JP2005289822A

JP2005289822A - 膜貫通型ペプチドを用いた磁性担体上への生体分子アンカリング法

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Publication number: JP2005289822A
Application number: JP2004102888A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Matsunaga; 是松永; Haruko Takeyama; 竹山春子; Takeshi Tanaka; 剛田中; Noriko Kunitachi; 國立典子
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2005-10-20

Abstract

【課題】膜貫通型のペプチドをアンカー分子として用いて膜表面上に効率的にタンパク質を固定化する方法、並びにその生成産物である磁気微粒子を提供すること。
【解決手段】有機膜に覆われた磁気微粒子を磁性担体として用い、その膜に強固に結合することができる両親媒性のペプチドをアンカーとして、ペプチドと有用タンパク質の融合体を用いて、有用タンパク質を担体上に固定化し、高感度イムノアッセイやDNA検出、細胞分離などバイオアッセイでの測定方法に利用する。
【選択図】図２

Description

本発明は、膜に自発的にアンカリングされる両親媒性のペプチドの利用に関する。

磁気微粒子に固定化された酵素、抗体等の生理活性を有するタンパク質は、磁気的に回収・分離ができるため、医療や臨床検査、バイオテクノロジー分野を初めとする各種産業において利用が期待される。

磁性細菌が生成する磁性細菌粒子は、菌体内ではマグネトソームと呼ばれる粒径５０〜１００ｎｍの磁気微粒子が１０〜２０個チェーン状に連なった構造をしており、厚さ約２〜４ｎｍの有機膜で覆われている。膜融合型磁気微粒子への生理活性物質の固定化は、磁気微粒子をアルカリ処理で分離し、これをγ−アミノプロピルトリエトキシシランやグルタルアルデヒドで処理したのち、これに生理活性物質を化学的に固定化することが行われていた。また、酵素処理により、磁性菌から脂質から成る有機薄膜に被覆された状態で磁気微粒子を分離し、グルタルアルデヒド処理後にタンパクの固定化を行う方法も知られている（特開平５−２０９８８４）。化学的固定化法としてマレイミド基、スクシイミド基などの反応基を有する架橋剤のアミノ基、チオール基との反応性を利用したタンパク質固定化が知られている (Anal. Chim. Acta 281, 585-589, 1993、Anal.
Chem. 63, 268-272, 1991、Anal. Chem. 65, 2036-2039,
1993、Anal. Chem. 68, 3551-3554, 1996、Anal
Chim Acta 475, 75-83, 2003、J. Biotechnol., 108, 153-159,
2004)。しかし、これらの方法では、固定化反応時に酵素や抗体の活性を損なう場合があり、また分子レベルでタンパク質を配向させて磁気微粒子上へ固定化することは不可能である。

化学的固定化等の処理を行う必要がなく、形質転換された磁性細菌を培養し、菌体内に生成した磁気微粒子を分離するだけで酵素、抗体その他の有用タンパク質を磁気微粒子の有機膜に結合した状態で安定して得ることができる磁気微粒子の製造方法が考案されている（特許公開平８−２２８７８２）。これは、磁性細菌の磁気微粒子膜に局在するタンパク質MagA（特許公開平８−２２８７８２）やMms16(特許公開２００２−１７６９８９)をアンカーとして利用し、遺伝子組み換え技術を用いて磁性細菌内で有用タンパク質を磁気微粒子上に固定化する方法である。この方法を用いて製造した磁気微粒子上ではタンパク質が分子レベルで配向していると考えられ、化学的固定化方法と比較してタンパク質の失活がなく効率的に固定化できることが報告されている (Anal. Chem. 72, 3518-3522, 2000)。

また、MagAタンパク質と酵素との融合遺伝子を大腸菌内で大量発現し、抽出したものをin vitroで膜融合型磁気微粒子上に導入する技術も開発されており、遺伝子組み換えに基づく方法と比較して効率的なタンパク質の固定化が可能であることが示唆されている(Biotechnol. Bioeng. 77, 614-618, 2002)。しかし、アンカー分子として、複数の膜貫通部位を有する膜タンパク質を用いるため、融合タンパク質を調製するのに煩雑な操作を必要とし、また可溶化の際に界面活性剤などを使用することから、タンパク質の失活を招く場合がある。

一方で、アフリカツメガエルの皮膚やミツバチの毒液などからMagainin (Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 5449-5453、1987)やMelittinといった抗菌性ペプチドが発見されており、その数は現在500種類以上に及ぶ。これらのペプチドは15~40残基のアミノ酸からなり、膜中など疎水環境にある場合にとる二次構造はαへリックス、βシート、ループ構造など多様性を示す。ヨーロッパアカガエルRona temporaria 由来のTemporin (Eur. J. Biochem. 242, 788-92, 1996)やオオカイコガHyalophora
cecropia由来のCecropin (Nature
292, 246-248, 1981)は、疎水環境においてαへリックス構造をとり、塩基性且つ両親媒性で直鎖状のペプチドである。このようなペプチドの抗菌作用メカニズムは、膜に近づくにつれランダムコイルからαへリックス構造となり、膜と平行にαへリックスの疎水面が膜表面に入り込んだ後、垂直に膜を貫通し、孔を形成することで溶菌させたり、界面活性剤作用により膜の破壊を引き起こすと考えられている。

また、アミノ酸配列のN末とC末が逆転した抗菌性ペプチドを用いた抗菌活性評価も行われており、Magaininについては、疎水性度やαへリックス形成傾向、αへリックス構造の両親媒性度の低下により、正配列のペプチド以下の活性であるという結果が得られている。一方、CecropinとMagaininのハイブリッドペプチドであるP18においては、逆転配列を持つペプチドの方が高い殺菌作用を持つという報告もある。
特開平８−２２８７８２特開平５−２０９８８４

本発明は、膜貫通型のペプチドをアンカー分子として用いて膜表面上に効率的にタンパク質を固定化する方法、並びにその生成産物である磁気微粒子を提供することを課題とする。

本発明者らは、配列表記載の配列番号１から３のペプチドが磁性細菌粒子膜上でアンカーとして働くことを見出し、本発明を完成させた。

本発明は、第一に、膜貫通型ペプチドをアンカーとし、該ペプチドと有用タンパク質の融合体を有機膜で被覆された磁気微粒子上に固定化した新規磁気微粒子を提供する。

また、本発明は、膜貫通型ペプチドを介した磁気微粒子を被覆する有機膜との自発的な結合性に着目し、融合タンパク質の状態で別の有用タンパク質を磁気微粒子に固定する方法等を提供する。

ペプチドの水溶液中での自発的な膜への結合、極めて短時間でのアンカリングに基づき、簡便、迅速なタンパク質固定化方法を提供する。

本発明におけるペプチドは膜に配向性を持ってアンカリングされるものであり、後述の配列表に記載の配列番号２、または３で示されるアミノ酸配列からなる。

本発明の磁気微粒子は、膜に自発的にアンカリングされるペプチドをアンカーとし、有機膜で被覆された磁気微粒子に有用タンパク質を固定化する方法である。このようにして、ペプチドの膜内での配向性に基づいて、タンパク質を分子レベルで配向した状態でアンカリングした磁気微粒子の製造が可能である。

本発明で使用する磁気微粒子としては、磁性細菌から分離された脂質膜で被覆された磁気微粒子が望ましい。磁性細菌から得られる磁性細菌粒子は、磁性細菌を培養後、微生物中から抽出することが可能である。その抽出方法としては、フレンチプレス等の物理的圧力によって微生物を破砕する方法やアルカリ煮沸、超音波破砕処理といった方法が採用できる。また、人工的に両親媒性高分子である有機膜を被覆した磁性流体粒子や化学架橋法により磁気微粒子表面に両親媒性の有機膜を固相化した磁気微粒子も利用することができる。磁気微粒子としては、Ｆｅ３Ｏ４（磁鉄鉱）、γ−Ｆｅ２Ｏ３（磁赤鉄鉱）、Ｃｏ・γ−Ｆｅ２Ｏ３、（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ２Ｏ３、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ２Ｏ３、ＳｉＯ２で被覆したＦｅ３Ｏ４、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド）とフェライトとの複合微粒子を挙げることができる。磁気感受性微粒子としてのフェライト系の粒子は、公知の方法によって製造できる。

磁気微粒子を被覆する脂質膜の例としては、リン脂質が挙げられる。リン脂質としては、例えばホオスファチジルエタノールアミン、ホオスファチジルセリン、ホオスファチジルイノシトール、ホオスファチジル−Ｎ−メチルエタノールアミン等を用いることができる。また、リン脂質の他にコレステロールや糖脂質、スフィンゴ脂質などを用いることもできる。

本発明において用いることができるペプチドとしては、水溶液中で塩基性を含む両親媒性を示し、細胞膜中にアンカリングされることができるペプチドであればいずれを用いてもよい。例えば、Magainin 、Melittinといった抗菌性ペプチド、Temporin 、Cecropin など、およびこれらのアミノ酸配列のN末とC末とが逆転したペプチド、ならびにこれらのハイブリッドペプチドを用いることができる。特に好ましくは、水溶液中で塩基性を含む両親媒性を示す、配列番号１から３に記載のペプチド、及びこのペプチドの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。

膜融合型磁気微粒子にアンカリングする、ペプチドと有用タンパク質の融合体は、大腸菌や酵母などをホストとした遺伝子組み換え技術により作製することができる。また、ペプチドのN末端のアミノ酸やC末端のカルボン酸、さらには側鎖に存在するアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基を官能基として利用して有用タンパク質との融合体を作製する技術を利用することが可能である。

タンパク質に融合させた配列番号１から３に記載のペプチドが正に帯電し、かつ膜融合型磁気微粒子の表面電荷が負に帯電するような緩衝液中で両者を混合し、１分間から１時間インキュベートすることで、ペプチドをアンカーとしたタンパク質の磁気微粒子上へのアンカリングが可能である。ここで、アンカリングされずに静電的にのみ結合したペプチドは高いイオン強度の緩衝液で洗浄することにより、除去することが可能である。
本発明の方法により得られる磁気微粒子は、その表面上に有用タンパク質を配向した状態でアンカリングすることができる。例えば、抗体を固定化することで、様々な抗原物質の免疫測定に基づく検出やウィルスや細胞の分離、環境毒物の除去等に有用である。

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１
磁性細菌Magnetospirillum sp.ＡＭＢ−１（ＡＴＣＣ７００２６４）からの膜融合型磁気微粒子の調製は、これまでの報告（Appl.Microbiol. Biotechnol. 35, 651-655, 1991）の方法に従った。ペプチドはFmoc
(9-fluorenylmethoxycarbonyl)固相合成法により、ペプチド合成機を用いて作製した。合成したペプチドを表１に示す。

まず、N末端、またはC末端のアミノ酸残基をビオチン化したtemporin
L-Kを用いて、蛍光標識ストレプトアビジンによる蛍光を顕微鏡により観察することでtemporin Lの膜配向性の評価を行った。リン酸緩衝液(pH7.4)に懸濁した350 micro-g/ml膜融合型磁気微粒子に対し、ビオチン化したtemporin L-K (30 micro-M)を添加し、１時間インキュベートさせた。その後、膜融合型磁気微粒子を磁気回収、1M NaClを含むリン酸緩衝液 (pH7.4)中での懸濁を繰り返し、洗浄を行った。さらに膜融合型磁気微粒子に対し、蛍光標識ストレプトアビジンを添加し、１時間反応させた。洗浄後の膜融合型磁気微粒子の位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡写真を図１に示す。N末端をビオチン化したtemporin L-Kをアンカリングした場合、蛍光標識ストレプトアビジンの結合によると考えられるAlexa
Fluor 350の蛍光が観察された。一方、C末端のアミノ酸残基をビオチン化したtemporin L-Kをアンカリングした場合、蛍光は観察されなかった（図１Ａ）。以上より、逆配列のtemporin
L-KはC末端から膜にアンカリングされることが示された（図１Ｂ）。さらにTL-A2、R12、Ｌ３はアンカリングできないのに対し、temporin L (I)、(II)においては、temporin L-Kと同様にアンカリングに利用できることが示された。

化学架橋法またはペプチドアンカーを用いた場合における、磁気微粒子膜表面へのタンパク質アセンブリング量を評価した結果を図２に示す。磁気微粒子膜表面にアンカリングされたストレプトアビジンに結合したAlexa Fluor 350の蛍光強度は、ペプチドアンカーを用いた場合、化学架橋法と同等であった。さらに、化学架橋法と比較して、反応操作が容易で短時間にアセンブリングが可能であることから、粒子表面への新規の生体分子アンカリング技術としての有用性が示された。

本発明の方法により得られるタンパク質をアンカリングした磁気微粒子は、種々なタンパク質、細胞、化学物質の分離用担体、および高感度検出等において有用である。また磁気ビーズはタイタープレートのような平板を固相とする方法と比べ、反応効率が良く、磁力によって外部からビーズの回収、離脱が可能であることから核酸抽出・精製や免疫測定などのバイオテクノロジー研究における機能性磁性担体としての汎用性が高い。

本発明にしたがって、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０標識ストレプトアビジンがＮ末端にビオチンを標識したペプチドを介して磁性細菌粒子上に結合したことを示す蛍光顕微鏡写真である。本発明による磁性細菌粒子上へのストレプトアビジン固定化量と化学架橋法による固定化量を比較した図である。

Claims

有機膜に覆われた磁気微粒子であって、前記磁気微粒子膜中に膜貫通型ペプチドがアンカリングされていることを特徴とする磁気微粒子。
有機膜に覆われた磁気微粒子であって、前記磁気微粒子膜中に膜貫通型ペプチドと融合されたタンパク質がアンカリングされていることを特徴とする磁気微粒子。
遺伝組み換え技術あるいは化学架橋法により作成した膜貫通型ペプチド融合タンパク質がアンカリングされた請求項１記載の磁気微粒子。
膜貫通型ペプチドが、配列番号１から３に記載されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の磁気微粒子。
配列番号２、または３に記載されるアミノ酸配列を有するペプチド。
配列番号２、または３に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ請求項１記載の磁気微粒子膜へアンカリングされることを特徴とするペプチド。
請求項１記載の磁気微粒子を製造する方法であって、膜融合型磁気微粒子を調製する工程とペプチド−タンパク質を自発的に磁気微粒子膜上に配向させる工程とを含む方法。
請求項５若しくは６記載のペプチドと、タンパク質とを結合させた融合タンパク質。
タンパク質が、抗原、抗体、受容体、レクチン、ホルモン、結合性タンパク質、酵素、及びマーカータンパク質から選ばれる１又は２以上のタンパク質であることを特徴とする請求項８記載の融合タンパク質。
請求項２，及び３に記載される磁気微粒子を用いて抗体をアンカリングした磁気微粒子を調製し、抗原を高感度に測定する方法。