CN1214367A - 人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体,包括人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab段抗体基因、基因产物及其应用,其特征在于此重组抗体是由存在于抗体基因轻链和重链可变区的高变区(CDRs)中特异性基因序列(摘要附图)决定的并获得有效表达的特异性识别汉坦病毒糖蛋白并具有抗病毒中和活性的功能性抗体。其今后的可能用途在于利用获得的中和性Fab抗体基因及其表达产物,可在临床上用于治疗肾综合征出血热。
Description
本发明涉及治疗用人源基因工程单克隆抗体的制备及应用,尤其是特异性针对汉坦病毒糖蛋白的中和性基因工程单克隆抗体。运用噬菌体表面表达(PhageDisplay)技术,从流行出血热疫区恢复期病人抗凝血中分离到的外周淋巴细胞中提取了总细胞RNA,通过RT-PCR方法,用一组人IgGFab基因特异性引物,从合成的cDNA中PCR扩增了一组轻链和重链Fab段基因,将轻链和重链先后***噬菌体载体pComb3,成功地建立了抗汉坦病毒抗体基因库,并用纯化的汉坦病毒颗粒以及抗汉坦病毒糖蛋白鼠单抗捕捉糖蛋白抗原的方法对此抗体库进行了富积筛选表达,获得人源中和性抗汉坦病毒汉坦型基因工程单克隆抗体Fab段基因及其表达。核苷酸序列分析证实所获基因为人源IgGFab基因,用特异性放射免疫沉淀(IP),IFAT和ELISA以及空斑减少中和试验鉴定表明,表达的人Fab抗体识别汉坦病毒糖蛋白G1,具有体外中和活性。作为一种潜在的治疗用抗体药物,这种中和抗体有望在将来被用于汉坦病毒引起的肾综合征出血热。
自1975年B淋巴细胞杂交瘤细胞融合技术问世以来,单克隆抗体作为临床诊断,临床治疗和预防的新型产物,其运用价值和开发前景已获得普遍的肯定分子生物学和分子免疫学的研究发展导致了基因工程单克隆抗体的产生和发展。通过抗体分子基因水平的重组可获得多种多样的特异性鼠源,兔源及人源抗体,使对单克隆抗体的研究有了突破性进展并越来越显示出其重要意义及实际运用前景国内外对基因工程单克隆抗体,尤其是人源化或人源抗体的研究已有10余年。而80年代末90年代初兴起的噬菌体抗体基因库技术侧已成为当今世界人源基因工程单克隆抗体研究的热点。目前已发展成功的基因工程单克隆抗体的形式有:1)人-鼠嵌合抗体,即将鼠单抗轻,重链可变区基因VL和VH分别与人抗体轻,重链恒定区基因CL和CH连接形成人-鼠嵌合轻链和重链基因,并在骨髓瘤细胞,昆虫细胞及CHO细胞中获得表达。2,重构抗体或人源化抗体,即用特异性鼠单抗Fab段中的高变区CDR区替代人单抗Fab段中的CDR区或在人-鼠单抗中将鼠Fab段中FR区中的表面决定族碱基替换成人抗体相应的基因序列。我国也已有成功报道。3)小分子抗体,包括Fab(完整轻链和Fd),sFv(VH和VL经一小连接肽相连),Fv(VH和VL组成)VH及MRU(最小识别单位)通过杂交瘤细胞或建立的噬菌体抗体基因库,获得Fab或sFv在原核细胞中表达。4,重组全抗体,即整个免疫球蛋白分子包括IgG,IgA分别在淋巴瘤细胞,非淋巴瘤细胞如CHO细胞以及杆状病毒***中的表达。
噬菌体表面表达多肽或蛋白技术创始于1985年。用此技术构建噬菌体抗体基因库是最近5-6年发展的热点。从抗体库筛选的抗体表达形式主要以Fab段抗体和scFv为主。用以构建抗体基因库的噬菌体载体***目前已构建和发展很多,其中比较有代表性的表达***是由美国Scripps研究所研究而成的pComb***,其基本原理是将PCR扩增的全套抗体轻链基因组和全套重链基因组***噬菌体载体pComb3中,其中Fd以与蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ融合蛋白的形式,轻链则以独立表达的形式,通过先导序列pelB分泌入细菌细胞间隙并组装成Fab,经辅助噬菌体感染后组成噬菌体抗体库。通过使用特异性抗原对抗体库进行富积筛选获得特异性抗体基因。1990年Scripps研究所从破伤风毒素免疫的供者外周血B细胞中首次获得人抗体基因库并获得人抗破伤风毒素单克隆抗体。至今此技术已较广泛用构建鼠和人抗体基因库并取得重要进展,通过噬菌体载体表达***由其是pCom3表达***建立抗体库从而获得抗病毒人单克隆抗体在国外已有成功的报道。目前世界上已报道的从噬菌体人抗体基因库中筛选到的抗病毒人单抗有:抗流感病毒单抗,抗HBsAg抗体,抗呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白抗体,抗单纯疱疹病毒抗体,抗HIVgp120抗体以及抗汉坦病毒核蛋白抗体等。上述抗体均以Fab段形式在大肠杆菌中表达,并同时获得特异性抗体基因序列。
汉坦病毒是引起严重传染病肾综合征出血热的病原体。肾综合征出血热在我国广泛流行,每年有10万左右的病人,其临床病死率较高,严重危害人民生命健康,致今未有特异性药物治疗。汉坦病毒基因由S、M和L三个片段组成,分别编码核蛋白、糖蛋白G1和G2以及病毒多聚酶。汉坦病毒中和抗原主要存在于由M片段编码的糖蛋白G1和G2上。实验证明抗G1和G2的中和性单克隆抗体具有被动保护地鼠免受汉坦病毒攻击的被动保护作用。用流行性出血热病人恢复期抗凝血或血清治疗临床出血热病人,其疗效已在我国疫区以及国外临床运用中获得肯定。因此在无特异性抗病毒治疗药物的情况下研制一种标准的抗汉坦病毒感染的抗体制剂具有非常重要的临床意义和良好的前景。
特异性抗病毒抗体可用于临床病毒病治疗已得到普遍公认。经典途径通过细胞融合筛选制备人单抗存在难度大,成功率低,选择范围小,表达细胞系不稳定,抗体滴度低等不足之处。用分子生物学手段组建人抗体基因年库,从中获得稳定的特异性抗体基因,可在原核或真核细胞中得到高效稳定的表达。并可在基因年水平上任意改进CDR区域的基因以获得高亲和力的中和抗体。重链,轻链随机组合大大增加了所获抗体的多样性,可获得一些用常规方法难以获得的人单抗。这是人特异性单抗研制技术中的一项重大突破。本研究技术可推广运用于多种抗病毒单抗的研制,在抗病毒病治疗中具有深远的实际运用价值。
人-鼠嵌合抗体可用于多方面的基础研究,但作为临床用制剂,其存在明显的缺点。虽然用人的Fc段替换了鼠的Fc段,但鼠的Fab段FR区仍然具有异源性,可诱导产生抗鼠体,不适合于反复应用某些嵌合抗体失去天然抗体的某些构象而导致抗体活性下降或人源化抗体或重配抗体虽然将特异性鼠单抗CDR区域替代入人抗体的CDR区,但鼠源的CDR序列往往与位于其之间的FR序列不相适应而导致抗体构象的改变。显而易见,人源基因工程单抗是研制抗病毒抗体的最佳选择。
本发明的目的是通过基因工程手段和噬菌体表面表达技术结合运用,直接从人抗体基因库中筛选出中和性抗汉坦病毒的基因工程单克隆抗体,获得其抗体基因,为将来可能的临床抗病毒治疗提供可行性的特异性抗体药物。
本发明陈述的人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体包括:
(1)为一种人源的在原核细胞中获得稳定有效表达的重组IgG Fab抗体,命名为AH23。
(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的,其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域(附图1)
(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗汉坦病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达,轻链和重链相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。
(4)特异性识别汉坦病毒包膜糖蛋白,并具有抗汉坦病毒感染的中和活性
(5)利用上述获得的中和性Fab抗体基因,可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒***中表达此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因,获得具有中和汉坦病毒感染的抗体产物,可在临床上用于治疗由汉坦病毒引起的肾综合征出血热。
传统的利用杂交瘤细胞技术获得人源单克隆抗体相当困难,而且建立的细胞系通常不稳定,基因易丢失。本发明陈述的人源抗汉坦病毒糖蛋白G1中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体,是在获得抗体基因的基础上获得基因产物的表达,此抗体基因可随着质粒DNA在细菌内的复制而稳定复制,并可根据不同需要任意改建抗体基因,从而获得一种可行性的临床治疗用抗体制剂。
以下的优先实施例对本发明作详细说明,担不意味着限制本发明的内容在这些实施例中,为说明本发明,采用噬菌体表达载体为pComb3(Barbas C.Ⅲetal,Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991,89:10164-10168)。所用主要菌株为商品化产品XLI-Blu(美国Strategene公司产品)。所用噬菌体为VCSM13(美国Strategene公司产品)。所用汉滩病毒毒株为国际标准汉滩病毒毒株76-118(SschmaljohnC.S.et al,Science 1985,227:1041-1044)和我国分离的汉滩病毒毒株84F-Li.(Liang M.F et al,Virus Research 1994,31:219-223)。
实施例1-4为人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体AH23的筛选制备方法;实施例6为人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体FabAH23的基因特征;实例7-11为人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体AH23的蛋白及功能特征。
实例1:人源IgG Fab段基因的PCR扩增:用淋巴细胞分离液(上海化学试剂厂)从安徽疫区EHF病人恢复期抗凝血中分离淋巴细胞,用Tril-Zon(美国Gibco,BRL)提取总细胞RNA,用Olig-dT引物将提取的RNA通过逆转录酶(美国Gibco,BRL)逆转录成cDNA,用一组特异性IgGFabGamma链、Kampa链及Lamda链引物(表1),对人源轻链和重链Fab基因进行PCR扩增。PCR条件为:94℃1分钟,54℃1分钟、72℃2分钟,35个循环(PE 480),上述PCR产物分别经琼脂糖凝胶回收,经过DNA纯化柱Spin-X(美国Gibco,BRL)纯化后,获得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd链PCR产物(附图2)。
实例2噬菌体抗体基因库的建立:将不同引物合成的Kamba和Lamda链PCR产物混合,将不同引物合成的Fd链混合,分别用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌体载体pComb3,将克隆入轻,重链基因的pComb3载体DNA连接产物经乙醇沉淀后,用10ul蒸溜水悬起,电转导入事先制备好的200ul电转菌XLI-Blu,(电转条件为:Bio-Red电转仪,0.2cm电转杯,2.5K伏),电转后加10mlSOC培养液,37℃1小时,加入10ml带有氨苄青霉素和四环素的SB培养液(3),37℃l小时,加入80-100ml前述SB,37℃2小时后加入辅助噬菌体M13GCM 1×10 12,1小时后加入卡那霉素(70ug/ml),37℃摇床培养过夜。用4%PEG8000和3%NaCl沉淀噬菌体上清,经9000rpm,20分钟,4℃离心后,用2ml 0.02M PBS PH 7.4重悬沉淀,建立噬菌体抗体库,分装保存于-20℃冰柜中。
实例3:用于抗体库富集筛选的汉坦病毒抗原的制备:1)汉坦病毒颗粒的纯化:按照文献方法(10),将汉坦病毒76-118株感染后的细胞上清液用PEG沉淀,经10-60%蔗糖密度梯度离心,收乳白色病毒带作为纯化的病毒颗粒抗原。2)感染细胞裂解液的制备:按文献方法,用汉坦病毒76-118,84-FLi感染E-6细胞后7天,用1%Trito-100,裂解液裂解细胞,制成汉坦病毒抗原。
实例4:噬菌体抗体库的特异性富积筛选:分别用上述纯化的汉坦病毒颗粒脱脂奶-PBS,37℃封闭2小时后加入上述噬菌体抗体库每孔60ul,37C孵育2小时,用5%Tween-20,-TBS反复洗20遍,最后用每孔60ul,pH2.2甘氨酸一盐酸洗脱液洗脱,pH9.6的Tris液中和。洗脱后的噬菌体继续感染2ml新鲜的OD600=1.0左右的XL1-Blu菌,经辅助噬菌体VCSM13(美国Stratagene)感染后进行下一轮筛选。如此反复筛选4-5次,将每轮特异性富积筛选后的噬菌体感染XL1-Blu菌,取适量菌(10-50ul)涂氨卞平皿37℃,4-5小时后,加5mMIPTG浸湿的硝酸纤维素膜,30℃过夜。此膜经氯仿固定后,用5%脱脂奶封闭,加入HRP标记的抗人IgGFab抗体染色。获得特异性抗体阳性克隆的富积增强。如图3,是人抗体基因库的富积筛选(硝酸纤维素膜免疫印迹法)。
实例5人IgGFab抗体AH23的可变区基因的核酸序列分析:用QiagenMiniprepKit(美国Qiagen)制备挑选出的阳性克隆DNA,用双脱氧法对特异性的人抗汉坦病毒IgGFab抗体可变区基因进行核酸序列分析。测序所用试剂盒为Sequenase Version 2.0 Sequencing Kit(美国USB/Amacia)。来源于载体pComb3的引物(5‘-CTAACTAGCTAGTCGCC)被用于测定轻链可变区基因;而重链基因则需被亚克隆入PCRⅡ载体(美国Invitro Gene),然后用M13或T7引物进行测定。至少3个克隆被用于确定同一相同的序列。所获序列均用DNAStrider(美国微软公司)序列分析软件进行分析处理,并比较Internet网络上基因库中的IgG序列。证实人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体AH23的Fab基因由人IgG链Fd和λ链组成,其基因特征由VH和VL结构域中的6个CDR区的特异性核甘酸序列和氨基酸构成,即VH-CDR1,VH-CDR2,VH-CDR3和VL-CDR1,VL-CDR2和VL-CDR3。如图1,是人源抗汉坦病毒糖蛋白基因工程单克隆抗体Fab段抗体AH23轻链和重链基因可变区的核苷酸和氨基酸序列。
实例6将带有AH23Fab抗体轻重链基因***的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA,用SpeⅠ和NpeⅠ切除载体中的gⅢ,变FdgⅢ融合蛋白为独立表达的蛋白,连接后转化XL1-Blu菌,从过夜生长的氨苄碟子中挑取单个菌落,接种SB或TB细菌培养液,当细菌长至OD=0.2-0.3,加入1mMIPTG,在30℃诱导表达10-12小时。收获细菌,离心后加入原培养液10倍浓缩量的PBS(0.02M PH7.4)悬起,反复冻融3次,高速离心后其上清即为表达的Fab抗体。汉坦病毒感染Vero-E6细胞后制成抗原片,加入表达的Fab,37Cf孵育后加荧光素IFTC标记的抗人IgGFab抗体,特异性免疫荧光反应即证实获得的人源基因工程单克隆抗体AH23针对汉坦病毒。如图4,是表达的人源抗汉坦病毒G1Fab抗体AH23对汉坦病毒的免疫荧光反应。
实例7酶联免疫吸附试验(ELISA):1)分别用实例3中制备的纯化的汉坦病毒抗原0.5ug和抗人IgGFab抗体0.1ug(美国Sigma)包被96孔板,加入不同稀释度的上述制备的人Fab表达产物细菌裂解液,37℃孵育1.5小时后,加入HRP标记的羊抗人IgGFab抗体.(Sigma)。2)分别用抗汉坦病毒核蛋白和糖蛋白单克隆抗体包被96孔板,加入上述方法4中所述的汉坦病毒感染的细胞裂解液,进一步加入人Fab抗体和HRP标记的抗人Fab抗体。显色底物为TMB,加入4N硫酸终止反应后,在OD450nm检测每孔OD值。结果证实本获得的人源基因工程单克隆抗体AH23针对汉坦病毒糖蛋白。如图5,是酶联免疫反应(ELISA)检测人源抗汉坦病毒基因工程单克隆抗体Fab抗体。
实例8放射免疫沉淀特异性汉坦病毒结构蛋白:用过量的汉坦病毒76-118感染Vero-E6细胞,用35S标记蛋氨酸和/或3H标记亮氨酸标记病毒蛋白,用细胞裂解液将标记后的感染细胞裂解后,加入表达的Fab可溶性裂解上清液,4℃过夜孵育后加入抗人IgGFab抗体偶联的蛋白A琼脂糖,经洗涤后,于沉淀中加入SDS-PAGE样品缓冲液,进行SDS-PAGE电泳,特异性放射免疫信号显示获得的人源基因工程单克隆抗体AH23针对汉坦病毒糖蛋白G1。如图6,是放射免疫沉淀鉴定表达的Fab对汉坦病毒结构蛋白的特异性结合。
实例9空斑减少中和试验(PRNT):在24孔细胞培养板中长成单层VeroE6细胞,将来自不同克隆的表达的Fab可溶性裂解上清液以及阴性对照从原液开始进行倍比稀释,或将纯化的Fab和牛血清白蛋白(BSA)标准化到200ug/ml,然后分别和30 PFU的汉坦病毒液混合,37℃孵育1.5小时,已每孔100ul加入板中,每个稀释度2孔,然后加入第一层6%琼脂糖(100ml含:0.6克琼脂糖,10%牛血清,1%PS,1%非必需氨基酸,4ml 7.5%谷氨酰胺和2ml 1M Hepes)。37℃,5%CO2条件下孵育7天,至第八天加第二层琼脂糖(同上,4%中性红)。以降低50%空斑数的抗体最高稀释度为中和抗体滴度。获得的人源基因工程单克隆抗体AH23具有体外中和汉坦病毒感染的功能,为中和性抗体。如图7,是空斑减少中和试验检测纯化的人Fab抗体对汉坦病毒76-118和84-Fli株的中和活性。
实例10:人Fab表达产物的亲和层析纯化:将抗人IgG抗体偶联到ProteinA-Sepharose4B(美国Sigma),然后进行亲和层析纯化。获得人源基因工程单克隆抗体AH23的电泳纯蛋白。如图8,是人源抗汉坦病毒单克隆抗体Fab段抗体AH23表达产物的SDS-PAGE。泳道从左到右:1.Mr:低分子量蛋白标准品:2.纯化的AH23Fab 3.未纯化的含有AH23Fab表达产物的细菌裂解液。
Claims (5)
1、人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体,其特征在于:(1)为一种在原核细胞中获得稳定有效表达的基因重组的人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体(2)其抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域(Complementarity-Dertemining Regions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的,其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域(附图1)(3)特异性的轻链和重链基因来源于对人源抗汉坦病毒抗体基因库的特异性富积筛选表达,其相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。(4)特异性识别汉坦病毒包膜糖蛋白,并具有抗汉坦病毒感染的中和活性
2、人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体的用途,其特征在于:利用上述获得的中和性Fab抗体基因,可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组病毒***中表达此抗体基因或以此为基础的改建后的含有此抗体基因任何其他基因,获得具有中和汉坦病毒感染的抗体产物,可在临床上用于治疗由汉坦病毒引起的肾综合症出血热。
3、根据权利要求1人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体,其特征在于:编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源抗汉坦病毒中和性抗体基因,可被用于任何表达***表达抗汉坦病毒中和抗体。
4、根据权利要求1人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体,其特征在于:编码所述特异性Fab抗体蛋白的基因为人源中和性抗汉坦病毒抗体基因,其核苷酸序列或由此产生的氨基酸序列可被用于相关基因的改造,而表达抗汉坦病毒糖蛋白的中和性抗体或多肽产物。
5、根据权利要求1人源抗汉坦病毒糖蛋白中和性基因工程单克隆抗体Fab抗体,其特征在于:所述抗体具有识别汉坦病毒糖蛋白上中和抗原,从而阻断汉坦毒感染的功能,其基因表达产物望在临床上用于治疗由汉坦病毒引起的肾综合征出血热。
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C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |