CN1238377C - 酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酸性抗菌肽及其应用，属于生物医学领域。酸性抗菌肽，分子量2021.4，等电点4.8，多肽氨基酸全序列一级结构为：Ile Leu Gly Pro Val LeuGly Leu Val Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val Leu Gly Ile Leu-AMIDATION。人工化学合成的酸性抗菌肽具有显著的抑制细菌生长的作用，可以作为制备抗微生物感染制剂的应用。

Description

酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用

技术领域：

本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用，属生物医学领域。

背景技术：

自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题。三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌，肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现(1)。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点(2)。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效，正成为新一类抗生素，其研制目前受到广泛重视(3)。

很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效(4)。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物(5)。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点(6，7)。据国内外文献报道，已从各种生物来源分离得到不同的抗菌肽(3)，而且有些已进入临床治疗。如从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性，在美国已获准作为广谱抗菌药物，其基因工程产品已进入三期临床；最近，Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽Magainin类似物MSI-78用于治疗926例糖尿病患者因多种细菌感染而引起足部溃疡的III期临床结果表明，MSI-78与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验；Applied Microbiology公司与Astra公司合作用抗菌肽nisin治疗胃溃疡的临床试验也取得良好的疗效(8)。另一方面，目前报道的抗微生物蛋白多肽，除Brogden等1996年报道的从羊肺分离的SAAP酸性抗菌肽外(9)，绝大多数都是碱性蛋白多肽(10)。由于酸性抗菌肽的特殊作用机制，因而酸性抗菌肽在抗微生物药物研制中具有特殊意义(3，9)。

发明人将本发明的酸性抗菌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的酸性抗菌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

参考文献

1，Liu KK，Antibiotic resistance in bacteria.A current and future problem.Adv.Exp.Med.Biol.，1999；455，387-396.

2，Chopra I，Research and development of antibacterial agents.Curr.Opin.Microbiol.，1998，1，495-501.

3，Zasloff M，Antimicrobial peptides of multicellular orgabisms.Nature，2002，415，389-395.

4，江苏新医学院，中药大词典，1997版，上海，上海科学技术出版社。

5，叶昌媛，费梁，胡淑琴，中国珍稀及经济两栖动物，1993，成都，四川科学技术出版社。

6，Lazarus，L.H.，Attila，M.，1993.The toad，ugly and venomous，wearsyet a precious jewel in his skin.Prog.Neurobiol.41，473-507.

7，赖仞，赵宇，刘衡，张玉洁，李文辉，张云，两栖类动物皮肤活性物质的利用兼论中国两栖类资源开发的策略。动物学研究，2002，23(1)，65-70。

8，Jacob L，Zasloff M，Potential therapeutic applications of magaininsand other antimicrobial agents of animal origin.Ciba Found Symp.，1994；186，197-216.

9，Brogden KA，De Lucca AJ，Bland J，Elliott S，Isolation of an ovinepulmonary surfactant-associated anionic peptide bactericidal forPasteurella haemolytica.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，412-416.

10，Hancock RE，Host defence(cationic)peptides：what is their futureclinical potential？Drugs 1999，57，469-473.

发明内容：

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

酸性抗菌肽，分子量2021.4，等电点4.8，多肽氨基酸全序列一级结构为：异亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-酰胺化亮氨酸(Ile Leu Gly Pro Val Leu Gly LeuVal Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val Leu Gly Ile Leu-AMIDATION)。

酸性抗菌肽基因的克隆包括：大蹼铃蟾皮肤总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，设计引物，利用PCR方法筛选酸性抗菌肽基因。扩增引物长度为18个核苷酸，其序列为5‘AGTATCGGNGCNAAAATC3’，其中N＝A、C、G、T，PCR另一扩增引物为位于克隆***部分的3‘端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3‘。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定。基因测序结果表明编码酸性抗菌肽的基因由632个核苷酸组成，自5’端至3‘端序列为：

atcaagatat ctgatagcat ataacaatat cctgagatcc tggtaaagat gaattttaag  60

tacatatttg cagtgtcctt tttaatagca tctgcatatg cacgaagtgt acagaatgat 120

gaacagtctc tgagtcagag ggatgtttta gaagaagaat cactgaggga aatcagaggt 180

ataggaggaa aaatcctatc tggtcttaaa acagctttaa aaggtgcagc caaagagttg 240

gcttctacgt atctgcatag gaagagaaca gctgaagaac acgaagaaat gaaaagactg 300

gaagccgtaa tgcgtgatct agattccttg gattatccag aggaagcttc tgaaagggaa 360

accagaggct tcaatcaaga cgagattgct aatcttttta ctaaaaaaga gaaacgcatt 420

ttggggccag tactaggttt ggttagtgat acacttgacg atgtacttgg aattcttgga 480

taattataac cagtaaaact ttgctttcat gaatctttgt aaaatgatgc taatcagata 540

acatataata aagcataaaa aagctattta aacaaactgc atgctctcta ctctgctatt 600

aaataaaaat aatttggagc aaaaaaaaaa aa                               632

编码成熟酸性抗菌肽为第418-477位核苷酸，其氨基酸序列为：

Ile Leu Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val

1               5                   10                  15

Leu Gly lle Leu-AMIDATION

            20

酸性抗菌肽基因作为基因工程制备酸性抗菌肽的应用。

酸性抗菌肽的制备方法：根据编码酸性抗菌肽的基因推断酸性抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

酸性抗菌肽作为制备抗微生物药的应用。

本发明的有益效果在于：

由大蹼铃蟾抗菌肽编码基因推导结构，合成的酸性抗菌肽具有显著的抑制细菌生长的作用。与其他来源碱性抗菌多肽相比，该酸性抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、特定抗菌谱系的有益特点。

附图说明：

图1为本发明酸性抗菌肽基因核苷酸序列。

图2为本发明成熟酸性抗菌肽氨基酸序列。

具体实施方式：

实施例一：

1，酸性抗菌肽基因克隆：

1)，大蹼铃蟾皮肤总RNA提取：活体大蹼铃蟾用水清洗干净，放入液氮中速冻4小时，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10ml总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20ml玻璃匀浆器中匀浆30分钟，加入等体积酚/氯仿溶液，，剧烈混匀，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀，上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为大蹼铃蟾皮肤总RNA。

2)，大蹼铃蟾皮肤mRNA的纯化：采用美国PROMEGA公司的mRNA分离纯化试剂盒。取大蹼铃蟾皮肤总RNA500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分钟，加人3μl的Oligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30秒，弃上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30秒，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，最后弃上清，加0.1ml DEPC水悬浮，至磁力架上吸附30秒，将上清移至新的试管，再加入0.15ml DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述试管，则上清中为纯化的大蹼铃蟾皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异戊醇，于-70℃放置30分钟，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

3)，大蹼铃蟾皮肤cDNA文库构建：采用美国GIBCOBRL公司SuperScript^TM质粒cDNA文库构建试剂盒，但方法操作有改进。cDNA第一链合成(mRNA反转录)，于1.5ml试管中加入2μl NotI引物和7μlmRNA，3μl DEPC水，70℃保温10分钟，立即放入冰浴冷却，然后加入4μl 5X第一链合成缓冲液，2μl 0.1MDTT，1μl 10mM dNTP混合物，在加入1μl SuperScript II反转录酶，于37℃保温1小时后放入冰浴。cDNA第二链合成，在第一链合成试管中加入：95μl DEPC水，30μl 5X第二链合成缓冲液，3μl 10mM dNTP混合物，1μl大肠杆菌DNA连接酶，4μl大肠杆菌DNA多聚酶I，1μl大肠杆菌RNA酶，反应总体积150μl，混匀后于16℃保温2小时；加入2μl T4 DNA多聚酶继续保温5分钟。DNA的抽提和乙醇沉淀，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合物抽提，12000rpm离心5分钟，取140μl上层溶液转移到干净试管中，加入70μl 7.5M乙酸铵，0.5ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干。SalI adapter的连接，上述沉淀溶于25μlDEPC水中，加入10μl 5XT4 DNA连接酶缓冲液，10μl SalI adapter，5μl T4 DNA连接酶，反应总体积50μl，于16℃保温16小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于41μlDEPC水中。Not I酶水解，于cDNA溶液中加入5μl React 3缓冲液，4μl Not I酶，反应体积50μl，于37 ℃保温2小时。重复上述DNA的抽提和乙醇沉淀过程，沉淀溶解于100μlTEN缓冲液中。将cDNA样品过DNA分级分离柱(试剂盒含有)后，去除小于300bp核苷酸的cDNA。cDNA大于300bp核苷酸的组份合并，体积为200μl，加入5ml酵母tRNA，100μl 7.5M乙酸铵，0.6ml无水乙醇，12000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，沉淀溶于20μl TEN缓冲液中。合成的cDNA连接到pSPORT 1质粒，取10μl溶解于TEN缓冲液中的cDNA，加入4μl5XT4 DNA连接酶缓冲液，1μl pSPORT1质粒(Not I-Sal酶水解，50ng)，4μlDEPC水，1μl T4 DNA连接酶，反应体积20μl，室温3小时，可准备转化大肠杆菌HB101感受态细胞。感受态细胞的制备，挑取单个HB101菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于，50ml LB培养液中，37℃振荡2小时，待菌液540nm OD值为0.4时，4℃，2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl₂悬浮，再2000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl₂重悬，分装后置冰浴内备用。连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克60秒，再置冰浴5分钟，加入无氨苄青霉素的SOC培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl涂布于含氨苄青霉素的LB平皿(15cm直径)，37℃培养16小时，每个LB平皿用5ml LB液体培养基洗涤菌落，加10％甘油冻存。构建的cDNA大约含4×10⁴个单独克隆。

4)，酸性抗菌肽基因克隆筛选：利用PCR筛选法筛选大蹼铃蟾阴离子抗菌肽基因，所用正向引物P1，长度为18个核苷酸，其序列为5‘AGTATCGGNGCNAAAATC3’，其中N＝A、C、G、T；和位于克隆***部分的3‘端的载体SP6启动子引物，其序列为5’CATACGATTTAGGTGACACTATAG3‘。PGR反应在如下条件下进行：94℃1分钟，45℃1分钟和72℃1分钟，30个循环。首先滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升，和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选第二轮筛选)，在96孔培养板(Costar)上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μl)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

5)，酸性抗菌肽基因序列测定和结果：提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核昔酸序列测定仪，测序引物为SP6和T7启动子，SP6启动子序列：5‘CATACGATTTAGGTGACACTATAG3’，T7启动子序列：5‘TAATACGACTCACTATAGGGA3’。基因测序结果自5‘端至3’端(见图1)。图1所示大蹼铃蟾酸性抗菌肽基因核苷酸的序列表为：序列长度，632个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：大蹼铃蟾皮肤。编码成熟酸性抗菌肽为第418-477位核苷酸，其氨基酸序列见图2。

酸性抗菌肽基因作为基因工程制备酸性抗菌肽的应用。

实施例二：

1，制备酸性抗菌肽：

酸性抗菌肽的制备方法：根据编码大蹼铃蟾抗菌肽的基因推断酸性抗菌肽的氨基酸序列，用自动多肽合成仪合成其全序列。通过HPLC反相C₁₈柱层析脱盐、纯化。

2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3，纯化的酸性抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

酸性抗菌肽，是中国两栖类动物大蹼铃蟾抗菌肽基因编码的一种单链多肽，分子量2021.4，等电点4.8，多肽氨基酸全序列一级结构为：异亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-酰胺化亮氨酸(Ile Leu Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Ser Asp ThrLeu Asp Asp Val Leu Gly Ile Leu-AMIDATION)。

实施例三：

酸性抗菌肽抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一个钢杯加入0.1-0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，酸性抗菌肽抑制细菌生长的作用：

菌株                                     最小抑菌浓度(μg/ml)     

                                            酸性抗菌肽

金黄色葡萄球菌ATCC2592                         100

(Staphylococcus auneus ATCC2592)

巴斯德溶血菌                                   50

(Pasteurella haemolytica)

由表1可见，合成的酸性抗菌肽具有显著的抑制细菌生长的作用，作为抗微生物物质在制备治微生物感染疾病药物中的应用。

                       说明书序列表

<110>中国科学院昆明动物研究所

<120>酸性抗菌肽及其基因和在制药中的应用

<160>3

<210>1

<211>632

<212>DNA

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<220>

<221>CDS

<222>(49)...(483)

<400>1

atcaagatat ctgatagcat ataacaatat cctgagatcc tggtaaag atg aat ttt 57

                                                     Met Asn Phe

                                                      1

aag tac ata ttt gca gtg tcc ttt tta ata gca tct gca tat gca cga 105

Lys Tyr Ile Phe Ala Val Ser Phe Leu Ile Ala Ser Ala Tyr Ala Arg

     5                  10                  15

agt gta cag aat gat gaa cag tct ctg agt cag agg gat gtt tta gaa 153

Ser Val Gln Asn Asp Glu Gln Ser Leu Ser Gln Arg Asp Val Leu Glu

20                  25                  30                  35

gaa gaa tca ctg agg gaa atc aga ggt ata gga gga aaa atc cta tct 201

Glu Glu Ser Leu Arg Glu Ile Arg Gly Ile Gly Gly Lys Ile Leu Ser

                40                  45                  50

ggt ctt aaa aca gct tta aaa ggt gca gcc aaa gag ttg gct tct acg 249

Gly Leu Lys Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Lys Glu Leu Ala Ser Thr

            55                  60                  65

tat ctg cat agg aag aga aca gct gaa gaa cac gaa gaa atg aaa aga 297

Tyr Leu His Arg Lys Arg Thr Ala Glu Glu His Glu Glu Met Lys Arg

        70                  75                  80

ctg gaa gcc gta atg cgt gat cta gat tcc ttg gat tat cca gag gaa 345

Leu Glu Ala Val Met Arg Asp Leu Asp Ser Leu Asp Tyr Pro Glu Glu

    85                  90                  95

gct tct gaa agg gaa acc aga ggc ttc aat caa gac gag att gct aat 393

Ala Ser Glu Arg Glu Thr Arg Gly Phe Asn Gln Asp Glu Ile Ala Asn

100                 105                 110                 115

ctt ttt act aaa aaa gag aaa cgc att ttg ggg cca gta cta ggt ttg 441

Leu Phe Thr Lys Lys Glu Lys Arg Ile Leu Gly Pro Val Leu Gly Leu

                120                 125                 130

gtt agt gat aca ctt gac gat gta ctt gga att ctt gga taa           483

Val Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val Leu Gly Ile Leu Gly *

            135                 140

ttataaccag taaaactttg ctttcatgaa tctttgtaaa atgatgctaa tcagataaca 543

tataataaag cataaaaaag ctatttaaac aaactgcatg ctctctactc tgctattaaa 603

taaaaataat ttggagcaaa aaaaaaaaa                                   632

<210>2

<211>144

<212>PRT

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(124)...(143)

<400>2

Met Asn Phe Lys Tyr Ile Phe Ala Val Ser Phe Leu Ile Ala Ser Ala

1               5                   10                  15

Tyr Ala Arg Ser Val Gln Asn Asp Glu Gln Ser Leu Ser Gln Arg Asp

            20                  25                  30

Val Leu Glu Glu Glu Ser Leu Arg Glu Ile Arg Gly Ile Gly Gly Lys

        35                  40                  45

Ile Leu Ser Gly Leu Lys Thr Ala Leu Lys Gly Ala Ala Lys Glu Leu

    50                  55                  60

Ala Ser Thr Tyr Leu His Arg Lys Arg Thr Ala Glu Glu His Glu Glu

65                  70                  75                  80

Met Lys Arg Leu Glu Ala Val Met Arg Asp Leu Asp Ser Leu Asp Tyr

                85                  90                  95

Pro Glu Glu Ala Ser Glu Arg Glu Thr Arg Gly Phe Asn Gln Asp Glu

            100                 105                 110

Ile Ala Asn Leu Phe Thr Lys Lys Glu Lys Arg Ile Leu Gly Pro Val

        115                 120                 125

Leu Gly Leu Val Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val Leu Gly Ile Leu Gly

    130                 135                 140

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)

<220>

<221>AMIDATION

<222>(20)

<400>3

Ile Leu Gly Pro Val Leu Gly Leu Val Ser Asp Thr Leu Asp Asp Val

1               5                   10                  15

Leu Gly Ile Leu-AMIDATION

            20

Claims (2)

1、酸性抗菌肽，其特征是一种单链多肽，分子量2021.4，等电点4.8，多肽氨基酸全序列一级结构为：异亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-亮氨酸-甘氨酸-异亮氨酸-酰胺化亮氨酸。

2、权利要求1所述的酸性抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。