CN105504057A - 抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用 - Google Patents

抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用。抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，包括重链和轻链，所述重链由鼠抗体重链可变区和人抗体重链恒定区组成，所述轻链由鼠抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区组成；所述鼠抗体重链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的重链可变区，所述鼠抗体轻链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的轻链可变区；所述人抗体重链恒定区为人抗体γ1恒定区，所述人抗体轻链恒定区为人抗体κ链恒定区。本发明具有较好的中和活性，与鼠单抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源性抗体可变区的高亲和力，又具有人抗体Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生率，在体内半衰期更长，具有较好的临床治疗效果。

Description

抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种抗体，具体涉及一种抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用。
背景技术
单克隆抗体技术的发展极大地影响了对人类疾病治疗方法的研究。Kohler和Milstein应用细胞融合技术制备单克隆抗体在生物学引起了一场革命，其影响等同于重组DNA克隆技术。从杂交瘤产生的单克隆抗体已被广泛地应用于诊断和基础科学研究中；在治疗人类疾病中，包括病毒和微生物感染，其疗效有待进一步证实。
尽管，鼠单克隆抗体通过其本身的特异性能够影响人类疾病的进展，但是由于其鼠源性的本质，应用于人类可以引起免疫排斥反应，限制了其在人类疾病治疗中的应用。同时，由于它们不同于人类蛋白质，被迅速从循环中清除，也不能被人免疫效应细胞或分子所识别。
因此，制备人单克隆抗体可以防止这些问题的发生，但是在制备人单克隆抗体的过程中也遇到了一些困难，产生人单克隆抗体的细胞系是EB病毒永生化的细胞，不能用于大规模生产人单克隆抗体。永生化的人单克隆抗体细胞系也可能携带人类病毒基因，例如人免疫缺陷病毒等。
此外，人类病毒在人免疫***中进化，一些重要抗原已经不能被人免疫***所识别，这些抗原在人体也不能产生有用的免疫反应。相比，这些病毒抗原对小鼠具有免疫原性，产生鼠单克隆抗体，可以用于疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高效中和作用的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用。
本发明所采用的技术方案为：
抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，包括重链和轻链，其特征在于：
所述重链由鼠抗体重链可变区和人抗体重链恒定区组成，所述轻链由鼠抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区组成；
所述鼠抗体重链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的重链可变区，所述鼠抗体轻链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的轻链可变区；
所述人抗体重链恒定区为人抗体γ1恒定区，所述人抗体轻链恒定区为人抗体κ链恒定区。
所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.1；
所述抗体重链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.2；
所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.3；
所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.4。
编码所述的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的基因，其特征在于：
编码抗体重链可变区的基因序列为SEQIDNo.5；
编码抗体重链恒定区的基因序列为SEQIDNo.6；
编码抗体轻链可变区的基因序列为SEQIDNo.7；
编码抗体轻链恒定区的基因序列为SEQIDNo.8。
所述的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体作为治疗肾综合征出血热的抗体药物的应用。
本发明具有以下优点：
本发明提供了一种抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，具有较好的中和活性，与鼠单抗相比，嵌合抗体既保留了鼠源性抗体可变区的高亲和力，又具有人抗体Fc段的多种免疫杀伤功能，从而大大降低了人抗鼠抗体反应的发生率，在体内半衰期更长，具有较好的临床治疗效果。
CHO细胞是生物制药领域应用最广泛的的哺乳动物细胞表达***，大分子蛋白如抗体分子能够由CHO细胞分泌表达，并且可以正确折叠，无需复性。此外，由CHO表达的蛋白具有蛋白质翻译后的修饰作用，尤其是抗体分子，糖基化影响其生物活性，用大肠杆菌或酵母表达***表达的蛋白无糖基化或糖基化结构与天然蛋白相差甚远，严重影响了蛋白质的生物学活性。而用CHO等哺乳动物细胞表达***表达的蛋白，其结构和功能都与人体内产生的蛋白非常接近。嵌合抗体真核表达的关键在于其表达的产量。为了实现嵌合抗体在真核细胞中的表达，本申请中采用了自主改建的真核表达载体，使用强启动子，增加有利于基因稳定整合和促进表达的元件，以提高目的基因的表达效率。
附图说明
图1为重链（pCI-H）和轻链（pCI-L）表达载体的酶切鉴定。
图2为鼠/人嵌合抗体的SDS-PAGE检测。
图3为鼠/人嵌合抗体的Western-blot检测。
图4为鼠/人嵌合抗体的中和活性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
一、鼠/人嵌合抗体真核表达载体的构建：
1、提取抗汉滩病毒鼠单克隆抗体杂交瘤细胞系mRNA，经逆转录成cDNA后作模板，采用特异性引物，以PCR法分别扩增VH和VL基因，将PCR扩增产物分别克隆至pUC18载体中，测序，获得重链和轻链可变区基因序列。
2、从健康人B淋巴细胞中克隆人IgG1重链恒定区和κ轻链恒定区基因，通过重叠延伸PCR，连接可变区与恒定区，得到完整抗体基因。将轻、重链基因分别用相应限制性内切酶切下，分别与表达载体相连，构建含有抗体基因的哺乳动物细胞表达载体。
二、鼠/人嵌合抗体的表达与纯化：
1、哺乳动物细胞CHO-K1对G418和MTX的敏感度确定：参照相关文献先测定哺乳动物细胞CHO-K1对G418的耐受度。将G418浓度系列稀释为300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml…1000μg/ml，按照每孔5×105个CHO-K1细胞接种于含不同浓度G418的6孔板中，观察细胞的生长状态。
2、测定真核细胞CHO-K1对MTX的耐受度。将MTX浓度系列稀释为25μM、50μM、100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM、400μM，按照每孔5×105个CHO-K1细胞接种于含不同浓度MTX的6孔板中，观察细胞生长状态。
3、稳定转染CHO-K1细胞系的建立与筛选：将含有抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体轻链、重链基因表达载体，用LipofectamineTM2000共转染CHO-K1细胞，48h后换含有G418和MTX的RPMI-1640完全培养基继续培养，观察细胞生长状态，每3d换液一次。待新的抗性细胞克隆生长起来后用ELISA法检测抗体是否表达。将抗性细胞克隆从培养孔内吸出并作细胞计数，计算出1ml的细胞数之后，用不完全1640培养液稀释后铺96孔板，1000个细胞/孔。用含有G418和MTX的1640完全培养基继续培养，观察孔内细胞克隆生产情况。筛选4周左右，每隔2-4d采用ELISA法检测每孔细胞的抗体表达量，结合细胞生长状态挑选稳定、高效表达的阳性克隆。将其用有限稀释法进行再次克隆化，将细胞按每孔约1个接种于96孔板，形成细胞克隆后挑选单克隆或克隆数较少的孔进行ELISA检测。挑选出表达量较高的孔继续按同样方法进行第三次克隆化，通过ELISA检测抗体表达量是否提高。ELISA检测包被抗体为山羊抗人IgG抗体，检测抗体为HRP-山羊抗人IgG抗体。显色液为OPD。当高表达孔单克隆细胞在96孔板内汇合度约至80%，将其转入24孔板，细胞状态稳定后转入25cm2培养瓶中培养。待细胞生长至瓶底约80%后，其中3/4细胞冻存，剩余1/4细胞继续培养。
4、连续传代稳定性检测：将筛选出的CHO-K1稳定转染细胞系连续传代培养6个月，在此期间每隔1w进行ELISA检测，验证筛选出的CHO-K1稳定转染细胞的传代稳定性。
5、冻存稳定性检测：每隔3w重新复苏冻存的稳定转染细胞，将其传代培养2w，在此期间每隔3d进行ELISA检测，验证筛选出的CHO-K1稳定转染细胞的冻存稳定性。
6、稳定转染细胞系的无血清培养：在无血清培养基条件下培养筛选出的CHO-K1稳定转染细胞系，观察细胞生长状态，验证筛选出的CHO-K1细胞是否能适应无血清培养，并用双抗体夹心ELISA检测在不同培养条件下筛选出的CHO-K1稳定转染细胞表达抗HTNVmAb3G1鼠/人嵌合抗体的能力。
7、抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的纯化：将筛选出的高表达细胞株进行无血清培养，收集培养上清。使用亲和色谱层析技术利用ProteinAHPSpinTrap进行抗体纯化。具体步骤如下：
（1）样品脱盐处理：
1)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡PD-10脱盐柱。
2)用1ml注射器缓慢上样，流速为1-10ml/min。
3)用2倍柱体积的pH7.2的洗脱缓冲液缓慢洗脱，流速为1~10ml/min，收集洗脱液。
4)用20倍柱体积的平衡缓冲液洗脱柱子后再用5倍柱体积的20%乙醇洗脱，将柱子保存在20%乙醇中，4℃存放。
（2）样品纯化：
1)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡ProteinAHPSpinTrap层析柱。
2)将脱盐后的嵌合抗体缓慢上样。流速控制在1-10ml/mim。
3)用3倍柱体积的pH3.5的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱样品，流速控制在1-10ml/mim。每只收集管中加入100μl1molTris-HCLpH9.0，保持样品的PH值趋于中性。
4)用20倍柱体积的平衡缓冲液再次平衡柱子，将柱子保存在20%乙醇中，4℃存放。
以蛋白A亲和层析纯化得到目的蛋白，说明其含有人Fc段；以人IgG为标准品，用ELISA法测定纯化后蛋白浓度，该细胞株表达水平约4mg/L，可用于制备治疗肾综合征出血热的抗体药物的应用。
8、SDS-PAGE检测目的蛋白：分别用还原和非还原SDS-PAGE鉴定纯化的鼠/人嵌合抗体的大小。将纯化后的嵌合抗体用10%的分离胶进行SDS-PAGE，电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色液染色30min，之后每隔30min换脱色液1次，重复此步骤3次后脱色过夜，照相。SDS-PAGE检测显示，纯化蛋白的相对分子量大小约为150KD，与标准抗体分子大小一致。
9、Western-blot检测目的蛋白：分别用还原和非还原Western-blot检测纯化后的嵌合抗体。将纯化后的嵌合抗体分别在还原和非还原条件下用10%的分离胶完成SDS-PAGE，转移至NC膜，转膜条件为100V，90min。将NC膜放入1×TBST中清洗3次，摇床震荡，每次5min。
在5%的封闭液中37℃封闭2h。取出NC膜将其放入1×TBST清洗3次，每次5min。将NC膜加入用1×TBST1:2000稀释的山羊抗人IgG中4℃孵育过夜。次日用1×TBST洗膜4次，每次5min。将NC膜加入用1×TBST1:10000稀释的IRDye标记小鼠抗山羊二抗，37℃避光孵育1h。用1×TBST洗膜6次，摇床震荡，每次5min。将NC膜用Odyssey红外荧光扫描成像***扫描分析。
所构建的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，包括重链和轻链。所述重链由鼠抗体重链可变区和人抗体重链恒定区组成，所述轻链由鼠抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区组成。所述鼠抗体重链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的重链可变区，所述鼠抗体轻链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的轻链可变区；所述人抗体重链恒定区为人抗体γ1恒定区，所述人抗体轻链恒定区为人抗体κ链恒定区。
所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.1；所述抗体重链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.2；所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.3；所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.4。
编码抗体重链可变区的基因序列为SEQIDNo.5；编码抗体重链恒定区的基因序列为SEQIDNo.6；编码抗体轻链可变区的基因序列为SEQIDNo.7；编码抗体轻链恒定区的基因序列为SEQIDNo.8。
将鼠抗体重链可变区基因与人抗体γ1恒定区基因相连、鼠抗体轻链可变区基因与人抗体κ链恒定区基因相连分别构建入高效的真核表达载体pCI-neo中，制备了重链表达载体和轻链表达载体。将重链表达载体与轻链表达载体共转染CHO-K1细胞，经过筛选获得稳定高表达具有中和活性的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的工程细胞株。
三、鼠/人嵌合抗体的中和活性检测：
体外细胞中和实验：
1）将Vero-E6细胞接种入96孔板，培养1d约至90%汇合度。
2）以汉滩病毒76-118株作为攻击病毒，用10%1640稀释病毒后，将病毒分别与抗汉滩病毒鼠单克隆抗体（阳性对照）、1A8抗体（阴性对照）、超滤后的1640培养液（空白对照）和鼠/人嵌合抗体等体积混合后37℃孵育1h。
3）将孵育后的混合液分别接种到培养好的Vero-E6单层细胞，37℃孵育1h。同时设置正常细胞作为未感染组对照。
4）用微量移液器将每孔的混合液吸弃，加入200μl温育的1640培养液继续培养，每隔三天换液一次。
5）检测：第10天将96孔板在-80℃和37℃交替冻融三次，取裂解上清用ELISA法检测。
中和试验结果显示该嵌合抗体具有与亲本单克隆抗体相似的中和活性，证明该抗体在体外能有效中和汉滩病毒，可用于制备治疗肾综合征出血热的抗体药物。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
SEQUENCELISTING
<110>中国人民解放军第四军医大学
<120>抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体及其应用
<130>2015
<160>8
<170>PatentInversion3.3
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Claims (4)

1.抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，包括重链和轻链，其特征在于：
所述重链由鼠抗体重链可变区和人抗体重链恒定区组成，所述轻链由鼠抗体轻链可变区和人抗体轻链恒定区组成；
所述鼠抗体重链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的重链可变区，所述鼠抗体轻链可变区为抗汉滩病毒鼠单克隆抗体的轻链可变区；
所述人抗体重链恒定区为人抗体γ1恒定区，所述人抗体轻链恒定区为人抗体κ链恒定区。
2.根据权利要求1所述的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体，其特征在于：
所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.1；
所述抗体重链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.2；
所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNo.3；
所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列为SEQIDNo.4。
3.编码权利要求2所述的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体的基因，其特征在于：
编码抗体重链可变区的基因序列为SEQIDNo.5；
编码抗体重链恒定区的基因序列为SEQIDNo.6；
编码抗体轻链可变区的基因序列为SEQIDNo.7；
编码抗体轻链恒定区的基因序列为SEQIDNo.8。
4.权利要求2所述的抗汉滩病毒鼠/人嵌合抗体作为治疗肾综合征出血热的抗体药物的应用。
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