CN1810830A - 抗hiv－1多肽c22,其编码序列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗HIV－1的多肽C22、该多肽C22表达前体、编码多肽的DNA序列、单体多肽的药物组合物，及其制法。本发明的多肽C22用融合蛋白表达得到多肽前体，酶切得到多肽C22，工艺简单，且可提高最终产率，适合于工业化生产。

Description

抗HIV-1多肽C22，其编码序列及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种抗HIV-1的多肽C22序列、其编码序列及制备方法。

背景技术

艾滋病(AIDS)是一种由艾滋病病毒侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。

自从1985年第一例艾滋病感染者在中国被发现后，艾滋病在中国呈几何级数的增长趋势，其增长趋势甚至超过了非洲。不但被感染者的数量急剧上升，而且全世界发现的所有艾滋病病毒的品种全部在中国出现。

艾滋病之所以猖狂于全球，就在于艾滋病病毒HIV侵入人体后直接侵犯人体免疫***，共计核查上的使人体免疫***中最重要、最具有进攻性的T4淋巴细胞，使机体一开始就处于丧失防御能力的地位。艾滋病病毒一旦进入人体，就寄生于T4淋巴细胞内最核心的部位，并于细胞核的遗传物质DNA整合为一体，人体没有能力使其分开，更没有力量杀灭它，艾滋病就成为一种“病入基因”的痼疾。艾滋病病毒随免疫细胞DNA复制而复制。病毒的繁殖和复制是免疫细胞遭到破坏和毁灭，并放出更多的病毒。新增殖病毒在感染更多的细胞。就这样，病毒一代代复制、繁殖、免疫细胞不断死亡。

艾滋病病毒是一种不同于一般病毒的逆转录病毒，具有极强迅速变异能力也给目前特效药和疫苗研制工作造成了极大困难。

目前在研抗HIV-1逆转录病毒的抑制剂主要包括：核苷类逆转录酶抑制剂，非核苷类逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，HIV CCR5、CXCR4受体抑制剂，HIV GP120 env阻断剂，干扰诱导剂，以及抗HIV膜融合抑制剂等。其中开发研制较早的是主要针对HIV-1病毒感染过程中起关键作用的酶类(逆转录酶或者蛋白酶)抑制剂，但是由于出现对药物呈抗性的病毒变体，需要药物保持持续稳定药效，并考虑药物潜在的毒性影响，这大大限制了现有抑制剂系列临床治疗的功效。因此需要大力开发安全、高效、不与其他抗逆转录酶病毒药物发生相互影响的新型药物。

HIV-1跨膜蛋白C端多肽抑制剂针对病毒入侵细胞的过程，抑制病毒入侵体细胞，属于抗HIV膜融合抑制剂。

1992年Wild等人提出HIV-1外膜融合蛋白gp41具有膜融合抗性，发现多肽N51(L6)C43，具有较高热稳定性，N多肽和C多肽分别以gp41三端发夹结构内的HR1、HR2的氨基酸序列为依据设计，N多肽和C多肽来自于构象稳定的螺旋三聚体，反相平行排列，中间以一段六个亲水氨基酸残基(Ser-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly)相连接。1997年Bergeron等相续提出N36(L6)C34与N34(L6)C28。

由于C多肽和N多肽形成反向平行的三端发夹结构，且具有七氨基酸重复排列的螺旋体结构，位于发夹结构内部的相邻N端多肽螺旋表面的g点、e点共同组成三个疏水槽，这三个疏水槽就是C端多肽与之相互作用的关键位点。目前研究人员所研究的C端多肽就是针对这些疏水槽设计位点设计，将其与HIV-1病毒gp41的三端发夹结构竞争结合，从而达到抑制病毒侵入的目的。

本发明所提出的多肽C22，也是针对HIV-1病毒gp41三端发夹结构的疏水槽构象而设计，可以与HIV-1病毒gp41的三端发夹结构竞争结合，从而对HIV-1在融膜侵入的过程中起到重要的作用，可以作为有效的抗HIV-1膜融合抑制剂。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离的抗HIV-1的多肽C22。

本发明的另一个目的是提供一种该多肽C22表达前体。

本发明的另一个目的是提供一种分离的编码该多肽C22和多肽C22表达前体的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种含有分离的抗HIV-1的多肽C22的药物组合物。

本发明的另一个目的是提供一种含有制备分离的抗HIV-1的多肽C22的方法。

在本发明的第一方面，本发明涉及一种分离的多肽C22，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，表示如下：

Glu Leu Asp Xaa Trp Ala Xaa Leu Trp Asn Trp Phe Asn Xaa Thr Asn

1               5                   10                  15

Trp Xaa Trp Tyr Xaa Lys

            20           。

更优的，本发明的多肽C22，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，表示如下：

Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn

1               5                   10                  15

Trp Leu Trp Tyr Ile Lys

            20          。

在本发明的第二方面，本发明涉及一种多肽C22表达前体，其氨基酸序列的特征是从氨基端至羧基端分别含有本发明所述的多肽C22与GST融合蛋白序列。

在本发明的第三方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其可以编码本发明所述的多肽C22。

在本发明的第四方面，本发明涉及一种分离的多核苷酸，其可以编码本发明所述的多肽C22表达前体。

在本发明的第五方面，本发明涉及一种含有可编码本发明所述多肽C22表达前体的表达载体。

在本发明的第六方面，本发明涉及一种可被上述表达载体所转化的宿主细胞。

在本发明的第七方面，本发明涉及一种含有药学上有效量的本发明的多肽C22与药学上可以接受的药物组合物。

在本发明的第八方面，本发明涉及一种含制备本发明多肽C22的方法，其包括步骤：

a)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的多肽C22表达前体的多核苷酸序列，从而表达出单位多肽C22表达前体；

b)分离出所述的单体多肽C22表达前体；

c)用蛋白酶酶切割所述的单体多肽C22表达前体；

d)分离出单体多肽C22。

本发明的多肽C22在氨基酸序列上的第4、7、11、14、18、21位氨基酸分别位于HIV-1外膜融合蛋白gp41C多肽与N多肽结合的疏水槽上，使本发明的多肽C22有效参与HIV-1病毒gp41的三端发夹结构竞争结合，从而可以作为有效的抗HIV-1膜融合抑制剂。本发明人研究发现本发明的多肽C22的第11位氨基酸必须是色氨酸，第4、7、14、18、21位氨基酸可以是任意氨基酸，较佳的是除了Cys、Met之外的任意氨基酸。

本发明人经过广泛而深入的研究，发现在用融合蛋白6ST***表达抗HIV-1多肽C22，可以大大简化抗HIV-1多肽的生产手段，提高多肽的得率，例如利用GST***的高表达量得到更多的蛋白，且易分离。

如本文所用，“本发明的多肽”指抗HIV-1多肽C22、及相应的单体抗HIV-1多肽C22表达前体。

本发明的多肽可以是重组多肽或合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)产生。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是单链或是双链。

本发明的抗HIV-1多肽C22的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、或人工合成的方法获得。首先可用人工合成的方法来合成有关序列，因为本发明的多肽长度较短。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量的获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明中，抗HIV-1多肽C22核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗HIV-1多肽C22编码DAN序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性李子有：大肠杆菌的lac或trp启动子，真和启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸腺激酶启动子、早期和晚期SV40启动子和其他一些已知的可控制基因在原合伙真和细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基团，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以使原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；真核细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS细胞等动物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌是，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超出里、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其他各种液相层析技术及这些方法的结合。

在一优选例中，本发明的抗HIV-1多肽C22是以单体抗HIV-1多肽C22前体即融合蛋白的形式表达，然后再经酶切处理。酶切后用分子筛层析等方法分离酶切产物，即可获得本发明的C22多肽。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抗HIV-1多肽C22以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

本发明的优点在于：

1)本发明揭示的多肽C22可以有效参与HIV-1病毒gp41蛋白的三端发夹结构竞争结合，从而可以作为有效的抗HIV-1膜融合抑制剂。

2)本发明的单体多肽C22可以由表达的单体多肽C22前体经过一步酶切得到。

附图说明

图1本发明多肽C22的PCR扩增产物电泳示意图，其中从左至右依次为温度梯度C22PCR产物，100bpDNAMarker，图中显示50-60℃均有条带，在60、52和50℃扩增出的条带量较小，56℃左右扩增出的条带量较大。

图2：15％SDS-PAGE鉴定经表达得到的GST-C22融合蛋白示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列事实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

材料和方法

1.酶和化学试剂：谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达与纯化***购自Pharmacia公司；PCR试剂盒购自Takara公司；限制性内切酶及T4连接酶购自MBI公司；DNA回收试剂盒为Promega公司产品；蛋白酶Enterokinase购自NBI公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

2.菌株和载体：大肠杆菌(E.coli)DH5α，DH10b，BL21为本实验室保藏。质粒pGEX-4T-1购自Amershem公司。

3.载体DNA、文库、引物和DNA序列测定：寡合苷酸引物合成分别由上海生工公司及上海***生物公司完成，DNA序列测定由上海博亚公司完成。

4.仪器：PCR仪、蛋白凝胶电泳仪、凝胶成像仪、FPLC都为Bio-Rad公司产品，HPLC为安捷伦公司Agilent 1100型

实施例1本发明多肽C22克隆的制备

1.1多肽C22核苷酸链的获得

分别设计C22单链核苷酸模板和正反向引物，用PCR反应获得C22核苷酸链(SEQID NO：3)。

设计模板与引物如下：

Templet for C22

5’GAA TTG GAT AAA TGG GCG TCG CTG TGG AAT TGG TTT AAT ATT ACC AAT TGG CTG TGG TAT

   ATT AAA 3’

5’primer for C22(EcoRI)

5’GC GAA TTC GAC GAC GAC GAC AAA GAA TTG GAT AAA TGG GCG 3’(SEQ ID NO：4)。

3’primer for C22(XhoI)

5’CCG CTC GAG TTA TTT AAT ATA CCA CAG CCA 3’(SEQ ID NO：5)。

在50μl反应体系中(50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，2.0mM MgCl2，200μM dNTPs)加入扩增引物各100pmole。充分混匀后开始PCR循环：95变性1分钟，94℃变性5分钟，55℃或58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行30个循环。最后在72℃保温10分钟。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收后用于克隆。如图1所示。

参考大肠杆菌偏爱密码子，化学合成了HIV-1 gp41 C端多肽C22核苷酸链。

1.2多肽C22克隆

将获得的C22PCR片段使用限制性内切酶双酶切，与同样双酶切的载体连接，使用连接酶。连接好的载体转化如感受态细胞。将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需25ngDNA)，体积不应超过感受态细胞的5％，轻轻旋转几次混匀内容物。冰浴30分钟；将管放入42℃水浴，定时90秒热休克；快速将管转移到冰浴90秒，使细胞冷却；每管加入800μlLB培养基，37℃缓摇45分钟，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；低速离心2分钟，去上清，留约100μl培养基在微量离心管内，重悬菌体；用玻璃铺菌器将菌液在琼脂板上铺匀；将平板倒置于37℃恒温培养箱，12-16小时后可出现菌落。涂板后挑取阳性克隆进行鉴定。

实施例2本发明多肽C22的表达与纯化

鉴定过的克隆摇菌，至OD值达到0.5-0.8之间时进行诱导表达，30摄氏度诱导过夜，8000g10分钟集菌。每500mL培养基所得菌体加入20mL2％triton in PBS、20uLDDT，溶菌酶和PMSF各100uL。以500W的功率超声破菌。破菌后13000g20分钟离心，取上清。上GlutathioneSepharose 4B柱结合，再用1×PBS冲洗后用还原谷胱甘肽洗脱，则得到GST-C22融合蛋白。如图2所示。所得融合蛋白经蛋白酶Enterokinase酶切后即可得到多肽C22。

实施例3：本发明多肽C22理化参数

经SDS-PAGE电泳，和标准分子量曲线，测得本发明多肽C22等电点为6.17。分子量为2812.22。

                          序列表

<110>同济大学

<120>抗HIV-1多肽C22，其编码序列及其制备方法

<130>040285

<160>5

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>4，7，14，18，21

<400>1

Glu Leu Asp Xaa Trp Ala Xaa Leu Trp Asn Trp Phe Asn Xaa Thr Asn

1               5                   10                  15

Trp Xaa Trp Tyr Xaa Lys

            20

<210>2

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn

1               5                   10                  15

Trp Leu Trp Tyr Ile Lys

            20

<210>3

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaattggata aatgggcgtc gctgtggaat tggtttaata ttaccaattg gctgtggtat      60

attaaa                                                                 66

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>引物

<400>4

gcgaattcga cgacgacgac aaagaattgg ataaatgggc g                          41

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ccgctcgagt tatttaatat accacagcca                                       30

Claims (9)

1.一种分离的多肽C22，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的多肽C22，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸编码权利要求1或2所述的多肽C22。

4.一种多肽C22表达前体，其特征在于，从氨基端至羧基端分别含有权利要求1或2所述的多肽C22序列与GST融合蛋白序列。

5.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸编码权利要求4所述的多肽C22表达前体。

6.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的DNA序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的表达载体转化。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1或2所述的多肽C22与药学上可以接受的载体。

9.一种制备多肽C22的方法，其特征在于，包括步骤：

1)在表达条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码权利要求5所述的多肽C22表达前体的多核苷酸序列，从而表达出权利要求4所述的单位多肽C22表达前体；

2)分离出所述的单体多肽C22表达前体；

3)用蛋白酶酶切割所述的单体多肽C22表达前体；

4)分离出单体多肽C22。

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