。
RNA的分离和克隆方法。为此研究，使用了2个样品的哈士蟆皮。通过oligo(dT)-纤维素亲和色谱法分离出富含poly(A)的RNA以及根据Richter等人的方法(1990b)获得cDNA文库(Richter，K.，Egger，R.& Kreil，G.(1990b)编码Bombina variegata皮中韩蛙皮素前体的cDNA分子克隆，FEBS Lett.262，353-355.)。
包括约10000个克隆的cDNA文库是用Hind III酶切esculentin 1cDNA获得的240bp片段筛选出的(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)，从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离(J.Biol.Chem.269，11956-11961)。这一片段编码esculentin 1前体的前区(prepro-region)。探针用随机引物法标记(Boehringer Mannheim)。55℃在100mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，含850mMNaCl，1mMEDTA，10xDenhardt’s溶液，0.1％SDS和100mg/ml酵母tRNA进行杂交16小时。在50℃用SSPE(0.3M NaCl，20mM磷酸钠，pH7.4，2mMEDTA)，0.2％SDS冲洗滤纸(Whatman 541，11cm×11cm)两次，每次15分钟。选择阳性克隆并用限制性内切酶裂解分析和进行核苷酸测序。
RNA印迹分析。用含0.8M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶电泳分离出富含Poly(A)RNA(5mg)(Arrand，J.E.(1985)在核酸杂交中制备核酸探针：实验方法(Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds)pp 17-45，IRL Press，Oxford)并直接杂交到Nytran sheets(Schleicher & Schuell)。Rt-17克隆的***片段用随机引物法标记并用作RNA印迹的探针。在55℃用0.1x SSPE，0.1％SDS冲洗滤纸，然后作放射自显影。
皮分泌物的收集和提纯。在奥地利萨耳斯堡捕获哈士蟆的3个样品(每个30-35g)。在实验室的terrarium中保存1年，喂养黄粉虫幼虫。用温和电击法(12V，脚到头)每间隔3周收集皮分泌物。通过用10ml 0.05％(体积比)乙酸清洗每只蛙的背部区域，从蛙的体表面收集分泌物。3只蛙的分泌物合并并冻干。通过Beckman model 332系列的HPLC分馏适合等分，使用反相柱(Aquapore RP-300，7mm×250mm.Applied Biosystems)，用含10-70％乙腈/异丙醇(4∶1)的0.2％(体积比)三氟乙酸梯度洗脱，流速1.8ml/min。肽的洗脱液在220nm用Beckman 165分光光度计检测。收集峰部分的洗脱液并冷冻干燥。取少量的各峰部分的洗脱液作丹磺酰氯衍生作用和反相HPLC分离后进行N-末端分析(Simmaco，M.，De Biase，D.，Barra，D.& Bossa，F.(1990b)，使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反相高压液相色谱技术进行氨基酸自动分析和酰胺化残基测定(J.Chromatogr.504，129-138)。使用大孔的C18柱(4.6mm×150mm，Supelco)，上述同样溶剂***作适当改变的梯度进行肽的进一步提纯。
结构分析。氨基酸分析是在6 N HCl汽相水解肽(1-2nmol)24小时后进行，采用Beckman System Gold分析仪，其装有离子交换柱和水合茚三酮衍生装置。用Perkin-Elmer model AB476A测序仪自动控制的Edman降解确定肽的序列。在某些情况下，通过质谱分析和/或羧基肽酶Y消化确定C-末端的酰胺化状态(Simmaco，M.，De Biase，D.，Barra，D.& Bossa，F.(1990b)使用丹磺酰氯柱前衍生作用和反相高压液相色谱技术进行氨基酸自动分析和酰胺化残基测定，J.Chromatogr.504，129-138)。
抗菌检测。抑菌活性是检测抗巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BMll，金黄色酿脓葡萄球菌(Staphyloco ccus aureus)Cowahl，酿脓链球菌(Strepto coccus pyogenes)b溶血型A，绿脓假单胞菌(Pseudomonasa eruginosa)ATCC 15692，大肠杆菌(Escherichiacoli)D21，大肠杆菌D21e7，大肠杆菌D21f1，大肠杆菌D21f2和大肠杆菌D22，采用抑菌圈试验，在LB肉汤/1％琼脂糖平板接种2×105活菌(Hultmark，D.，Engstrom，.，Andersson，K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman，H.G.(1983)昆虫免疫物质.Attacin，来自Hyulophora cecropin的抗菌蛋白系列，EMBO J.2，571-576)。白色念珠菌(Candida albicans)ATCC 10261的新鲜培养物接种于WB肉汤培养基，pH6.5，并在37℃下培养到OD600大约为0.6。培养物稀释300倍然后接种涂平板，加入测试肽，其浓度是通过氨基酸分析确定的，37℃过夜。测量抑菌圈和使用在(Hultmark，D.，Engstrom，.，Andersson，K.，Steiner，H.，Bennich，H.& Boman，H.G.(1983)昆虫免疫物质.Attacin，来自Hyulophora cecropin的抗菌蛋白系列，EMBO J.2，571-576)中的公式，通过对测试物质系列稀释后获得的抑菌圈的直径计算致死浓度(LC，抑制生长的最低浓度)。致死浓度值用至少5个试验样本的平均值表示，误差小于1个稀释度。
                       圆二色性测量
采用装有DP 520信息处理器的Jasco J710分光光度计，使用2mm光程的石英比色皿，在20℃进行圆二色性测量即CD测量。CD光谱值是3个系列记录的平均值。椭圆率作为平均摩尔浓度残基椭圆率(q)，以deg cm2dmol-1表示。氨基酸分析确定肽浓度。
                           结果
编码前体的cDNA克隆分析。编码信号肽和前部分esculentin 1前体的240bp Hind III酶切片段用作探针筛选由哈士蟆皮中获得的cDNA文库。检测到6个阳性克隆。存在于克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17中的***片段序列显示于图1。除poly(A)尾部外，这些cDNAs各自含有323，356和329个核苷酸。在第1个甲硫氨酸密码子之后，它们含有开放阅读框架可翻译成含有58(Rt-6)或61个氨基酸(Rt-5和Et-17)的多肽。所有推导的序列都有典型的肽前体特点。它们开始于含有疏水残基簇的信号肽。信号肽酶的裂解位置最可能定位在半胱氨酸残基后的位置22(von Heine，G.(1983)靠近信号序列裂解位置的氨基酸图谱，Eur.J.Biochem.133，17-21)。推断的成熟肽序列先于赖氨酸-精氨酸，典型的激素原转化酶加工位置。所有这些前体多肽终止于甘氨酸-赖氨酸序列。通过羧基肽酶E水解将暴露C-末端甘氨酸，这要求形成COOH-末端酰胺。对于克隆Rt-5和Rt-17预期的最终产品将是含有13个氨基酸的酰胺化肽，而Rt-6在此区域有9bp的缺失，这样编码得到仅是十肽。
RNA印迹分析。在来自哈士蟆皮的富含Poly(A)RNA中，来自克隆Rt-17的探针识别出大量信息，检测到一个单一的400-500范围内的核苷酸的相当宽的带。同样条件下，从其它的两栖类物种如侧褶蛙，爪蛙(Xenopus laevis)和Bufo viridis皮中没有获得信号。
皮分泌物中肽的分离和分析。哈士蟆的3个样本在受电刺激后，获得大约20mg的冷冻干燥材料。在初步HPLC提纯后(图2)，每一级分都进行N-末端分析，以鉴定预计来自cDNA序列的带有亮氨酸或苯丙氨酸的氨基酸末端的那些。相关的部分用HPLC进一步提纯并进行氨基酸和序列分析。根据这一方法，发现了3个预测的肽确实存在于分泌物中。也分离到结构上与这些肽相关的其它分子。这些肽的序列列于表1，定名为temporins。在表中也记录了从分泌物中收集到的每一种肽的量。在图2中所示的HPLC分布型，表示各种肽的洗脱位置。如表中所示temporin E的结构，在它的N-末端带有缬氨酸，其部分与temporin D洗脱。Temporins在它的C-末端均酰胺化，如前体(参见前述)结构所预期的，并含有大量的疏水氨基酸。除temporins H和K有10个残基长外，这些肽中的每一个都含有13个氨基酸残基。除temporins C，D，和E外，所有这些肽至少有一个碱性残基(赖氨酸或精氨酸)。在分析的过程中，在皮分泌物中也发现了22-残基肽(见表1)。它的序列与蜂毒肽有些相似，蜂毒肽是来自蜜蜂毒液的一种溶血肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黄蜂毒液，Science 251，1481-1485)。这样将其命名为类蜂毒肽(MLP)。
生物活性测定。首先检测提纯的temporins对巨大芽孢杆菌和大肠杆菌D21的抑菌活性。Temporins A，B，F，G和L对两个菌株都有活性，而temporins C，D，E，H和K仅对最敏感细菌巨大芽孢杆菌表现一些活性。
一些Temporins的回收率太低，不能允许详细地鉴定它们的生物特性。为确定结构和获得更多材料可化学合成Temporins A，B，D和H。合成的Temporins A和B的抑菌活性用致死浓度值表示，以及和血红细胞溶解获得的结果一起记录于表2。参考包括来自侧褶蛙的esulentin 1(Simmaco，M.，Mignogna，G.，Barra，D.& Bossa，F.(1994)从侧褶蛙皮分泌物中获得的抗菌肽。编码esculentin的cDNA分子克隆和新的活性肽的分离，J.Biol.Chem.269，11956-11961)，来自昆虫血淋巴的cecropin(Steiner，H.，Hultmark，D.，Engstrm，，Bennich，H.& Boman，H.G.(1981)在昆虫免疫中涉及的两个抗菌蛋白序列和特异性，Nature 292，246-248)和来自蜜蜂毒液的蜂毒肽(Habermann，E.(1972)蜜蜂和黄蜂毒液，Science251，1481-1485)。
合成的Temporins A和B与它们的天然对应物表现同样的活性，而发现Temporins D和H自身或作为其它蛙属肽的增强物都没有任何生物活性。对金黄色酿脓葡萄球和酿脓链球菌，Temporin A抗菌活性大约是Temporin B的3倍多。另一方面，这两种Temporins对大肠杆菌D21的抗菌活性很低，对于绿脓假单胞菌则完全没有活性。这表明Temporin A和B特异性抗格兰氏阳性菌。
如cecropins的线性元硫抗菌肽是对真菌没有活性的而防御素(带有3个S-S键)表现抗真菌活性。Temporin A和B对白色念珠菌有抗菌活性以及它们的效力等效于报道的来自南美蛙PhyllomedusaSauvagei的dermaseptin(Mor，A.，Hani，K.& Nicolas，P.(1994)脊椎动物肽抗生素dermaseptins有重叠结构特性而靶标特定的微生物，J.Biol.Chem.269，31635-61641)。
同时检测Temporin A和B对大肠杆菌D21的D21e7，D21f1和D21f2 3个菌株的抗菌活性，连续突变缺失增加了LPS中侧链数量(Boman，H.G.& Monner，D.A.(1975)来自大肠杆菌K12突变株脂多糖的鉴定，J.Bacteriol.121，455-464)。由于在envA基因处的突变，菌株D22产生可渗透性外膜(Normark，S.，Boman，H.G.&Matsson E.(1969)，大肠杆菌突变株，有不正常的细胞***和降低游离和染色体介导的对氨苄青霉素和几种抗生素抗性的能力，J.Bacteriol.97，1334-1342)。存在或不存在基础培养基E的情况下检测Temporins的活性(Vogel，H.J.& Bonner，D.M.(1956)大肠杆菌的N-α-乙酰鸟氨酸酶：部分提纯和某些特性，J.Biol.Chem.218，97-106)。
表3的结果显示培养基E增加了所有检测菌株的tempors活性。然而，没有发现对格兰氏阳性菌的类似作用。CD光谱显示活性的增加与螺旋结构的增加有关，如先前发现的FALL-39(Ageberth，G.，Gunne，H.，Odeberg，J.，Kogner，P.，Boman，H.G.& Gudmundsson，G.H.(1995)FALL-39，推断的人的肽抗生素，是无半胱氨酸和在骨髓和睾丸中表达的，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，195-199)。
在此使用的术语“功能性衍生物”包括有游离羧基的肽和酸加成盐。因此本发明并不局限于发明公开的这些具体的肽。
表1
哈士蟆皮肽序列和在分泌物中得到的相应量。用星号标注的是根据cDNAs预测的肽相应前体的结构。a表示酰胺化的COOH-末端。MLP，类似蜂毒肽的肽。相同的残基用黑体表示。间隔(-)是完全相同的***片段。
       肽                序列                   产量
                                        nmol/mgTemporin A       FLPLIGRVLSGILa           14.5Temporin B*     LLPIVGNLLKSLLa           19.4Temporin C       LLPILGNLLNGLLa           37.5Temporin D       LLPIVGNLLNSLLa           1.1Temporin E       VLPIIGNLLNSLLa           1.2Temporin F       FLPLIGKVLSGILa           13.5Temporin G*     FFPVIGRILNGILa           16.8Temporin H*     LSP---NLLKSLLa           8.7Temporin K       LLP---NLLKSLLa           9.8Temporin L       FVQWFSKFLGRILa           3.6MLP      FIGSALKVLAGVLPSVISWVK---Qa         5.1蜂毒肽   GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQa
表2
哈士蟆肽的抗菌和溶解活性。通过接种各有机体的琼脂糖平板上的抑菌圈计算致死浓度。Cecropin的数据取自Hultmark等人(1983)。酿脓链球菌β溶血型A和绿脓假单胞菌ATCC 15692是临床分离物，由Dr.Paolo Visca，Institute of Microbiology，University of Rome La Sapienza惠赠。NT，表示没有检测。有机体和菌株                       致死浓度
                           Temporin A  Temporin B  Esculentin 1  Cecropin A  MLP   蜂毒肽
                           μM巨大芽孢杆菌Bmll               1.2         2.8         0.1           0.5         NT    0.6金黄色酿脓葡萄球菌Cowan        2.3         6.0         0.4           ＞200       NT    0.2Y.pseudotubercolosis           7.0         7.0         NT            0.5         NT    NT酿脓链球面β溶血型A            2.0         7.0         NT            NT          NT    NT大肠杆菌D21                    11.9        21.0        0.2           0.3         NT    0.8绿脓假单胞菌                   ＞360       ＞360       0.7           NT          NT    NTATCC15692白色念球菌                     3.4         4.0         0.5           NT          NT    NT人红细胞                       ＞120       ＞120       ＞200         ＞400       0.5   0.9
表3
Temeporins A和B对大肠杆菌D21和相关的LPS修饰菌株的抗菌活性。试验在LB肉汤/1％琼脂糖，有或无培养基E(Vogel & Bonner 1956)下进行。细菌菌株是由Prof.H.G.Boman，University of Stockholm惠赠。
                   致死浓度化合物                D21        D21e7    D21f1  D21f2  D22
                  μMTemporin A            11.9       1.4      0.9    4.8    3.4Temporin A+ 培养基E   5.3        1.4      3.0    2.0    0.4Temporin B            21.0       13.2     10.0   3.3    11.2Temporin B+ 培养基E   3.4        4.2      3.5    9.3    12.2
序列
克隆  Rt-51   ACAATTCTGAGCCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTG
                                     M  F  T  L  K  K  S  L61  TTACTCCTCTTTTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCA
 L  L  L  F  F  L  G  T  I  N  L  S  L  C  E  E  E  R  N  A121 GAAGAAGAAAGAAGAGATGAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTTA
 E  E  E  R  R  D  E  P  D  E  R  D  V  Q  V  E  K  R  L  L181 CCAATTGTTGGAAACCTGCTCAAGAGCTTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATG
 P  I  V  G  N  L  L  K  S  L  L  G  K  +241 GAATTGGAAATCATCTGATGTGGAATATCATTTAGCTAAATGAGCAACAGATGTCTTATT301 TAAAAAAATAAATATGTTCCATC
克隆  Rt-61   GCTTTGTAGGATAGACCTGCACTGAAGTCTTCCAGCCGTCTACATTCTGAGCACCAACTG61  AACTACCCGAGCCCAAAGATGTTCACCTTGAAGAAATCCCTGTTACTCCTCTTTTTCCTT
                   M  F  T  L  K  K  S  L  L  L  L  F  F  L121 GGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGAGGAAGAGAGAAATGCAGAAGAAGAAAGAAGAGAT
 G  T  I  N  L  S  L  C  E  E  E  R  N  A  E  E  E  R  R  D181 GAACCAGATGAAAGGGATGTTCAAGTGGAAAAACGACTTTCACCAAACCTGCTCAAGAGC
 E  P  D  E  R  D  V  Q  V  E  K  R  L  S  P  N  L  L  K  S241 TTGTTGGGAAAATAACCAAAAATGTTAAGAATGGAATTG6AAATCATCTGATGTGGAATA
 L  L  G  K  +301 TCATTTAGCTAAATGCGCAACAGATGTCTTATTTAAAAAATAAATATGTTGCATAC克隆  Rt-171   CCCCTCCAGCTGTCTACATTCTCATAACCAACTGAACCACCCGAGCCCAAAGATGTTCAC
                                                     M  F  T61  CTTGAAGAAATCCCTCTTACTCCTTTTCTTCCTTGGGACCATCAACTTATCTCTCTGTGA
  L  K  K  S  L  L  L  L  F  F  L  G  T  I  N  L  S  L  C  E121 GGAAGAGAGAGATGCCGATGAAGAAAGAAGAGATGATCTCGAAGAAAGGGATGTTGAAGT
  E  E  R  D  A  D  E  E  R  R  D  D  L  E  E  R  D  V  E  V181 GGAAAAGCGATTTTTTCCAGTGATTGGAAGGATACTCAATGGTATTTTGGGAAAATAACC
  E  K  R  F  F  P  V  I  G  R  I  L  N  G  I  L  G  K  +241 AAAAAAAGTTAAAACTTTGGAAATGGAATTGGAAATCATCTAATGTGGAATGTCATTTAG301 CTAAATGCACATCAAATGTCTTATAAAAA

Claims (14)

1.多肽，选自下列肽：
F L P L I G R V L S G I L-酰胺
L L P I V G N L L K S L L-酰胺
L L P I L G N L L N G L L-酰胺
L L P I V G N L L N S L L-酰胺
V L P I I G N L L N S L L-酰胺
F L P L I G K V L S G I L-酰胺
F F P V I G R I L N G I L-酰胺
L S P N L L K S L L-酰胺
L L P N L L K S L L-酰胺
F V Q W F S K F L G R I L-酰胺和它们的功能性衍生物以及药用可接受盐。
2.根据权利要求1的一种或多种多肽用于治疗用途。
3.根据权利要求2的一种或多种多肽用于抗菌的用途。
4.根据权利要求4的一种或多种多肽用于抗细菌或真菌的用途。
5.根据上述任一权利要求的一种或多种多肽用于制造有抗菌活性药物的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所说的药物具有抗细菌或抗真菌活性。
7.一种药用组合物，包含作为活性成分的有效剂量的权利要求1所述的一种或多种多肽和药用可接受载体或稀释剂。
8.根据权利要求7的药用组合物，其中所说剂量是可产生抗菌活性的量。
9.根据权利要求8的药用组合物，其中所说剂量是可产生抗细菌或抗真菌活性的量。
10.根据权利要求7-9中任一权利要求的药用组合物，其中所说的载体或稀释剂适合口服，静脉，肌肉或皮下给药。
11.cDNA克隆，其序列是选自克隆Rt-5，Rt-6和Rt-17所示的序列。
12.一种抑制动物，例如哺乳动物包括人体内微生物生长的方法，包括给与抵抗微生物侵染引起紊乱的动物受者以抗菌量的权利要求1的一种或多种多肽或根据权利要求7-10的任一权利要求的组合物的步骤。
13.根据权利要求12的用于抑制细菌或真菌生长的方法。
14.根据权利要求12或13的方法，包括用可注射剂量形式注射权利要求7-10的任一权利要求的组合物给药。
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